Caracterización y variabilidad palinológica de ocho especies de cactáceas de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira y de la Universidad del Valle sede Meléndez [recurso electrónico]

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(1)CARACTERIZACIÓN Y VARIABILIDAD PALINOLÓGICA DE OCHO ESPECIES DE CACTÁCEAS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA Y DE LA UNIVERSIDAD DEL VALLE SEDE MELÉNDEZ. JOHAN KELBER HOME RAMÍREZ. UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA SANTIAGO DE CALI 2012.

(2) CARACTERIZACIÓN Y VARIABILIDAD PALINOLÓGICA DE OCHO ESPECIES DE CACTÁCEAS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA Y DE LA UNIVERSIDAD DEL VALLE SEDE MELÉNDEZ. JOHAN KELBER HOME RAMÍREZ. Proyecto de Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar al título de Biólogo con mención en Botánica.. Directora CREUCÍ MARÍA CAETANO Bióloga, Ph.D.. Codirectora ALBA MARINA TORRES GONZÁLEZ Bióloga, M.Sc., Ph.D.. UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA SANTIAGO DE CALI 2012.

(3) UNIVERSIDAD DEL VALLE. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS. PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA. JOHAN KELBER HOME RAMÍREZ, 1988. CARACTERIZACIÓN Y VARIABILIDAD PALINOLÓGICA DE OCHO ESPECIES DE CACTÁCEAS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA Y DE LA UNIVERSIDAD DEL VALLE SEDE MELÉNDEZ. MATERIAS O TEMAS: Cactaceae, palinología, palinotaxonomía, morfología polínica, morfometría polínica, microscopía..

(4) ii. NOTA DE APROBACIÓN. El trabajo de grado titulado “Caracterización y variabilidad palinológica de ocho especies de cactáceas de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira y de la Universidad del Valle sede Meléndez”, presentado por el estudiante JOHAN KELBER HOME RAMÍREZ, para optar por el título de Biólogo, fue revisado por el jurado y calificado como: APROBADO. _________________________________ Creucí María Caetano Ph.D. Directora. _________________________________ Alba Marina Torres González M.Sc., Ph.D. Codirectora. _________________________________ Olga Lorena Cortés Ceballos Jurado.

(5) iii. DEDICATORIA. A mi abuela Isabel y mi mamá, por haber creído en mí y darme su completo apoyo y a todos los que me acompañan en esta aventura de la ciencia..

(6) iv. AGRADECIMIENTOS A mi familia por que siempre he contado con su apoyo, nunca me han dejado solo y han dado lo mejor para que yo esté bien. A mis amigos por su amistad incondicional.. A mi directora Creuci María Caetano por haberme dado esta magnífica oportunidad, por su apoyo, orientación y confianza. A Efrén Muñoz por iniciarme en la palinología y por su asesoría invaluable durante todo el proceso del proyecto de grado. A la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira por permitirme usar su infraestructura de investigación como el banco de germoplasma y el laboratorio de microscopía y citogenética.. A mi codirectora Alba Marina Torres por su enorme colaboración, apoyo y confianza durante el desarrollo de este trabajo, además por haber dejado su huella en mi formación como científico y persona. A la Universidad del Valle sede Meléndez, a la facultad de ciencias, al departamento de biología y a la sección de botánica por que en sus instalaciones recibí una formación de calidad. A todos los profesores que con su conocimiento me formaron como biólogo. Al laboratorio de microscopía electrónica de la escuela de ingeniería de materiales y a su técnico Irvin Castro que me colaboraron con la toma de las micrografías.. Al herbario CUVC y a su director Philip Silverstone-Sopkin por haberme permitido trabajar en sus instalaciones y por haberme formado en la botánica. A Edier Soto por su asesoría en los análisis estadísticos..

(7) v. TABLA DE CONTENIDO Página 1. RESUMEN……………………………………………………………………………...1 2. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………...3 3. MARCO TEÓRICO………………………………………………………………….. 6 3.1. Palinología………………………………………………………………………….6 3.1.1. Definición……………………………………………………………………6 3.1.2. Historia………………………………………………………………………6 3.1.3. Métodos de preparación de material polínico………………………………..9 3.1.4. Morfología polínica………………………………………………………10 3.1.5. Palinotaxonomía……………………………………………………………10 3.2. La familia Cactaceae………………………………………………………………13 4. OBJETIVOS…………………………………………………………………………..15 4.1. Objetivo general…………………………………………………………………...15 4.2. Objetivo específico………………………………………………………………..15 5. HIPÓTESIS…………………………………………………………………………...16 6. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………….17 6.1. Área de estudio…………………………………………………………………….17 6.2. Colección y procesamiento de material polínico………………………………….18 6.3. Montaje de placas para microscopía óptica……………………………………….20 6.4. Observación y medición del polen en microscopio óptico………………………..21 6.5. Microscopía electrónica de barrido (MEB) para polen acetolizado………………22 6.6. Análisis estadístico de los datos…………………………………………………..23 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.……………………………………………………..25 8. CONCLUSIONES.……………………………………………………………………50 9.. LITERATURA CITADA……………………………………………………………51. ANEXO A………………………………………………………………………………..58 ANEXO B..………………………………………………………………………………62.

(8) vi. LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1.. Mapa del departamento del Valle del Cauca mostrando con área entramada los municipios de Cali y Palmira, donde se encuentran ubicadas la Universidad del Valle sede Meléndez y La Universidad Nacional sede Palmira……………………………………….17. FIGURA 2.. Esquema del campus de la Universidad Nacional sede Palmira, Valle del Cauca, donde se observa el banco de germoplasma de pitahaya……………………………………………………………………19. FIGURA 3.. Esquema del campus Meléndez de la Universidad del Valle, Valle del Cauca, donde se observan los lugares de cultivo de los cactus……….19. FIGURA 4.. Esquema de las placas montadas con polen de Cactaceae para observación del polen en microscopía óptica……………………………..21. FIGURA 5.. Mediciones del eje polar en vista ecuatorial, realizadas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas del banco de germoplasma de la Universidad Nacional sede Palmira y de la Universidad del Valle sede Meléndez…………………………………….34. FIGURA 6.. Mediciones del eje ecuatorial en vista ecuatorial, realizadas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas del banco de germoplasma de la Universidad Nacional sede Palmira y de la Universidad del Valle sede Meléndez…………………………………..35. FIGURA 7.. Mediciones del eje ecuatorial en vista polar, realizadas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas del banco de germoplasma de la Universidad Nacional sede Palmira y de la Universidad del Valle sede Meléndez……………………………………..36. FIGURA 8.. Mediciones del área de apocolpio, realizadas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas del banco de germoplasma de la Universidad Nacional sede Palmira y de la Universidad del Valle sede Meléndez……………………………………..37. FIGURA 9.. Índice de relación eje polar/eje ecuatorial, obtenido por MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas del banco de germoplasma de la Universidad Nacional sede Palmira y de la Universidad del Valle sede Meléndez……………………………..39.

