EFECTO DE LAS CONDICIONES AMBIENTALES SOBRE LA VELOCIDAD DE RESPIRACIÓN DE MICROORGANISMOS NITRIFICANTES
Nora C. Bertola1,2, Fabricio Ruiz1, Edgardo M. Contreras2
1Facultad de Ingeniería – Universidad Nacional de La Plata.
2Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (CIDCA) - CONICET – Facultad de ciencias Exactas - UNLP. 47 y 116 (1900) La Plata, Argentina.
e-mail: nbertola@ing.unlp.edu.ar; econtrer@quimica.unlp.edu.ar
Nora C. Bertola: Ingeniero Químico y Doctor en Ingeniería de la Universidad Nacional de La Plata, Investigador Adjunto del CONICET, docente de la Facultad de Ingeniería de la UNLP, Argentina.
Fabricio Ruiz: Ingeniero Químico de la Universidad Nacional de La Plata.
Edgardo M. Contreras: Bioquímico y Doctor de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata, Becario Posdoctoral del CONICET y docente de la Facultad de Ciencias Exactas de la UNLP, Argentina.
Palabras clave: nitrificación, aguas residuales, amonio, nitrito, nitrato, velocidad de respiración
RESUMEN
La nitrificación es el proceso microbiológico que convierte amonio a nitrito y posteriormente a nitrato.
La velocidad de nitrificación depende de factores ambientales tales como temperatura, pH, concentración de sustratos y presencia de compuestos tóxicos. En los últimos años la respirometría se ha aplicado con éxito en el estudio de la biodegradación aeróbica de compuestos de nitrógeno. Las medidas respirométricas están basadas en la determinación de los cambios que se producen en la velocidad de respiración de los microorganismos presentes cuando son expuestos a un pulso de sustrato.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto del pH, amonio, nitrito y nitrato sobre la velocidad de respiración de microorganismos nitrificantes utilizando un respirómetro cerrado.
Los microorganismos nitrificantes fueron cultivados en reactores aerobios de flujo continuo escala laboratorio empleando un medio de cultivo mineral con una concentración de 500 mgN/l. El pH fue controlado a un valor de 7.6 ±0.1 por agregado de solución de Na2CO3(1M) que actúa como fuente de carbono para las bacterias nitrificantes.
La velocidad de consumo de oxígeno de las bacterias nitrificante fue medida en un respirómetro cerrado. Los niveles de pH estudiados fueron entre 6.0 – 9.5, las concentraciones de nitrito y nitrato fueron entre 0 y 2100 mgN/l y en el caso del amonio se estudiaron concentraciones en el rango de de 54 a 2700 mgN/l.
La velocidad de respiración de las bacterias nitrificantes resultó ser dependiente del pH con un máximo en el rango 7-8. Por otra parte esta velocidad no fue afectada por el amonio y el nitrato a las concentraciones utilizadas, sin embargo se observó una inhibición parcial a altas concentraciones de nitrito.
INTRODUCCIÓN
El nitrógeno y el fósforo presentes en las aguas residuales dan lugar a problemas especiales en los cuerpos receptores. Por un lado tienen un papel importante como nutrientes en el proceso de eutrofización.
Por otra parte los compuestos orgánicos de nitrógeno, bajo condiciones ambientales favorables, se convierten en nitrógeno amoniacal el cual es tóxico para gran cantidad de especies ictícolas. El amonio puede oxidarse a nitrito y finalmente a nitrato mediante bacterias específicas las cuales determinan una demanda extra de oxígeno y en consecuencia, puede disminuir la concentración de oxígeno disuelto en las aguas receptoras. Asimismo la presencia de nitrógeno amoniacal en un agua residual conduce a la formación de cloraminas y tricloruro de nitrógeno por reacción con el cloro utilizado como desinfectante, los cuales tienen un poder desinfectante menor al cloro (Ramalho, 1993).
Algunas actividades industriales como por ejemplo la producción de fertilizantes, fermentaciones, procesadoras de carne, industrias lácteas, refinerías de petróleo, etc., generan aguas residuales que contienen gran cantidad de nitrógeno.
