implicaciones fisiopatológicas
FEDERICO MAYOR MENÉNDEZRESUMEN
Las quinasas de receptores acoplados a proteínas G (GRKs) represen-tan un imporrepresen-tante punto de convergencia de diferentes rutas de señaliza-ción. Las GRKs participan, junto con las arrestinas, en la regulación de re-ceptores acoplados a proteínas G (GPCR), una familia de centenares de proteínas de membrana de gran importancia fisiológica y farmacológica, y pueden también desempeñar un papel en la propagación de señal, contri-buyendo a ensamblar complejos multimoleculares en el entorno del recep-tor, actuando como proteínas adaptadoras («scaffold») gracias a su inter-acción con diversas proteínas implicadas en señalización celular. Además, las GRKs (y en particular la ubicua isoforma GRK2), pueden también fos-forilar ciertos receptores tirosina-quinasa y un número creciente de sus-tratos no-GPCRs, sugiriendo que estas proteínas podrían tener diversas fun-ciones efectoras. Otras interacfun-ciones funcionales descritas están implicadas en la regulación de la expresión, degradación, localización y actividad de las GRKs. Dado que los niveles y/o funcionalidad de GRK2 están altera-dos en diversas e importantes situaciones patológicas, como fallo cardia-co cardia-congestivo, inflamación o ciertos tumores, el mejor cardia-conocimiento de las redes de interacciones de esta proteína («interactoma) permitirá desvelar la contribución de GRK2 a procesos celulares básicos, y entender cómo sus alteraciones en condiciones patológicas pueden participar en el desen-cadenamiento o desarrollo de diversas enfermedades cardiovasculares in-flamatorias o neoplásicas, así como evaluar su potencial como diana diag-nóstica y/o terapéutica.
SUMMARY
G protein-coupled receptor kinases (GRKs) represent an important point of convergence of different signalling routes. GRKs participate together with arres-tins in the regulation of multiple G protein-coupled receptors (GPCR), a family of hundreds of membrane proteins of key physiological and pharmacological importance.Thanks to their ability to interact with a variety of proteins involved in cell signaling, GRKs (and in particular the ubiquitous GRK2 isoform) can also play a role in signal propagation by helping assemble macromolecular sig-nalosomes in the receptor environment thus acting as agonist-regulated adaptor scaffolds. Moreover, GRK2 can also phosphorylate certain tyrosine kinase re-ceptors and a growing number of non-GPCR substrates, thus suggesting that these proteins could have diverse «effector» functions. Other functional inter-actions have been shown to be involved in the regulation of GRK2 expression levels, degradation, localization, and activity. Since GRK2 levels/functionality are altered in a variety of important pathological conditions, such as heart fai-lure, inflammation or certain tumours, a better knowledge of the GRK2 protein interaction network (interactome) would help to unveil the contribution of GRK2 to basic cellular processes, to understand how its alteration in pathological con-ditions may participate in the triggering or development of several cardiovas-cular, neoplastic or inflammatory diseases and to evaluate its potential use a diagnostic and/or therapeutic target.
INTRODUCCIÓN
GRK2 es un miembro ubicuo de la familia de las quinasas de receptores acoplados a proteínas G, un grupo de siete serina/treonina quinasas que especí-ficamente reconocen y fosforilizan receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) activados, conduciendo a la desensibilización del receptor (1,2). Como se resu-mirá a continuación, nuevas evidencias indican que, además de una importante función reguladora de GPCR, GRK2 parece desempeñar un papel central e in-tegrador en muchas cascadas de transducción de señal. La complejidad de esta red de interacciones funcionales («interactoma») de GRK2 predice que altera-ciones en sus niveles y/o actividad, como las presentadas en diversas patologí-as cardiovpatologí-asculares, inflamatoripatologí-as o neoplásticpatologí-as relevantes, pueden tener efec-tos importantes en la señalización celular. En este capítulo se discutirá cómo un mejor conocimiento del interactoma de GRK2 y de sus consecuencias funcio-nales puede ayudar a comprender mejor los mecanismos y señales que
deter-minan sus niveles de expresión y actividad y sus alteraciones durante la evolu-ción de varias enfermedades, así como evaluar el efecto de dichas alteraciones en la compleja red de las funciones celulares y fisiológicas de GRK2.
CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DE LA FAMILIA GRK Las GRKs constituyen un grupo de proteínas S/T quinasas (siete miembros en los mamíferos) que específicamente reconocen y fosforilizan GPCRs activa-dos por agonistas y comparten una arquitectura de dominios funcionales similar (2-4). Los miembros de la familia GRK pueden ser subdivididos en tres grupos principales basados en homología de secuencias: la familia ropsodina quinasa o GRK visuales (GRK1 y GRK7), la subfamilia de la quinasa del receptor β -adre-nérgico (GRK2/GRK3), y la subfamilia GRK4 (GRK4, GRK5 y GRK6). GRK2, 3, 5 y 6 están expresadas ubicuamente en los tejidos de los mamíferos.
