FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MAESTRÍA EN CIENCIA ANIMAL
TASA DE GESTACIÓN EN NOVILLAS Bos taurus x Bos indicus CON EMBRIONES in vivo E in vitro, TRANSFERIDOS EN FRESCO Y
DESVITRIFICADOS TESIS
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIA ANIMAL
PRESENTA:
M.V.Z. RICARDO LÓPEZ AGUIRRE DIRECTOR:
DR. FELIPE MONTIEL PALACIOS CODIRECTOR:
PhD. RODOLFO CANSECO SEDANO ASESOR:
Dr. APOLO ADOLFO CARRASCO GARCÍA
TASA DE GESTACIÓN EN NOVILLAS Bos taurus x Bos indicus CON EMBRIONES in vivo E in vitro, TRANSFERIDOS EN FRESCO Y DESVITRIFICADOS
Por:
RICARDO LÓPEZ AGUIRRE
Tesis propuesta al Colegio de Profesores de Posgrado De la
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA De la
UNIVERSIDAD VERACRUZANA
Como requerimiento parcial para obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIA ANIMAL
DEDICATORIAS
Quiero dar gracias a Dios por permitirme iniciar y culminar esta meta, por darme la oportunidad de la superación personal, en sus manos estuve y gracias a él la llevé a cabo. Señor mío, provéeme de energía y fuerza de voluntad, así como sabiduría para generar transformación a través de las mentes de los educandos, en esta sociedad que tanta falta le hace.
A mis padres Leonel López Albarrán y Fausta Aguirre Machuca, y mi hermano Emmanuel López Aguirre, los amo tanto, gracias por todo el apoyo brindado, consejos a diario, ánimos en tiempos difíciles, y sobre todo regaños para que no me saliera del camino y llegara a la meta.
A toda mi familia Aguirre Machuca, por su apoyo incondicional, los quiero mucho. A mis compañeros de clase, Mariana Izaguirre, Valeria García, Andrés Santiago, Saúl Alberto, Macario Fernández, Arístides Villareal, Noé Ismael Moctezuma, fue un placer participar y culminar junto a ellos esta gran etapa.
A todos mis amigos los “FAPEROS”, que siempre estuvieron en todo momento y que se han convertido en una gran familia.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Felipe Montiel Palacios, por aceptarme y guiarme a través de esta etapa, ya que sus conocimientos otorgados han sido y serán de gran ayuda para mi formación personal y educativa.
Al Dr. Obdulio Molina Marcial, por facilitar y proporcionar los recursos para el desarrollo de la investigación.
Al PhD. Rodolfo Canseco Sedano, por su basta orientación y crítica hacia el trabajo realizado y a los conocimientos personales.
A la Dra. Concepción del Carmen Ahuja Aguirre por su ayuda durante todo el posgrado en la redacción de la tesis.
Al Dr. Pedro Paredes Ramos por guiarme hacia el camino de la expresión de las ideas.
Al Dr. Apolo Adolfo Carrasco García por sus comentarios tan acertados que sirvieron para el desarrollo de la investigación.
A la Dra. Patricia Cervantes Acosta por su gran apoyo hacia el crecimiento tanto personal como de investigación.
Al Dr. Belisario Domínguez Mancera por su apoyo en toda la estadística del estudio y en la formación académica.
A todo el equipo de Reproducción Animal, Dr. Gustavo Contreras Jácome, Dr. Yasser Kayser Alarcón, MCA. Andrés Santiago Hernández, MVZ. Manuel Eduardo Ávila, por todo el apoyo brindado en campo e institucional para que se llevara a cabo el trabajo.
El sustentante gozó de una beca otorgada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) para llevar a cabo su trabajo recepcional y obtener el grado de Maestro en Ciencia Animal. La beca comprendió el periodo de 01 de agosto de 2018 a 31 de julio de 2020 y corresponde a la convocatoria titulada “Becas Nacional (Tradicional) 2018-2”, con el número de becario 923009.
CONTENIDO
Página
LISTA DE CUADROS ... viii
LISTA DE FIGURAS ... ix
LISTA DE ABREVIATURAS ... x
INTRODUCCIÓN ... 1
1. ANTECEDENTES ... 3
1.1. Producción in vivo de embriones bovinos ... 3
1.2. Producción in vitro de embriones bovinos ... 4
1.3. Evaluación embrionaria ... 7 1.3.1. Desarrollo embrionario ... 7 1.3.2. Calidad embrionaria ... 9 1.4. Criopreservación de embriones ... 10 1.4.1. Crioprotectores ... 12 1.4.1.1. Crioprotectores permeables... 13 1.4.1.2. Crioprotectores no permeables ... 13 1.4.2. Vitrificación ... 14
1.4.2.1. Vitrificación de embriones bovinos ... 15
1.4.2.2. Vitrificación en Microdrop® ... 15
1.4.2.3. Vitrificación en Cryotop® ... 17
1.5. Transferencia de embriones en ganado bovino ... 18
1.5.1. Selección y manejo de receptoras ... 19
1.5.1.1. Factores que afectan la tasa de gestación en receptoras ... 20
1.5.1.1.1. Factores iatrogénicos ... 21
1.5.2. Sincronización de la ovulación en receptoras bovinas ... 23
1.5.3. Tasa de gestación en receptoras bovinas transferidas con embriones en fresco y vitrificados ... 24 HIPÓTESIS ... 27 OBJETIVO GENERAL ... 27 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 27 2. MATERIALES Y MÉTODOS ... 28 2.1. Sitio de estudio ... 28 2.2. Producción de embriones ... 28
2.2.1. Embriones producidos in vivo ... 28
2.2.2. Embriones producidos in vitro ... 29
2.3. Selección y manejo de receptoras bovinas ... 30
2.4. Protocolo de sincronización de la ovulación ... 30
2.5. Calentamiento de embriones vitrificados ... 31
2.5.1. Calentamiento de embriones vitrificados en Microdrop® ... 31
2.5.2. Calentamiento de embriones vitrificados en Cryotop® ... 32
2.6. Transferencia de embriones a receptoras bovinas ... 33
2.7. Diagnóstico de gestación ... 34
2.8. Análisis estadístico ... 34
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 35
CONCLUSIÓN ... 41
LISTA DE CUADROS
CUADRO 1. Tasa de gestación con embriones producidos in vivo e in vitro, transferidos en fresco y desvitrificados en novillas Bos taurus x Bos indicus en trópico seco. ... 35 CUADRO 2. Asociación entre el origen del embrión (in vivo vs. in vitro) y la preservación embrionaria (fresco vs. vitrificados) sobre la tasa de gestación pos-transferencia en novillas Bos taurus x Bos indicus en trópico seco. ... 37
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Protocolo de calentamiento de embriones vitrificados en Microdrop®
(Kuwayama et al., 2005). ... 32 Figura 2. Protocolo de calentamiento de embriones vitrificados en Cryotop®
LISTA DE ABREVIATURAS
OM Ovulación múltiple
TE Transferencia de Embriones
TETF Transferencia de Embriones a Tiempo Fijo IA Inseminación Artificial
TG Tasa de Gestación CC Condición Corporal CL Cuerpo Lúteo
IETS Sociedad Internacional de Tecnologías Embrionarias FSH Hormona Folículo Estimulante
LH Hormona Luteinizante EB Benzoato de Estradiol
eCG Gonadotropina Coriónica Equina ECP Cipionato de Estradiol
GnRH Hormona Liberadora de Gonadotropinas P4 Progesterona
PGF2α Prostaglandina F2 ALFA FIV Fertilización in vitro CIV Cultivo in vitro MIV Maduración in vitro CCOs Complejo cúmulo-ovocito DMSO Dimetilsulfóxido EG Etilenglicol PVP Polivinilpirrolidona ES Solución de Equilibrio VS Solución de Vitrificación TS Solución de Calentamiento DS Solución de Dilución
WS Solución de Lavado
SSS Sustituto de Suero Sintético PBS Solución Buffer Fosfato FBS Suero Fetal Bovino
BSA Albúmina de Suero Bovino NL2 Nitrógeno Líquido
PM Peso Molecular
ROS Especies Reactivas de Oxígeno ITH Índice de Temperatura y Humedad
RESUMEN
López Aguirre, Ricardo. MCA. Universidad Veracruzana, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Agosto 2020. Tasa de gestación en novillas Bos taurus x Bos indicus con embriones in vivo e in vitro, transferidos en fresco y desvitrificados. Director: Dr. Felipe Montiel Palacios. Co-Director: PhD. Rodolfo Canseco Sedano. Asesor: Dr. Apolo Adolfo Carrasco García.