El proceso general de remoción del nitrógeno consiste en una oxidación inicial del amonio (proveniente del agua residual o generado mediante el proceso de amonificación) seguido por una reducción del nitrato para generar formas gaseosas de nitrógeno, principalmente N2 aunque también puede aparecer N2O, NO, etc. La nitrificación es el proceso microbiológico que convierte amonio a nitrito y posteriormente a nitrato. La
velocidad de nitrificación depende de factores ambientales tales como temperatura, pH, concentración de sustratos y presencia de compuestos tóxicos (Henze y col., 2002). Estudios previos sugieren que las especies no cargadas NH3 y HNO2 son los verdaderos sustratos para las bacterias nitrificantes (Sharma y Ahlert, 1977). Sin embargo, otros estudios indican que estas moléculas pueden ser inhibidores de la nitrificación en altas concentraciones (Surmacz-Gorzka y col., 1996).
En los últimos años la respirometría se ha aplicado con éxito en el estudio de la biodegradación aeróbica de compuestos de nitrógeno (Surmacz-Gorzka y col., 1996).
La respirometría es la medición e interpretación de la velocidad de consumo de oxigeno por parte de los microorganismos (biomasa) en estudio bajo condiciones definidas y controladas. Las medidas respirométricas están basadas en la determinación de los cambios que se producen en la velocidad de respiración de los microorganismos presentes cuando son expuestos a un pulso de sustrato.
En el presente trabajo se estudió el efecto del pH, concentración de amonio, nitrito y nitrato sobre la velocidad de respiración de los microorganismos nitrificantes utilizando un respirómetro cerrado.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los microorganismos nitrificantes (MN) fueron cultivados en reactores aerobios de flujo continuo tipo Eckenfelder a escala laboratorio de 4.5 l. Se empleó un medio de cultivo mineral selectivo para MN:
SO4(NH4)2, 2.35 g/l; NaHCO3, 1.3 g/l; KH2PO4, 1.0 g/l; MgSO4.7H2O, 0.1 g/l; CaCl2.2H2O, 0.01 g/l. El pH de operación fue mantenido en 7.6 ± 0.1 mediante el agregado de Na2CO3 (1M) que actúa como fuente de carbono para las bacterias nitrificantes. El caudal de alimentación fue de 1.4 l/d (tiempo de residencia hidráulico, TRH = 3.21 d) y el tiempo de residencia celular de 90 d.
Las muestras de barros fueron lavadas varias veces con buffer fosfato (5 g/l de K2HPO4 ajustado a pH = 6.0 con NaOH) con el objeto de eliminar todo resto de fuente de nitrógeno. Los microorganismos fueron resuspendidos en buffer fosfato de pH = 8 y a la suspensión resultante se le determinó la biomasa en unidades DQO (Contreras y col., 2002) utilizando un equipo Hach (COD Reactor Modelo 45600 y Spectrophotometer DR/2000, Hach Cop., Loveland, USA).
La velocidad de respiración de los microorganismos nitrificantes fue medida en un respirómetro cerrado que consiste en un biorreactor de 30 ml en el cual se inserta un electrodo de oxígeno disuelto (YSI Modelo 58), sistema de provisión de aire, agitador magnético y control de temperatura (25oC). El electrodo de oxígeno estaba conectado a una PC y los datos fueron adquiridos con una frecuencia de 1 dato/seg. La velocidad de consumo de oxígeno (R) se calculó como la derivada de la concentración de OD respecto del tiempo.
Los diferentes niveles de pH (6.0 – 9.5) fueron obtenidos por el agregado de NaOH o H2SO4
concentrado. Se agregó un pulso de 1 ml de una solución de SO4(NH4)2 (10000 mgN/l) para obtener una concentración de 500 mgN/l como sustrato oxidable. En estos experimentos la concentración de biomasa fue de 575 mg DQO/l.
Para estudiar el efecto del nitrito y nitrato se agregaron al respirómetro diferentes volúmenes de soluciones de nitrito (4220 mgN/l) o nitrato (8540 mgN/l) para obtener concentraciones entre 0 y 2100 mgN/l.
En todos los casos se agregó un pulso de 1 ml de solución de SO4(NH4)210000 mgN/l. En los experimentos en los que se analizó el efecto del amonio se utilizó un pulso de una solución de 13540 mgN/l a fin de obtener concentraciones en el respirómetro entre 54 y 2700 mgN/l. En todos los experimentos el pH se mantuvo controlado a un valor de 8.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto del pH sobre la velocidad de respiración
El valor de la velocidad de respiración (R) para cada experiencia realizada a distintos pH´s se determinó como la pendiente de la recta obtenida graficando concentración de oxígeno disuelto (OD) vs tiempo, como la concentración de sustrato (SO4(NH4)2) estaba en exceso la velocidad obtenida fue la máxima (Rmax).