Las GRKs comparten una arquitectura estructural común (ver Figura 1), con un dominio catalítico central bien conservado (~270 aa), similar al de otras se-rina-treonina quinasas, flanqueado por un dominio N-terminal (~185 aa) y un dominio carboxilo-terminal de longitud variable (~105-230 aa). Se ha sugerido que el dominio N-terminal es importante para el reconocimiento del receptor y el anclaje a la membrana. Esta región contiene también un dominio RH (Regu-lator of G protein signalling homology domain) de ~120 aa. En el caso de las GRK2 y GRK3, se ha demostrado que el dominio RH interactúa específicamente con miembros de la familia Gαq, bloqueando de este modo su interacción con su efector, la fosfolifasa C beta. La región C-terminal de GRK2 contiene un ‘pleckstrin homology domain’ (PH) que permite su unión a fosfolípidos tipo PIP2 y a subunidades Gβγlibres, y que está por tanto implicado en su translo-cación dependiente de agonista a la membrana plasmática (2,4).
La estructura cristalina de GRK2 en complejo con subunidades β1γ2 de pro-teínas G proporcionó nuevos elementos para comprender la regulación de las GRKs, situando sus tres regiones diferenciadas (dominios RH, quinasa y PH) en los vértices de un triángulo, en un excelente ejemplo de cómo múltiples do-minios modulares se integran en una única molécula para transducir y regular vías de señalización (5). La estructura del dominio quinasa de GRK2 es pare-cida a la presentada por otras quinasas. Curiosamente, el dominio RH puede interactuar con los dominios quinasa y PH, sugiriendo una importante función en la regulación de la actividad de la quinasa. En el complejo, las característi-cas de la interfase de los dominios RH-PH indican que puede existir una regu-lación alostérica entre estas dos regiones. Por tanto, cambios en la
conforma-ción de los dominios RH o PH provocados por interacciones proteína-proteína o por fosforilación podrían llevar a cambios en la actividad catalítica vía su in-terfaz con el dominio quinasa. Además de esta arquitectura general, las investi-gaciones en curso que se discuten más adelante están dando a conocer la loca-lización de regiones implicadas en la interacción con distintas proteínas celulares y de puntos de fosforilación reguladora en la estructura de GRK2 (Figura 1 y referencias 2 y 4).
FUNCIÓN CARACTERÍSTICA DE GRK2: REGULACIÓN DE GPCR La fosforilación mediada por GRKs es uno de los mecanismos bien carac-terizados para la desensibilización de los GPCR. Concretamente, se ha mostra-do que GRK2 fosforila una gran variedad de GPCR ocupamostra-dos por agonistas, in-cluyendo receptores α y β-adrenérgicos, de angiotensina, endotelina,
FIGURA1. Representación esquemática de los dominios funcionales de GRK2. La quinasa muestra
tres dominios bien diferenciados: el catalítico, con homología a otras serina/treonina quinasas; una zona de homología con proteínas RGS (RH, del inglés RGS-Homology domain); y una región C-terminal que incluye un dominio de homología a plecstrina (PH) y otro de asociación a subunidades Gβγ de las proteínas G. Se muestran también las regiones implicadas en la interacción con diversas proteínas celulares identificadas hasta el momento, y los residuos
prostaglandina, esfingosina-1-fosfato o de quimioquinas, entre otros. La fosfo-rilación del receptor mediada por GRK2 provoca la unión de proteínas citosó-licas denominadas arrestinas, que bloquean la capacidad de los GPCR de inter-actuar con proteínas G, conduciendo a una rápida desensibilización. Como resultado de la unión de β-arrestinas, los receptores fosforilados son el objeto de endocitosis mediada por clatrina, un proceso que finalmente re-sensibiliza y recicla los receptores a la membrana plasmática, y que puede además ayudar a potenciar la activación de caminos de señalización adicionales, en los que las arrestinas y/o GRKs actúan como adaptadores («scaffolds») regulados por ago-nistas (ver referencias 2, 6 y 7). En este aspecto, se ha mostrado que las β -arres-tinas pueden reclutar diferentes moléculas señalizadoras, como c-Src, JNK-3, componentes de la cascada Raf/MEK/ERK, la fosfodiesterasa PDE4, el regula-dor del citoesqueleto Ral-GDS, componentes de la vía de señalización NFκB o la ubiquitina ligasa Mdm2, entre otros, al complejo del receptor (revisado en 8,9). Por lo tanto, el reclutamiento de arrestinas mediado por GRK es funda-mental para provocar la modulación de importantes cascadas de señalización in-tracelular por GPCR.
GRK2 TAMBIÉN FOSFORILA SUSTRATOS NO-GPCRS
Es muy interesante destacar que datos recientes muestran que GRK2 pue-de también interactuar funcionalmente con otros tipos pue-de receptores pue-de mem-brana, como los receptores de PDGF o EGF con actividad tirosina-quinasa. La fosforilación del receptor PDGF-R por GRK2 reduce la actividad del mismo (10, 11). Por otro lado, la presencia de EGF fomenta la asociación de su recep-tor con GRK2, seguida por la fosforilación de GRK2 en residuos de tirosina, llevando a la activación de la quinasa y a una mayor «downregulation» de re-ceptores de opiáceos co-expresados (12).
Además, con una activa participación de nuestro laboratorio, están siendo identificados un número creciente de sustratos citoplásmicos de las GRKs, es-pecialmente de GRK2. Entre ellos se encuentran tubulina, sinucleína, fosduci-na, la proteína ribosomal P2, una subunidad del canal epitelial de sodio, la pro-teína del citoesqueleto ezrina, la propro-teína de unión a calcio DREAM, o la p38 MAPK (4). GRK2 también inhibe la parada de crecimiento celular y la apop-tosis promovida por TGF en células de hepatoma promoviendo la fosforilación de Smads (13). En términos generales, los datos sugieren que GRK2 puede te-ner funciones «efectoras» y participar en la regulación de diversos procesos ce-lulares a través de la fosforilación de sustratos funcionalmente muy variados.
