Cultivo de células y protoplastos
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(2) - Aspectos técnicos. Ya que en las soluciones nutritivas usadas pera el cultivo de células vegeEales nuchos hongos y bacterias prolÍferarían con mayor rapíd,éz que el cultivo en- sí, ésto" debén ser nantenidos en condiciones totales de asepcia. DifGrentes métodos sinples existen para la desinfestación de1 tejído del cual se inicia un cultivo, que incluyen entre otros e1 uso de etanol y de hipoclorito de sodio o de calcio. zados por nedio de1 autoclavado (15 i es que llevan susLancias ter¡oo1áaprtef por roedio de su filtración d,e O,22 un? de tanaño. E1 manejo rlentro de cortinas de aire estéril creadas por 1as lla¡nadas cánaras de flujo la¡¡inar. Ir.. MEIODG DE CIILTIVO. l.. Cultivo en nedios sañi sSfifl6g. para e1 El nétodo nás sencillo cultivo de cé1u1as in vÍtro consiste en eI Eantenimiento de éstas sobre medios senisólidos, en los oue 1as soluciones nutritivas han sido solidificadas pgr med.iodál uao de agentes gelificantes. l-a principal característica de este tipo de cultivos es que só1o parte de las células del cal1o están en contacto con el medio de cultivo, razón por la cual se crean gradientes de nutrientes y reguladores de cieciniento a 1o largo del cal-lo, 1o que significa que de acuerdo a 1a posici-ón de 1as cé1u1as en el ca11o éstas están expuestas a diterentes condiciones de cultivo. Este fenóneno es conocido cono efecto de posición.. 2.. Cultivo de célu1as el suspeersi{n. A diferena:i¡ de 1os cultivos en nedíos semisól-idos en los cultivos en susDenaión las células se encuentran suoergidas en é1. EsEoSson agitados constantenente a razón de unas 100-150 rpn, con e1 fln de garan¿izar la correcta aireación y distribución de nutrientes, Lo que ocaaiona adenás la separación mecáníca de 1os callos en céIuÍas aisladas y grupos pequeñas de éstas.. Debído a que l-as célu1as están sunergidas en el mealío de culEivo y a que éste es agitado constantemente, todas 1as cé1ulas se encuentran expuestas a las mismas condicíones, con 1o que se elimina el efecto de posición ya mencionado. Este método abre la posibilidad de cultivar cé1u1as a gran escala, por ejenplo en fernentadores que pueden alcanzar varios miles de lltros de capacidad. - El subcultivo. Periódicanente los cultivos celulares deben ser subcultivados a nedios frescos, para 1o cual basta con transferir parte alel ca11o o de 1a suspensión. La frecuencia con 1a que se debe realizar e1 subcultivo depende de la taza de crecimÍento del. 40.
(3) y las razones por las cuales se hace necesario pueden ser cultivo, regulaademás de agotaniento de l-as fuentes de energía, nutrientes' sustancÍas la acumulación de oxígeno, o de1 dores del- Creci-miento inhibicloras tlel crecimiento o la ocurrencia de cambios grandes en é1 pll. - la densidad de cultivo. El subcultivo de partes muy pegueñas células en suspensión, de una cantidad< de tratándose o callo, del final menor de 104 - l0concentración en una células, reducida de nuy céiulas/nl (dependiendo del genotipo y del nedio) puede resultar en el no creciniento del cultivo. la explicación nás aceptada de las causas de este fenómeno es la síguiente: Metabolitos sintetizados por 1as cé1u1as que gon esencia1eá para su creci-olento, se difunden fácil¡rente (con nayor faci-lidad En caso de que en cultivos en suepensión) en el nedio de cultivo. sea muy baja, la concentración de éstos la densidad de cultivos de 1a céluIa baja a niveLes críticos metabolitos en e1 interior en los cuales ningún netabolisno celular es posible y las cé1uI-as nueren (5). es úenor Por regla general 1a densidad celular nínina de cultivo de células nedio. E1 cultivo sea e1 en nutrientes náá rico míentral por posible uso de diferenmedio del es baja densidad o en aísladas tes técnicas: - Cultivo nodriza: la céJ.ula es cultivada sobre un papel flltro que a su vez eslLá,colocado sobre un callo o una capa db ¿élú1as. a la El papel filtro Pernite la difusión de sustancias nutritivas se ali-menta. esta célula, con lae cuales - Uso de medios condicionados o Eedios en los que anEeriorEente Estos son enriquecidos de esta [utnera coD han crecido células. de otras pueden pronover el creciniento que sustancÍas nutritivas cé1ulas. - Enriquecimiento del medio con sustancias nutritivas como arninoáci(5). dos, ácidos orgánicos, vitaminas, agua de coco, etc. - Reducción clel vo1únen de cultivo. El cultivo de 104 - 105 cé1u1as/ más común en meillos llquÍdos' de cultivo n1 que es La alensidad nínima cé1u1a en 10-10O nanolitros de oedio de equivale al cul-ti-vo de Ia ( En eate sistena, conocido como micro1nI= 1/1000000 Ef), .jl-tiuo nedio de cultivo son protegidas de Ia cultivo, las nicrogotas del evaporación por rnedio de su incrustaci.ón en gotas de aceite nineral (7).. 4l.