(9) vii. FIGURA 10. Mediciones del grosor de sexina, realizadas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas del banco de germoplasma de la Universidad Nacional sede Palmira y de la Universidad del Valle sede Meléndez……………………………………..40 FIGURA 11. Valores promedio de mediciones de grosor de nexina, realizadas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas del banco de germoplasma de la Universidad Nacional sede Palmira y de la Universidad del Valle sede Meléndez……………………………….41 FIGURA 12. Dendrograma del análisis de grupos usando el algoritmo de grupos pareados y medida de similitud Bray-Curtis de las mediciones de caracteres cuantitativos, obtenidos de observaciones en MO y MEB sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas del banco de germoplasma de la Universidad Nacional sede Palmira y de la Universidad del Valle sede Meléndez……………………………………………………………..42 FIGURA 13. Polen de Hylocereus polyrhizus, observado en MO a 400 y 1000 aumentos. A y B vista polar a 400 X con enfoque sobre la superficie del grano. C vista polar a 400 X con enfoque sobre el margen del grano. D vista ecuatorial a 400 X enfoque sobre los dos colpos laterales. E y F vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre el colpo central. G y H vista lateral de exina a 1000 X, a espínula, b columela……………62 FIGURA 14. Superficie del polen de Hylocereus polyrhizus, observado en MEB a 4000 y 7000 aumentos. A superficie a 7000 X, a espínula, b perforación de la exina (puncta), c engrosamiento de margen externo de puncta (Annulus). B, C y D superficie a 4000 X donde se observan espínulas y perforaciones………………………………………………….63 FIGURA 15. Polen de Hylocereus costaricensis observado en MO a 400 y 1000 aumentos. A vista polar a 400 X con enfoque sobre la superficie del grano. B vista polar a 400 X con enfoque sobre el margen del grano. C y D vista ecuatorial a 400 X enfoque sobre los dos colpos laterales. E y F vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre el colpo central. G y H vista lateral de exina a 1000 X, a espínula, b columela……………64 FIGURA 16. Grano de polen de Hylocereus costaricensis observado en MEB a 1000 y 4000 aumentos. A vista ecuatorial a 1000 X, a colpo. B, C y D superficie a 4000 X donde se observan espínulas y perforaciones rodeadas por Annulus, a procesos espinosos de dos puntas……………....65.

(10) viii. FIGURA 17. Polen de Hylocereus undatus, observado en MO a 400 y 1000 aumentos. A, B y C vista polar a 400 X con enfoque sobre el margen del grano, se alcanza a notar la ornamentación de espínulas. D vista ecuatorial a 400 X enfoque sobre el margen del grano, se observan los tres colpos (dos laterales y uno central). E vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre el margen del grano, se observa un colpo. F vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre colpo central. G y H vista lateral de exina a 1000X……………….…………………….66 FIGURA 18. Grano de polen de Hylocereus undatus, observado en MEB a 4000 aumentos. A, B, C y D superficie a 4000 X donde se observan espínulas y perforaciones rodeadas por Annulus, a proceso espinoso de dos puntas…………………………………………………………………67 FIGURA 19. Polen de Selenicereus megalanthus, observado en MO a 400 y 1000 aumentos. A vista polar a 400 X con enfoque sobre la superficie del grano. B vista polar a 400 X con enfoque sobre el margen del grano. C vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre el colpo central. D vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre el margen del grano. E y F vista lateral de exina a 1000 X, a espínula……………………………………...68 FIGURA 20. Grano de polen de Selenicereus megalanthus, observado en MEB a 4000 aumentos. A superficie a 4000 X donde se observa abertura. B, C y D superficie a 4000 X donde se observan espínulas y perforaciones rodeadas por Annulus, a espínulas dobles………………………………...69 FIGURA 21. Polen de Hylocereus sp., observado en MO a 400 y 1000 aumentos. A vista polar a 400 X con enfoque sobre el margen del grano. B vista polar a 400 X con enfoque sobre la superficie del grano. C vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre los dos colpos laterales. D vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre el colpo central. E vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre el margen del grano. F, G y H vista lateral de exina a 1000 X, a espínula, b columela…………………………………………...70 FIGURA 22. Grano de polen de Hylocereus sp., observado en MEB a 4000 y 15000 aumentos. A corte transversal de exina a 15000 X, a espínula, b columela. B, C y D superficie a 4000 X donde se observan espínulas y perforaciones rodeadas por Annulus………………..…………………..71.

(11) ix. FIGURA 23. Polen de Acanthocereus tetragonus, observado en MO a 400 y 1000 aumentos. A y B vista polar a 400 X con enfoque sobre superficie del grano. C vista polar a 400 X con enfoque sobre el margen del grano. D y E vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre los dos colpos laterales. F vista lateral de exina a 1000 X, a espínula………………….72 FIGURA 24. Grano de polen de Acanthocereus tetragonus, observado en MEB a 1000, 4000 y 15000 aumentos. A vista polar a 1000 X. B corte transversal de exina a 15000 X, a espínula, b columela, c puncta, d annulus. C vista de corte transversal de exina a 4000 X D superficie a 4000 X donde se observan espínulas y perforaciones rodeadas por Annulus……………...73 FIGURA 25. Polen de Pereskia bleo, observado en MO a 400 y 1000 aumentos. A, B y C vista polar a 400 X con enfoque sobre las aberturas y la superficie del grano. D vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre aberturas. E vista polar a 400 X con enfoque sobre el margen del grano. F, G y H vista transversal de exina a 1000 X, a columela………………………………74 FIGURA 26. Grano de polen de Pereskia bleo observado en MEB a 1000, 4000 y 15000 aumentos. A vista ecuatorial a 1000 X con aberturas. B vista superficial de exina a 15000 X, a espínula, b puncta, c annulus. C vista superficial a 4000 X con abertura. D corte transversal de exina a 15000 X, a columela…………………………………………………...75 FIGURA 27. Polen de Epiphyllum oxypetalum, observado en MO a 400 y 1000 aumentos. A y C vista polar a 400 X con enfoque sobre el margen del grano. B vista polar a 400 X con enfoque sobre superficie del grano. D vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre colpo central. E y F vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre los dos colpos laterales. G y H vista transversal de exina a 1000 X, a espínula, b columela……………..76 FIGURA 28. Grano de polen de Epiphyllum oxypetalum observado en MEB a 1000, 4000 y 6000 aumentos. A vista polar a 1000 X con aberturas. B vista superficial de exina a 6000 X, a espínula. C vista ecuatorial a 1000 X con dos aberturas. D vista superficial a 4000 X, a espínula, b perforación, c annulus………………………………………………………………….77 FIGURA 29. Polen de Nopalea cochenillifera, observado en MO a 400 y 1000 aumentos. A vista ecuatorial a 400 X con enfoque sobre superficie del grano, se notan cinco poros. B vista polar a 400 X con enfoque sobre superficie del grano, se observan cuatro poros. C vista polar a 400 X con enfoque sobre el margen del grano, se observan cuatro poros en los bordes. D y E vista transversal de exina a 1000 X………………………………..78.

(12) x. FIGURA 30. Grano de polen de Nopalea cochenillifera observado en MEB a 1000, 4000 y 15000 aumentos. A vista ecuatorial a 1000 X con aberturas. B vista superficial de exina a 4000 X, a poro, b perforación sin annulus. C vista ecuatorial a 1000 X con dos aberturas. D vista superficial a 15000 X, a espínulas…………………………………………………….79.

(13) xi. ÍNDICE DE TABLAS Página TABLA 1.. Modificaciones estandarizadas al protocolo de acetólisis propuesto por Fonnegra (1989b), basadas en las variaciones de tiempo de centrifugación, velocidad (revoluciones por minuto), duración en solución de acetólisis y temperatura de baño María………….20. TABLA 2.. Caracteres cualitativos del polen de Cactaceae obtenidos de MO y MEB que permitieron evidenciar diferencias entre las especies de la subfamilia Cactoideae con las especies de la subfamilia Opuntiodeae y Pereskiodeae……………………………………………………………..29. TABLA 3.. Valores de p obtenidos en prueba de Kruskal-Wallis para mediciones de eje polar en vista ecuatorial, realizadas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas………………………....58. TABLA 4.. Valores de p obtenidos en prueba de Kruskal-Wallis para mediciones de eje ecuatorial en vista ecuatorial, realizadas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas……………………...58. TABLA 5.. Valores de p obtenidos en prueba de Kruskal-Wallis para mediciones de eje ecuatorial en vista polar, realizadas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas…………………………58. TABLA 6.. Valores de p obtenidos en prueba de Kruskal-Wallis para mediciones de área de apocolpio, realizadas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas………………………………..59. TABLA 7.. Valores de p obtenidos en prueba de Kruskal-Wallis para mediciones de índice de relación eje polar/eje ecuatorial, realizadas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas……………....59. TABLA 8.. Valores de p obtenidos en prueba de Kruskal-Wallis para mediciones del grosor de sexina, realizadas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas………………………………..59. TABLA 9.. Valores de p obtenidos en prueba de Kruskal-Wallis para mediciones de grosor de nexina, realizadas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas………………………………..60.