El efecto del pH en la velocidad de respiración se presenta en la Figura 1; R fue afectada fuertemente por el pH en las condiciones experimentales empleadas obteniéndose una curva tipo campana invertida con un máximo para un pH comprendido entre 7 y 8.
pH
6 7 8 9 10
R(mgO2L-1 h-1 )
0 10 20 30 40 50 60
Figura 1. Efecto del pH en la velocidad de respiración de los microorganismos nitrificantes.
Este tipo de curva puede ser interpretada suponiendo que la enzima responsable de la velocidad de respiración es activa solamente en un estado de ionización particular (Bailey y Ollis, 1986):
(inactiva) E
(activa) EH
(inactiva)
EH
2 K1 →K2 −
←
→
+ ← (1)
donde K1 y K2 son las constantes de la primera y segunda reacción de la enzima respectivamente.
Planteando las ecuaciones de equilibrio para cada reacción:
] [EH
] H [ ] EH K [
2
1 +
=
+ (2)[EH]
] H [ ] E K
2[
+
=
− (3)La cantidad total de enzimas [ ET] presentes en el sistema se representa por la siguiente ecuación:
[E
T] = [EH
2+] + [EH] + [E
-]
(4)despejando [EH2+] y [ E-] de (2) y (3) respectivamente resulta:
K ] H [ ] EH ] [ EH [
1 2
+
=
+ (5)] H [
K ] EH ] [ E
[
−=
+ 2 (6)Reemplazando (5) y (6) en (4) se obtiene:
] H [
K ] EH ] [
EH K [
] H [ ] EH ] [ E
[
21
T +
+
+ +
=
(7)y reordenando resulta:
+ +
=
+ +] H [ 1 K K
] H ] [ EH [ ] E
[
21
T (8)
a partir de esta ecuación se puede expresar [EH] en función de la concentración de protones [H+]:
+ +
=
+ +
] H [
K K
] H 1 [
] E ] [
EH [
2 1
T (9)
Si la velocidad de respiración máxima (Rmax ) es proporcional a [ EH ], la dependencia de Rmax con respecto a [H+] se puede expresar como:
+ +
= α
+ +
] H [
K K
] H 1 [ R
2 1
max (10)
donde αes un coeficiente experimental.
La ecuación (10) fue ajustada a los datos experimentales y se obtuvieron los siguientes coeficientes:
α= 53.8 ± 2.3 mgO2 l-1 h-1, K1 = 0.35 ± 0.04 µM, K2 = (8.9 ± 1.6) x10-4 µM (r2 = 0.9741). En la Figura 1 se observa el ajuste obtenido a los datos experimentales (r2= 0.9741).
Para calcular el valor de pH óptimo, se derivó Rmax (ecuación 10) con respecto a [H+] y se igualó a cero la ecuación resultante, con lo que se obtuvo
2 1
K K ] H
[
+=
(11)El valor óptimo de pH calculado con esta ecuación fue 7.75 ±0.06.
Efecto del amonio, nitrito y nitrato sobre la velocidad de respiración.
Los experimentos para estudiar el efecto del amonio, nitrito y nitrato sobre la velocidad de respiración de las bacterias nitrificantes se realizaron a un pH de 8, cercano al valor correspondiente al pH óptimo calculado mediante la ecuación (11). En la figura 2 se presenta un ejemplo típico de curvas de oxígeno disuelto (OD) en función del tiempo obtenidas
mediante respirometría cerrada, para concentraciones de nitrito de 0, 567, 1320 y 2100 mgN/l.
t(h)
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
OD(mg/l)
0 1 2 3 4 5 6 7
tc
Figura 2. Ejemplos de curvas oxígeno disuelto (OD) en función del tiempo (t) obtenidas en un respirómetro cerrado para distintas concentraciones de nitrito, (•) 0, ( ) 567, ( ) 1320, ( ) 2100 mgN/l.
Curvas obtenidas a distintos tiempos después del agregado de nitrito (10, 70, 150, 290 min.)
