Expresión de las citosinas de la respuesta Th1 (TNF-a, TNF-b, INF-y,IL-1B), Th2 (IL-10) y Th17 (IL-17a) en ventrículo izquierdo de rata

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(1)U N I V E R S I D A D D E S O N O RA U N I D A D REGIONAL S U R DIVISIÓN DE CIENCIAS E INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO, BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS. "El saber de mis hijos 11•. hará mi grandeza. Expresión de las citosinas de la respuesta Th1 (TNF-a, TNF-13, IFN-y,. IL-113), Th2 (IL-1 O) y Th17 (IL-17a). en ventrículo izquierdo de rata. TESIS P R O F E S I O N A L PRÁCTICA. Que para obtener el título de:. Q U Í M I C O BIÓLOGO C L Í N I C O. Presenta:. José Francisco Chiprés Montaño. Navojoa, Sonora. Marzo del 2 0 1 7.

(2) Universidad de Sonora Repositorio Institucional UNISON. Excepto si se señala otra cosa, la licencia del ítem se describe como openAccess.

(3) FORMA DE APROBACIÓN. Los. miembros. Práctica. de. recomiendan. del. José. que. jurado. calificador. Francisco. sea. Chipres. aceptado. designado. Montaño,. como. requisito. para. la. revisar. han. parcial. la. Tesis. encontrado. para. Profesional. satisfactoria. obtener. el. Título. y. de. Químico Biólogo C l í n i c o .. Dr.. dalupe Soñanez Organís. Presidente. Dr. Edgar F.. rán Palacio. Vocal. 11.

(4) AGRADECIMIENTOS. A mi alma mater Universidad de Sonora.. A mi comité de Tesis por sus atentos comentarios y ayuda.. A. mi. asesor. Dr.. José. Guadalupe. Soñanez. Organis. por. siempre. asesorarme,. aconsejarme y guiarme de la manera correcta y por brindarme su amistad.. Al Dr. Jesús Alfredo Rosas Rodríguez por sus consejos y brindarme su amistad.. A la. Universidad de. Sonora por el financimiento. del proyecto. US0513002079. que. permitió la realización del trabajo.. 111.

(5) DEDICATORIAS. Primeramente, a Dios por permitirme culminar esta grata etapa de mi vida.. A. mi Madre. Rosa. Dihnora,. por sacarme. adelante. y siempre. apoyarme.. Te. quiero. mamá.. A mi padre Ofelio y mi hermano Eduardo por siempre apoyarme en mis decisiones.. A José Arquímides por siempre. ayudarme. de la. mejor manera y por brindarme. su. amistad.. A mis compañeros de laboratorio Jeravy,. Rafa,. Melissa,. José,. Juan,. Jenny y Mónica. que siempre estuvieron ahí para apoyarme.. A mis amigos Ju/ián, Ana Lucero, Arturo, María José, Daniel, Sergio, /van, José Angel,. José Andrés,. Yulenny, por siempre apoyarme en todo momento. Los amo amigos.. A Luz Andrea por siempre brindarme su ayuda y amistad.. Brenda,. gracias por siempre apoyarme durante todo momento,. gracias por siempre. estar ahí cuando más /o necesité, gracias por ser un pilar muy importante en mi vida, te amo.. Tata, gracias por criarme como tu hijo y formarme como persona de bien,. te extraño. tanto Tata.. A mi mamá Cruz por siempre cuidarme y brindarme todo su amor,. te extraño mucho. mamá Cruz.. IV.

(6) CONTENIDO. FORMA DE APROBACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ii. AGRADECIMIENTOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . .. ¡¡¡. DEDICATORIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iv. LISTA FIGURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . 7. LISTA DE TABLAS . . . . . . . . . . . . . . . . . • • • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . • • • . . . . . . . . . . 8. INTRODUCCIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9. A N T E C E D E N T E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . 10. El Corazón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10. Ventrículo izquierdo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . • • . . . . . . . . 10. Citosinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . 12. Clasífícación funcional de las citosinas. 12. Citosinas de la respuesta de células T cooperadoras. 14. Citosinas de la respuesta Th1. 15. Citosinas de la respuesta Th2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . 15. Citosinas de la respuesta T h 1 7 . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . 16. Citosinas expresadas en el corazón. JUSTIFICACIÓN. 17. 18. H I P Ó T E S I S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . 19. OBJETIVOS. 19. Objetivo General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . • • . . . . . . . 19. Objetivos Especifícos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . • • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19. MATERIALES Y MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . • • . . . . . . . 20. Manejo de animales y recolección de muestras. 20. Extracción del RNA total de ventrículo izquierdo y síntesis de DNA complementario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20. Diseño de oligonucleótidos específicos. 21. Especificidad de los oligonucleótidos utilizados por PCR cuantitativo. 21. 5.

(7) Expresión de las citosinas de la respuesta T h 1 , Th2 y T h 1 7 por PCR punto final. RESULTADOS Y D I S C U S I Ó N. 22. 23. Integridad y pureza del RNA total. 23. Diseño de oligonucleótidos para cada una de las citocinas. 24. Evaluación de la especificidad de los oligonucleótidos para cada una de las citosinas. 27. Expresión de las citosinas en ventrículo izquierdo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30. CONCLUSIÓN. 32. BIBLIOGRAFÍA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33. 6.

(8) LISTA FIGURAS. Figura. Página. 1.. Morfología del corazón h u m a n o .. 1 1. 2.. Análisis de la integridad de las muestras de RNAt.. 24. Alineamiento. múltiple. de. secuencias. nucleótidicas. de. las. 25. nucleótidicas. de. las. 26. nucleótidicas. de. las. 27. Diagramas de temperaturas de disociación de las citosinas T h 1 ,. 28. 3.. citosinas de la respuesta Th 1 .. Alineamiento. múltiple. de. secuencias. 4.. citosinas de la respuesta Th2.. Alineamiento. múltiple. de. secuencias. 5.. citosinas de la respuesta Th 1 7 .. 6.. Th2 y T h 1 7 .. 7.. Productos de PCR obtenidos para cada citosina.. 31. 7.

(9) LISTA DE TABLAS. Tabla. Página. 1 .. Clases funcionales de citosinas. 13. 2.. Características de los RNAt extraídos de ventrículo izquierdo. 23. 3.. Características. para. 24. Temperaturas de disociación de las citosinas de la respuesta. 28. de. los. oligonucleótidos. utilizados. amplificar las citosinas de la respuesta T h 1 , Th2 y T h 1 7 4.. T h 1 , Th2 y T h 1 7. 8.

(10) INTRODUCCIÓN. El corazón es un músculo cardíaco que tiene la función principal es bombear sangre a todo. el. organismo. mezcla. para. compleja. mantener la demanda. de. células,. donde. de oxígeno y nutrientes.. las. más. predominantes. Está. son. compuesto de. los. miocitos. una. cardíacos. (cardiomiocitos). y los fibroblastos. El papel que desempeñan los cardiomiocitos es estructural. y. que. funcional. respuesta. ya. a. quimosinas. sus. son. capaces. cambiantes. desempeñan. un. de. alterar. demandas. papel. sus. procesos. fisiológicas. importante. en. del. la. de. síntesis. corazón,. y. degradación. donde. remodelación. las. cardiaca. en. citosinas. y. y. fisiológica,. principalmente en trastornos patológicos (Berne, 1 9 8 1 ).. Las. citosinas. respuesta. son. proteínas. pro-inflamatoria. de. y. bajo. peso. molecular que juegan. anti-inflamatoria.. Existen. varias. un. papel. familias. de. importante en. citocinas. que. la. se. clasifican por su función biológica, y las citocinas de la respuesta de celulas T cooperadoras. (Th,. T por su maduración es en el timo y h helper, de la traducción del inglés) son una de las. más. importantes.. La. células que median. respuesta. la. Th. provee. actividad citotóxica,. cooperación. y se dividen. con. células. del. sistema. inmune. y. en tres tipos de células T h 1 , Th2 y. T h 1 7 (Berger, 2000; Damsker y col., 2 0 1 0 ) .. La inducción de quimosinas, citosinas pro-inflamatorias y otras moléculas relacionadas como. interleucina ( 1 L ) - 1 13 , factor de necrosis tumoral a (TNF-a), factor de crecimiento transformante. 13. (TGF-131). y factor. nuclear. KB. (NF-KB). son. característicos. de. trastornos. patológicos. del. corazón (Serra y col., 201 O; Murray y col., 2000; Xia y c o l . , 2009). El incremento de citosinas. pro-inflamatorias durante trastornos patológicos está. en. contraste. citosinas. con. corazones. pro-inflamatorias. de. tales. animales. como. IL-6,. altamente. ejercitados. TNF-a,. donde. TGF-131. y. correlacionado con fibrosis,. no. hay. NF-KB,. un. incremento. mientras. que. de. otros. estudios demuestran que citosinas anti-inflamatorias como I L - 1 0 disminuyen. Sin embargo, la. expresión. génica. de citosinas de. rata se desconoce.. de la. respuesta Th1. la. respuesta T h 1 ,. Th2 y T h 1 7 en. ventrículo. izquierdo. de. Por lo anterior, este trabajo plantea evaluar la expresión de las citosinas. (TNF-a, TNF-13,. IFN-y,. I L - 1 13 ) , Th2 (IL-4,. IL-6,. IL 10) y T h 1 7 (IL-17a) en. ventrículo izquierdo de rata por medio de PCR.. 9.