(14) xii. TABLA 10.. Valores de p con corrección de Bonferroni en prueba de análisis de similitud (ANOSIM) usando las variables cuantitativas obtenidas en MO sobre granos de polen acetolizados de ocho especies de cactáceas…...60. TABLA 11.. Promedios de mediciones de caracteres cuantitativos obtenidos por medio de MO y MEB……………………………………………………....61.

(15) 1. 1. RESUMEN Las semejanzas y diferencias del polen han constituido una metodología básica para la clasificación de diversas familias de plantas, como también para determinar líneas evolutivas y filogenias. Los caracteres palinológicos en algunos casos, clarifican problemas taxonómicos que otros tipos de caracteres no pueden esclarecer, aunque en muchos casos no son la solución definitiva en la taxonomía dentro de un grupo de plantas. En este trabajo se evaluó la variabilidad de la morfología polínica en ocho especies de cactáceas del banco de germoplasma de la Universidad Nacional sede Palmira y del campus de la Universidad del Valle sede Meléndez. Por medio de microscopía óptica (MO) y electrónica de barrido (MEB) se caracterizaron los granos acetolizados de polen de Hylocereus undatus, Hylocereus polyrhizus, Hylocereus costaricensis, Hylocereus sp., Selenicereus megalanthus, Acanthocereus tetragonus, Pereskia bleo, Nopalea cochenillifera y Epiphyllum oxypetalum. Las especies de la subfamilia Cactoideae presentaron polen de tamaño grande (eje polar 50-100 µm), forma oblato esferoidal, tricolpado, exina con espínulas grandes (longitud 1,34-1,71 µm) y perforaciones con annulus. P. bleo se diferenció por tener polen de forma prolato esferoidal, 12 brevicolpos, exina con espínulas medianas (longitud 0,5 µm) y perforaciones con annulus. N. cochenillifera por su parte presentó polen de forma prolato esferoidal, 12 poros, exina con espínulas pequeñas (longitud 0,25 µm) y perforaciones sin annulus. Por medio de un análisis de grupos realizado con los caracteres cuantitativos del polen, obtenidos en MO y MEB, se encontró que las especies formaron dos grupos, uno conformado por N. cochenillifera y P. bleo (similitud=76%) y el otro por las especies de Cactoideae (similitud=82%). Dentro de Cactoideae se agruparon las pitahayas (H. polyrhizus, H. undatus, H. costaricensis,.

(16) 2. Hylocereus sp. y S. megalanthus) (similitud=94%) a parte de E. oxypetalum y A. tetragonus (96%). Finalmente en las pitahayas H. polyrhizus se agrupó con Hylocereus sp. (similitud=98%), mientras S. megalanthus se agrupó con H. undatus y H. costaricensis (similitud=95%), los cuales presentaron una similitud de 97%. Estos resultados fueron sustentados mediante pruebas Kruskal-Wallis y un análisis de similitud (ANOSIM) de los caracteres cuantitativos obtenidos en MO. Estos resultados muestran la variabilidad en la morfología y la morfometría del polen de Cactaceae, permitiendo diferenciar y clasificar hasta la categoría de especie, evidenciando las relaciones a nivel de género, subtribu, tribu y subfamilia..

(17) 3. 2. INTRODUCCIÓN La familia Cactaceae forma uno de los grupos más diversificados entre las Magnoliophyta o plantas con flores que existen en América. Esta familia de plantas es autóctona del continente americano, representada por 100 a 150 géneros y más de 2000 especies (Anderson 2001), aunque existe una especie del género Rhipsalis que habita de forma natural en África y Asia (Barthlott & Taylor 1995). Son plantas típicas de regiones áridas, pero también habitan en selvas tropicales y en zonas templado-frías (Anderson 2001).. La familia Cactaceae se reconoce por presentar los siguientes caracteres: tallo suculento fotosintético, hojas convertidas en espinas sobre yemas axilares modificadas (areolas), flores de perianto separado en muchas partes, numerosos estambres y ovario ínfero con muchos óvulos con placentación parietal (Gibson & Nobel 1990, Anderson 2001). Sin embargo, la gran diversidad de especies ha ocasionado que el manejo taxonómico sea muy complejo, existiendo categorías como subfamilia, tribu, subtribu, género, especie y subespecie (Bravo-Hollis 1978).. En la actualidad para las cactáceas existen diversos sistemas de clasificación sin unificar y muchas especies reciben varios nombres de forma simultánea (Barthlott et al. 1997, Anderson 2001). La causa principal radica en la falta de definición del concepto de especie, y en la falta de comprensión de que estas plantas se encuentran constantemente en diferenciación, existiendo intergradación de caracteres que hace difícil en la práctica delimitar las especies y los géneros (Bravo-Hollis 1978). Contribuyen también a dificultar la clasificación las descripciones irregulares e incompletas realizadas en diagnosis breves e.

(18) 4. incompletas en donde faltan datos de flores, frutos, semillas, hábitats, entre otros (Bauer 2003). También hay descripciones con errores de interpretación hechas con plantas de colecciones a menudo deformadas por el cultivo, y descripciones que consideraron como especies diferentes a los estados juveniles, maduros y seniles de una misma especie (BravoHollis 1978, Anderson 2001).. Bravo-Hollis (1978) propuso realizar caracterizaciones basadas en morfología, fisiología, bioquímica, genética, ecología, biogeografía y fitogenética en Cactaceae con la finalidad de apreciar los patrones en la evolución y ordenar con mayor precisión los grupos taxonómicos. Posteriormente se desarrollaron técnicas que permitieron entender mejor las relaciones entre las especies de cactáceas, como los análisis moleculares y bioquímicos (Nassar et al. 2002, Arias et al. 2003, Butterworth & Wallace 2004, Edwards et al. 2005, Shishkova et al. 2006, Almaraz-Abarca et al. 2007).. La palinología es una ciencia que puede ayudar a dar claridad en la taxonomía de las cactáceas, basada en la morfología y morfometría del polen, ya que las semejanzas y diferencias encontradas en los granos de polen, constituyen una evidencia para identificar diversas especies de cactus (Kurtz 1948, Kurtz 1963, Leuenberger 1976, Kiesling 1984, Garralla & Cuadrado 2007, Garralla et al 2008, Cuadrado & Garralla 2009, Lattar & Cuadrado 2010) , como también para determinar líneas de evolución y filogenia (Erdtman 1960, Walker & Doyle 1975)..

(19) 5. Dichas evidencias, obtenidas del análisis morfológico de los granos de polen junto con la información etnobotánica, también ha permitido observar la existencia de diversidad en las formas silvestres ancestrales, escapadas y cultivadas en los agroecosistemas de América Latina (Schmit & Debouck 1991). Dejando a la palinología y a otro tipo de estudios de caracterización un camino largo por recorrer en la búsqueda por aclarar la taxonomía de Cactaceae.. El objetivo principal de este estudio es evaluar la existencia de variabilidad en la morfología polínica de ocho especies de cactáceas del banco de germoplasma de la Universidad Nacional sede Palmira (H. undatus, H. polyrhizus, Hylocereus sp., H. costaricensis, S. megalanthus y A. tetragonus) y del campus de la Universidad del Valle sede Meléndez (E. oxypetalum, P. bleo y N. cochenillifera). Se espera existan diferencias morfológicas, morfométricas y estructurales entre los granos de polen de las ocho especies de cactáceas estudiadas que permitan separarlas entre sí. Para la familia Cactaceae estos resultados indican que la morfología y morfometría del polen es variable hasta la categoría taxonómica de especie y explica relaciones entre géneros, tribus y subfamilias..

