Flujo de información genética

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Tema 13: Transcripción.

Flujo de información genética

DNA RNA

Replicación

Transcripción Traducción

Proteínas

Retrotranscripción

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Tema 15

Transcripción Introducción Tipos de ARN

RNA polimerasas Fases: Iniciación Elongación Terminación

Transcripción en Eucariotas

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Transcripción

* Proceso de síntesis de ARN.

* Mecanismo celular por el cual la información genética contenida en el ADN es transferida a una molécula de ARN.

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RNA RNA

* Macromolécula sintetizada por las RNA polimerasaspor transcripciónde una secuencia de nucleótidos de DNA que sirve como molde. A diferencia del DNA el RNA engloba a una familia muy heterogénea.

* Formado por nucleótidos unidos por enlaces fosfodiester. Presenta una composición similar a la del DNA:

Nucleótidos: A, U, G y C.

* Generalmente son de cadena sencilla.

* La estructura primaria viene determinada por la secuencia de nucleótidos y pueden presentar formas muy variadas de estructuras secundarias(stem-loop structures), formadas por uniones intracatenarias.

También han sido observadas estructuras terciariaspara ciertos tRNA y rRNA.

* La estructura secundariade las regiones de doble cadena, se asemeja a la forma A del DNA, más que a la forma B, la cual no puede ser adoptada debido a impedimentos estéricos a causa del grupo OH del C2´ de la ribosa.

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RNA RNA

Tipos de RNAs en la célula eucariótica Tipos de RNAs en la célula eucariótica

RNA heterogéneo nuclear (hnRNA).

RNA mensajero (mRNA).

RNA ribosómico (rRNA).

RNA de transferencia (tRNA).

RNA pequeño nuclear (snRNA): U1, U2, U4, U5, U6

RNA citoplasmático pequeño (scRNA): 7SL RNA.

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RNA RNA

El RNA heterogéneo nuclear (hnRNA).

Representa las moléculas precursoras del RNAmque son transcritas directamente del DNA y que codifican para una proteína determinada. Incluyen secuencias codificantes (exones) y no codificantes (intrones).

Este RNA será procesado.

El RNA mensajero (mRNA).

Representan las moléculas procesadas del hnRNAque codifican para una proteína determinada. Su secuencia de nucleótidos es traducida en una secuencia de aminoácidosen el proceso de traducción para sintetizar una proteína .

Se incluyen formas muy heterogéneas tanto en tamaño como en secuencia, existiendo, en general, una molécula de mRNA para cada gen o grupo de genes que vayan a expresarse

Es el menos abundantede todos los RNAs celulares. En E. Coli. Representa entre el 2 y el 5 % del total del RNA

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RNA RNA

El RNA ribosómico (rRNA):

Es el RNA más abundanteen la célula

Principal componente de los ribosomas.Tienen una función catalítica y estructuralen la síntesis de proteínas.

Existen diferentes tiposen función de sus coeficientes de sedimentación, asociados de forma específica a la subunidad grande y a la subunidad pequeña de los ribosomas, tanto en procariotas como en eucariotas.

16S (subunidad ribosómica pequeña).

23S (subunidad ribosómica grande).

Procariotas

18S (subunidad ribosómica pequeña).

28S (subunidad ribosómica grande).

5,8S (subunidad ribosómica grande).

Eucariotas

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RNA RNA

El RNA de transferencia (tRNA).

Es el RNA más pequeñocon unos 75 nucleótidos de media.

Su función es transportar los aminoácidos en forma activadahasta el ribosoma, durante el proceso de traducción del mRNA.

Existe al menos un tipo de tRNA para cada uno de los 20 aminoácidos. Sin embargo, algunos aminoácidos tienen varios tRNAs como por ejemplo la Leu y la Arg, que pueden ser transferidos a la cadena polipeptídica por 6 tRNAs diferentes cada uno.

Todos los tRNAs presentan en su extremo 3´ la secuencia de nucleótidos CCA, independientemente del aminoácido que transporten. El extremo 3´ constituye el extremo aceptordel aminoácido.

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RNA RNA

El RNA pequeño nuclear (snRNA):

Participan en el proceso de soldadura de los exonesdurante la formación del mRNA. Splicesome.