El objetivo del presente estudio fue determinar la tasa de gestación en novillas Bos taurus x Bos indicus que reciben embriones producidos in vivo e in vitro, transferidos en fresco y desvitrificados. Se utilizaron 120 embriones grado 1 (excelente), asignados al azar a cuatro tratamientos: T1= Transferencia en fresco de embriones producidos in vivo (n=30), T2= Transferencia de embriones producidos in vivo vitrificados (VIT) en Cryotop® (n=30), T3= Transferencia en fresco de embriones producidos in vitro
(n=30), T4= Transferencia de embriones producidos in vitro VIT en Microdrop® (n=30).
Se seleccionaron novillas, las cuales se sometieron a manejo zootécnico, nutricional, sanitario y a un protocolo convencional de sincronización de la ovulación con dispositivo de progesterona más eCG. Los embriones se transfirieron por vía transcervical no quirúrgica al día 17 de iniciado el protocolo de sincronización. El diagnóstico de gestación fue al día 60 pos-transferencia por palpación transrectal. La diferencia en TG entre tratamientos se evaluó mediante ji-cuadrada. La asociación entre la TG y el origen del embrión (in vivo e in vitro), así como la asociación entre la TG y la preservación embrionaria (fresco y vitrificado) se evaluaron mediante regresión logística binaria (STATISTICA v.10). La TG general fue del 47.5 %. No se encontró diferencia estadística en TG entre los tratamientos (T1= 60 ± 9.09 %; T2= 53.3 ± 9.26 %; T3= 36.6 ± 8.94 %; T4= 40 ± 9.09 %; p=0.05). Al evaluar la asociación origen del embrión se encontró una menor TG para los embriones producidos in vitro que los producidos in vivo (p=0.043). No hubo diferencia en TG para la asociación preservación embrionaria (en fresco o VIT) (p=0.854). En conclusión, la TG con embriones producidos in vivo e in vitro, transferidos en fresco y desvitrificados no difiere estadísticamente, sin embargo, la asociación origen del embrión (in vivo vs. in vitro) resultó ser determinante en la TG, logrando mejores resultados con embriones producidos in vivo en comparación in vitro. Palabras clave: Criopreservación, Biotecnologías reproductivas, Sincronización de la ovulación
ABSTRACT
López Aguirre, Ricardo. MCA. Universidad Veracruzana, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. August 2020. Pregnancy rate in Bos taurus x Bos indicus heifers with in vivo and in vitro produced embryos, fresh and vitrified. Director: Dr. Felipe Montiel Palacios. Co-Director: PhD. Rodolfo Canseco Sedano. Advisor: Dr. Apolo Adolfo Carrasco García.
The aim of the present study was to determine the pregnancy rate (PR) in Bos taurus x Bos indicus heifers that receive embryos produced in vivo and in vitro, transferred fresh and devitrified. A total of 120 embryos grade 1 (excellent), randomized to four treatments, were used: T1= transfer of fresh embryos in vivo produced (n=30), T2= transfer of embryos in vivo produced vitrified in Cryotop® (n=30), T3= transfer of fresh
embryos in vitro produced (n=30), T4= transfer of embryos in vitro produced vitrified in Microdrop (n=30). As recipients, heifers were selected, which underwent zootechnical, nutritional, and sanitary management and a conventional ovulation synchronization protocol with eCG plus progesterone device. The embryos were transferred by non-surgical transcervical route on day 17 of the initiation of the synchronization protocol. Pregnancy diagnosis was done on day 60 after transfer by transrectal palpation. The difference in PR between treatments was evaluated by chi-square test. The association between PR and the origin of the embryo (in vivo and in vitro), as well as the association between PR and embryo preservation (fresh and vitrified) were evaluated using binary logistic regression test (STATISTICA v.10). The general PR was 47.5%. No statistical difference was found in PR between treatments (T1= 60 ± 9.09 %; T2= 53.3 ± 9.26 %; T3= 36.6 ± 8.94 %; T4= 40 ± 9.09 %; p=0.05). When evaluating the association origin of the embryo, a lower PR was found for the embryos produced in vitro than those produced in vivo (p = 0.043). There was no difference in PR for the embryo preservation association (fresh or VIT) (p = 0.854). In conclusion, the PR with embryos produced in vivo and in vitro, transferred fresh and devitrified does not differ statistically, however, the association origin of the embryo (in vivo vs. in vitro) turned out to be decisive in the PR, achieving better results with in vivo produced embryos compared with in vitro.
INTRODUCCIÓN
A partir de 1980 se desarrollaron biotecnologías reproductivas como la ovulación múltiple (OM) y la transferencia de embriones (TE), siendo técnicas bien establecidas y confiables con el objetivo del mejoramiento genético en los hatos ganaderos (Hasler, 2014). Estas biotecnologías permiten introducir descendencia genéticamente superior, mejorar la genética a corto plazo, disminuir el riesgo de contagio de enfermedades infecciosas, multiplicar características deseables de hembras y machos, y facilitan la comercialización de embriones (Hasler, 2014; Mebratu et al., 2020). De igual forma, otras técnicas como la fertilización in vitro y la criopreservación de embriones han sido muy útil principalmente para incrementar la producción de animales, producción en masa de embriones, almacenamiento en bancos de germoplasma y transporte de embriones bovinos en el mundo (D’Alessandro y Martemucci, 2016).
En 2019 la Sociedad Internacional de Tecnologías Embrionarias (International Embryo Technology Society), por sus siglas en inglés IETS, reportó a nivel mundial la transferencia de 386,133 embriones producidos in vivo, de los cuales el 60 % fueron criopreservados y el resto se transfirió en fresco. También se reportó la transferencia de 742,906 embriones producidos in vitro, de los cuales 27 % habían sido criopreservados y el 73 % fueron transferidos en fresco. El líder a nivel mundial en la aplicación de esta biotecnología es América del Sur, donde se realizaron 308,636 transferencias con embriones en fresco y 198,763 con embriones congelados. En México se reportó un total de 32,372 embriones transferidos, 4,294 fueron producidos in vivo, de los cuales, tan solo 40 % fueron criopreservados; por otro lado, 27,982 fueron producidos in vitro derivados de aspiración folicular, de los cuales el 60 % se transfirió en fresco (Viana, 2019).
La tasa de gestación (TG) reportada en receptoras bovinas transferidas con embriones producidos in vivo transferidos en fresco oscila entre un 53 y 62 % (García et al., 2019;
Nimbona et al., 2019), mientras que la TG con embriones producidos in vitro transferidos en fresco va de 46 a 40 % (Gutnisky et al., 2013; Do et al., 2018).
En este sentido, la vitrificación es una de las técnicas de criopreservación cuyo propósito es eliminar la formación de cristales de hielo, al generar un aumento extremo en la viscosidad de las soluciones crioprotectoras (Vajta y Kuwayama, 2006), además, provee una vía opcional de preservación de embriones con porcentajes óptimos de viabilidad pos-calentamiento y tasas de gestación, lo que le coloca como una técnica sencilla, de fácil ejecución y costo-eficiente (Cabrera et al., 2006; Hasler, 2014). Las TG reportadas en bovinos con embriones producidos in vitro desvitrificados oscilan entre 23 a 48 % (Ríos et al., 2010; Gutnisky et al., 2013; Do et al., 2018), mientras que al utilizar embriones producidos in vivo desvitrificados se han logrado hasta 53 a 70 % (Lonergan et al., 2007; Zárate et al., 2018). Las receptoras bovinas juegan un papel fundamental en la TG, siendo las novillas consideradas más aptas fisiológicamente para la actividad reproductiva, ya que presentan menos probabilidades de estar bajo estrés nutricional o padecer alguna enfermedad reproductiva; en novillas se han reportado mejores resultados al compararlas con receptoras multíparas, transferidas con embriones producidos in vitro (30 vs. 20 %) (Dochi et al., 2008). Los embriones producidos in vivo e in vitro desempeñan un papel central en la producción de lácteos y carne en bovinos (Hansen, 2009). Más aún, en asociación con la tecnología de vitrificación de embriones (Vajta y Kuwayama, 2006) han marcado un progreso a nivel mundial. Sin embargo, el uso de esta tecnología es todavía muy limitado en la industria ganadera en el trópico de México (Viana, 2019). Debido a que se han reportado pocos estudios en bovinos que incluyan tasa de gestación con embriones producidos in vitro a nivel nacional, es importante realizar investigación que genere información al respecto.