(4) III.. I{EDIOS DE CIILTIVO. Los requerinientos nutricionales de las células vegetales son relatívamente simples en comparación con aquellos de laé células aninales. las células vegetales por 1o general están en capacidad de sintetizar 1a nayorla de sustancias necesarias en su netábo1isno a partir de unas pocas que le son ofrecidas en los mediosde cultivo. los conponentes de toda solución nutritiva célutas vegetai-es son los siguientes:. Dara eI cultivo. de las. - Sales minerales. Estas apottan 1os nismos nacro y nicroelementos que han sido identificados cono esenciales para eI crecimiento de plantas complet.aa, aunque en proporciones diferentes y en concentraciones generalmente [ayores. es sr¡miniatrado El hierro en forna de quelato para evitar su precipitación. - Azúcares. Cubren con 1os requerinientos energéticos de 1os cultívos y aportan adenás cadenas de carbono para las slntesis orgánicas de las células. El azúcar más comúnmenteusacla es 1a sacarosa, -. Vitaminas. Estudios realizados en diferentes especies vegetales han denostrado que la única vitamina realpente eaencial para eI crecimiento de células de éstas in vitro, es Ie tianina. lledios de cultivo 1Levan por 1o general adenás de la tianina otras vitaminas como la pirodoxina y et ácido nicotlnico, cono tanbién nio-inositol, un azúcar-alcohol que de igual n¿¡nera es considerado cono vitamina.. - Reguladores del creciniento. l¡ induccién de divisiones celulares en cultivos sóIo es posible en presencia de reguladores de creciIDiento en el rnedio de cultivo, Estoa son por 10 general hormonas vegetales de las clases de las auxinas y citoquiRinas, naturales o sintét.icas (Figura 1). otros reguladores del creciniento, pertenecientes a otras clases de hornonas vegetales cono e1 ácido ábsclsico, e1 ácido giberé1ico son raramente utilizados para la inducéión y e1 manteniEiento de cultivos cel-ulares, aunque 1o son con nayor frec{encia en la inducción de procesos de diferenciación de células cu,ltivadas. - Otro factor 5,5 y 5,8.. importante es el pH que generalménte es aJustado entre. 42.
(5) ZEA CHe -COOH. "\ , C ' C ,CHzOH. IAA. -crl,. HN-á. cooH. Cu,. t H. R'NX P,A*. @otl CH. I. o ). Fielra. 1.. EstTr¡cu¡ra de las principales fitohorrnonas usadas en los nedios ile Alrxinas: (ras sintéticas están narcadas con r¡fi astérisco). cultivo. 2-4 ü ' ácido (NAA)-r (IAA) naftalenaoétiao ácí& ácído índoiacéti@ , clorrof€noÉacÉtico (2,+-ú1. Cito<luininas: Zeatina (ZEA), Kineti¡a. , ..,f{t^l. , Be.nzi ll nni nnntrrina. (BA'l '. dá 1a conposición de dos medios de cultivo r¡uy En Ia Tabla 1se frecuentenente usados. Aunque éstos fueron desarrollados para obtener un crecimiento óPtf.Eo dL cé1u1as de tabaco (lts ) I -de soya -(85) han podido ser culti(6), en ellos, sin o con Pocas nodificaciones, yadas aatisfactoriaEente de Plantaa pertenecientes a un células Bren número de esPecies (l-3). I¡s medios de_ cultivo cuya composición es conocida en eu totalidad Otras sustancias' que aunque no son se lee denonlna sÍntéticos. esenciales si pueden fómentar el crecimiento de cultivoe celulares son aninov iuqa¡ un p"pe1 íEportante en procesos de diferenciaclón, á"iCór, áciaós orgánicos y sustancias de composiclón lndeflnlda etc' cono agua de coco, extracto de levadura, caselna hidrollzada' con regularidad en medios Este t-ipo de sustancias son incluldas de cultlvo.. t,?.
(6) Tabla 1.. Conposición de dos de los medios nás frecuentenente utili?ados en el cultivo de céIu1as vegelales (sin f itohornonas) .De acuerdo con Reinert y BJ.nding, 1986, Concentración ng/l MS. llacronutrieDtes MgS0O. 370 170. 7 H2O. Kzto4. 85. 250. 150. HrO NaHTPOO.. KNo3. 1900. NH4NO3. 1650. CaClr. ZHrO (NH4)2. so4. 440. 2500. 150 134. l'[lcronutrientes 6,2. H3803 MnS04.H20. 1 5, 6. 10. ZnS0O.7HrO. 8,6. 2HrO NaMo0O.. 0,25. o,25. .7Hr0 CUSOO. o,025. o,025. CoCl, .6Hr0 K1. o,o25. o,o25 0 ,7 5. FeSOO. TH,O. 0,83 27,A. Na, EDTA. 37,3 40. NaFe EDTA. 30 x 10'. Sacarosa. ?. 2O x 1O-. Vitaminas. 0,5. Tianina HCL Piridoxina I{CL Acido nicotínico Mio-inositol pH. o,5 o,5 100. 44. 10 I I. 100 5,5.