(11) ANTECEDENTES. El Corazón. El corazón humano es un músculo que contiene cuatro cámaras situadas a la izquierda de la. cavidad. torácica,. cuya. función. es. bombear. sangre. a todo. el. organismo. para. mantener. la. demanda de oxígeno y nutrientes. El pericardio exterior, miocardio medio y pericardio interior. son. las tres. capas que. comprenden. la. pared. del. corazón.. conectivo y tejido adiposo que protege el corazón al. está. hecho. de tejido. sanguíneos,. muscular cardíaco. organizado. capilares linfoides y fibras nerviosas,. El. pericardio,. consiste en tejido. reducir la fricción, el miocardio grueso. en. planos. y suministrado. por capilares. y el endocardio se compone de epitelio y. tejido conectivo con muchas fibras elásticas y colagenosas (Berne, 1 9 8 1 ).. El interior del corazón está dividido en cuatro cámaras huecas, con dos a la izquierda. y dos. a. sangre. la. derecha. (Figura. regresándola. ventrículos. y reciben. al. 1 ).. Las. corazón,. sangre. de. la. cámaras. superiores. mientras. que. aurícula. para. las. son. llamadas. cámaras. bombear. hacia. aurículas. inferiores. las. y. son. arterias.. La. reciben. llamados. aurícula. y. ventrículo izquierdo están separados de la aurícula y ventrículo derecho por una pared sólida. llamada septum evitando que la sangre se mezcle (Berne, 1 9 8 1 ) .. La. aurícula. derecha. pequeña (seno coronario),. corazón.. La. pared. del. recibe. sangre. de. la vena. cava. superior,. cava. inferior y la. más. la cual drena sangre al interior de dicha aurícula al miocardio del. músculo. ventricular. derecho. es. más. delgada. que. el. ventrículo. izquierdo, debido a que solo bombea sangre a los pulmones con una baja resistencia al flujo. de. sangre.. Por. otro. lado,. el. ventrículo. izquierdo. bombea. sangre. a. todo. el. organismo. estructuralmente es más corto y tiene mayor forma cónica que el derecho y forma. y. parte de. ápex del corazón (Berne, 1 9 8 1 ) .. Ventrículo izquierdo. El ventrículo izquierdo forma el vértice del corazón, donde la mayor parte de toda su cara y. borde izquierdos dan hacia al diafragma. Debido a que la tensión arterial es mucho más alta. en. la. circulación. sistemática. que. en. la. pulmonar,. el. trabajo que el ventrículo derecho (Moore y col., 201 O).. ventrículo. izquierdo. desarrolla. más. Una de sus funciones principales es. 10.

(12) mantener las válvulas en su lugar durante la contracción del músculo cardiaco y así evitar un. prolapso hacia las aurículas ya que la sangre pasa desde el ventrículo izquierdo a través de. la válvula aortica hacia la aorta ascendente donde esta se dirige hacia las arterias coronarias. que irrigan el corazón (Tortera y Derrickson, 2 0 1 1 ) .. El. participa. ventrículo. en. la. izquierdo. relajación. tiene. la. diastólica. y. capacidad. de. de:. llenado,. 1). 2). relajarse. contraerse. rápidamente. rápidamente. por. lo. que. por. lo. que. participa en la contracción sistólica y de eyección, y 3) aumentar o disminuir su capacidad de. bombeo durante cambios de presión. o volumen. de sangre (Berne,. 1 9 8 1 ).. La. cardiaca, ya sea por cuestiones fisiológicas o patológicas (Grossman y col.,. Leinwand,. durante. 2014;. dichos. activación. Pelliccia. procesos,. crónica. de. c. y. ya. col. ,. q. ue ,. i t osinas. 1991),. se. han. las. conducido. específicas. card íac o y posteriormente la muerte. (N. c i tosin a s. q. ue ,. ian y col . ,. si. desem p e ñ an. estu d ios. no. 2004;. son. M. ehra. en. los. n. u. y. c o l.,. 1975;. papel. cual e s. contr o ladas,. 2005. remodelación. se. levan. l. i. Chung y. mpo rt ante. reporta. a. un. la. allo. f. ).. Cámaras Izquierdas. Auricula derec. Fi. gura. 1 ). las. 1 .. c. Cá. maras huecas. q. ue d i v i den al cora z ón , con dos a la izquierda y dos a la. ámaras superiores ll a m adas aur í cula. y. 2). las cámaras. (Tomado de Berne,. 1 9 8. i. d. erec h a :. nferiores llamadas ventrículo. 1).. 11.

(13) Citosinas. Las. citosinas. son. proteínas. reguladoras. de. bajo. peso. molecular. responden a diferentes estímulos del cuerpo (Salman y Salih, 2 0 1 5 ) ,. o. glicoproteínas. que. las cuales, constituyen. una red de interacciones en la que se conectan distintos tipos celulares y cada una de ellas. induce o suprime su. sinérgica. la. acción. propia síntesis o la. de otras citosinas. de otras. o bien. citosinas.. actúan. Además,. favorecen. de manera. como verdaderos antagonistas. de. sus. efectos biológicos y función reguladora (Filella y col., 2002) Las citosinas son nombradas de. manera. arbitraria. interferones,. citosinas. dependiendo. etc.),. se. y. algunas. formaban. y. de. otras. su. función. son. actuaban. biológica. llamadas. sobre. los. (Factor. interleucinas. leucocitos. por. (Abbas,. de. necrosis. que. se. tumoral,. creía. 2012).. Las. que. las. funciones. principales de las citosinas es estimular la respuesta inmune humoral, respuesta inflamatoria,. regulación de la hematopoyesis y proliferación celular (Salman y Salih, 2 0 1 5 ) .. Las citosinas son producidas en forma limitada y con poca duración, la vida media de. las citosinas depende de su función en el hospedero.. diferentes efectos en la. una sola célula,. Se da el caso que una citosina tenga. misma célula o diferentes citosinas que tengan la. misma acción en. esto último dependiendo del estimulo que haya recibido el cuerpo,. una vez. que la citosina llega a su célula diana produce su efecto o efectos específicos, estas células. diana. responden. al. efecto. de. las. citosinas. produciendo. nuevo. RNA. mensajero. (RNAm). y. proteínas, siendo asl una respuesta biológica especifica (Khan, 2008).. Clasificación funcional de las citosinas. Las citosinas están clasificadas por familias y cada. una de ellas tiene una función. biológica. específica (Tabla 1 ). La familia de las citosinas TNF incluye más de 20 miembros codificados. por. un. gen,. con. un. enfoque. en. la. propiedad. biológica. celular. A pesar de que hay alrededor de 33 citosinas,. incluyendo a I L - 1 a ,. inflamatorias.. IL-1�,. como. lo. es. evitar. la familia de IL-1. ellas. Por otra parte,. induce. biológicas.. La. una. familia. fase. de. tiene. proliferación. 11. miembros,. I L - 1 8 e IL-33, esta familia funciona principalmente como citosinas. la familia de. IL-6,. incluye miembros como. IL-6, factor inhibidor. de leucemia, I L - 1 1 , oncostaina, factor neurotrópico ciliar y cardiotropina-1. de. la. aguda. IL-10. de. proteínas. incluye. a. IL-22. hepáticas. que. se. entre. encarga. otro. de. en donde cada una. tipo. de. inhibir. o. actividades. regular. las. respuestas inflamatorias e inmunes (Dinarello, 2007).. 12.