INTERACCIONES DE GRK2 INDEPENDIENTES DE SU ACTIVIDAD QUINASA
GRK2 pueden también contribuir, además de a estos procesos dependientes de su actividad catalítica, a modular respuestas celulares de forma independien-te de la fosforilación, gracias a su capacidad de inindependien-teractuar con varias proindependien-teínas implicadas en señalización y tráfico celular, como las subunidades Gαq y Gβγ de las proteínas G, la enzima PI3K, clatrina, GIT, caveolina, MEK, AKT, y RKIP (revisado en referencias 2-4). Por ejemplo, se ha sugerido que la interacción de GRK2 con PI3Kgamma facilita su reclutamiento a la membrana en respuesta a agonistas adrenérgicos, contribuyendo a la endocitosis y desensibilización del re-ceptor (14). La asociación GRK2/MEK parece ser importante para el control de la inducción por quimioquinas de la activación de MAPK (15). Uniéndose a MEK, GRK2 podría interferir (a nivel global o en localizaciones sub-celulares definidas) con la asociación de MEK a proteínas importantes para su localiza-ción celular, internalizalocaliza-ción o actividad, como los ‘scaffolds’ MEK-ERK. Por otro lado, dado que las proteínas GIT pueden interactuar con diversas moléculas de señalización implicadas en muchos procesos celulares como dinámica del ci-toesqueleto, tráfico de membranas o adhesión celular (16), hemos mostrado re-cientemente que la interacción dinámica GRK2/GIT1 está involucrada crítica-mente en la modulación de procesos de migración de células epiteliales (17).
INTERACCIONES FUNCIONALES REGULATORIAS
La interacción de GRK2 con otras proteínas celulares parece estar implicada en la regulación de sus niveles de expresión, localización y actividad (2, 7, 9).
Modulación de la localización subcelular de GRK2
GRK2 fue inicialmente caracterizada como una enzima soluble que inter-actuaba pasajeramente con el lado citosólico de la membrana plasmática tras la activación de GPCR. El control de la actividad de GRK2 y de su reclutamien-to a la membrana parece implicar tanreclutamien-to la interacción de dominios N- y C-ter-minales de la quinasa con diferentes proteínas celulares (como dominios intra-citoplasmáticos de GPCR, subunidades Gbetagamma, subunidades Galphaq/11 y lípidos de la membrana plasmática), como la fosforilación por distintas qui-nasas, que podrían aumentar (PKA, PKC, Src) o disminuir (MAPK) la unión a
la membrana y/o la actividad catalítica de GRK2 (2, 18, 19). Por otra parte, la distribución subcelular basal de esta quinasa parece ser más compleja, ya que también se ha encontrado en otros compartimentos celulares, sugiriendo que existen múltiples mecanismos que regulan el tráfico entre los diferentes reser-vorios de esta proteína. Así, cantidades significativas de GRK2 están asociadas específicamente con membranas microsomales a través del dominio N-terminal (20), y GRK2 co-localiza en endosomas con receptores beta2-adrenérgicos in-ternalizados tras la estimulación por agonista (21). En este aspecto, GRK2 pue-de interactuar directamente con clatrina vía un «clathrin box» presente en la re-gión carboxilo-terminal de GRK2. Además, está quinasa puede asociarse a proteínas del citoesqueleto como tubulina y α-actinina, y, como muchas prote-ínas implicadas en la transducción de señales, GRK2 está también presente en fracciones ricas en caveolina de las membranas celulares (2-4).
Regulación de la actividad de GRK2
La actividad de las GRKs está estrechamente modulada por múltiples me-canismos. Los procesos reguladores incluyen fosforilación por distintas quina-sas como c-Src, PKA, PKC o ERK1/2 (revisado en 2) e interacción con varias proteínas. La asociación con α-actinina, actina, calmodulina, caveolina, el inhi-bidor de Raf RKIP, o con un componente de la membrana microsomal sin iden-tificar modula negativamente las funciones catalíticas de GRK2. La fosforila-ción de GRK2 en determinados residuos de tirosina o de serina está cobrando importancia como un mecanismo clave para modular dinámicamente su inter-acción con otras proteínas celulares. La fosforilación de tirosinas por c-Src pa-rece aumentar la interacción de GRK2 con Gαq (4) y con la proteína adapta-dora GIT1 (17). Por otro lado, ERK1/2 fosforila GRK2 en la serina 670, perjudicando fuertemente la interacción GRK2/Gβγ e inhibiendo la transloca-ción de la quinasa y su actividad catalítica, mientras modula también la inter-acción de GRK2 con GIT1 (2,17).
Regulación de la expresión de GRK2
Se conoce poco acerca de los mecanismos que controlan la transcripción de GRK2. En células de músculo liso de aorta, los agentes que inducen vasocons-tricción fisiológica e hipertrofia aumentan de forma notoria la actividad del pro-motor de GRK2, mientras que las citoquinas pro-inflamatorias promueven el
efecto contrario, sugiriendo que la expresión de GRK2 está fuertemente con-trolada a nivel transcripcional por la interacción de varias vías de señalización (22). Sin embargo, es necesario determinar si estos mecanismos pueden apli-carse a otros tipos de células.