(20) 6. 3. MARCO TEÓRICO 3.1 Palinología 3.1.1. Definición La palinología del griego Palynein (dispersar, esparcir) consiste en el estudio de esporas y granos de polen, los cuales son dispersados por agentes como viento, agua y animales (Fonnegra 1989a); esta definición básica proviene de otras dos muy importantes definiciones, las cuales podríamos llamar definición amplia y definición reducida. En la primera, la palinología es el estudio morfológico de las esporas y granos de polen actuales, subfósiles y fósiles, como también su dispersión y aplicaciones (incluyendo en sentido amplio el estudio de microfósiles, quistes o estructuras quistiformes de algas o de origen desconocido tanto de la época reciente como de las otras eras geológicas) (Hyde & Williams 1945, Fægri 1956). Según Erdtman (1952), la otra definición, considera a la palinología como la ciencia que estudia las paredes de esporas y granos de polen sin tener en cuenta el interior vivo. Actualmente la segunda definición es la que universalmente se acepta para definir este concepto (Fonnegra 1989a).. 3.1.2. Historia La historia de la morfología polínica está necesariamente asociada con el desarrollo del microscopio a través del tiempo. Las primeras observaciones se hicieron cuando el microscopio alcanzó un considerable grado de desarrollo en el siglo XVII y a través del tiempo cada mejora lograda en la construcción de los microscopios se refleja en el avance del conocimiento de la morfología del polen (Wodehouse 1935)..

(21) 7. A mediados del siglo XVII, aprovechando los avances de Hooke y van Leeuwenhoek en la elaboración de microscopios, dos importantes personajes enfocaron sus esfuerzos en la anatomía microscópica. Estos fueron Nehemiah Grew y Marcello Malpighi, quienes convergieron casi que simultáneamente en las primeras descripciones de los granos de polen a finales del siglo XVII. En estas descripciones ellos notaron que los tamaños, formas y colores de los granos de polen variaban dependiendo de la especie, incluso observaron algunas estructuras como los sulcos característicos de monocotiledóneas (Wodehouse 1935; Agashe & Caulton 2009).. Después de la muerte de Grew y Malpighi, hubo un periodo de casi 150 años en el que el estudio de los granos de polen quedó detenido por completo. En el siglo XIX un repentino despertar se evidenció con los trabajos descriptivos de Mirbel y Purkinje y las clasificaciones basadas en morfología del polen de von Mohl y Fritzsche (Wodehouse 1935).. Los caracteres de los polinarios para clasificar géneros y especies de orquídeas fueron usados por primera vez por Jhon Lindley en 1830 (Wodehouse 1935). Aunque en realidad no usó caracteres de las monadas sino de los polinarios (unidad polínica conformada por másulas de granos de polen). Tres años después Julius Fritzsche clasificó las formas del grano de polen de un gran número de familias, notando también la presencia de un solo surco en la mayoría de monocotiledóneas y tres en las dicotiledóneas, aunque su clasificación fue pobremente entendida y artificial (Wodehouse 1935)..

(22) 8. Muchos otros investigadores hicieron posteriormente más clasificaciones basadas en caracteres polínicos, pero todas ellas fueron artificiales. Fue solo hasta Hugo Fischer a comienzos del siglo XX cuando se realizaron las primeras clasificaciones naturales basadas en la filogenia (Wodehouse 1935). El estudio del grano de polen recibió un gran impulso por su valor en la taxonomía vegetal, por el descubrimiento de que podría causar alergias, por su aplicación en paleontología, arqueología y prospección de petróleo (SalgadoLabouriau 1973).. Fue Erdtman (1943) con su libro “An Introduction to Pollen Analysis” quien dio uno de los impulsos más importantes a la palinología, cuando en éste se introdujeron las novedosas técnicas de preparación de polen fresco y fósil, las cuales marcarían el inicio de la etapa más próspera de la palinología. En éste libro Erdtman describió la morfología polínica de 13 familias de monocotiledóneas y 63 familias de las anteriormente llamadas dicotiledóneas, además del polen de algunas gimnospermas y esporas de pteridofitos. A partir de este momento muchos trabajos palinológicos basados en la descripción del polen empezaron a realizarse, debido principalmente a que las nuevas técnicas desarrolladas por Erdtman permitieron la observación de nuevos caracteres, facilitando las determinaciones taxonómicas y clasificación de muchas otras familias de plantas, especialmente aquellas que se encontraban fuera del continente europeo.. Hacia 1960 la palinología fue dominada por el microscopio óptico de luz y junto con él, nuevas técnicas como el análisis LO (L: lux y O: obscuritas), un método de estudio de patrones de la exina, basado en el enfoque a diferentes niveles de ésta (Fonnegra 1989a,.

(23) 9. Hess et al. 2009). También fue en esta época donde la palinología pasó de ser una ciencia básica a una ciencia con múltiples aplicaciones entre las que se encuentran aplicaciones industriales, médicas, alimenticias y forenses (Hess et al. 2009). A mediados de la década de 1970 llegó el microscopio electrónico de barrido (MEB), el cual fue clave en el inicio del estudio de la superficie del polen y hasta la actualidad es una herramienta invaluable que proporciona evidencias morfológicas importantísimas y útiles en la identificación y clasificación del polen y las esporas (Hess et al. 2009).. 3.1.3. Métodos de preparación de material polínico La identificación de esporas y granos de polen no se puede realizar si no se dispone de colecciones de referencia de especies conocidas, debidamente catalogadas e identificadas por medio de fotografías y descripciones (Melhem 1978).. El polen puede ser obtenido de ejemplares de herbario, de material fresco (e.g. botones florales, flores, miel y aire) y de material fosilizado. Este material, con excepción del polen fósil, puede ser sometido a varios procesos entre los que se encuentran el examen al natural, la acetólisis de Erdtman, la diafanización, la acetólisis láctica, el método de Wodehouse y el método de potasa (Fonnegra 1989b).. En esta investigación se utilizó la acetólisis de Erdtman (1960), ya que es el método de preparación más difundido y de mayor trascendencia en la palinología actual. La técnica consiste en una hidrólisis ácida del material polínico, con lo cual se degrada la intina y el protoplasma del grano de polen, conservándose la pared externa de esporopolenina o exina..

(24) 10. El proceso acetolítico vuelve a la exina trasparente, permitiendo el paso de la luz, lo que facilita la observación de caracteres presentes en la estructura y escultura, útiles en la clasificación (Erdtman 1960, Fonnegra 1989b, Hess et al. 2009).. 3.1.4. Morfología polínica Las esporas y granos de polen presentan variabilidad en cuanto a unidad polínica, polaridad, simetría, aberturas, estructura y escultura de la pared, número, tipo y posición de aberturas, forma y tamaño del grano. Todos estos son caracteres regulados genéticamente, aunque la forma y el tamaño pueden variar según el método de preparación para su estudio (Erdtman 1960). Los principales caracteres de valor taxonómico e importantes para la identificación de los granos de polen son número, posición y forma de las aberturas y ornamentación y estratificación de la exina (Fonnegra 1989a).. La importancia taxonómica y evolutiva de la morfología polínica puede ser analizada a nivel de especie, género, familia o categorías superiores. Cuando el tipo de polen de un taxón es característico y constante, el taxón es denominado estenopalinológico, pero cuando el polen varía considerablemente se le conoce como euripalinológico (Fonnegra 1989a). 3.1.5. Palinotaxonomía La palinotaxonomía es el estudio de la taxonomía vegetal con base en la morfología de los granos de polen (Faegri 1956, Fonnegra 1989a). Actualmente la palinotaxonomía ha tomado cierto protagonismo en la taxonomía vegetal, ya que anteriormente los taxónomos.