1. ANTECEDENTES
1.1. Producción in vivo de embriones bovinos
La ovulación múltiple (OM) es una técnica que induce un gran número de ovulaciones en un ciclo ovárico debido a la administración de hormonas exógenas, principalmente gonadotropinas (Sapna, 2019). En los protocolos de OM en bovinos, las hembras donantes son inducidas a OM mediante el tratamiento con hormona folículoestimulante (FSH) para estimular la liberación de múltiples ovocitos en el momento de la ovulación. Estas hembras son inseminadas con semen de toros probados y de alta calidad genética (Gordon, 2003), con la finalidad de poder fecundar la mayoría de los ovocitos, para posteriormente, realizar la recolección de embriones a través del procedimiento de infusión uterina. Una vez realizada la técnica, se determina el número total de estructuras recolectadas, ya sea embriones transferibles, embriones degenerados u ovocitos no fertilizados, de los cuales únicamente se transfieren embriones de grado 1 o 2 en fresco, o se criopreservan para su posterior uso (Lamb et al., 2019). En promedio, se recuperan 6.4 embriones transferibles por donadora en cada tratamiento de inducción de OM (Viana, 2019); sin embargo, este número fluctúa según la raza de la vaca y la edad (AETA, 2018). En el trópico mexicano, utilizando donadoras Bos taurus x Bos indicus se ha reportado un promedio de 5.9 ± 1.6 embriones transferibles, 1.6±1.5 embriones degenerados y 2.7±3.8 ovocitos no fertilizados (Naranjo et al., 2019). En donadoras Bos taurus se ha reportado 5.7±0.76 embriones transferibles y 3.0±0.86 embriones degenerados (Soria et al., 2017); en donadoras Bos indicus el promedio obtenido es 6.2±1.0 embriones transferibles, 0.6±0.3 embriones degenerados y 0.7±0.3 ovocitos no fertilizados (Baruselli et al., 2006).
Actualmente, el protocolo recomendado para donadoras Bos taurus x Bos indicus consiste en insertar un dispositivo intravaginal bovino liberador de progesterona (1.9 g de progesterona), más la aplicación de 2.5 mg de benzoato de estradiol y 50 mg de progesterona vía IM en el día 0. Del día 4 al 7 se administra vía IM FSH en dosis decrecientes, iniciando con 80 mg totales dividida en dos aplicaciones con diferencia de 12 h (06:00 y 18:00), continuando con 60, 40 y 20 mg en los días subsiguientes bajo el mismo esquema de aplicación. El día 6 del tratamiento, además de la aplicación de FSH, se administra doble aplicación de dinoprost trometamina por vía IM, 25 mg por la mañana y 25 mg por la tarde. Al día 7 se retira el dispositivo intravaginal más doble
aplicación de eCG (200 UI) vía IM en un intervalo de 12 h. El día 8 se administra 0.25 mg de GnRH a las 06:00 h, posteriormente a las 18:00 h se realiza el primer servicio de inseminación artificial (IA) utilizando una pajilla de semen congelado. El día 9 a las 06:00 h se da el segundo servicio de IA. La recolección de embriones se lleva a cabo el día 16 del protocolo. Finalizada la recolección se administran 25 mg de dinoprost trometamina por vía IM para realizar lisis de los cuerpos lúteos (Bó et al., 2006). Vasconcelos et al. (2010) determinaron la TG en receptoras multíparas de la raza Holstein con las siguientes características: 169.8 ± 4.4 días en lactación, 37.3 ± 0.3 kg de leche/día, CC de 3.0 ± 0.4 (escala de 1 5), y un número de lactancia de 2.1±0.1. Utilizaron embriones producidos in vivo (etapa de mórula, blastocisto temprano y expandido; grado 1 y 2) transferidos en fresco. El diagnóstico de gestación fue al día 28 y 60 pos-transferencia, obteniendo un 38.1 % (48/126) y 32.5 % (41/126) en TG, respectivamente, con un 5.6 % en pérdidas embrionarias durante ese periodo de evaluación.
1.2. Producción in vitro de embriones bovinos
Una alternativa para la producción de embriones es la fertilización in vitro (FIV), ya que se aprovecha en mayor medida la producción de ovocitos, además, requiere menos unidades de semen en comparación con la OM. De hecho, una sola pajilla de semen puede proporcionar suficientes espermatozoides para fertilizar de 800 a 1000 ovocitos (Tríbulo et al., 2012). Por otro lado, se pueden recolectar ovocitos de folículos antrales de ovarios obtenidos de rastro, lo que aumenta enormemente la cantidad de embriones que se pueden producir (Lamb et al., 2019). En un panorama mundial, en 2016 se produjeron 666 215 embriones, reportándose un incremento del 8.7 % en comparación con el 2015, además, se aumentaron las transferencias en un 11.4 % (Perry, 2017). Cuando se realiza la producción de embriones in vitro, características como su morfología y bioquímica son principalmente afectadas debido a las condiciones en que se desarrollan los mismos y que difieren de aquéllas que tienen cuando se producen in vivo (Cutini et al., 2000). Estas diferencias en el medio ambiente en que se desarrollan se traducen en que los embriones producidos in vitro presentan mayor cantidad de cromosomas anormales, un espacio perivitelino pequeño, una mala compactación de las mórulas, menor número de blastómeros, sobre todo a nivel de la masa celular interna, incremento en la cantidad de vacuolas citoplasmáticas y uniones imperfectas
entre blastómeros (Massip et al., 1995). Además, presentan una mayor sensibilidad al frío y a la congelación debido al incremento de lípidos en el citoplasma, aunque no está claro el por qué y cómo ocurre dicha acumulación de lípidos; existe evidencia que indica que la acumulación puede ser influenciada por el uso de un medio de cultivo indefinido, el cual es frecuentemente suplementado con suero fetal bovino, lo que da como resultado anormalidades en el metabolismo embrionario, afectando sus propiedades y la estabilidad de las células; además, las lipoproteínas de dichos medios de cultivo son absorbidas por el embrión, dando como resultado un aumento en la síntesis de triglicéridos (Dinnyés y Nedambale, 2009; Leão et al., 2014).Dicha acumulación de lípidos en el citoplasma provoca alteraciones en la retícula mitocondrial y endoplásmica, provocando reducción en su desarrollo (Wu et al., 2011). Sin embargo, se puede llevar a cabo una lipólisis inducida por lipolíticos administrados durante el cultivo embrionario, como puede ser norepinefrina, dibutiril cAMP, isoproterenol, forskolina y teofilina (Seamon et al., 1981; Holm, 2003). Se ha demostrado que la adición de forskolina al medio de cultivo de embriones Bos indicus antes de realizar la vitrificación mejora las tasas de supervivencia, proporcionado tasas de gestación satisfactorias después de la TE en comparación con su control (48.8 vs. 18.5 %) (Sanches et al., 2013). Por otro lado, se ha reportado que los embriones producidos in vitro resultan en aproximadamente un 10 a 20 % menor TG en receptoras Bos taurus productoras de carne, y 20 a 40 % en productoras de leche, así como incremento de pérdidas embrionarias en comparación con los embriones derivados de OM (Ealy et al., 2019). La producción de embriones in vitro comprende en primera instancia la recolección de ovocitos, ya sea de ovarios de rastro o por aspiración folicular guiada por ultrasonido, la maduración, fertilización, y el cultivo de embriones (Do et al., 2017). Como primer punto, se realiza la búsqueda de los complejos cúmulo-ovocito (CCO) utilizando un microscopio estereoscópico. En cuanto a su evaluación, se determina de la siguiente manera: Grado 1) CCO compactos con más de cuatro capas de células del cúmulo intactas y un citoplasma homogéneo; Grado 2) CCO compactos con tres a cuatro capas de células cumulares intactas y citoplasma homogéneo; Grado 3) CCO compactos con una o dos capas de células del cúmulos intactas y citoplasma homogéneo; Grado 4) ovocitos desnudos, sin unión de células cumulares; CCO expandidos con dispersión de células del cúmulo, ovocitos atrésicos y con vacuolización y/o contracción del citoplasma y células cumulares oscuras (Ayala et al., 2018).