Por otra parte, nuestro grupo ha mostrado que la regulación de la estabili-dad de GRK2 puede proporcionar un importante mecanismo para modular sus niveles de expresión. GRK2 se degrada rápidamente por la vía del proteasoma, y la activación de receptores β2AR incrementa la ubiquitinación y recambio de la quinasa (2, 23). Nuestro laboratorio ha mostrado también que la unión de arrestina a GPCRs activados promueve la degradación de GRK2 al permitir el reclutamiento de c-Src y la fosforilación de GRK2 en determinados residuos de tirosina (23). La fosforilación por MAPK también promueve la degradación de GRK2 en un proceso también dependiente de la función de β-arrestina (24). Más recientemente, hemos demostrado que Mdm2, una E3-ubiquitina ligasa impli-cada en el control del crecimiento celular y la apoptosis, desempeña un papel crítico en el recambio de GRK2 (25). La asociación de Mdm2 y GRK2 y la sub-siguiente proteolisis es estimulada por la activación de β2AR y la presencia de β-arrestina. Por el contrario, la activación de la vía de señalización PI3K/Akt por agonistas como IGF-1 altera la degradación de GRK2 mediada por Mdm2, dando lugar a un aumento en la estabilidad y niveles de la quinasa, lo que pue-de ser relevante en distintos contextos fisiopatológicos, como el cáncer.
INTERACTOMA DE GRK2 E IMPLICACIONES FISIOPATOLÓGICAS En resumen, el complejo «interactoma» de GRK2 que hemos resumido has-ta ahora propone que eshas-ta quinasa puede ser un nodo relevante en las redes de señalización celular (Figura 2). En lo que concierne a la señalización de GPCR, emerge el concepto de que tanto las arrestinas como las GRKs pueden poner fin a ciertas señales mientras desencadenan la propagación de otras al ayudar a con-gregar «signalosomas» macromoleculares en el entorno del receptor, actuando como adaptores o «scaffolds» regulados por agonistas (2, 4, 8, 9). Además de eso, la existencia de otros sustratos no-GPCR y la interacción independiente de fosforilación de GRK2 con diversas proteínas de señalización implicadas en pro-cesos biológicos esenciales sugiere nuevos papeles funcionales para GRK2 que podrían ser relevantes para la fisiología humana y para diversas enfermedades. Por consiguiente, es tentador sugerir que cambios en la expresión/actividad de GRK2 pueden afectar diferencialmente la funcionalidad de las proteínas con las que interactúa, alterando la homeostasis de maneras distintas, dependiendo
también del tipo celular del que se trate. Por ejemplo, el hecho de que ratones que carecen de GRK2 mueren entre los días 9 y 14 de desarrollo embrionario (26) apoya la idea de que esta proteína desempeña un papel crítico en la proli-feración/diferenciación/migración celular a lo largo del desarrollo. Además, la expresión alterada de GRK2 ha sido asociada a diversas enfermedades huma-nas y se ha identificado en modelos animales de diferentes patologías. Los ni-veles de proteína de GRK2 están disminuidos en artritis reumática (RA) en es-clerosis múltiple (27) y en modelos de daño isquémico en corazón (3). Por el contrario, la expresión de GRK2 está incrementada en otras situaciones patoló-gicas como fallo cardiaco congestivo e hipertensión (3) y alterada en diversos tumores (28). Estas alteraciones en la expresión de GRK2 pueden directamen-te causar estas enfermedades o contribuir a su evolución.
A continuación se discuten las alteraciones de GRK2 descritas hasta ahora en determinadas patologías de interés, así como algunas posibles implicaciones fisiopatológicas de ciertas nuevas interacciones de GRK2 con proteínas de se-ñalización celular recientemente descubiertas.