Son pequeñas secuencias de unos 150 nucleótidos de media: U1, U2, U3, U4, U5, U6,

El RNA citoplasmático pequeño (scRNA):

Es un RNA de unos 300 nucleótidos 7SL RNAque forma parte del SRP (Signal Recognition Particle) que ejerce una función específica en el envío de proteínas recién sintetizadas hacia compartimentos intra- o extracelulares.

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Transcripción

* El concepto de mRNA fue introducido por François Jacob y Jacques Monod en 1961.

Mensajero de vida muy corta entre el núcleo y el citoplasma

* Polinucleótido.

* Composición reflejo de la del ADN que lo especifica.

* Heterogéneo en tamaño.

* Asociado transitoriamente con los ribosomas.

* De síntesis y degradación rápida.

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Transcripción

Iniciación: tiene lugar en secuencias promotoras o promotores

Elongación: polimerasa

ρ -independiente

Terminación:

ρ -dependiente

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Transcripción en procariotas

* La enzima clave en la síntesis del ARN es la ARN polimerasa.

Descubierta por Jerard Hurwitz y Samuel Weiss independientemente

* Es una holoenzima de unos 500 kd formada por cuatro clases de subunidades

*Actividad Catalítica: Ataque nucleofílico del grupo 3´-hidroxilo de la cadena naciente sobre el fosforilo alpha del NTP entrante, produciéndose un enlace fosfodiester

* Polimeriza en sentido 5´-3´

*Procesativa: Desde el inicio de la transcripción no abandona el molde hasta la terminación

*No tiene actividad correctora. Tasa de error 10-4

*No necesitan cebadores. Capaces de iniciar la transcripción

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RNA polimerasa: Procariotes

Un solo tipo de RNA polimerasa para todos transcritos

Subunidad Mr kDa n Función

α 36.5 2 Iniciación de la cadena.

Interacción con proteínas reguladoras y promotores

β 151 1 Iniciación y elongación

β’ 155 1 Unión al DNA

ω 11 1 Desconocida

σ 70 1 Reconocimiento del

promotor

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Ensamblaje de la Partícula Central

α α

₂

α

₂

β α

₂

ββ’ = core enzyme αΙ

β β’

αΙΙ Párticula Central

Unión al DNA de forma no específica

+

vegetativa (principal σ)

σ

⁷⁰

Subunidad SIGMA

Reconocimiento del Promotor

Intercambiable Choque Térmico

(emergencias)

σ

³²

Retirada de nitrogeno (emergencias)

σ

⁶⁰

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Transcripción

Iniciación de la Transcripción

* La polimerasa se une a secuencias específicas dentro del ADN, denominadas centros promotores. La subunidad σ colabora en la localización de la secuencia promotora

Footprinting Técnica de la huella Se utiliza para identificar

y caracterizar secuencias promotoras

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Regiones protegidas Hebra codificante

Con sentido

Hebra no codificante Sin sentido

Molde

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Transcripción

Centros promotores

Secuencia -35 Secuencia -10

5´ Upstream 3´ Downstream

+1

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Transcripción

Centros promotores

* Los promotores presentan diferentes eficacias en la iniciación de la transcripción.

1 transcripción cada 2 segundos a 1 cada 10 minutos

* Los promotores más fuertes tiene secuencias –35 y –10 que coinciden con las consensos.

* La distancia óptima entre ambas secuencias consensos es de 17 nucleótidos.

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Transcripción en procariotas

Inicio

* La ARN polimerasa se une al ADN de manera inespecífica y busca el sitio promotor desplazándose por la molécula de ADN.

* Puede detectar las secuencias –35 y –10 sin desenrollar la doble hélice.

* Estas características hacen que la búsqueda del promotor sea un proceso rápido.

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Transcripción en procariotas

Inicio

* La ARN polimerasa produce un la separación de la molécula de ADN en una región situada entre –9 a +2.

* En concreto cada ARN polimerasa unida desenrolla un segmento de de ADN de 17 pb.

1,6 vueltas de la hélice B-DNA

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Transcripción en procariotas

* La ARN polimerasa tiene dos sitios de unión de ribonucleótidos.

* El sitio de iniciación incluye preferentemente ATP o GTP. La mayoría de los ARN comienzan por una purina.

* El sitio de elongación incluye el resto de ribonucleótidos que serán añadidos.