Como segundo paso en la producción in vitro de embriones, los CCO de calidad 1 y 2 se introducen en medio de maduración in vitro (MIV) suplementado con 0.1 UI/ml de FSH, 10 % v/v de suero fetal bovino (fetal bovine serum, FBS) y 4 mg/ml de albúmina de suero bovino (bovine serum albumin, BSA). Posteriormente, se maduran en una placa de cultivo celular con medio IVM, cubriéndolo con 600 ml de aceite mineral durante 22 a 24 h en una incubadora de mesa a una temperatura de 38.8 °C en una atmósfera humidificada al 5 % de CO2 y 21 % de O2. Como tercer paso, ya terminado
el tiempo de maduración se realiza la fertilización in vitro con espermatozoides de bovinos frescos o congelados-descongelados. En este último caso, las pajillas de semen congeladas se retiran del nitrógeno líquido (NL2), se mantienen en el aire durante 10 s
y se colocan en baño maría (37 °C) durante 30 s. Posteriormente, el semen se coloca en un tubo de centrífuga cónico de 15 ml que contiene un sistema de gradiente de densidad discontinuo utilizado para separar y purificar los espermatozoides bovinos, el cual se centrifuga a 300 g durante 15 min. Los CCO se lavan en medio de FIV que contiene 4 mg/ml de BSA, 10 UI/ml de heparina, 25 µM de penicilamina, 12.5 µM de hipotaurina, y 1.25 µM de epinefrina. Posteriormente, se transfirieren a una placa de cultivo celular que contiene 300 ml de medio FIV y se cubren con 600 ml de aceite mineral. Después de centrifugar, se extrae el sedimento y se coloca en 500 ml de medio de dilución de espermatozoides y se centrifuga a 300 g durante 5 minutos. Finalmente, se retira el sobrenadante y se evalúa la concentración y motilidad espermática. Los espermatozoides procesados se agregan a los CCO a una concentración de 1 x 106
espermatozoides móviles/ml y se incuban a 38.8 °C con aire atmosférico humidificado al 5 % de CO2 y 21 % de O2 durante 18 a 22 h. Como último paso, después del período
de fertilización, las células del cúmulo se eliminan por pipeteo repetido. Los presuntos cigotos se lavan dos veces en medio de cultivo in vitro (CIV) (Vitro Cleave®)
suplementado con 4 mg/ml de BSA y 2 % v/v de FBS, luego se transfieren a un medio de CIV con 3.5 ml de aceite mineral y se incuban a 38.8 °C con aire atmosférico humidificado al 5 % de CO2, 6 % de O2 y 89 % de nitrógeno durante seis a siete días,
cuando se calificará la calidad y la etapa de desarrollo embrionario, para así transferirlos en fresco o someterlos a criopreservación (Do et al., 2018). Al respecto, Stewart et al. (2011) realizaron un estudio para comparar la TG con embriones producidos in vitro (blastocisto y blastocisto expandido, grado 1) fertilizados con semen sexado, transferidos en fresco y vitrificados en pajilla de 0.25 ml. Como receptoras, seleccionaron novillas y multíparas de la raza Holstein y Jersey. El diagnóstico de gestación lo realizaron al día 40 y 97 pos-transferencia. Los resultados mostraron
mayor TG al transferir en fresco en comparación con vitrificado tanto al día 40 de gestación (42.1 vs. 29.3 %) como al día 97 (36.4 vs. 25.7 %). En otro estudio realizado por Pereira et al. (2015), compararon la TG en primíparas y multíparas de la raza Holstein, transfiriendo embriones producidos in vitro (mórula compacta, blastocisto temprano y expandido; grado 1 en fresco. Las receptoras estaban con 163 ± 1.15 días en lactación, produciendo 30.6 ± 0.13 kg de leche/día, con CC de 2.88 ± 0.01 (escala de 1 a 5; emaciado a obeso), y con número de lactancia de 2.3 ±0.02. El diagnóstico de gestación lo realizaron al día 60 pos-transferencia. Los resultados no mostraron diferencia estadística (primíparas= 36.42 %; multíparas= 32 %).
1.3. Evaluación embrionaria 1.3.1. Desarrollo embrionario
La etapa de desarrollo del embrión es la que determina su clasificación, siendo el primer factor que se usa para evaluar su viabilidad y su posterior transferencia. Cuando se calcula la edad embrionaria esperada en el día de la colección, el día del estro se considera como el día 0 (Romo y Dorn, 2012). El desarrollo embrionario se evalúa utilizando un microscopio estereoscópico. De acuerdo con la IETS, el desarrollo embrionario se clasifica en ocho categorías: 1. Presunto cigoto; 2. Embrión de 2 a 16 células; 3. Mórula temprana; 4. Mórula compacta; 5. Blastocisto temprano; 6. Blastocisto; 7. Blastocisto expandido; 8. Blastocisto eclosionado (IETS, 2000).
1) Presunto cigoto. Es una célula grande, rodeada por una membrana vitelina, con apariencia lisa. Un cigoto y un óvulo no fertilizado no pueden distinguirse uno de otro con un microscopio estereoscópico, pero un óvulo fertilizado generalmente tiene dos cuerpos polares y un óvulo no fertilizado usualmente tiene uno.
2) Embrión de dos células. Se forma entre 36 y 48 h después del inicio del estro. Contiene dos células o blastómeros separados, con una membrana vitelina visible que rodea a cada una de las células.
2) Embrión de cuatro células. Contiene cuatro blastómeros separados y del mismo tamaño, con una membrana vitelina que rodea a cada uno. Se forma al tercer día después del estro.
2) Embrión de ocho células. Contiene ocho células o blastómeros separados, que parecen un racimo de uvas. Se forma cuatro días después del estro.
2) Embrión de 16 células. Contiene blastómeros individuales, que parecen adherirse unos a otros. Se forma entre el 4o y 5to día después del estro. Se mantiene una
agrupación o masa de células de forma esférica, en la cual se observan individualmente los blastómeros, sin embargo, es difícil realizar el conteo celular. La masa celular ocupa casi todo el espacio perivitelino.
3) Mórula temprana. Aproximadamente 32 células que están adheridas formando una masa compacta. Las células individuales apenas se pueden distinguir.
4) Mórula compacta. Tiene aproximadamente 64 células que se han adherido para formar una masa compacta. Se observa un borde ondulado en la parte exterior de la masa celular, y el citoplasma se observa con manchas. Se mantiene una compactación de la masa celular. En la periferia de la masa celular las células son esféricas. La observación individual de los blastómeros es imposible, la masa celular ocupa la mayor parte del espacio perivitelino.
5) Blastocisto temprano. Contiene alrededor de 160 células que ocupa casi todo el espacio perivitelino. Se empieza a formar una cavidad interna o blastocele a partir de células trofoblásticas que ocupa menos del 50 % de la masa celular del embrión. El blastocele se puede observar sobre la masa celular en una tonalidad de color claro. 6) Blastocisto. Se compone aproximadamente de 200 células. El blastocele se ha desarrollado y abarca más de la mitad de la totalidad del embrión, el cual ocupa todo el espacio perivitelino. La masa celular interna comienza a agruparse en uno de los lados del embrión. Esta etapa se caracteriza por una marcada diferenciación entre una capa de células grandes y aplanadas que se alarga y extiende en toda la periferia del embrión (trofoblasto), que rodea a una masa de células más pequeñas que se encuentran a un lado de la cavidad (masa celular interna, de color más oscuro y compacta). El trofoblasto formará la placenta y las membranas fetales, mientras que la masa celular interna dará origen al individuo.
7) Blastocisto expandido. El blastocele se ha expandido hasta llenar la zona pelúcida. Se pueden distinguir células trofoblásticas individuales en lados opuestos del blastocele, y la masa celular interna se localiza en una pequeña área dentro del trofoblasto. El embrión comienza a aumentar de tamaño en esta etapa, mientras que la zona pelúcida se va adelgazando aproximadamente a una tercera parte de su grosor normal a causa de la expansión. El embrión ocupa la totalidad del espacio perivitelino.
8) Blastocisto eclosionando de la zona pelúcida. Presenta más de 200 células al 8o o 9o
día. Las células del trofoblasto provocan que la zona pelúcida se expanda, hasta que se rompe. El embrión sigue expandiéndose y sale de la zona pelúcida. La zona pelúcida presenta una fisura por donde el embrión eclosiona o sale. paulatinamente, posteriormente comienza a alargarse y pierde su forma redonda. Es muy difícil identificar y distinguir a estos embriones entre los desechos endometriales que hay en la caja de recolección. Los blastocistos eclosionados también son más frágiles porque pierden la zona pelúcida que los protege. El embrión puede presentar la forma esférica de un blastocisto expandido, o puede colapsarse.