(25) 11. se preocupaban muy poco por tener en cuenta los granos de polen al hacer revisiones de grupos vegetales y cuando lo hacían era de forma superficial (Faegri 1956). En gran medida ese protagonismo se debe al desarrollo de la microscopía óptica y electrónica, que ha permitido la descripción de nuevos caracteres que proporcionan mayor resolución taxonómica (Nowicke & Skvarla 1979).. Entre los primeros trabajos palinotaxonómicos de Cactaceae, se encontró que el polen de especímenes de cactus nativos de Arizona tenía dos formas predominantes, un grano esferoidal y otro dodecacolpado (Kurtz 1948). Además el número y posición de las aberturas, el tamaño y la ornamentación de la exina se usaron para clasificar géneros, subgéneros y especies. En otro estudio de morfología del polen de Cactaceae se describieron 630 especies de 157 géneros, uno de los trabajos más completos e importantes de la palinotaxonomía Leuenberger (1976).. En los años 80 el interés comercial que empezaron a adquirir muchas especies de cactáceas, especialmente las pitahayas por su valor alimenticio, reactivó la investigación en esta grupo (Becerra 1987). El interés luego se trasladó en escoger los fenotipos promisorios para los cultivos a gran escala, debido a la gran diversidad infragenérica e infraespecífica (Muñoz et al. 2009). Además, se comenzaron a implementar las caracterizaciones morfológicas a inicios de los años 2000, dentro de las cuales reaparecieron con una mayor frecuencia las caracterizaciones palinológicas (Nyeffeler 2002, Raveh et al. 1998, Castillo et al. 2005, Garralla & Cuadrado 2007)..

(26) 12. Un trabajo realizado con cactus argentinos mostró que el grano de polen de la subfamilia Opuntioideae (i.e. Austrocylindropuntia, Maihueniopsis, Opuntia y Tephrocactus) es esferoidal, apolar, radiosimétrico, pantoaperturado, tectado perforado, tectado imperforado, espinuloso, nanoespinuloso o reticulado (Garralla & Cuadrado 2007). Los caracteres morfológicos que permitieron la diferenciación de los taxa en este estudio fueron el tipo de exina, forma y número de poros y elementos supratectales.. También en Argentina se encontró que los granos de polen de Cactoideae (i.e. Cereus, Cleistocactus, Denmoza, Echinopsis y Monvillea) son estenopalínicos, esferoidales a prolatos, isopolares, radiosimétricos, de tamaño medianos a grandes, ámbito circular a subcircular, tricolpados, con exina tectada, tectum con perforaciones rodeadas de engrosamientos anulares y con presencia de espínulas, microespinas y nanoespinas (Lattar & Cuadrado 2010). Los caracteres palinológicos de los géneros de Cactoideae estudiados por estos autores, revelaron que hay mucha afinidad con las subfamilias Pereskioideae y Maihuenoideae, y no con Opuntioideae.. Por otra parte en México se encontró que los granos de polen de Hylocereus undatus de diversas regiones son tricolpados, tectados, con ornamentación equinada, escasas gemas, con perforaciones con bordes y con el eje polar y el diámetro ecuatorial variable, siendo los dos últimos caracteres valiosos en la diferenciación de varios genotipos (Castillo et al. 2005)..

(27) 13. En Colombia el único registro de trabajo palinológico con la familia Cactaceae es el realizado en Selenicereus megalanthus (pitahaya amarilla) donde se encontró que el polen es trizonocolporado, reticulado, con espínulas menores a cinco µm, contorno circular en vista polar y romboidal en vista ecuatorial; tamaño polínico de 89 µm; mónada isopolar radiosimétrica; forma oblato esferoidal; tectum de 200 nm de grosor, subtectado y discontinuo; infratectum granular columelar de 0.8 a 1µm y espínulas de 1.7 µm de diámetro (Muñoz et al. 2009).. 3.2. La familia Cactaceae Se han descrito con base en la morfología floral, morfología vegetativa, secuencias genéticas y morfología palinológica cuatro subfamilias, Pereskiodeae, Cactoideae, Mahiuenoideae y Opuntiodeae (Anderson 2001). Éstas actualmente son reconocidas como grupos naturales por el grupo internacional de sistemática de las Cactaceae (Anderson 2001, Bravo-Hollis 1978, Leuenberger 1986).. La subfamilia Pereskiodeae tiene un solo género, Pereskia, y 17 especies, las cuales son consideradas miembros primitivos de la familia Cactaceae. Este género es ampliamente distribuido en América Central, Sur América y el Caribe en bosques secos. Las características que separan a Pereskiodeae de las demás subfamilias son principalmente areolas que producen hojas y no ser suculentas (Edwards et al. 2005).. La subfamilia Opuntiodeae contiene 230-350 especies distribuidas en 15 géneros. Se diferencia por la presencia de la areola opuntioide y la presencia de pequeñas cerdas.

(28) 14. llamadas gloquidios. Las semillas tienen una envoltura funicular muy dura (Anderson 2001, Britton & Rose 1919, Barthlott & Hunt 1993). Esta subfamilia representa el 16% del total de la diversidad de la familia Cactaceae y es quizá el linaje más distintivo de la familia (Stuppy 2002). La subfamilia Cactoideae es la más diferenciada y contiene cerca del 75% de la diversidad de especies dentro de la familia (Britton & Rose 1919). Posee una característica común a todos los géneros que es, una diminuta hoja subtendiendo cada areola. Otras características son tallos suculentos, acostillados (con algunas excepciones) y areolas sin gloquidios (Wallace & Gibson 2002)..

(29) 15. 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general • Evaluar la variabilidad en la morfología polínica de ocho especies de cactáceas del banco de germoplasma de la Universidad Nacional sede Palmira y del campus de la Universidad del Valle sede Meléndez.. 4.2 Objetivos específicos • Describir y medir las características externas e internas del polen de cada una de las especies trabajadas por medio de microscopía óptica y electrónica de barrido. • Determinar cuales caracteres son importantes en la separación de las especies. • Establecer las posibles relaciones taxonómicas entre las especies estudiadas..

(30) 16. 5. HIPÓTESIS • Ha: las características morfológicas internas y externas del polen muestran la existencia de variabilidad entre las ocho especies de cactáceas del banco de germoplasma de la Universidad Nacional sede Palmira y del campus de la Universidad del Valle sede Meléndez. • Ho: las características morfológicas internas y externas del polen no muestran la existencia de variabilidad entre las ocho especies de cactáceas del banco de germoplasma de la Universidad Nacional sede Palmira y del campus de la Universidad del Valle sede Meléndez..

(31) 17. 6. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1 Área de estudio El trabajo de investigación fue realizado con anteras florales de plantas cultivadas en el banco de germoplasma de la Universidad Nacional en Palmira, Valle del Cauca (Fig. 2) y en el campus de la Universidad del Valle sede Meléndez en Cali, Valle del Cauca (Fig. 3). Las dos localidades se enmarcan y pertenecen a la zona de vida de bosque seco tropical (Bs-T) según la clasificación de Holdridge (1966).. Figura 1. Mapa del departamento del Valle del Cauca mostrando con área entramada los municipios de Cali y Palmira, donde se encuentran ubicadas la Universidad del Valle sede Meléndez y La Universidad Nacional sede Palmira..

(32) 18. 6.2 Colección y procesamiento de material polínico El material polínico proveniente de las anteras de H. undatus, H. polyrhizus, Hylocereus sp., H. costaricensis, S. megalanthus y A. tetragonus fue obtenido en el banco de germoplasma de la Universidad Nacional. El polen de P. bleo, N. cochenillifera y E. oxypetalum, fue extraído de plantas cultivadas libremente en el Campus de la Universidad del Valle sede Meléndez (Figura 3).. El material polínico usado, se extrajo el día siguiente a la apertura floral, de por lo menos dos flores provenientes de la misma planta. Las anteras fueron colocadas en frascos de vidrio con ácido acético glacial, los cuales fueron rotulados con el nombre de la especie y la fecha de colección. Cada una de las muestras fue acetolizada en el laboratorio de citogenética de la Universidad Nacional sede Palmira, siguiendo el protocolo de Fonnegra (1989b) con algunas modificaciones estandarizadas en las variables de tiempo de centrifugación, velocidad (revoluciones por minuto), duración en solución de acetólisis y temperatura de baño María (Tabla 1). Estas modificaciones fueron necesarias porque muchos granos de polen presentaron deformaciones, fragmentaciones y restos de protoplasma..