* El grupo 3´-OH del primer nucleótido ataca al P-alfa del segundo, formándose un enlace fosfodiester.

* La ARN polimerasa no necesita un cebador para iniciar la polimerización.

* Las cadenas de ARN pueden formarse de novo.

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Transcripción en procariotas

Elongación

X

P 3´

P P P

γ β α

G o A

5´

5´ 3´

Iniciada la transcripción la subunidad sigma se separa del complejo

DNA-RNA-Proteína

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Inhibidores de la iniciación

Rifamicinas: Rifamicina B y rifampicina

No son efectivas una vez iniciada la elongación

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Transcripción en procariotas

Elongación

* Tras la polimerización de 6-10 nucleótidos la subunidad σ se separa de la holoenzima.

* La burbuja de transcripción (ARN polimerasa, ADN molde y ARN naciente), se desplaza a lo largo de la molécula de ADN.

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Transcripción en procariotas

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Transcripción en procariotas

* El ARN sintetizado se enrolla con la hebra de ADN molde formándose un híbrido ADN-ARN, de unos 8-10 nucleótidos de longitud.

* La región desenrollada del ADN y la longitud del híbrido DNA-RNA permanecen constantes mientras la ARN polimerasa avanza por el molde.

* La molécula de ADN debe de ir desenrollandose por delante de la burbuja y enrollandose por detrás. Esto lo hacen las topoisomerasas (DNA girasa).

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Transcripción en procariotas

Se enrollaría

*

* Para evitar que el extremo 5´ del ARN se enrolle sobre sobre el ADN, justo antes de que se forme una vuelta completa la cadena de ARN se curva alejándose de la cadena de ADN.

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Transcripción en procariotas

* La velocidad de síntesis del RNA es aproximadamente de unos 50 nucleótidos/s.

* La ARN polimerasa carece de actividad nucleasa y su tasa de error es de 10⁴-10⁵ bases.

¿ Por qué tienen una tasa de error unas 10

⁵

veces superior a la de la ADN polimerasa y carece de actividad correctora ?

¿ Por qué tienen una tasa de error unas 10

⁵

veces superior a la de la ADN

polimerasa y carece de actividad correctora ?

(29)

Transcripción en procariotas

Finalización

•Se paraliza la formación de enlaces fosfodiésteres.

•Se separa el híbrido ARN-ADN.

•Se rebobina el ADN y se libera la ARN polimerasa.

¿ Dónde se termina la transcripción ?

* Existen secuencias de parada (stop signals) en el ADN.

* Una de ellas consiste en una región palindrómica rica en GC seguida de otra rica en AT.

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Transcripción en procariotas

Finalización

El transcrito puede formar una estructura en horquilla, seguida de una

cola de poli U

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Transcripción en procariotas

Finalización

1)

2)

3)

Las uniones U-A (RNA-DNA) son poco estables.

Se separa el híbrido y se libera la molécula

de ARN.

(32)

Transcripción en procariotas

* La burbuja se vuelve a cerrar y la holoenzima sin la subunidad

σ

tiene menos afinidad por el ADN bicatenario que por el monocatenario, por lo tanto se separa del ADN.

* La holoenzima se une de nuevo al factor sigma y vuelve a buscar un nuevo promotor.

Terminación

ρ -independiente

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Transcripción en procariotas

Terminación ρ-dependiente

* Los ARN que presentan señales de terminación dependientes de rho (ρ) no suelen presentar el lazo en horquilla seguido de uracilos.

* El factor rho detecta señales de terminación no detectadas por la RNA polimerasa.

* El factor rho tiene una estructura hexamérica, actividad ATPasa y se une específicamente al ARN monocatenario.

* Se une a una secuencia de unos 72 nucleótidos (12 por subunidad) y se activa.

* Su activación parece ser debida más a rasgos estructurales en la molécula de ARN naciente (no existen secuencias consensos).

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Transcripción en procariotas

Terminación ρ-dependiente

Unión de rho al ARN naciente

Debilita la interacción entre el molde y el transcrito provocando su separación,

la de la enzima y la del propio factor rho La actividad ATPasa le permite

moverse unidireccionalmente a

lo largo de la hebra de ARN

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Transcripción en eucariotas

En eucariotas la transcripción la realizan 3 tipos de RNA polimerasas.