1.3.2. Calidad embrionaria
El grado de calidad del embrión es una indicación de sus posibilidades de desarrollo, y se determina mediante una evaluación morfológica para estimar el porcentaje aparente de viabilidad (Romo y Dorn, 2012). La IETS (2000) utiliza un sistema de cuatro categorías: Grado 1 (excelente), Grado 2 (bueno), Grado 3 (regular) y Grado 4 (degenerado). El sistema de grados está diseñado para identificar a los embriones que tienen mayor potencial para desarrollarse. Las características de cada grado son las siguientes:
Grado 1 (excelente): Embriones casi perfectos, con más del 98 % de su masa celular aparentemente activa y saludable. No hay blastómeros desprendidos y el embrión tiene forma redonda, color claro, desarrollo adecuado a su edad, pocas vesículas, sin desechos celulares ni blastómeros extruidos.
Grado 2 (bueno): Embriones con el 70-98 % de su masa celular aparentemente activa y saludable. Hay blastómeros desprendidos y puede ser que el embrión no tenga forma redonda; es compacto o con una leve inconsistencia (por lo menos el 50 % de las
células deben estar intactas), poco irregular, color uniforme, desarrollo adecuado a su edad, presencia de pocas vesículas y blastómeros extruidos y pocos desechos celulares. Grado 3 (regular): Embriones de baja calidad, con menos del 70 % de su masa celular aparentemente activa y saludable. Hay varios blastómeros desprendidos y el embrión puede tener forma irregular; se muestra una inconsistencia muy marcada (por lo menos el 25 % de las células deben estar intactas), hay desechos celulares, tiene color obscuro o presenta zonas claras y oscuras; también presenta vesículas, blastómeros extruidos y su masa celular interna es pequeña.
Grado 4 o degenerado (no transferible): Ninguna de sus masas celulares parecen estar activas y la mayoría de sus membranas están rotas. El embrión puede tener forma aplanada o cóncava. Estos embriones nunca deben tomarse en cuenta para ser transferidos. El embrión tiene una degeneración muy marcada; su masa celular interna es pequeña (menor al 25 % de lo normal), tiene color obscuro, presenta inconsistencia, vesículas o irregularidades en los blastómeros.
1.4. Criopreservación de embriones
La criopreservación de embriones tiene el objetivo principal de mantener una óptima viabilidad y funcionalidad celular a temperaturas bajo cero, que oscilan entre -80 °C y -196 °C, siendo posible detener casi por completo la actividad enzimática, metabolismo, respiración, crecimiento y multiplicación de la célula, permitiendo almacenar los embriones por largos periodos de tiempo sin afectar su viabilidad ni provocar cambios en su estructura genética (Gordon, 2003).
El desarrollo de la criopreservación de embriones bovinos se inició con los métodos de congelación lenta en la década de 1970 (Mapletoft y Hasler, 2005), lo que proporcionó ventajas como la eliminación de riesgos de transmisión de enfermedades, incremento en la descendencia de hembras donadoras, e introducción de alta calidad genética en hatos comerciales (Martínez, 2008).
Los periodos críticos para la sobrevivencia embrionaria durante la criopreservación son la fase inicial del congelamiento y el periodo de retorno (descongelado) a condiciones fisiológicas (Ávila et al., 2006). Las lesiones embrionarias inducidas por el congelamiento se deben a la formación de cristales de hielo, fracturas celulares,
deformación celular, y daños tóxicos y osmóticos como la formación de radicales libres, que causan daño celular y provocan una disminución en su viabilidad alterando la delicada interacción célula – célula inherente en los embriones a criopreservar (Vajta y Kuwayama, 2006; Rodríguez y Jiménez, 2011).
El fundamento biofísico de la criopreservación se basa en la necesidad de remover al máximo el agua intracelular antes de iniciar el descenso de la temperatura por debajo de los 0 °C para evitar daño celular (Vajta y Kuwayama, 2006). Durante el proceso, la temperatura disminuye y provoca que el agua del medio se cristalice, induciendo un aumento en las concentraciones de solutos extracelulares; la velocidad de congelamiento se desarrolla de forma lenta, provocando que la célula embrionaria sufra una deshidratación adecuada (Ávila et al., 2006).
A su vez, la membrana celular es el organelo que sufre mayor daño durante la congelación, debido a la pérdida rápida de fluidez en sus componentes lipídicos. Cuando se somete a procesos que involucran bajas temperaturas (25 a 16 °C), reduce su actividad fisiológica hasta un 60 %, induciendo en mayor grado la difusión pasiva y la ósmosis, para regular el estrés osmótico (Mendoza et al., 2000). Cuando se llega a temperaturas entre 10 a -16 °C, la membrana lipídica entra en una fase de transición, la cual se ve afectada por la fusión de los liposomas afectando el comportamiento de las membranas en la transición de líquido a gel (Arav, 2014) y la velocidad de penetración de los crioprotectores (Ávila et al., 2006; Díez et al., 2012), lo que altera su funcionalidad y provoca un alto índice de fracturas en la ZP; en contraste, durante la etapa de deshidratación celular puede presentar pérdidas de lípidos afectando su integridad y capacidad de expansión durante la rehidratación al volver a condiciones isotónicas (Seidel, 2006). Al llegar a este punto, los crioprotectores actúan reduciendo el estrés osmótico por sus propiedades coligativas, manteniendo la integridad física y disminuyendo la formación de hielo (Ávila et al., 2006).
Cuando se inicia la cristalización se libera energía en forma de calor de fusión, aumentando la temperatura hasta alcanzar el punto eutéctico de congelación, en donde casi toda el agua se solidifica (Gao y Critser, 2000). Al añadir crioprotectores se modifica la temperatura de solución de congelación, tornándola más baja, hecho que retarda la formación de cristales de hielo y disminuye la temperatura por debajo de los
0 °C, produciendo el descenso del punto eutéctico para deshidratar la célula y disminuir el gradiente osmótico, evitando daños celulares (Ávila et al., 2006; Lee et al., 2007). En sus inicios, los métodos de criopreservación incluían pajillas de vidrio, adicionadas en serie con dimetilsulfóxido (DMSO) diluido y un programa de enfriamiento de dos etapas de tres horas, que involucraban velocidades de enfriamiento de 0.1 a 0.3 °C/min. La biotecnología evolucionó a partir de pajillas de 0.25 ml, que contenían embriones equilibrados directamente en glicerol al 10 % y programas de tasa de enfriamiento de aproximadamente 0.4 °C por minuto, teniendo una duración en su desarrollo de 1.5 horas. Posteriormente, los protocolos se acortaron y simplificaron en gran medida, exponiendo a los embriones a glicerol al 10 % durante aproximadamente 10 minutos, siendo colocados en un congelador programable a una temperatura de -6.0 °C; después de inducir el seeding la temperatura baja entre 0.4 a 0.6 °C/min hasta los -32 °C, temperatura ideal para la inmersión en nitrógeno líquido (Hasler, 2014).
1.4.1. Crioprotectores
Los crioprotectores son sustancias químicas hidrosolubles de baja toxicidad que permiten la conservación de un tejido o de células por mucho tiempo cuando se las mantiene a baja temperatura, además, provocan la disminución del punto eutéctico en la solución. Dicho descenso implica que se alcanzará una concentración dada de solutos a una temperatura menor, de forma que la célula estará más deshidratada y el gradiente osmótico al que estará sometido será menor (Ávila et al., 2006; Díez et al., 2012).
Los crioprotectores son utilizados para disminuir los efectos provocados por lesiones tóxicas y osmóticas durante el proceso de criopreservación (Díez et al., 2012). Aunque cada crioprotector tiene características propias de acción, sus funciones generales son: mantener la estabilidad en la membrana celular, inducir la salida del agua intracelular del embrión, reducir la concentración de electrolitos del medio extracelular, y disminuir el punto eutéctico en la solución (Cabodevila y Teruel, 2001).
De acuerdo con la permeabilidad celular los crioprotectores se pueden dividir en dos categorías: permeables y no permeables.
1.4.1.1. Crioprotectores permeables
Son pequeñas moléculas de bajo peso molecular (PM) que penetran fácilmente en la membrana del embrión, formando enlaces de hidrógeno con moléculas de agua intracelular y disminuyendo la temperatura de congelación de la solución, lo que evita la formación de cristales de hielo (Ávila et al., 2006; Pereira y Marques, 2008). Entre estos crioprotectores se encuentran el glicerol (92 Da), el etanol (46 Da), DMSO (78 Da), etilenglicol (EG) (62 Da), propilenglicol (76 Da) y otros alcoholes (Ávila et al., 2006).