(33) 19. Figura 2. Esquema del campus de la Universidad Nacional sede Palmira, Valle del Cauca, donde se observa el banco de germoplasma de pitahaya.. Figura 3. Esquema del campus Meléndez de la Universidad del Valle, Valle del Cauca, donde se observan los lugares de cultivo de los cactus..

(34) 20. Tabla 1. Modificaciones estandarizadas al protocolo de acetólisis propuesto por Fonnegra (1989b), basadas en las variaciones de tiempo de centrifugación, velocidad (revoluciones por minuto), duración en solución de acetólisis y temperatura de baño María. Centrifugación Centrifugación Acetólisis Lavado 1 Lavado 2 Lavado 3 inicial en acetólisis 2000 rpm x 5 Baño María 100 °C x 2000 rpm x 3 Agitación x 2 minutos Fonnegra (1989b) minutos 1.5 - 2.5 minutos minutos Centrifugación 2000 rpm x 5 minutos H. polyrhizus 3000 rpm x 4 Baño María 63 °C x 3000 rpm x 4 Agitación x 5 minutos H. costaricensis minutos 4 minutos minutos Centrifugación 3000 rpm x 4 minutos H. undatus S. megalanthus Agitación x 2 minutos 3000 rpm x 4 Baño María 67 °C x 3000 rpm x 4 Agitación x 5 minutos P. bleo minutos 4 minutos minutos 3000 rpm x 4 minutos Centrifugación 3000 rpm x 4 minutos Protocolos. Hylocereus sp. Se deja decantar Baño María 70 °C x 20 minutos 7 minutos A. tetragonus 3000 rpm x 4 Baño María 67 °C x E. oxypetalum minutos 4 minutos N. cochenillifera. 2500 rpm x 4 minutos 3000 rpm x 4 minutos. Agitación x 2 minutos se deja decantar 20 minutos Agitación x 2 minutos Centrifugación 3000 rpm x 4 minutos. 6.3 Montaje de placas para microscopía óptica El material polínico acetolizado fue montado en placas de vidrio, cinco por cada muestra estudiada, en el laboratorio de citogenética de la Universidad Nacional sede Palmira. Para cada montaje se depositó un trozo (2 mL³) de gelatina glicerinada sobre el porta objetos, dejando calentar sobre una plancha de calentamiento a 70 ºC hasta que la gelatina se derritió. Posteriormente se adicionó una gota del material polínico acetolizado de las diferentes muestras sobre la gelatina derretida. Con un palillo se extendió el polen junto con la gelatina haciendo círculos sin producir burbujas, luego se colocaron puntos de parafina derretida alrededor de la gelatina, los cuales se dejaron solidificar nuevamente. Por último se colocó el cubreobjetos y se llevó la mezcla polínica a la plancha para su homogenización y sellado en los bordes con parafina. Cada una de las placas fue rotulada con un código según la especie y un número serial que dependió de la cantidad de placas montadas por muestra (Figura 4)..

(35) 21. Figura 4. Esquema de las placas montadas con polen de Cactaceae para observación del polen en microscopía óptica.. 6.4 Observación y medición del polen en microscopio óptico (MO) Las mediciones y observaciones en MO se realizaron en el laboratorio de microscopía de la sección de botánica de la Universidad del Valle, sede Meléndez, para éstas se escogieron de cada una de las especies máximo 20 granos de polen por cada caracter, distribuidos por lo menos en tres placas. Los granos de polen fueron observados teniendo en cuenta los caracteres cualitativos de unidad polínica, polaridad, simetría, forma, número, posición y tipo de aberturas y estructura de esporodermis. También se obtuvieron datos cuantitativos en micrómetros (µm), como tamaño, eje polar, eje ecuatorial (en vista polar y vista ecuatorial), área de apocolpio, índice de relación eje polar/eje ecuatorial, índice de área polar, grosor de nexina y sexina. Para estas dos últimas características solo se midieron diez granos de polen por especie. Las observaciones, mediciones y toma de fotografías se realizaron en microscopio Nikon Eclipse E200 equipado con cámara digital Optikam 500, la magnificación implementada fue 400 X, con excepción de los caracteres grosor de sexina y exina, los cuales se midieron en magnificación 1000 X. Las áreas, longitudes y ediciones de imagen fueron obtenidas usando el programa Optika Vision Pro versión 2.7 (Optika Microscopes 2000-2007)..

(36) 22. 6.5 Microscopía Electrónica de Barrido (MEB) para material polínico acetolizado La preparación del material polínico para la observación en el MEB se realizó siguiendo el protocolo de Bozzola &Russell (1999) en dos tiempos. El primero se llevó a cabo en el laboratorio de microscopía de la sección de botánica de la Universidad del Valle sede Meléndez y comprende la deshidratación y el secado, el segundo se realizó en el laboratorio de microscopía electrónica de la escuela de ingeniería de materiales de la misma universidad, e incluyó el recubrimiento con oro y la observación en el MEB.. •. Deshidratación y secado: los granos de polen acetolizados se deshidrataron en un horno a 70 °C durante 24 horas, luego cada una de las muestras se montó una porción sobre cinta de carbono para el recubrimiento posterior con oro.. •. Recubrimiento con oro: los granos de polen totalmente secos se sombrearon con una capa delgada de carbón y oro, utilizando un ionizador POLARON SEM COATING SISTEM series 11 HD, con un voltaje de 0 – 5 Kv, frontal a la placa de oro por 5 minutos.. •. Observación y medición en el MEB: los granos de polen de las muestras de Cactaceae, se observaron en el microscopio electrónico de barrido del laboratorio de microscopía electrónica de la escuela de ingeniería de materiales de la Universidad del Valle. Para cada una de las especies se realizó registro fotográfico de la superficie de la exina a 4000X, 7000X y 11000X de aumento, con una distancia de trabajo de 17 mm y un voltaje de 25 Kv; las fotografías fueron guardadas en.

(37) 23. archivos digitales en formato de imagen JPG. Posteriormente, fueron obtenidas mediante el programa Optika Vision Pro versión 2.7 (Optika Microscopes 20002007) diez mediciones de diámetro de perforaciones, grosor de annulus, diámetro de espínulas, longitud de espínulas, densidad de espínulas y densidad de perforaciones.. 6.6 Descripción polínica de las especies Cada una de las muestras estudiadas fue descrita basándose en los caracteres obtenidos de la observación en el MO y en el MEB y en el sistema de descripción taxonómica que se fundamenta en el carácter y el estado del carácter (Fonnegra 1989c).. 6.7 Análisis estadístico de los datos Se realizó una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis para observar la existencia de diferencias estadísticas entre las variables cuantitativas: eje polar en vista ecuatorial, eje ecuatorial en vista ecuatorial, eje ecuatorial en vista polar, área de apocolpio, índice de relación eje polar/eje ecuatorial, grosor de la sexina y grosor de la nexina. Estas variables fueron seleccionadas por tener un número de mediciones iguales o mayores de 20. También se elaboraron gráficas basadas en la prueba de Kruskal-Wallis que muestran las medias y los límites de confianza para cada una de las variables evaluadas. Posteriormente se realizó un análisis de similitud (ANOSIM) con corrección de Bonferroni, para establecer diferencias significativas entre especies, teniendo en cuenta las mismas variables cuantitativas usadas en la prueba de Kruskal-Wallis..