FIGURA2. Esquema del interactoma global de GRK2. Esta quinasa es capaz de fosforilar una gran variedad de GPCR, así como ciertos receptores de membrana con actividad tirosina quinasa, como los de EGF o PDGF, lo que promueve clásicamente su desensibilización e internalización, pero que también inicia cascadas de señales que contribuyen a configurar la respuesta biológica. Por otra parte, se están identificando múltiples sustratos no-GPCR, cuya fosforilación por GRK2 puede tener efectos positivos o negativos sobre su actividad (como se indica en el esquema), así como otras interacciones de la quinasa con proteínas celulares, independientemente de su actividad catalítica. Se postula que, dependiendo del contexto de señalización y del tipo celular, tendrán lugar preferentemente un subconjunto de estas posibles interacciones, que determinará
GRK2 y fallo cardiaco
GRK2 desempeña un papel muy importante en la regulación de la señaliza-ción β-adrenérgica en el corazón. La relación entre un incremento en los niveles de proteína de GRK2 y fallo cardiaco congestivo (HF) ha sido establecida en mo-delos animales y en pacientes con diferentes enfermedades cardiacas. Los niveles del mensajero y actividad de GRK2 están aumentados en pacientes con cardio-miopatías dilatadas, isquémicas o idiopáticas, con isquemia cardiaca o con hiper-trofia ventricular izquierda (revisado en referencia 3). Es interesante destacar que, en algunos modelos animales, el desarrollo de fallo cardiaco está precedido por una elevación de los niveles de GRK2, lo que correlaciona con una contractilidad mio-cárdica y una respuesta β-adrenérgica progresivamente disminuida. Más aún, los niveles de GRK2 están elevados después del infarto sólo en los animales que des-arrollarán fallo cardiaco (29). Todo ello subraya la importancia de los niveles de GRK2 como un marcador de la predisposición a la disfunción cardiaca y apoya la idea que GRK2 puede ser una potencial diana terapéutica. Diversos modelos ex-perimentales en ratón parecen aportar esa prueba de concepto. Así, una estrategia exitosa para restablecer la función cardiaca en animales con fallo cardiaco ha sido la inhibición de la actividad de GRK2 mediante la sobreexpresión del fragmento GRK2ct, una construcción que comprende el dominio de unión a subunidades Gbe-tagamma de GRK2, lo que inhibe la quinasa endógena al evitar su translocación en la membrana. Los animales transgénicos que sobreexpresan GRK2ct también muestran una contractilidad basal y una respuesta a isoproterenol aumentada, lo que sugiere que la actividad de GRK2 modula directamente las respuestas β -adre-nérgicas cardiacas in vivo (30). Sin embargo, aunque el cruce de estos ratones con otros que mimetizan diferentes tipos de fallo cardiaco puede revertir la disfunción cardiaca, la expresión de GRK2ct no previene otras formas de deterioro del cora-zón, como las observadas en ratones transgénicos que sobreexpresan Gαq o do-minantes negativos de CREB, a pesar de que se consigue restablecer la señaliza-ción β-adrenérgica (revisado en 3). Estos resultados indican que los potenciales beneficios de una terapia génica basada en la expresión de GRK2ct dependerán de la etiología del fallo cardiaco, y sugieren que los efectos de GRK2ct pueden ir más allá de la modulación del módulo de señalización β1AR/adenilil ciclasa.
Se debería además considerar que los receptores α2-adrenérgicos, que regu-lan negativamente la liberación de catecolaminas por la glándula adrenal, tam-bién son desensibilizados por GRK2. Puesto que la GRK2 adrenal está tamtam-bién incrementada en fallo cardiaco, esto desencadenaría un pico de catecolaminas, lo cual es per se perjudicial para la función cardiaca a largo plazo. Por tanto, los efectos patológicos de GRK2 en fallo cardiaco pueden depender tanto de
efec-tos «locales» sobre la contractilidad cardiaca como de efecefec-tos «sistémicos» con-secuencia de una excesiva desensibilización de receptores neuro-humorales (31). Otra cuestión no resuelta es si la expresión elevada de GRK2 es un factor precipitante del fallo cardiaco congestivo o si puede ser considerado un proceso inicial de adaptación en respuesta al «overdrive» adrenérgico, que será patológi-co a largo plazo. Es interesante apuntar que ratones transgénipatológi-cos que sobreex-presan GRK2 en corazón no muestran síntomas manifiestos de cardiomiopatía aunque la proteína GRK2 alcance niveles más altos que los detectados en pa-cientes y en varios modelos animales con fallo cardiaco. De este modo, las tera-pias desarrolladas para prevenir el incremento de GRK2 en pacientes con enfer-medades cardiacas deberían ser aún consideradas con prudencia.
En este contexto, se necesitan modelos experimentales que permitan ex-plorar en detalle las consecuencias funcionales de diferencias en los niveles de GRK2 similares a los alcanzados en pacientes (del orden del doble) en respuesta a estímulos patológicos crónicos o agudos y, además, comparar los resultados con los obtenidos en procesos fisiológicos normales, como el envejecimiento. Los ratones hemizigotos para GRK2, que manifiestan una reducción del 50% en los niveles de esta proteína, surgen como un modelo interesante para rela-cionar las diferencias encontradas en estos procesos.
A pesar del papel crítico de las GRK2 en el corazón, el conocimiento de los mecanismos que modulan su expresión en células cardiovasculares es limitado. Se ha informado de que la presencia de beta-agonistas incrementa el mRNA de GRK2, mientras que la isquemia podría promover la degradación de GRK2 por el proteasoma en algunos modelos experimentales (revisado en 3). No obstante, hay poca información integrada acerca del efecto general de estímulos fisiopato-lógicos clave (angiotensina/ catecolaminas/isquemia-reperfusión) en parámetros relacionados, como la expresión de GRK2/ GRK3/ GRK5 (las tres isoformas des-empeñan un papel importante en la regulación cardiaca de GPCR), el estatus de fosforilación de GRK2, que puede alterar su actividad, localización y proteínas de interacción, y la expresión de moduladores clave de GRK, como RKIP.