Kasai (1996) realizó un estudio comparando la velocidad de penetración de cinco crioprotectores en embriones producidos in vitro, dando como resultado que el EG reduce al mínimo el volumen del embrión sin ocasionar daños, a su vez permite que éste recupere su volumen original más rápido, evitando lesiones osmóticas. En el mismo estudio evaluaron las tasas de supervivencia embrionaria, determinando que el EG es el menos tóxico (98 %), seguido por el glicerol (88 %) y el DMSO (68 %), mientras que el propilenglicol (16 %) y la acetamida (0 %) resultaron ser muy tóxicos para el embrión.
Kuwayama (2007) menciona que una proporción igual de DMSO y EG, mediante el uso de un equilibrio en dos etapas y la suplementación con sacarosa en la concentración final, es la combinación más eficiente para vitrificar embriones. Por otro lado, Souza et al. (2018) comparon distintas proporciones de crioprotectores para la vitrificación de embriones bovinos producidos in vitro, concluyendo que la combinación de 25 % DMSO + 25 % EG + 1.0 M sacarosa junto con un corto tiempo de exposición mejora las tasas de reexpansión (65.2 %) y eclosión (68.2 %), en comparación con el protocolo con 12.5 % DMSO + 25 % EG + 12.5 % propilenglicol + 1 M sacarosa de larga exposición que obtuvo menores resultados (14.8 % y 6.9 %, respectivamente). Esto se debe a que existe una interacción positiva entre el EG y el embrión, que puede ser debida a su menor toxicidad y mayor facilidad de dejar la célula al momento de calentarlo, y al combinarlo con DMSO, que incrementa la permeabilidad de la membrana, favorece la introducción de mayores cantidades de crioprotectores a la célula.
1.4.1.2. Crioprotectores no permeables
Los crioprotectores no permeables son sustancias de alto PM (>100 Da) que se distribuyen en el espacio extracelular, normalmente asociados con agentes
crioprotectores permeables (Ávila et al., 2006; Pereira y Marques, 2008), que reducen la toxicidad de la solución y proveen protección contra el agrietamiento de la zona pelúcida (Pereira y Marques, 2008). Los embriones al someterse a vitrificación sufren deshidratación, la cual debe ser regulada durante el calentamiento. Para contrarrestar el estrés osmótico que se genera durante la rehidratación del embrión en la etapa de calentamiento, se exponen a concentraciones decrecientes de un soluto no permeable, generalmente se utiliza la sacarosa (342 Da), con la finalidad de establecer las condiciones isosmóticas naturales del embrión. Por su parte, la sacarosa actúa como un tampón osmótico, previniendo la entrada de agua al embrión y evitando que genere una lesión. En presencia de sacarosa, los embriones se encogen gradualmente a medida que los crioprotectores permeables se difunden pasivamente fuera del embrión. Finalmente, cuando se elimina el crioprotector, los embriones se rehidratan en un medio isotónico sin sacarosa y se rehidratan hasta alcanzar un volumen normal (Rall, 1992; Gupta et al., 2016).
La mayoría de las soluciones utilizadas para criopreservar ovocitos bovinos y vitrificar embriones contienen suero fetal bovino o albúmina de suero bovino como componente macromolecular, aunque también se utilizan otros crioprotectores no permeables como la galactosa (180 Da), glucosa (180 Da), polivinilpirrolidona (PVP) (2,500 Da) y proteínas de alto peso molecular (Pereira y Marques, 2008).
1.4.2. Vitrificación
La vitrificación es la transición de una solución acuosa del estado líquido al estado vítreo (sólido) sin pasar por el estado sólido cristalino, por lo que se ha desarrollado como una alternativa para la criopreservación de embriones, ya que simplifica y acelera considerablemente el proceso de criopreservación sin requerir de costosos equipos (Papadopoulos et al., 2002; Vajta y Kuwayama, 2006).
La estrategia de la vitrificación es básicamente diferente a la congelación por curva lenta, ya que mantiene un balance delicado entre diversos factores tales como la formación de cristales de hielo extracelular e intracelular que lesionan las membranas celulares y orgánulos, evita el daño osmótico, la toxicidad de los electrolitos concentrados, alteraciones del citoesqueleto, disminuye el efecto tóxico de los crioprotectores y minimiza las fracturas de la zona pelúcida (Kasai, 1996; Vajta y Kuwayama, 2006). Esta técnica de criopreservación utiliza altas concentraciones de
crioprotectores y altas tasas de enfriamiento y calentamiento, que a su vez permiten un pasaje rápido a través de la zona de temperatura de peligro que oscila entre 15 y -5 °C (Papadopoulos et al., 2002). Una estrategia para evitar la toxicidad de una solución de vitrificación es acortar el tiempo de exposición de los embriones a la solución, sin embargo, si la exposición es demasiado corta, la penetración del crioprotector no es suficiente y se puede formar hielo intracelular incluso si no hay hielo extracelular, por lo tanto, el tiempo de exposición óptimo para una vitrificación exitosa es crucial para prevenir lesiones tóxicas y prevenir la formación de hielo intracelular (Kasai, 1996). 1.4.2.1. Vitrificación de embriones bovinos
Martino et al. (1996) reportaron bajas tasas de lesión embrionaria ocasionadas por vitrificación ultrarrápida, sumergiendo un óvulo en nitrógeno líquido, dando como resultado la disminución del volumen de solución de vitrificación y altas tasas de supervivencia después de la preservación (68 a 98 %) (Kasai, 1996; Kuwayama, 2005). Sin embargo, se menciona que al minimizar el volumen de solución de vitrificación aumenta la tasa de enfriamiento y calentamiento hasta 40,000 °C/S, disminuyendo la posibilidad de formación de cristales de hielo, de fracturas en el embrión y en la zona pelúcida, de daño al citoesqueleto y al contenido lipídico de la membrana, y aumenta la supervivencia y desarrollo embrionario, dando como resultado el aumento del número de crías nacidas en comparación con curva lenta, tanto en embriones producidos in vivo como in vitro (Kuwayama, 2007; Dos santos-Neto et al., 2017). Con base en lo anterior, la mejora de un protocolo de vitrificación de embriones puede ser lograda gracias al reemplazo del agua intracelular por los crioprotectores permeables durante el periodo de equilibrio y a la mínima presencia de estos crioprotectores en el citoplasma pos-calentamiento (Isachenko et al., 2003).
Las estadísticas de supervivencia y desarrollo de embriones, tanto producidos in vitro como in vivo, proporcionan pruebas convincentes de que la vitrificación no excede los efectos causados por toxicidad química, estrés osmótico y otros efectos nocivos durante el proceso, además, están bastante por debajo de los causados por la congelación por curva lenta (Kuwayama, 2007).
1.4.2.2. Vitrificación en Microdrop®
El método de vitrificación de embriones bovinos por Microdrop fue descrito por Dinnyés et al. (2000) y modificado por An et al. (2016). En primera instancia, los embriones se
lavan tres veces en medio de lavado y mantenimiento de embriones isotónicos (Holding; Renova Life Inc., College Park, MD, EUA), para luego ser tratados con tripsina al 0.25 % (Gibco, Grand Island, NY, EUA) durante 1 min. Posteriormente, los embriones con zona pelúcida intacta se lavan seis veces en medio Holding. Las soluciones de vitrificación y los medios de calentamiento se preparan utilizando solución buffer fosfato (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, D-PBS, Renova Life Inc., EUA). Para realizar la vitrificación, se preparan las siguientes soluciones: (I) solución de lavado de embriones, que contiene 7.5 % de suero fetal bovino (Foetal Bovine Serum, FBS; Hyclone, Logan, EUA) en D-PBS, suplementado con 100 UI/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina; (II) solución basal de embrión, preparada con FBS al 15 % en D-PBS, suplementada con la misma concentración de penicilina y estreptomicina; (III) solución de vitrificación, que contiene medio basal suplementado con 2.3 M de DMSO, 2.7 M de EG y sacarosa, con un pH de 7.8 (kit de vitrificación; Renova Life Inc. EUA). Como primer paso, los embriones se incuban durante 5 minutos en solución de lavado, seguido de incubación en solución basal y mantenimiento durante 3 minutos a 39 °C; después, los embriones se lavan en una gota de 20 µl de solución de vitrificación; posteriormente, cada embrión se extrae en una gota de 3 µl de solución de vitrificación con una pipeta de vidrio separada (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA), para luego dejar caer directamente en nitrógeno líquido. Subsecuentemente, los Microdrop se transfieren a crioviales (Corning, Corning, NY, EUA) enfriados en nitrógeno líquido, sellados y finalmente almacenados en un termo criogénico para su almacenamiento a largo plazo.