Nucleolo ARNr de 18S, 5,8S y 28S

* RNA polimerasa II Nucleoplasma Precursores del mRNA y snRNA

* RNA polimerasa III Nucleolplasma ARNt y ARNr de 5S

* RNA polimerasa I

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Transcripción en eucariotas

* RNA polimerasa II

* Complejo de entre 8 y 12 subunidades.

* Poseen dos grandes subunidades de unos 240 y 140 kd. RPB1 (β) RPB2 (β´)

•La subunidad de 240 kd posee múltiples repeticiones de la secuencia consenso en el extemo

• Carboxilo terminal

YSPTTSPS

(27 en levaduras y 50 en mamíferos)

* Son secuencias regulables por fosforilación y participan en el reconocimiento de señales de activación.

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Transcripción en eucariotas

Iniciación: los genes de eucariotas, al igual que los de procariotas, precisan de promotores para iniciar la transcripción

Región promotora

* Destacar la presencia de la región TATA box hacia el nucleótido –25 y -100

Secuencia consenso más frecuente

* Presente en la mayoría de los promotores de los genes eucarióticos dando mRNA.

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Transcripción en eucariotas

Región promotora. Secuencias adicionales para una alta actividad promotora

* Otras secuencias importantes entre las posiciones –40 y -110.

CAAT GC TATA

-110 -40

5´ 3´

-25

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Transcripción en eucariotas

Inicio

* La ARN polimerasa II necesita de factores de transcripción para iniciar la transcripción (TFII).

* La transcripción comienza con la unión del factor TFIID al compartimentoTATA.

* La unión se realiza a través de la TBP (TATA Binding Protein) una subunidad del complejoTFIID. Provocando cambios conformacionales en la estructura del ADN.

TBP

ADN

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Transcripción en eucariotas

Inicio

A la unión de TFIID por la subunidad TBP, le sigue la unión secuencial de otros factores de transcripción

TFIIA, TFIIB, TFIIF

RNA polimerasa II y TFIIE

Aparato básico de transcripción Aparato básico de transcripción

Helicasa

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Transcripción en eucariotas

Inicio

* Existen múltiples factores de transcripción que pueden unirse a múltiples sitios en el ADN.

Sp1

HSTF

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Transcripción en Eucariotas

Inicio

* En eucariotas, además de la región promotora existen otras regiones intensificadoras (enhancers) que participan también en la iniciación.

* Las secuencias intesificadoras no tienen una localización precisa respecto al sitio de iniciación.

* Las secuencias intesificadoras son bidireccionales.

* Pueden ejercer su efecto sobre promotores situados a miles de pares de bases de distancia.

* Las secuencias intesificadoras pueden localizarse secuencia arriba, secuencia abajo o incluso en medio de un gen.

* Una secuencia intensificadora suele ser efectiva en un determinado tipo de célula y no en otras (intensificador de la inmunoglobulina en linfocitos B).

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Activación de la transcripción en eucariotas

Paso 1: DNA-binding transactivators (DBTs) se unen a las secuencias intensificadoras (enhancer sequences).

Paso 2: DBTs unen a los co-activators con actividad HAT (Histona Acetil Transferasa) permitiendo la

remodelación de la cromatina.

Paso 3: DBTs también interactúan con el TFIID permitiendo que la TBP se una a la TATA box.

Paso4: Unión de la RNA pol II y formación del complejo básico de transcripción

Paso 5: Iniciación de la transcripción

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TATATATATATA

=DNA-binding transactivators

=Enhancers

=Histones

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=HMG proteins

Inr

TATA

HAT

AC AC AC AC AC

AC AC

AC

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AC AC AC

AC

AC AC AC AC

HAT

TATA

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TFIIH

TATA

TFIID

TBP RNA Polymerase II And basal TF’s P P

P P

Phosphorylation of

C-terminal tail of

RNA pol.II

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Transcripción en Eucariotas

Elongación y Terminación

* La transcripción en eucariotas también suele empezar por A o G.

* La terminación es poco conocida en eucariotas.

* En algunos transcritos existe la estructura en horquilla seguida de la secuencia de residuos de uracilo.

* La mayoría de los ARN mensajeros eucariotas experimentan procesos de maduración como la adición de una cola de poli-A en el extremo 3´y otras modificaciones.

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