Curva obtenida después de lavar con buffer fosfato la muestra con un tiempo de contacto de 290 min.
Para todas las concentraciones de nitrito ensayadas se observó un rápido descenso de la concentración de oxígeno disuelto y limitación de oxígeno a concentraciones bajas de OD. Además, esta limitación parece ser función de la concentración del nitrito. Como se puede observar el la figura 2 un aumento en la concentración de nitrito produce una disminución en la velocidad de respiración de los microorganismos.
A fin de estudiar el efecto del tiempo de contacto se realizaron medidas respirométricas a distintos tiempos después del agregado de nitrito (10, 70, 150 y 290 min.). A modo de ejemplo se muestran en la figura 2 las curvas obtenidas para un concentración de nitrito de 1320 mgN/l, siendo similares las obtenidas para las otras concentraciones de nitrito estudiadas. Las curvas muestran una disminución del efecto inhibitorio de la actividad respiratoria a medida que aumenta el tiempo de contacto. Este efecto es resultado de una disminución de la concentración de nitrito a causa de la oxidación del mismo a nitrato por los microorganismos presentes. Por otra parte se estudió la reversibilidad del efecto del nitrito realizando ensayos respirométricos utilizando las muestras obtenidas de los experimentos con el mayor tiempo de contacto lavadas con buffer fosfato. Las curvas obtenidas (Figura 2) son coincidentes con la curva control (sin agregado de nitrito) lo que indicaría la reversibilidad del efecto producido por el nitrito.
A partir de las curvas de OD en función del tiempo se calculó la velocidad de respiración R = -dOD/dt.
En la figura 3b se representan los valores de R en función de OD para diferentes concentraciones de nitrito (obtenidas a partir de las curvas representadas en la figura 3a). De los resultados obtenidos se puede observar que la variación de R aumenta a medida que la concentración de OD disminuye.
En las experiencias realizadas para estudiar el efecto en R de diferentes concentraciones de amonio y nitrato no se observó incidencia alguna en la velocidad de respiración.
Figura 3. Ejemplos de curvas obtenidas con el respirómetro cerrado: (a) oxígeno disuelto (OD) en función del tiempo y (b) velocidad de respiración (R) en función del OD para distintas concentraciones iniciales de nitrito.
La dependencia de R con OD puede ser representada por una ecuación tipo Monod:
= +
= K OD
R OD dt R
- dC
O
max (12)
donde Rmax (mgO2/ l h) corresponde a la velocidad máxima de respiración, KO(mgO2/ l) es la constante de semisaturación correspondiente al oxígeno disuelto. Como puede observarse en la Figura 3b, la ecuación (12) se ajustó satisfactoriamente a los datos experimentales en todos los casos.
En la Figura 4 se presenta el efecto de la concentración de nitrito, nitrato y amonio en el valor de los coeficientes Rmax y KO. El valor de Rmax resultó aproximadamente constante para todas las condiciones ensayadas (Fig. 4a, c, e); por otra parte, KOno fue afectado por nitrato y amonio (Fig. 4d, f) pero aumentó con el incremento de la concentración de nitrito de 0.7 ± 0.2 mgO2/l (nitrito =0) a 3.4 ± 0.8 mgO2/l (nitrito = 1360 mgN/l) (Fig. 4b). Estos resultados sugieren que el nitrito actuaría como un inhibidor competitivo de la respiración de los microorganismos nitrificantes. La inhibición competitiva se caracteriza por un aumento en el valor de la constante de semisaturación del sustrato (KO) a medida que se incrementa la concentración del inhibidor; sin embargo, la velocidad máxima (Rmax) se mantiene constante tal como se muestra en la Figura 4a y b. La oxidación del amonio es iniciada por la enzima amonio monooxigenasa (AMO) la cual oxida amoníaco a hidroxilamina; el oxígeno incorporado puede provenir del oxígeno molecular (O2) o del tetróxido de dinitrógeno (N2O4) según las siguientes reacciones (Shmidt y col., 2003):
t(h)
0.00 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15 OD(mgO2/l)
0 1 2 3 4 5 6 7
a
OD (mgO2/l)
0 1 2 3 4 5 6
R(mgO2/lh)
0 20 40 60 80 100 120 140
b
[NO
-2]
[NO
-2]
NH
3+ O
2+ 2H
++ 2e
-→NH
2OH + H
2O
(13)NH
3+ N
2O
4+ 2H
++ 2e
-→NH
2OH + 2NO + H
2O
(14)El N2O4podría formarse abióticamente a partir del nitrito mediante las siguientes reacciones:
3HNO
2→HNO
3+ 2NO + H
2O
(15)2HNO
2+ 2NO
→N
2O
4+ N
2O + H
2O
(16)Por lo tanto un incremento en la concentración inicial de nitrito provocaría un aumento en la concentración de N2O4el cual competiría con el oxígeno molecular por la AMO. Como resultado de esta competencia habría un aumento de la constante de semisaturación para el oxígeno tal como se observa experimentalmente (Figura 4b).