Para poder ser transferidos, los embriones vitrificafos son calentados a temperatura ambiente. Se utiliza solución de calentamiento (TS), compuesta por solución buffer fosfato (PBS; Phosphate buffered saline, SIGMA-ALDRICH®, México), sustituto de suero
sintético (SSS) al 20 % [Serum Replacement 1 (50×), SIGMA-ALDRICH®, México] y 1
M de sacarosa (SIGMA-ALDRICH®, México), solución de dilución (DS), compuesta de
PBS con SSS al 20% y 0.5 M de sacarosa, y solución de lavado (WS), compuesta de PBS con SSS al 20%.
Los embriones se colocan en 500 µl de TS en una caja de Petri (100 X 15 mm, Petri
Dish with Cover, Corning®, EUA) a 37 °C. En otra caja de Petri (100 X 15 mm) se
añaden 2 gotas de DS y 3 gotas de solución de WS de 20 µl cada una a temperatura ambiente. Los crioviales se extraen del termo criogénico, se destapan y se colocan los
Microdrop en un recipiente con NL2, posteriormente, con unas pinzas previamente
enfriadas se localizan las perlas y se sumergen rápidamente en TS durante 1 min. Los embriones se colocan en DS por dos minutos en cada gota y por último se sumergen en WS por 3 min en cada gota (Kuwayama, 2007). Una vez calentados, los embriones son cargados en pajillas de transferencia y se transfieren a las receptoras.
Al respecto, Trigal et al. (2012) determinaron la TG con embriones producidos in vitro y fertilizados con semen sexado, vitrificados por el método Microdrop. Las receptoras seleccionadas fueron novillas Bos taurus x Bos indicus, edad entre 15 a 18 meses y CC de 3±0.5 (escala 1 a 5). La TG reportada fue de 42 %, sin reportar pérdidas embrionarias. Por otro lado, An et al. (2016) determinaron la TG en novillas Angus, Simental y Bos taurus x Bos indicus, con embriones producidos in vivo, grado 1 y 2, en estado de desarrollo de mórula y blastocisto, transferidos en fresco o vitrificados por el método Microdrop®. El diagnóstico de gestación se realizó al día 60 pos-transferencia.
La TG fue similar tanto con transferidos en fresco como vitrificados (47.1 % y 39.7 %, respectivamente).
1.4.2.3. Vitrificación en Cryotop®
El Cryotop® es un dispositivo utilizado para la vitrificación de embriones que contiene
una fina tira de polipropileno, delgada y estrecha (0.4 mm de ancho, 20 mm de largo y 0.1 mm de espesor) unida a un soporte de plástico duro. Para proteger el dispositivo de daños mecánicos durante el almacenamiento, se coloca una tapa de plástico de 3 cm de largo sobre el dispositivo para cubrir la fina tira de polipropileno (Kuwayama, 2007).
Para vitrificar los embriones se utiliza la técnica descrita por Kuwayama (2007). Se utiliza solución de equilibrio (ES) compuesta de PBS al 20 %, de sustituto de suero sintético (SSS), más 7.5 % de EG y 7.5 % de DMSO, y solución de vitrificación (VS), compuesta de PBS al 20 % de SSS más 15 % de EG, 15 % de DMSO y 0.5 M de sacarosa. En un plato de Petri se coloca una gota de ES y 4 gotas de VS de 20 μl cada una. Posteriormente, cada uno de los embriones se coloca en la gota de ES de 5 a 15 minutos, después se pasan por las 4 gotas de VS durante 5, 5 y 10 segundos con un lavado respectivo. Inmediatamente después de ser lavados en la última gota de VS, cada embrión se carga con un capilar de vidrio estrecho en la parte superior de la fina tira en un volumen <0.1 ml. Después de la carga, se elimina casi toda la solución para
dejar solo una capa delgada que cubra los embriones, y la muestra se sumerge rápidamente en NL2. Posteriormente, se coloca la tapa de plástico sobre la parte final
de la tira del Cryotop® y se almacena dentro del termo criogénico.
El enfoque de volumen mínimo del dispositivo Cryotop® aumenta las tasas de
enfriamiento, y especialmente el calentamiento (hasta 40 000 °C/min), lo que puede contribuir a mayores tasas de supervivencia y de desarrollo, tanto in vitro como in vivo (Sanches et al., 2013). Un estudio realizado por Sanches et al. (2013) determinaron la TG en receptoras Bos indicus y Bos taurus x Bos indicus transfiriendo blastocistos producidos in vitro vitrificados por el dispositivo Cryotop®. La TG general que obtuvieron
fue del 48.8 %, por otro lado, no encontraron diferencias estadísticas respecto a la variable raza de las receptoras (Bos taurus x Bos indicus= 42.5; Gyr= 44.8; Guzerat= 40.3; y Nelore= 43.2 %). En México, Naranjo et al. (2016) realizaron un estudio en los estados de Veracruz y Guerrero, transfiriendo embriones producidos in vivo vitrificados por el dispositivo Cryotop a receptoras multíparas Bos taurus x Bos indicus. Los resultados que obtuvieron fueron similares en ambos estados (20 vs. 27 %). Un estudio realizado por Zárate et al. (2018) reportó TG de 64 % en receptoras Bos taurus x Bos indicus con embriones producidos in vivo (blastocistos expandidos) vitrificados con el dispositivo Cryotop®. Por otro lado, Do et al. (2018) determinaron la TG en receptoras
multíparas de raza Angus, Brahaman y Droughtmaster, utilizando embriones producidos in vitro vitrificados en diferente etapa de blastocisto (temprano, expandido y eclosionado) comparado con su control en fresco, y no obtuvieron diferencia estadística entre la TG con embriones transferidos en fresco o vitrificados (41 vs. 34 %, respectivamente), además, la etapa de blastocisto al momento de la transferencia (temprano, expandido y eclosionado) no tuvo efecto sobre la TG (30 vs. 40 vs. 50 %, respectivamente).
1.5. Transferencia de embriones en ganado bovino
El objetivo principal de la TE es aumentar las tasas de reproducción de hembras genéticamente valiosas. Debido a las bajas tasas de reproducción y los largos intervalos generacionales en los bovinos, esta biotecnología resulta ser altamente útil. El ganado puede ser valioso por muchas razones, ya sea por su valor genético comprobado o por tener características únicas como la resistencia a enfermedades. Idealmente la transferencia de embriones se utiliza para satisfacer objetivos tanto genéticos como financieros simultáneamente, es decir, aumentar la producción de leche o carne o
aumentar su eficiencia. Es posible aumentar las tasas de reproducción de vacas valiosas en un promedio de 10 veces o más en un año determinado y cinco veces o más de por vida con las técnicas actuales de TE (Alkan et al., 2020; Mebratu et al., 2020).
El uso de la TE como biotecnología de reproducción asistida se basa en la transferencia de embriones de seis a siete días de desarrollo (Block et al., 2010). En los programas de TE a gran escala se han identificado muchos factores que afectan su éxito y uso generalizado, que en particular afectan la TG, y entre los que se incluyen la selección, manejo y protocolos de sincronización en receptoras, factores iatrogénicos, ambientales, así como origen y grado embrionario al momento de realizar la TE (Bó et al., 2012; Ferraz et al., 2016; Roper et al., 2018).
1.5.1. Selección y manejo de receptoras
La selección de receptoras se realiza con base en diversos criterios, como son: estar clínicamente sanas y tener buen historial reproductivo, condición corporal (CC) óptima, presencia de ciclicidad ovárica, ya sea por estro natural o inducido, demostrar la presencia de un cuerpo lúteo (CL) y presentar un cérvix viable para realizar la técnica de TE (Houghton et al., 1990; Bó et al., 2002; Solórzano et al., 2008).