(14) Tabla 1 . Clases funcionales de citosinas.. Clase Funcional. Propiedades Primarias. Factores de Crecimiento. Otros efectos. Polarización de. Ejemplos. IL-2, IL-4,. IL-7, IL-17, IL-. Expansión clonal. de Linfocitos. Citosinas Th1. ¡ Respuesta Th 1. C itosinas Th2. ¡ Respuesta Th2. Th 1 fTh2fTh 1 7. 15. Expansión Clonal de CTLº. IFN-y, IL-2, IL-12, IL-18. ¡Producción de. IL-4,. IL-5, IL-18, IL-25,. anticuerpo. 23. IL-. Citosinas Th17. ¡ Respuesta Th17, IFN-y. Respuesta autoinmune. ll-17, IL-23, IFN-y. Citosinas pro-. 1 Mediadores. I Respuesta inmune. IL-1a, IL-1�. TNF-a, IL-12,. inflamatorias. inflamatorios. innata. IL-18, IL-23. ¡ Letalidad mediada por. IL-10, IL-13, TGF-�. IL-22,. citosinas. I L- 1 R a, IFN-a/�. ! Enfermedad autoinmune. IL-1a, TNF-a, IL-6, leptina,. pro-aterogénica. adiponectina,. Citosinas anti-. l Genes inflamatorios inflamatorias. Adipocinas. Pro-inflamatorias. Señalización de citosinas. Activación de células B,. IL-6, CTNF, I L - 1 1 ,. LIF,. Factores de crecimiento gp130. fase aguda. CT-1. Activación de células B. BNDF, NGF. Resorción ósea. Estimulación inmune. RANK L. Hematopoyesis. Pro y anti-inflamatorio. Factores de crecimiento. ¡ Células. nervioso. nerviosas/Schwann. Citosinas activadoras de. osteoclastos. Factor de estimu1ación de. IL-3, IL-7, G-CSF, GM-. colonias. CSF, M-CSF. Citosinas angiogénicas. Neovascularización. Pro-metástasis. VEGF, I L - 1 , IL-6, IL-8. Fibrosis. Pro-metástasis. FGF, HGF, TGF-�. BMP. Factores de crecimiento. mesenquimatosos. Incrementar al MHC clase lnterferón tipo. 11. Activación de macrófagos. IFN-y 11. Anti-inflamatorio; antilnterferón tipo I. Anti viral; l MHC clase I. IFN-a, IFN-� angiogénico. Quimosinas, otros. T Migración celular. T Activación celular. IL-8, MCP-1, MIP-1a. Tabla tomada de Dinarello, 2007.. 13.

(15) Citosinas de la respuesta de c é l u l a s T cooperadoras. La respuesta de las células Th (llamadas T ya que maduran en el timo, y "h" de su traducción. del. inglés. las. helper),. cuales. son. un. grupo. de células. que. se dividen funcionalmente. para. proveer cooperación con otras células del sistema i n m u n e y células que median la actividad. citotóxica.. Las. células. Th. expresan. moléculas. CD4. que,. tienen. interactuar con el complejo mayor de histocompatibilidad de clase. vital. para. la activación del sistema inmune (Albelo y col.,. 2013).. la. 11,. función. biológica. de. siendo este un proceso. Está regulada por citosinas. que son responsables por la mayoría de los efectos biológicos del sistema i n m u n e , así como,. inmunidad. mediada. por células y respuestas alérgicas,. donde los linfocitos T,. son la. mayor. fuente productora de citosinas ya que estas células llevan receptores específicos de antígeno. en su superficie que les permite el reconocimiento de patógenos extraños.. Los linfocitos T se. distinguen por la presencia de moléculas de superficie celular conocidas como células CD4 y. CDS,. donde. los. linfocitos. T. que. expresan. CD4. son. conocidos. también. como. células. cooperadoras y a su vez estas se dividen en tres tipos de células Th 1 , Th2 y Th 1 7 (Berger,. 2000; Damsker y col., 201 O).. Las citosinas de la. los T N F " s ,. producen. IL-1. respuesta T h 1. que comprenden. e IL-2 que funcionan durante la respuesta inflamatoria.. IL-4,. IL-5,. IL-6,. IL,9,. IL-10. e. IL-13. que. intervienen. fagociticas e inhibiendo a las mismas (Romagnani, 2000).. la. familia. las citosinas. de. las. IL-17. son. relacionadas. con. la. durante. IFN-y,. la familia. de. Las células Th2 que. proliferación. células. Las células T h 1 7 compuestas por. respuesta. pro-inflamatoria. durante. enfermedades autoinmunes como artritis reumatoide (Hernández, 2009).. La. proliferan. medio. respuesta. a. de. IL-4. anticuerpos.. producción. las. de. diferenciación. células. e. En. por. el. IL 1 3. parte. las. T-citotóxicas. con. caso. IFN-y. de. una. de. de T dentro. de. en. posible. Th17. dirigidas. células. que. por. Th1. medía. enfermedades. participación. tiene. IL-17. I L - 1 7 juega. efecto. que. un. rol. a. en. su. la. actividad. de. autoinmunes.. de. IL-33. Las. regulan. enfermedades. vez. son. importante en. IL-2. e. IFN-y. células. la. Th2. modelos de. por. producción. autoinmunes. reguladas. que. por. con. IL-23.. de. la. La. enfermedades. autoinmunes, en comparación con células T que son producidas por las células Th 1 , ya que. el mismo efecto se da con las células T reguladoras (Treg) que son también controladas por. las citosinas expresadas. por dichas células.. Las células Treg tienen. la función. de suprimir. procesos autoinmunes como el caso de rechazo de injertos en humanos que depende de si. hay una expresión por parte de I L - 1 0 y TGF-[3 (Dinarello, 2007).. 14.

(16) Citosinas. de. la. sanguíneo. por. destrucción. de. citosina. varios. es. la. celulares. y. y. potente. la. del. Histocompatibilidad. del. vía. MHC. de. ante. T. a. CD4,. inducir. Otra. que. puede. activación. misma,. un. de. y. llamada. esta. Hodgkin,. de. de. la. necrosis. alfa,. citosina. de. está. de. de. es. a. la. Se. linfoides. I L - 1 ,. IL-6. ha. por. por. de. una. (Barbara. la. y. col.,. macrófagos. a. la. es. una. durante. su. enfermedades. col.,. Mayor. la. de. regulación. regula. que. alfa. de. la. los. también. con. de. (TNF-a),. actividad. esta. además. especies. citosina. de. regular. reactivas. se. induce. pro-inflamatoria. humanas. 1996).. desarrollo.. como. ser. a. de. sí. 2 0 08 ) .. citosina. y. de. 2008).. tumoral. TNF-a. mononucleares. (Sriskandan. parásitos,. además. sino. es. esencial. activación. (Khan. 1996),. 2013).. es. También. deficiencia. (Khan. y. induciendo. de. en. 11,. tipo. v i r u s,. inflamatorio. col.,. envuelto. Complejo. antígeno,. producción. y. IFN-. 2008). del. necrosis. Esta. celular.. intracelular.. el. causa. 2008).. está. bacterias,. resultado. torrente. 2016),. (Khan,. 2008).. IFN-y,. el. interferones. Hernández.,. que. células. IFN-y. 1. constitutivamente. visto. (TNF-13). por. con. (Khan. presente. (Fragoso. vía. secundarios. los. expresión. Factor. quimosinas,. beta. e. el. tipo. en. col.,. también. de. inmunomodulador. nitrógenos. IL-12. r e l a ci o n a d a. genes. tumorales. de. y. como. que. es. poderoso. producida. por. células. La. y. diferenciación. pató geno. dando. sus. mellitus. causadas. un. para. (Quanhui. familia. (Mata. secretada. Está. Una. artritis. también. en. sangre. envuelta. variación. p s o r i a s i c a,. en. la. genética. linfoma. no. otras.. mastocitos. ayudando. 11. 11. y. aumentada. contra. MHC. liberación. Citosinas de la respuesta Th2.. Th2,. es. MHC. células. tumoral. mediada. 11. y. malignas.. producción. órganos. entre. células. la. y. NK. malignas. expresen. un. intermediarios. (PBMC),. formación. con. e. linfotoxina. periférica. como. a. es. inflamatoria,. proliferación. mononucleares.. I. ( I L - 1 13 ). diabetes. respuesta. pro-inflamatorias. incremento. también. Factor. células. la. células. huésped. a. beta. enfermedades. clase. del. a. pertenece. células. estimula. leucocitos,. (ROS). de. de. citosinas. efecto. ante. antígeno. las. eliminando. causar. oxigeno. que. las. su. del. solo. T,. fagocitos. defensa. no. a. de. realiza. citotóxica,. la. la. de. (MHC). presentación. linfocitos. ayuda. I. linfocitos. cuerpo. la. apoptosis,. (IFN-y),. eliminación. activador. de. 1. inflamatorios. conducen. mediador. como. por. lnterleucina. procesos. que. gamma. activado. para. en. 13. importante. protección. hongos. un. células. lnterferón. producido. para. las. un. Th1.. macrófagos. procesos. El. respuesta. y. células. NK. diferenciación. La. interleucina. (natural. de. killers),. células. T. y. 4. ( I L- 4 ). participa. también. es. en. una. la. citosina. producida. regulación. funciona. como. del. factor. por. sistema. de. células. inmune. crecimiento. 15.