En lo referente al efecto del nitrito, Painter (1970) informó que la toxicidad del nitrito en Nitrosomonas sp. ocurre a concentraciones superiores a 420 mgN/l en experimentos efectuados a diferentes valores de pH.
Otros estudios mostraron que los microorganismos oxidantes del amonio son sensibles a la acumulación del nitrito (Anthoniesen y col., 1976). Zumft (1993) informó que muchas especies de bacterias son susceptibles a la toxicidad del nitrito a causa de la formación del complejo metal-nitrosyl que ocurre cuando los iones NO+o los radicales NO interactúan con enzimas bacterianas. Los radicales se forman espontáneamente del nitrito siendo esta reacción más favorable en medio ácido; sin embargo, los experimentos del presente trabajo fueron realizados a pH = 8.0.
Nitrito (mgN/l)
0 500 1000
Ko(mgO2/l)
0 1 2 3 4 5 6
Nitrato (mgN/l)
0 500 1000
Amonio (mgN/l)
0 1000 2000 3000
Rmax(mgO2/lh) 0 50 100 150 200 250
a
b
c
d
e
f
Figura 4. Efecto de la concentración de nitrito (a,b), nitrato (c,d) y amonio (e,f) en los coeficientes Rmy KOde la ecuación (2).
CONCLUSIONES
- La velocidad de respiración de los microorganismos nitrificantes fue afectada por el pH en las condiciones experimentales empleadas obteniéndose una curva con un máximo para valores entre 7 y 8.
- Las concentraciones estudiadas de nitrato y amonio no tuvieron influencia sobre la velocidad de respiración de los microorganismos nitrificante en todas las condiciones ensayadas.
- La constante de semisaturación para el oxígeno (KO) aumentó con el incremento de la concentración de nitrito lo que sugiere que el nitrito actúa como un inhibidor competitivo de la respiración de los microorganismos nitrificantes.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen la financiación suministrada por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), por la Universidad de la Plata y por el Proyecto PICT 09-11211 de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Argentina.
REFERENCIAS
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- Bailey J.E. y Ollis D.F. (1986). Biochemical Engineering Fundamentals. McGraw-Hill, New York.
- Contreras, E.M., Bertola, N.C., Giannuzzi, L. y Zaritzky, N.E. (2002). A modified methods to determined biomass concentration as COD in pure cultures and in activated sludges systems. Water SA, 28: 463-467.
- Henze M., Harremoës P., Jansen J.C., Arvin E. (2002). Watewater Treatment (3rd Ed.) Springer-Verlag Berlin Heidelberg, New York.
-Painter H.A. (1970). A review of literature on inorganic nitrogen metabolism in microorganisms. Water Res., 4:393-450.
- Ramalho R. S. (1993). Tratamiento de aguas residuales. Ed. Reverté, S. A. Barcelona, España.
- Sharma B. y Ahlert R.C. (1977). Nitrification and nitrogen removal. Water Res., 11:897-925
- Surmacz-Gorzka J., Gernaey K., Demuynck C. Vanrolleghem P., y Verstraete W. (1996). Nitrification monitoring in activated sludge by oxygen uptake rate (OUR) measurements. Water Res., 30:1228-1236
- Scmidt I., Sliekers O., Schmid M., Bock E., Fuerst J. Kuenen J.G., Jetten S.M. y Strous M. (2003). New concepts of microbial treatment processes for the nitrogen removal in wastewater. FEMS Microbiology Reviews, 27(4): 481-492.
-Zumft W.G. (1993). The biological role of nitrite oxide in bacteria. Arch. Microbiol., 160:253-246.