GRK2 e hipertensión
Varias manifestaciones clínicas de hipertensión han sido asociadas a una presión aumentada de GRK2. Tanto la actividad citosólica de GRK como la ex-presión de la proteína estaban selectivamente aumentadas en linfocitos de pacien-tes hipertensos (32, 33). Estos cambios se producían en paralelo a una ineficiente
respuesta beta-adrenérgica, que es esencial para mediar respuestas vasodilatadoras. Dado que GRK2 es un regulador fundamental del sistema beta-adrenérgico, un des-equilibrio entre los mecanismos vasoconstrictores y vasodilatadores promovidos por niveles de quinasa alterados podrían conducir a un incremento de la resisten-cia vascular e hipertensión. Una de las precauciones de este estudio iniresisten-cial era si los cambios observados en los linfocitos reflejaban los que estaban ocurriendo en la vasculatura. Este hecho se confirmó por los mismos autores en ratas espontáne-amente hipertensas y en ratas DAHL hipertensas en respuesta a sal, sugiriendo que GRK2 participa en el desarrollo de la hipertensión de diferentes etiologías (33). La elevada expresión de GRK2 en la vasculatura no es solamente un bio-marcador de hipertensión, sino que participa en su desarrollo. Así, ratones transgénicos que so-breexpresan GRK2 (incluso a niveles modestos) en el músculo liso vascular mues-tran una respuesta beta-adrenérgica atenuada, sin cambios en la vasoconstricción alfa-adrenérgica, lo que resulta en la elevación de la presión sanguínea y en re-modelado vascular (34). Recientemente se ha sugerido que otra vía de señalización importante para el mantenimiento de la tensión portal está alterada a consecuencia de niveles elevados de GRK2 (35). La hipertensión portal promovida por ligadura de los conductos biliares en ratas se acompaña de una disminución de la señaliza-ción por el receptor de endotelina ET-1 y de una atenuaseñaliza-ción de la producseñaliza-ción en-dotelial de NOS, así como por un aumento en la expresión de GRK2. Más aún, ra-tones hemicigotos para GRK2 muestran mayores niveles de eNOS y una menor hipertensión tras daño hepático que los controles. Este nuevo papel de GRK2 en-dotelial en la homeostasis vascular podría ser relevante en la hipertensión prima-ria en humanos, pero no se sabe aún si el aumento de GRK2 detectado en esos pa-cientes en músculo liso vascular se produce también en el endotelio.
En conjunto, estos estudios sugieren que una mayor expresión vascular de GRK2 puede contribuir de forma importante a la patogénesis y/o al mantenimiento de hipertensión esencial en humanos en presencia de una respuesta vasoconstric-tora intacta. Por otra parte, es de destacar que se ha encontrado que GRK2 mo-dula la funcionalidad de canales de sodio epiteliales (ENaC) cuya hiperactividad está directamente relacionada con el desarrollo de hipertensión. Una mayor acti-vidad de GRK2 produce la estabilización de la proteína ENaC y una absorción de sodio aberrante, lo que podría producir un aumento en la presión sanguínea (36).
GRK2 y enfermedad de Alzheimer
A pesar de que GRK2 está expresada a altos niveles en neuronas y en cé-lulas de glía, sólo recientemente se ha comenzado a investigar su posible papel
fisiopatológico en enfermedades como el Alzheimer (AD) o el infarto cerebral. La cantidad de GRK2 localizada en la membrana se ha encontrado significati-vamente reducida en un modelo de ratón transgénico de AD que sobreexpresa el péptido beta-amiloide, a pesar de que los niveles totales de la quinasa se en-contraban incrementados (37). Este cambio en los niveles de GRK2 precede a las alteraciones cognitivas y se correlaciona con una hiperactividad de GPCR como los receptores de trombina y glutamato en células de glía. La proteína GRK2 cerebral también modula la inflamación mediada por microglía, y sus ni-veles de expresión podrían influir en la sensibilidad al infarto cerebral (38). Más recientemente, se ha encontrado una correlación positiva entre los niveles de GRK2 en linfocitos periféricos y la severidad de la enfermedad en pacientes de AD (39). Sin embargo, queda por determinar si esta expresión en linfocitos re-fleja cambios en la expresión de GRK2 en el cerebro y si estos cambios son es-pecíficos de AD frente a otras enfermedades degenerativas como el Parkinson.
PAPEL FUNCIONAL DE GRK2 EN MIGRACIÓN DE CÉLULAS EPITELIALES E INMUNES. IMPLICACIONES FISIOPATOLÓGICAS
La migración celular requiere la integración espacio-temporal de información procedente de señales mecánicas y de moléculas difusibles actuando a través de GPCRs como quimioquinas, lípidos bioactivos como la esfingosina-1 fosfato (S1P) y de factores de crecimiento. Las alteraciones en procesos migratorios están pre-sentes en enfermedades inflamatorias crónicas, invasión tumoral y metástasis, y otras patologías (40). En este sentido, además de participar en la regulación y se-ñalización de diversos GPCR relacionados con procesos migratorios, se ha mos-trado que GRK2 puede interaccionar con diferentes proteínas implicadas en mi-gración, como MEK, Akt, ezrina, PI3Kγo GIT (4, 7, 9, 41). Datos recientes sugieren que GRK2 desempeña un papel complejo y muy relevante en migración de célu-las epiteliales e inmunes. El efecto global de los niveles de GRK2 en el proceso migratorio parece depender del tipo celular, de los estímulos específicos actuando a través de receptores GPCR, RTK o de integrinas, así como del contexto de se-ñalización, e implicar su interacción dinámica con varias proteínas celulares.