(17) para los linfocitos (Zamorano y col., 2003).. La IL--4 suprime la producción de células T h 1 , es. requerida para la producción de l g E y es la principal citosina que causa el cambio de isotipo. de células B hacia lgG a lgE e lgG4 (Khan, 2008).. La. interleucina. macrófagos,. linfocitos. 6. (IL-6). T y. B,. es. etc.,. producida. tiene. un. por. varios. efecto. tipos. celulares. pro-inflamatorio.. Es. como:. monocitos,. activada. bacterias y también por otras citosinas y la acción de otras citosinas como IL-1. por. virus,. y TNF-a.. La. IL-6 es la principal estimuladora de proteínas de fase aguda. Tiene un papel importante en la. termogénesis corporal y es secretada en el tallo cerebral ya que es muy importante para la. producción. de. las. etapas. finales. para. la. fiebre. (Ramírez. y. col.,. 2010).. Es. regulada. por. factores esteroidales y hormonales (Khan, 2008).. lnterleucina 1 0 ( I L - 1 0 ) , es una citosina anti-inflamatoria secretada por los macrófagos. (Khan,. 2008),. causa. inhibición. de. la. maduración. de. células dendríticas que. esta. a su. vez. causa una reducción de las citosinas pro-inflamatorias lnterferón g a m m a , interleucina 1 , 4 y 5. y factor de necrosis tumoral. alfa.. También funciona como. inhibidor de células Th1. e inhibe. células presentadoras de antígenos (Khan, 2008). Un nivel elevado de I L - 1 0 puede provocar. problemas al momento de combatir una infección microbiana y también se asocia que niveles. bajos de esta interleucina puede llevar a un desarrollo de alguna enfermedad autoinmune e. incluso cáncer (lyer y C h e n g . , 2 0 1 2 ) .. Citosinas. de. inflamatoria. la. respuesta T h 1 7 .. que. mesenquimales. ejerce. al. lnterleucina. principalmente. inducir. la. expresión. su. del. la granulopoyesis y dirigen. Talamás.,. Esta. citosina. regula. IL-6. (IL-17a),. función. es. sobre. factor estimulante. cuales aumentan. 2012).. 17a. una. citosina. células. de. principalmente. mieloides. colonias. y. (G-CSF),. células. en. las. neutrófilos hacia el sitio de infección (Flores y. en. células. de. cartílago,. en. el. líquido. sinovial. y. tejido óseo. Se ha visto también que regula la producción de óxido nítrico y aumenta niveles. del. RNA. mensajero. del. óxido. nítrico. sintasa.. Un. incremento. de. IL-17a. puede. elevar. los. niveles de manera desenfrenada de IL-1 y TNF-a en el cartílago, liquido sinovial y el menisco. y esto a su vez provocar artritis reumatoide (Moseley y col., 2003).. 16.

(18) Citosinas expresadas en el corazón. Las. citosinas. desempeñan. un. papel. importante. principalmente en trastornos. patológicos.. del. acompañados. músculo. cardiaco. están. en. la. remodelación. cardiaca. y fisiológica,. Estudios demuestran que daños o padecimientos. por. la. inducción. inflamatorias y otras moléculas relacionadas como. de. interleucina. p. tumoral (TNF-a), factor de crecimiento transformante. quimosinas,. citosinas. pro. ( I L ) - 1 P , factor a de necrosis. (TGF-P1) y factor nuclear KB (NF-KB). (Serra y col., 201 O; Murray y col., 2000; Xia y col., 2009).. En. contraste,. pro-inflamatorias. corazones de. tales. como. IL-6,. animales. TNF-a,. ejercitados. TGF-P1. demuestran que citosinas anti-inflamatorias como. ejercicio en. y. no. tienen. NF-KB,. incremento. mientras. que. de. citosinas. otros. estudios. I L - 1 0 disminuyen. Además,. la práctica de. un modelo de hiperactividad por P-adrenérgicos atenúa la disfunción cardiaca y. fibrosis mediante la inhibición de citosinas pro-inflamatorias (Ghung y Leinwand,. embargo,. existen. resultados contradictorios que demuestran que. 2014).. IL-6 aumenta en. Sin. musculo. esquelético ejercitado.. Se. ha. sugerido. que. el. mantenimiento. del. embarazo. entre citosinas pro y anti- inflamatorias (Shurin y c o l . ,. embarazo. normal,. la. sobre. regulación. de. la. esta. mediado. por. un. balance. 1 9 9 9 ; Thellin y col., 2000). Durante un. respuesta. inmune Th2. se. encarga. de. regular. varios efectores del sistema inmune celular, incluyendo la respuesta citotóxica y liberación de. citosinas inflamatorias. En contraste, un desbalance en la producción de Th1fTh2 en favor de. Th1. puede. durante. estimula. inducir. estadios. la. inflamatorias. labor. de. tempranos. secreción. (IL-1P,. de. IL-8. parto. del. (Shurin. y. embarazo. citosinas. y TNF-a). Th2. col.,. 1999).. lleva. (IL-10. permitiendo. y. a. la. IL-6). un. La. producción. producción. y. disminuye. balance. positivo. de. de. Th2. citosinas. progesterona. citosinas. durante. Th1. el. y. que. pro. embarazo. (Diehl y Rincon, 2002; Ugwumadu, 2002).. 17.

(19) JUSTIFICACIÓN. El ventriculo izquierdo es. la sección del corazón encargado de bombear sangre a todas las. partes del cuerpo, y en donde su funcionamiento depende de moleculas que participan en su. remodelación estructural. Durante estímulos fisiologicos o patologicos, se ha demostrado que. las. citosinas. de. la. respuesta. Th1,. Th2. y. Th17. participan. en. el. buen. funcionamiento. del. corazón. Sin embargo, la expresión de citosinas de la respuesta Th en corazón de un modelo. de. rata. sana. respuesta. se. desconoce.. Th1(TNF-a,. Por. TNF-13,. lo. IFN-y,. tanto,. este. I L - 1 13 ). PCR en ventriculo izquierdo de ratas sanas.. citosinas. de. la. repuesta. Th1,. Th2. y. trabajo. Th2{1L-4,. IL-6,. Lo anterior,. Th17. en. plantea. evaluar. IL-10). las. citosinas. y Th17{1L-17a). de. la. mediante. permitirá evaluar el perfil génico de. futuros. estudios. con. modelos. de. ratas. sometidas a estrés fisiológico o patológico.. 18.

(20) HIPÓTESIS. Las citosinas de la respuesta T h 1. (TNF-a, TNF-f3, IFN-y, I L - 1 f3 ) , Th2 (IL-4, IL-6, IL 10) y T h 1 7. (IL-17a ) se expresan en ventrículo izquierdo de rata en condiciones normales.. OBJETIVOS. Objetivo General. Amplificar. las. citosinas. de. la. respuesta. Th1. (TNF-a,. TNF-f3,. IFN-y,. I L - 1 f3 ) ,. Th2. (IL-4,. IL-6,. IL 1 0 ) y T h 1 7 (IL-17a) por medio de PCR en ventriculo izquierdo de rata.. Objetivos Especificas. Para cada una de las citosinas de la respuesta T h 1. (TNF-a, TNF-f3,. IFN-y,. I L - 1 f3 ) , Th2 (IL-4,. IL-6, IL 1 0 ) y T h 1 7 (IL-17a):. •. Diseñar oligonucleótidos específicos.. •. Evaluar la especificidad de los oligonucleótidos por medio de PCR cuantitativo.. •. Amplificar el cONA por medio de PCR punto final.. 19.