(38) 24. Finalmente se realizó un análisis de conglomerados o de formación de grupos usando el algoritmo de grupos pareados y medida de similitud Bray-Curtis, con la finalidad de conocer la relaciones de semejanza existentes entre los géneros y las especies estudiadas mediante un dendrograma. La mayor o menor similitud o afinidad entre los grupos y entre especies se estableció en un rango de valores que va de cero a uno, siendo cero la mínima y uno la máxima similitud. Para este análisis se usaron las variables cuantitativas obtenidas de MO y MEB: eje polar en vista ecuatorial, eje ecuatorial en vista ecuatorial, eje ecuatorial en vista polar, área de apocolpio, índice de relación eje polar/eje ecuatorial, grosor de la sexina, grosor de la sexina, índice de área polar, longitud de espínulas, diámetro de espínulas, densidad de espínulas, diámetro de perforaciones, grosor de annulus y densidad de perforaciones.. Las pruebas de Kruskal-Wallis, sus correspondientes gráficas y el análisis de similitud (ANOSIM) se realizaron con el programa estadístico Statistica versión 7 (Stat Soft, Inc. 2004) mientras el análisis de grupos fue realizado con el programa Past versión 2.04 (Hammer et al. 2001)..

(39) 25. 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN A continuación se presentan las descripciones polínicas de cada una de las especies trabajadas en la investigación: Hylocereus polyrhizus (F.A.C. Weber) Britton & Rose Grano de polen grande (65,63) 79,33 (88,93) x (77,4) 91,85 (100,31) µm en vista ecuatorial y (82,64) 91,02 (103,9) µm de diámetro ecuatorial en vista polar. Grano radiosimétrico isopolar. Forma suboblato (P/E=0,86). Contorno en vista polar circular; área polar mediana (I. A. P.=0,39). Polen trizonocolpado. Exina total 3,51 µm; nexina 0,83 µm; sexina 2,68 µm, tectada perforada; superficie lisa ornamentada con perforaciones y espínulas; perforaciones (0,86) 1,09 (1,21) µm de diámetro, bordeadas por annulus de 0,2 µm de grosor, densidad de 0,1 por µm2; espínulas (1,03) 1,34 (1,72) µm de longitud, (0,86) 1,04 (1,21) µm de diámetro en base, densidad de 0,061 por µm2.. Hylocereus undatus (Haw.) Britton & Rose Grano de polen grande (72,95) 76,57 (83,09) x (85,56) 87,99 (91,17) µm en vista ecuatorial y (82,64) 91,02 (103,9) µm de diámetro ecuatorial en vista polar. Grano radiosimétrico isopolar. Suboblato (P/E=0,87). Contorno en vista polar circular; área polar mediana (I. A. P.=0,41). Trizonocolpado. Exina total 4,17 µm; nexina 0,81 µm; sexina 3,36 µm, tectada perforada; superficie lisa ornamentada con perforaciones y espínulas; perforaciones (0,69) 1,01 (1,21) µm de diámetro, bordeadas por annulus de 0,2 µm de grosor, densidad de 0,13 por µm2; espínulas (1,21) 1,41 (1,72) µm de longitud, (0,86) 1,02 (1,21) µm de diámetro en base, densidad de 0,075 por µm2, presencia de algunas espínulas con dos puntas..

(40) 26. Hylocereus costaricensis (F.A.C. Weber) Britton & Rose Grano de polen grande (67,35) 74,27 (80,48) x (83,77) 87,89 (97,03) µm en vista ecuatorial y (88,01) 93,62 (102,45) µm de diámetro ecuatorial en vista polar. Grano radiosimétrico isopolar. Forma suboblato (P/E=0,85). Contorno en vista polar circular; área polar mediana (I. A. P.=0,36). Polen trizonocolpado. Exina perforada; exina total ca. 4,44 µm; nexina 0,92 µm; sexina 3,52 µm, tectada perforada; superficie lisa ornamentada con perforaciones y espínulas; perforaciones (0,52) 0,77 (1,03) µm de diámetro, bordeadas por annulus de 0,2 µm de grosor, densidad de 0,12 por µm2; espínulas (1,21) 1,46 (1,72) µm de longitud, (0,69) 0,89 (1,21) µm de diámetro en base, densidad de 0,072 por µm2, presencia de algunas espínulas con 2 puntas.. Selenicereus megalanthus (K. Schum. Ex Vaupel) Moran Grano de polen grande (71,81) 78,09 (81,61) x (88,49) 92,61 (99,17) µm en vista ecuatorial y (96,01) 102,75 (111,41) µm de diámetro ecuatorial en vista polar. Grano radiosimétrico isopolar. Forma suboblato (P/E=0,84). Contorno en vista polar circular; área polar mediana (I. A. P.=0,35). Polen trizonocolpado. Exina total 4,89 µm; nexina 0,82 µm; sexina 4,07 µm, tectada perforada; superficie lisa ornamentada con perforaciones y espínulas; perforaciones (0,52) 0,74 (0,86) µm de diámetro, bordeadas por annulus de 0,19 µm de grosor, densidad de 0,13 por µm2; espínulas (1,55) 1,71 (1,90) µm de longitud, (1,21) 1,41 (1,72) µm de diámetro en base, densidad de 0,078 por µm2, presencia de algunas espínulas dobles..

(41) 27. Hylocereus sp. Grano de polen grande (71,1) 75,8 (79,93) x (85,6) 93,15 (97,82) µm en vista ecuatorial y (88,69) 94,48 (98,86) µm de diámetro ecuatorial en vista polar. Grano radiosimétrico isopolar. Forma suboblato (P/E=0,81). Contorno en vista polar circular; área polar mediana (I. A. P.=0,39). Polen trizonocolpado. Exina total 3,99 µm; nexina 0,84 µm; sexina 3,15 µm, tectada perforada; superficie lisa ornamentada con perforaciones y espínulas; perforaciones (0,86) 0,97 (1,21) µm de diámetro, bordeadas por annulus de 0,2 µm de grosor, densidad de 0,14 por µm2; espínulas (1,21) 1,58 (1,90) µm de longitud, (0,86) 1,11 (1,21) µm de diámetro en base, densidad de 0,088 por µm2.. Acanthocereus tetragonus (L.) Hummelinck Grano de polen grande (82,16) 86,95 (95,96) x (89,08) 94,15 (101,3) µm en vista ecuatorial y (90,17) 94,89 (113,8) µm de diámetro ecuatorial en vista polar. Grano radiosimétrico isopolar. Forma oblato esferoidal (P/E=0,92). Contorno en vista polar circular; área polar mediana (I. A. P.=0,44). Polen trizonocolpado. Exina total 4,28 µm; nexina 0,86 µm; sexina 3,42 µm, tectada perforada; superficie lisa ornamentada con perforaciones y espínulas; perforaciones (0,52) 0,73 (1,03) µm de diámetro, bordeadas por annulus de 0,2 µm de grosor, densidad de 0,16 por µm2; espínulas (1,03) 1,53 (1,72) µm de longitud, (0,86) 1,1 (1,29) µm de diámetro en base, densidad de 0,075 por µm2.. Pereskia bleo (Kunth) DC. Grano de polen grande (68,49) 73,63 (77,48) x (68,5) 72,44 (77,18) µm en vista ecuatorial y (70,22) 72,93 (75,65) µm de diámetro ecuatorial en vista polar. Grano radiosimétrico.