Hasler (2014) menciona que para lograr altas tasas de gestación en programas de transferencia de embriones se deben utilizar no sólo embriones de buena calidad, sino también receptoras saludables, ya que las bajas tasas de gestación comúnmente se deben a problemas en el manejo de la receptora y no a la biotecnología en sí. Por otro lado, Baruselli et al. (2010) sugieren que es ventajoso transferir a receptoras con alta concentración de progesterona (P4) y con mayor tamaño de CL cuando se trabaja en ganado de cría en pastoreo. Rodríguez et al. (2007) mencionan que se pueden obtener mejores resultados cuando se transfieren embriones de calidad excelente en receptoras con CL >14 mm de diámetro.
Por otro lado, las vaquillonas son seleccionadas principalmente como receptoras porque es menos probable que se encuentren bajo estrés nutricional o que tengan una historia de problemas sanitarios, además el útero virgen es más apropiado para recibir un embrión transferido (Cutini et al., 2000). Por su parte, receptoras Bos taurus y Bos indicus poseen diferencias en su fisiología reproductiva (Baruselli et al., 2011). Específicamente, el ganado Bos indicus tiene una mayor sensibilidad a las
gonadotropinas, una duración más corta del estro y con mayor frecuencia expresa el estro durante la noche (Bó et al., 2003). Además, este tipo de receptoras producen más folículos ováricos reclutados por onda folicular en comparación con Bos taurus (30 a 60 vs. 15 a 33, respectivamente) (Sartori et al., 2010), sin embargo, el diámetro del folículo dominante es menor (10 a 12 vs. 14 a 20 mm, respectivamente), por lo que se asocia a un menor tamaño de CL (17 a 21 vs. 20 a 30 mm respectivamente) (Bó et al., 2003) y a una menor producción de P4 (CL <14 mm= 0.96 ng/ml; CL 15-20 mm= 1.30 ng/ml; CL >20 mm= 2.38 ng/ml), que tendría repercusiones en la TG, siendo menor en aquellas receptoras con CL de menor tamaño (CL <14 mm= 31 %; CL 15-20 mm= 41 %; CL >20 mm= 58 %) (Baruselli et al., 2003).
Ferraz et al. (2016) reportaron que al seleccionar receptoras nulíparas se obtienen mejores TG en comparación con hembras primíparas o multíparas (42 vs. 37 vs. 31 %, respectivamente); en cuanto a la calidad del embrión, mencionan que al utilizar embriones de calidad excelente se incrementan las TG hasta un 10 %; asimismo, al realizar la TE en el día 7 u 8 se observan mejores resultados en comparación con los días 6 y 9 (40.9 vs. 36.6%); en contraste, mencionan que se obtiene mayor TG cuando las transferencias se realizan bajo un Índice de Temperatura y Humedad (ITH) menor de 79 % (39 % en TG). García et al. (2019) difieren en los resultados de TG obtenidos en hembras Suizo Americano en trópico, donde mencionan que no hay diferencia en la utilización de receptoras multíparas vs. novillas (85 vs. 62 %); además, mencionan que la hora del estro (mañana y tarde) y el estadio de desarrollo del embrión (blastocisto y blastocisto expandido) no afectan la TG, sin embargo, las multíparas expresan una mayor respuesta al estro en comparación con las novillas.
Por otro lado, Hasler (2001) comparó la TG entre novillas y vacas multíparas de la raza Holstein Friesian, obteniendo mejores resultados con la utilización de novillas al transferir en fresco embriones producidos in vivo (70.5 vs. 52.8 % respectivamente), sin embargo, cuando transfirió a novillas y vacas multíparas de carne no obtuvo diferencias (65.9 vs. 68.6 %).
1.5.1.1. Factores que afectan la tasa de gestación en receptoras
Existen numerosos factores que pueden influenciar el establecimiento de una gestación como resultado de la transferencia de embriones, como son los factores iatrogénicos y
ambientales, en particular dentro de estos últimos el estrés por calor (Hasler, 2004; Roper et al., 2018).
1.5.1.1.1. Factores iatrogénicos
El lugar de depósito del embrión en el útero, la dificultad para realizar la transferencia y el tiempo aproximado en completarla han sido los factores más estudiados. Bó et al. (2012) y Roper et al. (2018) mencionan que la TG no se ve influida por el técnico que realiza la TE. Por otro lado, la localización anatómica donde se deposita el embrión (tercio craneal, medio y caudal del cuerno uterino) no afecta las TG (Roper et al., 2018). Sin embargo, se ha mencionado que la TG aumenta cuando existe una sincronía entre el ambiente uterino y la etapa de desarrollo del embrión al momento de la transferencia (Barnes, 2000). Asimismo, se ha determinado como un factor predisponente para que se lleve a cabo la gestación, las secreciones del tracto reproductivo, ya que fisiológicamente son diferentes dependiendo del órgano y de la etapa del ciclo estrual en que se encuentre la receptora (Hugentobler et al., 2007). En cuanto a la dificultad en realizar la TE, se determinó que no es un factor que afecte los resultados; por otro lado, el tiempo necesario que se lleva para realizar la TE es un factor que predispone a reabsorción embrionaria, siendo ideal realizar la TE en menos de 9 minutos, aproximadamente, tiempo transcurrido desde que se introduce la mano en el recto hasta que se deposita el embrión (Roper et al., 2018), esto debido a que, una manipulación excesiva con la finalidad de obtener acceso al sitio más craneal del cuerno uterino puede estimular la secreción de prostaglandina F2 alfa (PGF2α) (Wann y Randel, 1990), afectando la TG, ya que las células de un embrión en estado de mórula y blastocisto poseen receptores en su membrana plasmática para PGF-2α provocando lisis celular (Scenna et al., 2004).
1.5.1.1.2. Estrés por calor
Otra de las variables a tomar en cuenta para realizar la TE es el estrés calórico, el cual, se define como un entorno que actúa para impulsar la temperatura corporal por encima de la temperatura de ajuste (Hansen, 2009), lo que ocasiona alteraciones en el confort térmico de las receptoras, el cual es regulado por mecanismos fisiológicos como el aumento en la tasa de respiración, pulso, sudoración y vasodilatación (Arias et al., 2008). La especie Bos taurus tiene una mayor susceptibilidad al estrés calórico ya que es menos eficiente para regular la temperatura corporal, debido a que la pérdida de calor depende en su mayoría de la evaporación por vía respiratoria, y en menor grado,
por la sudoración, lo que afecta de manera exponencial el desempeño reproductivo (Duica et al., 2007).
Los bovinos, como grupo endotermo, tienen la característica de tolerar mejor las bajas temperaturas, sin embargo, cuando se someten a altas temperaturas por encima del punto de ajuste corporal, ocasionan interrupciones en la fluidez de membranas celulares, en la estructura de las proteínas, y sobre todo pérdida de líquidos y electrolitos; por lo cual, en los endotermos la regulación corporal puede considerarse un medio de control homeocinético, por lo que el logro del equilibrio de la temperatura corporal implica procesos dinámicos que producen perturbaciones en otros procesos fisiológicos como la reproducción (Hansen, 2009). En contraste, se ha demostrado que las receptoras Bos taurus x Bos indicus presentan una mayor adaptabilidad a condiciones de calor extremo y mayor resistencia a los efectos producidos por el estrés calórico (Garrett et al., 1988; Duica et al., 2007).
El estrés calórico puede ocasionar interrupciones en los procesos reproductivos a través de dos mecanismos generales: 1) los cambios homeocinéticos para regular la temperatura corporal provocan la redistribución del riego sanguíneo desde el núcleo del cuerpo hacia la periferia, y 2) el estrés provoca una disminución en la ingesta de alimento, reduciendo la producción de calor metabólico, lo que ocasiona cambios en el equilibrio energético y una baja disponibilidad de nutrientes que puede llegar afectar la ciclicidad, el establecimiento de la gestación y el desarrollo fetal (Hansen, 2019). El embrión en su inicio de desarrollo es más susceptible al estrés calórico materno, sin embargo, dicha susceptibilidad disminuye a medida que avanza en su desarrollo fisiológico (Hansen, 2019). Ealy et al. (1993) demostraron que al exponer una vaca a estrés por calor en el día 1 (embrión de 1 y 2 células) después al celo disminuye la proporción de embriones que se desarrollan hasta la etapa de blastocisto; por el contrario, cuando la someten a estrés en los días 3 (embrión de 8-16 células), 5 (mórula) y 7 (blastocisto), no hay un efecto negativo en la producción de embriones al día 8.
Se ha determinado que el estrés calórico sobre el embrión preimplantado provoca una mayor producción de especies reactivas de oxígeno (ROS, Reactive Oxygen Species), sin embargo, cuando es mayor a 4 días en su desarrollo disminuye la producción de