(21) MATERIALES Y MÉTODOS. Manejo de a n i m a l e s y recolección de muestras. Se. utilizaron. ratas. de. la. cepa. Sprague-Dawley. de. tres. meses. de. edad. (260. ±. 1 O gr). sin. ningún reto experimental. Para el manejo de las ratas se siguieron los cuidados descritos por. el Comité de. uso. Ética de la. de animales de. Universidad de Colima con las bases de la Guía para el cuidado y. laboratorio. (US. Department of health).. Las. ratas fueron. alimentadas y. provistas de agua diariamente en cajas de acrílico, manteniendo un ambiente controlado de. entre 20 y 25ºC con intervalos de 1 2 horas de luz y 1 2 horas de oscuridad.. Para. disectar el. corazón,. las. ratas fueron. sedadas con. pentobarbital. sódico. (50. mg. por kg de peso) vía peritoneal para posteriormente colectar el corazón y separar el ventrículo. izquierdo.. Las muestras se congelaron inmediatamente con nitrógeno líquido y almacenadas. a -80ºC para su posterior uso.. Extracción del RNA total de ventrículo izquierdo y síntesis de DNA complementario. Para. la. extracción. del. RNA. total. (RNAt). se. siguió. el. protocolo. siguiendo. las. instrucciones del fabricante.. Se. homogenizaron. izquierdo. en. 500. el. homogeneizador. (Kinematica),. µL. de. TRlzol. se agregaron. 100. usando. Una vez centrifugado se colectó la fase acuosa en. 300. isopropanol frío. RNA!.. El. pelle!. resuspender. en. concentración. integridad. se. de. RNAt. 50. µL. y pureza. evaluó. y se. del. por. centrifugó. formado. de. 30. agua. RNA. se. a. lavó. con. tratada. total. se. electroforesis. 12,000g. con. 500. gel. µL. de. de. por. (lnvitrogen). de ventrículo. PT. a 12500. 10-35. RPM. GT. por 1 5. un nuevo tubo, se agregaron. min. a 4 ºC. etanol. al. al. 1%. para. 75%. al. absorbancia. agarosa. mg. POL YTRON. dietilpirocarbonato. determinó. en. por 20. TRlzol. a 50. µL de cloroformo frío y se centrifugó. min a 4ºC.. µL de. de. de. para. 0.1 %. a 260. teñidos. presipitar el. finalmente. (DEPC).. y 280nm,. con. Sybr. La. y la. Sale. (lnvitrogen).. Para. eliminar contaminaciones. DNasas utilizando el kit DNase. 1. por. (Roche).. DNA. genómico. Se tomaron 1. O. (DNAg). el. RNAt fue. tratado. con. µg del RNAt el cual se mezcló con. 5 µL de solución tamponada provista por el kit, 1 µL (1 O U de enzima) de la enzima DNase I y. 20.

(22) se. incubó. a 37ºC durante. 15. min. para finalmente. se agregar 2. µL de. EDTA. (0.2. M). para. detener la reacción.. La síntesis de DNA complementario (DNAc) se realizó a partir del RNAt libre de DNAg. utilizando el kit QuantiTec Reverse Transcription Kit (Qiagen) y el oligo dT (50 µM), en donde. se realizó. la. siguiente. mezcla en. un. microtubo:. 1. µg de. RNAt, 2 µL de WipeOut y 2 µL de. agua, y se incubó por 5 min a 42 ºC. Una vez terminada la incubación se agregaron 4 µL de. solución. tamponada. aligo. (50. dT. µM). provista. que. se. por el. incubó. kit,. a 42. 1. µL. ºC. de. la. por 25. enzima transcriptasa. min.. Una. reversa. vez terminada. la. y 1. µL de. incubación. se. almacenó a -20 ºC para su posterior uso.. Diseño de oligonucleótidos específicos. Los. oligonucleótidos. específicos. para. cada. una. de. las. citosinas. se. diseñaron. en. base. a. secuencias nucleotídicas de sus homólogos de Rattus norvergircus depositadas en el banco. de. genes. GenBank.. múltiples. los. en. la. Las. citosinas. herramienta. oligonucleótidos fueron. isoforma.. Las. que. presentaron. bioinformática. diseñados. características. en. Clustal. base. fueron. PCR. de. consideraciones:. 100-250. porcentajes. de. pares. G-C. oligonucleótidos.. de. Todos. 1). de. longitud. bases;. 55-60%;. los. 4). Omega. las. de. 3). Para todos. 20-23. no. formen. realizaron. de. alineamientos. conservadas. el. 2). amplifican. alineación. (Tm). secundarias. sintetizados. por. entre. software. los oligonucleótidos. estructuras. oligonucleótidos fueron. no. utilizando. nucleótidos;. temperatura. se. (ebi.ac.uk!Tools/msa/clustalo/). regiones. analizadas. {biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc).. siguientes. a. isoformas. la. y. cada. OligoCalc. se tomarán. las. fragmentos. de. de. o. -60ºC;. dímeros. compañía. 3). de. lntegrate. DNA Technology (IDT).. Especificidad de los o/igonucleótidos utilizados por PCR cuantitativo. La especificad de los oligonucleótidos utilizados para amplificar cada una de las citosinas fue. evaluada. cada. una. por. de. medio. las. de. PCR. citosinas.. cuantitativo. Se. realizaron. (qPCR). utilizando. reacciones. de. los. amplicones. PCR. cuantitativo. purificados. mezclando. de. lo. siguiente: 7.5 µL de SYBR Green (Bio-Rad), 2 µL del amplicon purificado, 5 µL de agua miliQ. estéril y 0.25 µL (20 uM) de cada oligonucleótido (sentido y antisentido).. 21.

(23) La. (Applied. min;. mezcla. de. Biosystems). 95. ºC. por. 15. reacción. y se. fue. utilizó. las. segundos y 60. colocada. en. el. equipo. Step-One. siguientes condiciones de. ºC. por. 1. minuto. (40. Real-Time. amplificación:. ciclos). con. una. system. 95 ºC. única. por. 10. medición. de. fluorescencia. Para la curva de disociación el programa a utilizar fue: 95 ºC por 1 5 segundos,. 60. ºC. por. 1. especificidad. y. min. de. los. 95ºC. por. 15. segundos,. oligonucleótidos. se. subiendo. determinó. 0.3. mediante. ºC. la. cada. 20. segundos.. temperatura. de. La. disociación. obtenida para cada uno de los amplicones producidos durante la reacción de PCR, siguiendo. la guía establecida por Bustin y col, en 2009 para la publicación de datos de qPCR ( M I Q E de. sus siglas en inglés). Expresión de las citosinas de la respuesta T h 1 , Th2 y T h 1 7 por PCR punto final. Las. citosinas fueron. incluidos. en. la. amplificadas. tabla. 2,. la. mezcla. (equivalente a 150 ng de RNAt),. Q. estéril. reacción. y. 2.5. de. µL. PCR. (20. fue. por medio. µM). de. la. PCR. reacción. punto final. de. PCR. utilizando. fue. la. los. oligonucleótidos. siguiente:. 3 µL. de. cDNA. 1 0 µL de Platinum Supermix (lnvitrogen), 4.5 µL de agua mili. de. colocada. los. en. oligonucleótidos. un. sentido. termociclador. de. y. punto. antisentido.. final. La. (Applied. mezcla. de. Biosystems). utilizando las siguientes condiciones del programa: 94ºC por 3 minutos; seguido de 40 ciclos. con. 94ºC. 72ºC. por. por 30. 7. electroforesis. purificados. segundos,. minutos.. en. gel. utilizando. Los. de. el. 58ºC. productos. agarosa. kit. por 40. al. llíustra. 1.5. segundos. de. %. GFX. PCR. obtenidos. teñidos. PCR. y 72ºC. con. DNA. por 40. segundos. fueron. visualizados. SybrSafe. and. Gel. y. y finalmente. mediante. posteriormente. Band. Purification. fueron. Kit. (GE. Healthcare Lile Science) para su posterior uso en el PCR cuantitativo.. 22.