(42) 28. isopolar. Forma prolato esferoidal (P/E=1,02). Contorno en vista polar circular; área polar grande (I. A. P.=0,68). Polen pantobrevicolpado. Número de aberturas por grano 12 brevicolpos, de 21,74 µm de longitud y 6,42 µm de ancho. Exina total 3,62 µm; nexina 0,86 µm; sexina 2,76 µm, tectada perforada; superficie lisa ornamentada con perforaciones y espínulas; perforaciones (0,54) 0,55 (0,69) µm de diámetro, bordeadas por annulus de 0,15 µm de grosor, densidad de 0,39 por µm2; espínulas (0,4) 0,5 (0,55) µm de longitud, (0,26) 0,33 (0,36) µm de diámetro en base, densidad de 0,28 por µm2.. Epiphyllum oxypetalum (DC.) Haw. Grano de polen grande (93,47) 98,85 (104,01) x (98,24) 104,29 (110,63) µm en vista ecuatorial y (100,34) 110,98 (117,49) µm de diámetro ecuatorial en vista polar. Grano radiosimétrico isopolar. Forma oblato esferoidal (P/E=0,95). Contorno en vista polar circular; área polar mediana (I. A. P.=0,44). Polen trizonocolpado. Exina total 4,39 µm; nexina 0,78 µm; sexina 3,61 µm, tectada perforada; superficie lisa ornamentada con perforaciones y espínulas; perforaciones (0,86) 0,98 (1,21) µm de diámetro, bordeadas por annulus de 0,21 µm de grosor, densidad de 0,062 por µm2; espínulas (1,29) 1,52 (1,88) µm de longitud, (0,86) 1,03 (1,21) µm de diámetro en base, densidad de 0,051 por µm2.. Nopalea cochenillifera (L.) Salm-Dyck Grano de polen grande (94,41) 100,05 (104,74) x (93,17) 97,62 (104,36) µm en vista ecuatorial y (92,38) 98,26 (105,1) µm de diámetro ecuatorial en vista polar. Grano radiosimétrico isopolar. Forma prolato esferoidal (P/E=1,03). Contorno en vista polar circular; área polar grande (I. A. P.=0,64). Polen pantoporado, número de aberturas por.

(43) 29. grano12 poros elipsoides, 18,2 µm de longitud y 8,57 µm de ancho. Exina total 3,69 µm; nexina 1,03 µm; sexina 2,66 µm, tectada perforada; superficie ondulada, ornamentada con espínulas; perforaciones de contorno circular a irregular menores de 0,5 µm de diámetro, densidad de 0,55 por µm2; espínulas (0,23) 0,25 (0,27) µm de longitud, (0,23) 0,26 (0,27) µm de diámetro en base, densidad de 0,22 por µm2.. Tabla 2. Caracteres cualitativos del polen de Cactacea obtenidos de MO y MEB que permitieron evidenciar diferencias entre las especies de la subfamilia Cactoideae con las especies de la subfamilia Opuntiodeae y Pereskiodeae. Especie. Tamaño. Forma. Hylocereus polyrhizus Hylocereus costaricensis Hylocereus undatus Selenicereus megalanthus Hylocereus sp. Acanthocereus tetragonus Pereskia bleo Epiphyllum oxypetalum Nopalea cochenillifera. Grande Grande Grande Grande Grande Grande Grande Grande Grande. Oblato-esferoidal Oblato-esferoidal Oblato-esferoidal Oblato-esferoidal Oblato-esferoidal Oblato-esferoidal Prolato-esferoidal Oblato-esferoidal Prolato-esferoidal. Ornamentación de exina Aberturas Número Tipo Espínulas Perforaciones 3 Colpos Grandes Con annulus 3 Colpos Grandes Con annulus 3 Colpos Grandes Con annulus 3 Colpos Grandes Con annulus 3 Colpos Grandes Con annulus 3 Colpos Grandes Con annulus 12 Brevicolpos Medianas Con annulus 3 Colpos Grandes Con annulus 12 Poros Pequeñas Sin annulus. Las especies de la subfamilia Cactoideae que incluyen los géneros Acanthocereus, Epiphyllum, Selenicereus e Hylocereus presentaron granos de polen similares, teniendo en cuenta los caracteres de unidad polínica (mónada), simetría (radiosimétrico isopolar), tamaño (grande), forma (oblato esferoidal), contorno en vista polar (circular), área polar (mediana), aberturas (trizonocolpado) y ornamentación (espínulas y perforaciones rodeadas por annulus) (Tabla 2). Para estas especies se pudo comprobar que su morfología correspondió a la forma dominante del polen de Cactoideae (Kurtz 1963, Kurtz 1948, Leuenberger 1976, Cuadrado & Garralla 2009, Lattar & Cuadrado 2010), llamada por Leuenberger (1976) polen tipo Cereus. Este tipo de polen es subesferoidal a prolato,.

(44) 30. tricolpado, con exina tectada, ornamentada con espínulas y perforaciones rodeadas de engrosamientos anulares llamadas punctas. La similitud en los caracteres cualitativos, hace necesario el uso de caracteres cuantitativos y morfométricos que permiten establecer diferencias entre las especies de la subfamilia Cactoideae.. En el trabajo de Kurtz (1963) el eje ecuatorial para el género Acanthocereus fue de 75 µm, para el género Epiphyllum estuvo entre 57 y 111 µm, para el género Selenicereus estuvo entre 75 y 90 µm y para el género Hylocereus fue de 70 µm, mientras que para la presente investigación el eje ecuatorial de A. tetragonus estuvo entre 89,08 y 101,34 µm; para E. oxypetalum estuvo entre 98,24 y 110,63 µm, para S. megalanthus entre 88,49 y 99,17 µm, para H. polyrhizus entre 77,4 y 100,3 µm, para H. undatus entre 85,56 y 91,17 µm, para H. costaricensis entre 79,63 y 97,03 µm y para Hylocereus sp. entre 85,55 y 97,82 µm. Los anteriores resultados muestran que solo E. oxypetalum y S. megalanthus presentaron mediciones acordes a las de Kurtz (1963), mientras que A. tetragonus y las especies del género Hylocereus presentaron valores por encima de los obtenidos por Kurtz en su trabajo. Esto puede ser explicado principalmente por la forma de preparación del material polínico, ya que Kurtz (1963) no usó acetólisis sino montaje de polen fresco con glicerina, y también a la resistencia de la exina, ya que las especies que no presentaron cambios notables en su eje ecuatorial con los dos tratamientos de preparación, puede ser que tengan exinas resistentes a la expansión ocasionada por la salida del protoplasma durante la acetólisis de Erdtman (Fonnegra 1989b)..

(45) 31. Las dos especies restantes, P. bleo y N. cochenillifera que corresponden a las subfamilias Pereskiodeae y Opuntiodeae respectivamente, presentaron morfologías que las diferencian claramente de las demás especies de la subfamilia Cactoideae. Estas especies tuvieron polen con forma (prolato esferoidal), área polar (grande), aberturas (12 brevicolpos en P. bleo y 12 poros en N. cochenillifera) y ornamentación (espínulas muy cortas y perforaciones sin annulus en N. cochenillifera) (Tabla 2). Aunque este tipo de morfología no es considerada dominante dentro de sus correspondientes subfamilias son variaciones presentadas que van acompañadas de caracteres determinantes, tales como múltiples brevicolpos presentes en especies primitivas de Pereskia y las perforaciones de la exina muy pequeñas presentes exclusivamente en los géneros Nopalea y Tacinga (Luenberger 1976).. Dentro de la descripción hecha por Leuenberger (1976) y el trabajo de Kurtz (1963) para la subfamilia Pereskiodeae, se encontraron varios caracteres presentes en P. bleo, tales como: exina con perforaciones rodeadas de un annulus, espínulas y 12 aberturas (policolpadobrevicolpos). Aunque en el caso de la medida del eje ecuatorial según Kurtz (1963) el género Pereskia presentó entre 52 y 70 µm, en este trabajo P. bleo presentó valores entre 68 y 77 µm, fenómeno que puede ser explicado por la forma en que se prepararon las muestras, ya que Kurtz (1963) solo usó gelatina glicerinada sin acetólisis para el montaje de los granos de polen.. La presencia de 12 brevicolpos, según Leuenberger (1976), es un criterio para considerar a P. bleo como una especie primitiva dentro de la subfamilia Pereskiodeae, ya que el polen.