GRK2 y enfermedades inflamatorias
GRK2, altamente expresada en diferentes tipos celulares del sistema inmu-ne, parece constituir un importante regulador de las respuestas de estas células
en situaciones de inflamación. GRK2 fosforila muchos receptores de quimio-quinas como CCR5, CCR2b. CXCR4, CXCR2 y receptores quimiotácticos para la sustancia P, S1P, o fMLP, responsables del tráfico de leucocitos hacia los fo-cos inflamatorios, de la salida de células T desde los órganos linfoides, o de la activación y proliferación de leucocitos (27, 41). Es de destacar que se ha en-contrado una disminución de la expresión de GRK2 (del orden del 50%) en leu-cocitos de pacientes con artritis reumatoide o de esclerosis múltiple, en compa-ración con sujetos sanos (revisado en referencias 27 y 41). El hecho de que esta disminución de niveles es consecuencia directa de la patología se ha demostra-do en modelos animales de artritis, que específicamente muestra una reducción de la expresión de GRK2 en esplenocitos y en células de los nodos linfáticos mesentéricos. De acuerdo con su papel en desensibilización de GPCRs, se ha mostrado que GRK2 atenúa la migración inducida por quimioquinas de células T y de monocitos, de tal forma que al decrecer los niveles de GRK2 se produ-ce una migración incrementada (4, 27, 42).
La disminución de los niveles de GRK2 en células inmunes durante la in-flamación podría representar inicialmente un mecanismo adaptativo para facili-tar la respuesta celular; sin embargo un déficit crónico de GRK2 promovería una respuesta inflamatoria exagerada o aberrante. Así, células T aisladas de ra-tones hemicigotos para GRK2 (que presentan una reducción del 50% en los ni-veles de esta quinasa) muestran un aumento significativo en la señalización y en la quimiotaxis promovida por ligandos de receptores CCR1 y CCR5 en com-paración con células de ratones salvajes (43). Sin embargo, no se ha combado que la alteración en los niveles de GRK2 sea determinante para la pro-gresión de la artritis reumatoide. Esta noción si parece abrirse paso en otra enfermedad inflamatoria como la esclerosis múltiple (44). La expresión de GRK2 en leucocitos de pacientes de esta patología (y no de otros desórdenes neurológicos sin un componente inflamatorio) se encuentra disminuida del or-den del 40% en relación con individuos sanos. Es interesante destacar que el inicio de la encefalomielitis experimental autoinmune (EAE) está significativa-mente acelerada en ratones hemicigotos para GRK2, que muestran una mayor infiltración inicial de células T en el cerebro. Curiosamente, estos animales muestran menores infiltrados inflamatorios a largo plazo y menos recaídas de la enfermedad comparado con animales control. Por tanto, los efectos de una expresión de GRK2 alterada no tiene una correlación evidente en términos pa-tológicos, ya que muchos tipos celulares, no solamente del sistema inmune sino también del tejido inflamado, son responsables del desarrollo de la patología y pueden responder de forma diferente a esos cambios. Se necesitan, por tanto, más datos sobre los mecanismos de regulación de GRK2 y su efecto en
distin-tos tipos celulares para evaluar la posible eficacia terapéutica de la modulación de los niveles de GRK2 en artritis reumatoide y otras patologías inflamatorias. Otra relación funcional de GRK2 recientemente descrita puede ser también relevante en patologías cardiovasculares e inflamatorias. Nuestro grupo ha mos-trado que GRK2 fosforila directamente a p38 MAPK en el residuo T123, que está localizado a la entrada del canal de anclaje («docking groove»), que p38 utiliza para interaccionar específicamente con sus quinasas activadoras y con sus sustratos. Hemos demostrado que la fosforilación en ese residuo interfiere con la capacidad de p38 de ser activada y también con su asociación a sustra-tos (45). Más aún, cambios en los niveles de GRK2 pueden modificar procesos celulares mediados por p38, tales como la diferenciación a adipocitos y la se-creción de TNFα tras la estimulación con LPS, que está incrementada en ma-crófagos procedentes de ratones heterozigotos para GRK2 (45). Es interesante destacar que la actividad y los niveles de GRK2 parecen correlacionar inversa-mente con el estado de activación de p38 en diferentes situaciones patológicas, tales como hipertensión y fallo cardiaco (3), y procesos inflamatorios como la artritis reumatoide o enfermedades inflamatorias intestinales, lo que de nuevo sugiere un papel importante de GRK2 en el control de la activación de p38 (46).
GRK2 y cáncer
Los GPCRs están implicados en muchos aspectos de la progresión del cán-cer y la metástasis. Los receptores de S1P, LPA, diversos receptores de qui-mioquinas y receptores activados por proteasas (PARs) se encuentran sobreex-presados en diferentes tumores, lo que conduce a una proliferación y migración celular alteradas. En este contexto, GRK2 podría contribuir a estos procesos como un modulador negativo clásico de estos GPCRs.
Sin embargo, sorprendentemente, GRK2 también parece poder actuar como un transductor positivo de la señal de alguno de estos receptores. Por ejemplo, nuestro laboratorio y otros grupos han encontrado que GRK2 potencia la seña-lización a través del receptor Smoothened y coopera con éste en transformación de líneas celulares de fibroblastos y en ensayos de formación de focos (48, 49). Además, otras funciones de GRK2 independientes de GPCRs parecen estar im-plicadas en posibles actividades pro-transformantes de esta quinasa. GRK2 ate-núa los efectos anti-proliferativos y pro-apoptóticos de TGF-βen células de he-patocarcinoma humano (13). Por otra parte, diferentes vías de señalización relacionadas con cáncer pueden causar un incremento en los niveles de GRK2 en diversas líneas celulares de cáncer de mama (11, 25).