(24) RESULTADOS Y DISCUSIÓN. Integridad y pureza del RNA total. La. amplificación de. siguiendo. las. extracción. se. RNA. instrucciones. muestran. ribosomales. derecho. integro. e. y. RNA total. las citosinas. 28S,. izquierdo. listo. para. RNA extraído.. para. la. en. del. la. 185. se. presentan. de. bandas. de. la. extracción de. mencionado. RNAt de ventriculo. previamente.. Los. izquierdo. resultados. de. la. 3 y Figura 5, donde se pueden observar los diferentes. RNAs. y. con. protocolo. Tabla. síntesis. inició. cDNA.. ambos ventrículos fue en. transferencia.. fuertes. y. Además,. Tanto. definidas,. la. relación. las. muestras. indicando. 260/280. promedio de 2 ± 0.05,. lo cual. que. de. las. indica. de. el. ventriculo. RNAt. está. muestras. la. pureza. de. del. Este RNA se limpió de gDNA contaminante y se utilizó como templado para la. síntesis de cDNA para posteriormente evaluar la expresión de las citosinas T h 1 , Th2 y T h 1 7 .. Tabla 2. Cuantificación del RNAt de las muestras Control (C) de ventriculo izquierdo.. Muestra de RNA. Concentración (ng/µL). 260/280. 1. 1341.5. 2.06. 2. 365.3. 2.04. 3. 779.3. 2. 4. 339.53. 1.95. 5. 338.9. 2. 6. 164. 2. 1. RNA ribosomal 28s. .... RNA ribosomal 18s. .... 2. 3. 4. 5. 6. Figura 2. Análisis de la integridad de las muestras de RNAt de ventriculo izquierdo en un gel. de agarosa al 1 % teñido con Syber Safe.. 23.

(25) Diseño de o l i g o n u c l e ó t i d o s para cada una de las citocinas. Se. realizaron. alineamientos. oligonucleótidos. bioinformática. base. a. las. específicos. Clustal. regiones. caracteristicas de cada. Con. lo. anterior,. se. para. Omega. no. multiples. cada. (Figura. conservadas. de. una. 2,. 3. secuencias. de. y 4).. Los. presente. en. uno de ellos fue revisada. demuestra. que. los. las. nucleotídicas. citosinas. utilizando. oligonucleótidos. los. la. fueron. alimenamientos,. utilizando. para. diseñar. herramienta. diseñados. mientras. que. el software OligoCalc (Tabla. oligonucleótidos. a. utilizar. cumplen. con. en. las. 3).. las. características optimas para amplificar de manera especifica cada una de las citocinas.. Tabla. 3.. Caracteristicas. de. los. oligonucleótidos. utilizados. de. las. citosinas. de. la. respuesta. T h 1 , Th2 y T h 1 7 .. Nombre del. Tamaño del. Número de acceso al. amplicon (pb). GeneBank. 1 5 5 pb. NM_ 138880.2. 216 pb. NM_012675.3. 196 pb. NM_080769.2. 2 1 4 pb. NM_031512.2. 208 pb. NM_201270.1. 1 9 3 pb. NM_012589.2. 244 pb. NM_012854.2. 194 pb. NM_001106897.1. Secuencia 5'-3' oligonucleótido. Th1 IFN-y IFNgFw1. CTTGGTTTTGCAGCTCTGC. IFNgRv1. GATATCTGGAGGAACTGGC. TNF-a TNFaFw1. GGAACTGGCAGAGGAGGCG. TNFaRv1. GGAGAAGTTCCCAAATGGGC. TNF-Jl TNFbFw1. GTCTCCACCTCCTGAGGG. TNFbRw1. CCTTGTTGGGTACCCCAGC. IL-1 Jl IL 1bFw1. GCTAGTGTGTGATGTTCCCA. IL 1bRv1. GCCTCAAGGGGAAGAATCTA. Th2 IL-4 IL4Fw1. CGGTATCCACGGATGTAACG. IL4Rv1. TGTACCTCCGTGCTTGAAG. IL-6 IL6Fw1. CTTCCAGCCAGTTGCCTTCT. IL6Rv1. GAGAAAAGAGTTGTGCAATGGC. IL-10 IL 10Fw2. GCTGCCTTCAGTCAAGTGAA. IL 10Rv2. GCCAAGCCTTGTCAGAAATG. Th17 IL-17a IL 17aFw2. TTCAGTGTGTCCAAACGCCG. IL 17aRv2. AAAGTCCTCAACTCCCTTAGC. 24.

(26) TNF-a y TNF-b TNF-Q:. ATGAGCACGGAAAGCATGATCCGAGATGTGGAACTGGCAGAGGAGGCGCTCCCCAAAAAG. 60. TNF-�. ATGA-CACCACTTGGACGTCTCCACCTCCTGAGGGTGCTTAG------CACCCCT-----. 48. >>TNFaFl>> >>TNFbFl>>. TNF-a. ATGGGGGGCCTCCAGAACTCCAGGCGGTGTCTGTGCCTCAGCCTCTTCTCATTCCTGCTC. 120. TNF-�. --------CCTGTCTTCCTCCTGGGGCTGCTGCTGGCCCTGCCTCTAG------------. 88. TNf-a. GTGGCGGGGGCCACCACGCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCCCAACAAG. 180. TNF-�. GGGCCCAGGGACTCTCTGGTGTTCG--CTTCTCAGCTTCCAGG---ACAG-CTCACCAG-. 141. TNF-a. GAGG.ñGAAGTTCCCAAATGGGCTCCCTCTCATCAGTTCCATGGCCCAGACCCTCACACTC. 240. TNF-�. -----------------------CCCCCTCAGAAG-CACTTGACCCATGGCCTC------. 171. <<TNFaRl<<. TNF-a. AGATCATCTTCTCAAAACTCGAGTGACAAGCCCGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAA. 300. TNf-�. ----------CTGAAACCTG-----------CCG---CTCACCTTGTTGGGTACCCCAGO. 207. <<TNFbl<<. N-g IFN-al. ATGGCTCGGCTCTGTGCTTTCTTGATGTCCCTGGTGGTGGTGAGCTACTGGTCAGCCTGC. IFN-�1. ATGGCCAACAGGTGGACCCTCCACATTGCGTTCCTGCTGTGCTTCTCCACCACTGCCCTC. 60. rrn-v. ATG----AGTGCT--ACACGCCCCCT---CTTGGTTTTGCAGCTCTGCCTCAl'GGCCCTC. 51. IFN-a:1. TGTCTAGGATGTGACCTGCCTCATACTCATAACCTCAGGAACAAGAGAGTCTTCACACTC. 120. IFN-�1. TCCATCGACTACAAGCAGCTCCAGTTCCGACAJ\.AGCACTAGCATTCGG------ACATGT. 114. IFN-y. TCTGGCTGTTACTGCCAAGGCACACTCATTGAAAGCCTAGAAAGTCTG-------AAGAA. 104. IFN-al. CTGGCACAAATGAGGAGACT-CTCCCCTGTCTCATGCCTGAAGGACAGAAAGTACTTTGG. 179. IFN-�l. CAGAAGCTCCTGAGGCAGCTGAATGGAAGGCTCAA-CCTCAGCTACAGGACGGACTTCAA. 17 3. IFN-y. CTATTTTAACTCAAGTAGCA---TGGATG-CTATG----GAAGGAAAGAGCCTCCTCTTG. 156. 60. >>IFN;FWl>>. .. .. .. IFN-al. GTTCCCTTTGGAGAAGGTGGATGGCCAGCAGATCCAGAAGGCTCAAGCTATCCCTGTCCT. 239. IFN-�1. GATCCCTATGGAGGTGATGCACCCGTCACAGATGGAGAAGAGTTACACTGCCTTTGCCAT. 233. ';1'!AT:}--?:!��--------------. 197. IFN-y. GG---ACGGTAACACGAAAAT. <<IfllgRvl<<. IL-1b. IL-la. ---------AGATCAGCACCTCAC-----------------------AGCTTC-CAGAAT. 363. IL-1�. CTCGTGGGATGATGACGACCTGCTAGTGTGTGATGTTCCCATTAGACAGCTGCACTGCAG. 374. .... .. . . ... .... . . . . . .. . . >>ILlbF'Jl>>. IL-la. AATTTGAGATACAJ\.ATTGAT-AAGGATCGTCAAGCAGGAGTTCATCATGAATGATTCC-C. 421. IL-1�. GCTTCGAGATGAACAACAAA.AATGCCTCGTG---------------CTGTCTGACCCATG. 419. ... .. .. .. . ... .. .... IL-la. TCAACCAAAATATATATGTGGATATGGACAGAATACATCTCAAAGCTGCTTCGTTAAATG. 481. IL-113. TGAGCTGAAAGCTCTCCACCTCAATGGACAGAACATAAGCCAA-----------------. 462. IL-la. ACCTGCAGCTTGAAGTAAAATTTGACATGTATGCCTAC-TCATCGGGAGG-AGACGACTC. 539. IL-1¡3. -----------CAAGTGGTATTCTCCATGA--GCTTTGTACAAGGAGAGACAAGCAACGA. 509. ..... .... ... .. .. . . .. IL-la. TAAATATCCTGTGACT------CTCAAAGTCTCAAATACTCAGCTCTTTGTGAGTGCTCA. 593. IL-113. CAAAATCCCTGTGGCCTTGGGCCTCAAGGGGAAGAATCTATACCT-GTCCTGTGTGATGA. 568. .... ". ..... ". ... ... .. . . . .. . . .. . . ... .. <<ILlbRvl<<. Figura 3. Alineamientos múltiples de secuencias nucleótidicas de las citosinas T h 1 . En. amarillo se indica la secuencia de nucleótidos usada para el diseño de oligonucleótidos. específicos. y. los asteriscos indican las regiones conservadas entre secuencias.. 25.

(27) IL-4,. IL-6. e. IL-1 O. IL-10. AT---GCCTGGClc;\GCACTGCT;JGTTGCCTGCTCTTACTGGCIGGAGTGAAGACCAGC. 57. IL-4. AT---G--GC--------------------------------------------------. 5. IL-E. ATGAAGTTTCTCTCCGCA-----------------------------AGAGACTTCCAGC. 31. ••. • »IL6!\ll». 112. IL-10. AAAGGCCATTCCATCCGGGGTGACAATAACTGCACCCACTTCCCAGTCAGCCAGA----. IL-4. ---------------------�---TCTCAGCCCCCACCTTGCTGTCACCCTGTTC--. 36. IL-6. C'..GTTGCCT-----------------TCTTGGGACTGATGTTGTTGACAGCCACTGCCTT. 74. . . . .. .. •. >>IL10i\12>>. IL-10. ------CCCACAIGCTCCGAGAGCTGAGGGCIGCCTTCAGTCAAGTGAAGACTTTCTTTC. 166. IL-4. TGCTTTCTCAIATGTACCGGGAAC-------GGTATCCACGGATGTAACGACAGCCCTCT. 89. IL-6. CCCTACTTCACAAGTCCGGAGAGG-------AGACTTCACAGAGGATACCACCCACAAC-. 126. ••. • •. .. • • • •. ... .... ... .. >>IL4F-,:1>>. ;;. ;;. i1 ;e;. '1GCACCAGCTCQO_li0JACTG-CIGACAGATTCCITACIGCAGGACTTIAAG. 225. IL-4. G--AGACAGAICATCAACACTTTGAACCACGTC1i.CAGA----------------AAAAGC. 131. IL-6. -------AGAC------CAGTATATACCACTTCACAAG----------------TCGGAG. 157. IL-10. •. ••••. ••. •. ••. <<IL10Rv2<<. 263. IL-10. GG----TTACTTGGGTTGCCA-AGCCTTGTCAGAlv.IGATCA-----------------A. IL-4. GA----cTCCA------TGCACCGAGATGTTTGT-------------------ACCAGAC. 162. IL-6. GCTTAAttACATATGTTCICAGGGACAICITGGAAATCAC�CACT!CTGCM.�. 217. •. •. ••. •. • •. •. • <<IL6Rv1<<. IL-10. GTTTTACCTG-----GTAGAAGTGATGCCCCAGGCAGAGAACCATG------GCCCA--. 309. IL-4. Gl'CCTTACGCC---AAO.------AGGAACACO.CGGAGAAcc;..CCTCAI--C'IGCAG-. 209. IL-6. ATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGCACT-GTCAGAAAACAATCTGAAACTTCCAGAA. 276. •. • •. •. •. •. •. . . . . .. . .. ••. IL-10. -------GAAATCAAGGAGCATTTG--------AATTCCCTGGGAGAGAA--------GC. 346. IL-4. -------GGCTTCCAGGGTGCTTCGCAAATTTTACTTCCCACGTGATGTACCTCCGTGC!. 262. IL-6. ATACAAAGAAATGATGGATGCTTCCAAACTGGATATAACCAGGAAATTTGCCT-----AT. 331. •. •. ••. ... ••. .... ... IL-10. TGAAGA----------cCCTCTGGATACAGCTGCGACGCTGTCATCGATTTCTCCCCTGT. 396. IL-4. TGAAGAACAAGTCTGGGGTTCT=GAACTGAGGAAACTC-TGTAGAGGTGTCAGCGGT. 321. IL-E. TGAAAATCTGCTCTGGTCTTCTGGAGT----TCCGTTTCTA-CCTGGAGTT--------T. 378. .. . . . .. . .. . .. •. ••. .. .... ... •. Figura 4. Alineamientos múltiples de secuencias nucleótidicas de las citosinas Th2. En. amarillo se indica la secuencia de nucleótidos usada para el diseño de oligonucleótidos. específicos y los asteriscos indican las regiones conservadas entre secuencias.. 26.

(28) IL-17a IL-17c. CTCTCTCACGGGCAGGCTCCTCCGCACCTGCTAACTCGAAGTGCCAGGTGGGAGCAGGCC. IL-17a. CTAC--AGTG--AAGGCAGC---GGTACTCATCCCTCAAAGTTCAGTG-----------. 160. IL-17f. 222. CATC--AGCTCGGGAGCAGC---TCGGAGGA-ACCCCAAAGTAGGGCTT----------. 107. IL-17b. CTTG--GCCC--CT-GGGCCTCACCAGGTG-CCGCTGGACCTGGTGTCTCGAGTAAAGCC. 205. IL-17d. CGGG--ACTG--CGCGGACCGGCCGAGGAGCTCACTGGAGCAGCTGTACGGCGGCTGGCC. 155. .. '. '. IL-17c. CTCCCTGTGGCCCTAGT-----GGCCAGT--CTGGAGGCCACAGGCCGCAGGAGACAGCA. 275. IL-17a. -------TGTCC-AAACGCCGAGGCCAATAACTT---TCTCCAGAACGTGAAGGTCAACC. 209. IL-17f. --TCTGCTCTGCAGAAAGCCG------GGAACTGCCCTCCCCTGGAGGA---TAACAGTG. 156. IL-17b. CTA-----CGCCCGAATGGA------AGAG---TAC--------GAGAGGAACCTTGGCG. 243. IL-17d. GG--------CCGGCCTGCC------AGCGCCTTCCCA--CCAACACCTGCAGCTCGGGC. 199. ' >>IL17aFW2>>. IL-17c. AGAAGGACCTCTACCTGGAACACAGT-GCCCCGTGCTGCGGCC-AGAGGAGGTGC----. IL-17a. TGAAAGTCCTC------------AACT--CC----CTTAGCTCAAAAGCGAGCTCCAGAA. 251. IL-17f. TGAGAGTTGAC------------ATTCGCAT----CTTCAATCAAAACCAGGGCATTTCT. 200. IL-17b. AGATGGTGGCCCAGCTGA---GGAACAGCTCTGAGC--CAGCCAAGAAGAAGTGTGA--. 295. IL-17d. ---CGCGCGAGCAGGCGC---GCAATGCCACCCTGC--CCGGCCGGGGCAGGTCCNACGA. 251. '. 328. •. '. <<IL17aRv2<<. Figura 5. Alineamiento múltiple de secuencia nucleótidica de la citosina T h 1 7 . En amarillo se. indica la secuencia de nucleótidos usada para el diseño de oligonucleótidos específicos y los. asteriscos indican las regiones conservadas entre secuencias.. Evaluación de la especificidad de los oligonucleótidos para cada una de las citosinas. La. especificidad de. los oligonucleótidos utilizados para amplificar cada una de las citosinas. se realizó por qPCR utilizando los productos de PCR purificados para cada una de ellas.. productos. ( I L 17a). obtenidos. presentan. para. las. citosinas. de. dicion. a. 7. -. 5. a. am. p. li. fi. cación. ,. m. l con una temp. ·e. se. atribuye. a. e. ientras. rat. la. u. isoci. a. ci. ó. n en. especificid. e. er mental. xp. i. a. promedio de. d. de. los. Para. ue. ó. 8. q. p. 7. -. formación. que las curvas de disociaci. la. q. ra de. resultados obtenidos debido a. d. (TNFa,. TNFb,. IFNg. y. IL 1 b},. 5. las citosinas TNFa,. ara. ·e. de. TNFb. (. d meros í. t. .. 8. l. p. ).. L. de. re. g. IL 1. se. b. i. go. nucle. ó. L1. ob. os picos ad c. oli. s. y. I. a. se. io. tido. 7. n. a. ó. tidos. un. p. uti i l. e. z. q. ue. i. ados. a. pico adici. d. em. á. s. o. su. nal. ,. l. o. preci. le. s. lo. s,. entan un solo p co. ño. a. y. ob. un. sió. r. cua. una. p. y Th17. y. e. m. no. e. p. r. p. pi. p. es. a. ue. s. los. a. eratura. A. co. ura. ect. dos m. re. o. pe at. af. mp. b.. ta. un solo. rv a. equeñ. t. l. t. esul. n. se. con. -200. s. (IL6). de los productos. se. rv. ·e para los productos esperado de. n muestran. oligonuc e. IFN. Figura 7. ue las mues ras. 6 1. ,. IL6 y. Th2. ·e. una sola temperatura de desnaturalización de 8 6 . 1 8. amplificados (Tabla 4 y Figura 6).. pico. Th1. Los. e. d. r de. st an. roducibili. r. d. a. d. .. 27.