En este sentido, hemos demostrado recientemente que GRK2 se degrada rá-pidamente por el proteasoma, y que Mdm2, una E3-ubiquitina ligasa implicada en el control del crecimiento celular y la apoptosis, y bien conocida por su papel en controlar la degradación y actividad transcripcional de p53, desempeña un pa-pel crítico en la ubiquitinación y recambio de GRK2 en respuesta a la activación de GPCRs (25). Este proceso implica la función adaptadora de beta-arrestina. Por el contrario, la activación de la vía de señalización PI3K/Akt por agonistas como IGF-1 altera el patrón de fosforilación de Mdm2 y promueve su localización nu-clear, lo que impide la degradación de GRK2 y promueve un incremento de los niveles de esta quinasa (25). Este descubrimiento predice que la disfunción de la vía de señalización PI3K/Akt que tiene lugar en muchos tipos de cáncer, provo-cará una alteración de los niveles de GRK2 en distintos tipos celulares.
En este sentido, hemos descubierto recientemente (17) que los niveles in-crementados de GRK2 potencian la migración de células epiteliales hacia fi-bronectina, mientras que la disminución de los niveles de la quinasa promueve el efecto contrario. El efecto de GRK2 en la migración celular a fibronectina implica la activación paracrina de receptores de S1P acoplados a Gi. GRK2 mo-dula positivamente la actividad de la vía de señalización Rac/PAK/MEK/ERK en respuesta a adhesión y a S1P por un mecanismo que implica su interacción dinámica (dependiente de fosforilación) con GIT1, una proteína adaptadora cla-ve en procesos de migración celular (16, 17).
Estos nuevos datos apuntan la idea de que los niveles de expresión de GRK2 pueden alterar la migración celular en condiciones patológicas. La migración alte-rada de células epiteliales es crítica en la progresión de cáncer y en procesos me-tastáticos en respuesta a señales que incluyen integrinas y GPCRs (S1P, quimio-quinas, PARs) (47, 50). Nuestros datos preliminares muestran que la migración de células transformadas de cáncer de mama también se regula positivamente al au-mentar los niveles de GRK2 y se inhibe fuertemente cuando se silencia la expre-sión de GRK2 utilizando la metodología de siRNA (Salcedo, Mayor y Penela en preparación), lo que sugiere que GRK2 podría ser una potencial diana terapéutica en cáncer. En la actualidad, estamos investigando si GRK2 puede contribuir tam-bién a otros aspectos de la progresión del cáncer, como proliferación o diferencia-ción. Por otra parte, será también necesario profundizar en el análisis de posibles cambios de expresión de GRK2 en pacientes de cáncer. Se han descrito incrementos en los niveles de GRK2 en muestras de pacientes con tumores de tiroides (28) y de cáncer de mama (nuestros propios datos), mientras que se han observado dis-minuciones en un subgrupo de tumores de próstata (51). Será interesante determi-nar en el futuro las causas de estas alteraciones en los niveles de GRK2 y su po-sible implicación en el proceso de transformación oncogénica.
GRK2 COMO DIANA TERAPÉUTICA
Como en el caso de otras proteínas quinasas, la búsqueda de inhibidores ATP-miméticos de GRK2 plantea el problema de la especificidad y los efec-tos secundarios. Dado que el dominio catalítico de las GRKs está altamente conservado, será difícil encontrar inhibidores específicos de isoforma. Ade-más, los nuevos datos sobre dominios específicos de interacción de GRK2 con otras proteínas celulares pueden abrir nuevas estrategias de modulación basadas en el diseño de péptidos o moléculas capaces de alterar específica-mente esas interacciones. Por último, una mejor comprensión de los meca-nismos moleculares que regulan la expresión y función de GRK2 podrían ser también utilizados para modular indirectamente su actividad in vivo median-te agenmedian-tes capaces de modular su expresión o estabilidad de forma específi-ca de tipo celular.
En resumen, el complejo interactoma de GRK2, que implica a múltiples proteínas señalizadoras implicadas en procesos biológicos esenciales, sugieren nuevos papeles funcionales de GRK2 relevantes en fisiología y patología hu-manas. Sin embargo, la modulación de esa red de interacciones por señales ex-tracelulares, su papel fisiológico o patológico concreto, y su integración espa-cial y temporal con otras funciones de GRK2, están aún por determinar.
AGRADECIMIENTOS
La labor de mi grupo de investigación es posible gracias a proyectos y ayu-das del Ministerio de Educación y Ciencia (SAF2005-03053), Fundación Ra-món Areces, Fundación Mutua Madrileña, la Red de investigación cooperativa en enfermedades cardiovasculares (RECAVA) del Instituto de Salud Carlos III (RD06-0014/0037), la red de excelencia INSINET de la Comunidad de Madrid (S-SAL-0159-2006), y la Red de excelencia europea MAIN (Migration and In-flammation) (LSHG-CT-2003-502935).
LISTA DE ABREVIATURAS
βAR, receptor beta-adrenérgio; EGF, factor de crecimiento epidérmico; GPCR, receptores acoplados a proteínas G; GRK, quinasa de receptores aco-plados a proteínas G; MAPK, quinasa activada por mitógenos; S1P, esfingosi-na-1-fosfato.
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