(29) Tabla 4. Temperaturas de disociación de las citosinas de la respuesta T h 1 , Th2 y T h 1 7. Citosina. Temperatura de disociación (Tm). No. de picos. Th1. TNF-a. 88.12ºC. TNF-P. 88.44ºC. IFN-y. 83.64ºC. Th2. IL-6. 83.79ºC. Th17. IL-17a. 88.27°C. 28.

(30) A). ... .,. e. ". �. � 4. s ••. 1 " 8. • �. ••. ... .. Temperatura. .,... .... ••. .... nt.e. l'SI. .... Tm: 83.64. re). __.. ..... ••. Tm: 84.84. TNF-b. 1. 1. 1. 1. 1. II U I. ••. Tem. ,. ... raurra. •e. 1$... .... . ... . ... Tm:88.12. 1. 1. 1. 111 .1. R .I. •1. N.I. ,0 .1. .,... "''. Temperatura (ºC). Figura 6a. Diagramas de temperaturas de disociación de las citosinas T h 1. Tm: 88.42. (A), en donde. cada gráfico muestra la amplificación específica de un solo fragmento de DNA.. 29.

(31) 8). IL-17a. ... ..•. i. �. j. ••. o. 1. i .!:. ... ••. f �. l. �. .. ••. •... ... ". ". n•. N .t. Figura. 6b.. donde. de. gráfico. Expresión. La. los. expresión. cDNA's. ellas.. En. IL 1 b ). Th2. y. y. 2 0 1 1 ). etapas. muy. una. ha. 7. (IL 17a). la. las. que. en. Estudios. i m p o rt a n t e. las. tienen. un. fueron. las. ... .... ••. ••. ••. de. disociación. y. los. fue. los. en. amplificadas. de. por. -200. en. un. de. pb.. PCR. Las. ventrículo. solo. ••. Th2. (B). y. Th17. fragmento. de. (B).. en. DNA.. izquierdo. PCR. oligonucleótidos. de. citosinas. ventrículo. evaluada. productos. tamaño. las. especifica. citosinas. citosinas. de. ••. Tm: 83.79. punto. final. utilizando. correspondientes. purificados. citosinas. izquierdo,. para. Th1. para. cada. (TNFa,. mientras. uno. cada. una. que. las. una. de. TNFb,. de. las. IFNg. y. citosinas. IL6.. en. citosinas. de. una. estadios. que. estudios. no. con. modelos. amplificadas,. respuesta. normales. demostraron. ya. de. .L. T•mper•tur., {"C). amplificación. muestran. demostrado. que. de. la. sintetizados. se. cuales. tempranas. mientras. 2001).. los. amplificó. Se. col.,. Figura. Th17. solo. cada. previamente. la. citosinas,. de. .,_.. temperaturas. muestra. t. rff. Tm: 88.27. Diagramas. cada. .... .,... ••. Tempe.-.tura ('C). f. r. que.. regula. la. no. en. como. inflamatoria. hay. ratas. una. rata. IL-10,. en. de. daño. (Kasama. hay. tejido. expresión. con. i n fi l t r a c i ó n. de. en. de. el. neutrófilos. una. del. y. col.,. expresión. intestino. esta. el. de. Chaudhry. IL-10. grueso. interleucina. miocardio. y. 1995;. IL-10. e. incremento. durante. hígado,. (Moore. juega. de. y. un. y. col.,. papel. TNF-a. en. 30.

(32) plasma. (Yang. y. col.,. expresión de I L - 1 0. 2000).. atenúa. la. Krishnamurthy. producción. y. su. grupo. de. estudio. demostraron. de citosinas pro-inflamatorias como. que. la. I L - 1 13 y TNF-a. post infarto al miocardio en el ventriculo izquierdo de rata. También se ha demostrado que en. corazón de ratón un incremento de IL-4 puede inducir a la sobre expresión de mastocitos y a. su. vez. causar. embarazadas. fibrosis. se. ha. cardiaca. (Peng. comprobado. IL-4. y. col.,. 2015).. presenta. un. Por. leve. otro. lado,. aumento. en. estudios. suero. en. mujeres. durante. etapas. tempranas de un embarazo normal y disminuye a medida que el embarazo avanza (Omu y. col.,. 1999;. Vílchez. y col.,. 2000),. demostrando. así. que. una. expresión. de. IL-10. e. IL-4. en. corazones normales de rata puede significar un daño importante en el músculo cardiaco.. Estudios. en. modelos. de. rata. con. infarto. al. miocardio,. hipertrofia. del. ventrículo. izquierdo e isquemia, han mostrado que los genes expresados para las citosinas T h 1. a,. IFN-y. control. e. I L - 1 13 ). (Ono. cardiacas. y. tuvieron. col.,. crónicas. un. 1998).. se. ligero. aumento. Mientras. encontró. un. que. en. en. la. un. modelo. desequilibrio. de. expresión. TNF-a,. producción excesiva de TNF- 13 (Asselbergs y col., 2007).. por. Sato. humanos. izquierdo,. y. col.,. (1999),. aumenta. corroboran. que. la. expresión. que,. en. pacientes. que. permanece en condiciones moderadas sin. no. han. comparación. humanos. que. con. puede. Por otro lado,. de. considerablemente durante daños al. mientras. de. en. IL-6. corazón. sufrido. producir Proteína. en. las. ratas. enfermedades. desencadenar. una. estudios realizados. plasma. sanguíneo. producido en. ningún. a. (TNF. daño,. C reactiva.. de. el ventrículo. esta. citosina. Se ha demostrado. también, que en musculo cardiaco infartado de rata I L - 1 7 a aumenta su expresión regulando. el. incremento. de. IL-6. durante. este. padecimiento,. mientras. que. en. músculo. cardiaco. no. infartado I L - 1 7 a , se muestra en niveles normales (Ávalos y col., 2 0 1 2 ) .. • al. ....... .e. .... ..!i. Figura 7. Productos de PCR obtenidos para cada una de las citosinas. Gel de agarosa al. 1 . 5 % teñido con SybrSafe.. 31.

(33) CONCLUSIÓN. Las citosinas de la respuesta Th1. (TNF-a, TNF-�. IFN-y, I L - 1 � ) . Th2 (IL-6) y T h 1 7 ( I L - 1 7 a ) se. expresan en ventrículo izquierdo de rata sugiriendo que el corazón necesita de estas para su. función. normal.. izquierdo. en. un. Con. lo anterior,. modelo. se. puede evaluar el. experimental. de. rata. como. perfil de dichas citosinas en ventriculo. lo. es. la. hipertrofia. cardiaca. fisiológica. inducida por el embarazo, y su proceso reversible el posparto.. 32.

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