(7) IV.. REGENENACION DE PLAMAS DE CTJLTIVG CEU'IARES. que en aninales en los que generalnente 1a diferenciaA1 contrario ción cel-ular es irreversible, en plantas algunos tipos de células diferenciadas conservan Ia habilidad de dedlferenciar, regresar a uú estado oeristemático y de regenerar plantas completas. Esta habllidad es llanada totipotencia. Dos vías ae conocen para la regeneración de plantas a partir de cultivos la eobriogénesis y 1a organogénesis incluídas celulares, en el térnino norfogéneeis. l.. ls enbriocénesis: consiste en Ia fornación de enbriones somáticos o estructuraa bipolaree que son réplicas en su norfologla y fisiologla de enbriones zigóticos, al Eenos en estadios internedlos del desarrolLo de estos últioos. EI desa¡rollo de e¡briones sonáticos in vitro incluye estadios gl-obulares, acorazonados y en forma de torpedo, con un eje enbrionario y con polos radicu1ar y apical bien definidos. Ia regeneración de plantas a partir de enbriones sonáticos sucede generalnente. en un proceso similar a 1a gerninación (Figura 2).. 2. Ia ofg,anogénesis: co¡rsiste en la fornación en loe cal1os de lleuse o retoños, los cuales después de su desarrollo a pequeños tallos pueden ser cortados y transferidos a un nedio de cultivo de diferente cooposici6n con el fln de enraizarlos y obtener pequeñas plántu1as. I,a Tabla 2 muestra Las princípales de regeneración.. diferencias. entre 1os dos nétodos. -. Factores de 1os que depende la inducción de morfogénesis.. l.. En una misna especie .existen genotipos o variedadee Genotipo. en loa que 1a inducción de morfogénesis puede ocurrir con Eayor facilidad que en otraa. de que la capacidad de regeneración puede ser Existen índicios de una variedad a otra co¡Do característj-ca genética transnitida nendeliana .. y ttpo de células. Este es ínfluenciado por 2. Estádo fisiológico No todos 1os tlpos ]a forna en que se han cultivado las células. de células presentes en un calLo o en una suspensión llegan a particlpar en procesoB de diferenciación.. 45.
(8) Tabla 2.. Principales. diferencias. entre 1as vías de regeneración.. Organogénesis. hbriogénesis: bipolares Estructuras vascular con e1 callo.. sin. conexion. Estructuras con conexión el caIlo.. : monopolares vascular con. La diferenciación se inicj-a por 1o gepartir a de una sola cé1u1a. neral. inicial la dif erenciación abarca un grupo de células.. la índuccíón requÍere por 1o general relativanente altas concentraciones de auxinas sin o con bajas de citoquininas.. ls induccíón requiere nornalmente al-tas concentraciones de ciEoqui,ni-na o sin o con bajas de auxina.. Puede ser inducida tanto en medios Llquidos como en medios se¡nisólidos.. Nornalmente es obtenida bre nedios senisólídos.. so-. En diferentes especies 1a rnorfoJ-ogla de las células con estas capaEstas han sido descritas cidades ha sid<¡ muy bien caracterizada. pequeña6, redondas' ricas en citop].asna como células relativanente y no vacuoladas. y condi.ciones de cultivo. Dentro 3. Conposición del medio de cultlvo es la más inportante de los cornponentes del medio, e1 factor de y el tipo f€ concentración concentración de fitohornonas. iones en eI medio, Ia presión osmótica de este, e1 pH, 1a temperaque influyen en 1os factores tura y la lu¡ninosidad son otros procesos de diferenciación. -. Cultivos eubriogénicos. al nomento de teaLizar el que generalmente incluye como por ejemplo de 2,4-D la obtención de cultivos capacidades morfogénicas. Por nedio de 1a aplícaci.ón de selección y del uso del medio adecuado, subcultivo de auxinas potentes altas concentraciones posible en nunerosas especies ha sido que constan únicamente de cé1ulas con enbriogénicos. o cultivos. en suspensión' es más fáci1 de realízar en cultivos La selección enbriogénicos por ejeurplo por medio de filtraciones. Cultivos pueden mantener 1as capacidades de regenerar plantas por años.. 46.
(9) HIPOCOÍTII,O. II. ALTA CONC.DE AUXINA: S x TO-7 2,4-D. ü CALLO. I. AITA CONC.DE AIIXINA. ú SUSPENSION. vI. FILTRACION. I. BAJACONC.DE AUXINA:s x IO-8 2,4-D. CELIJLASDE 12 um I ú. MASAPROEI'tsRIOGENICA. I I Y. MEDIOSIN AIIXINA. ü EI.ItsRIONESSO}'ATICOS MEDIOSIN AUXINA. PLAMAS Ei-t.:ra 2.. Método para i.'ducír emb¡iones sonáticos v regenerar Plantas en zanahoria (Green et al. 1987).. - El problema de Ia regeneracl6n, de Desde los Primeroa reportes en 1os celulares plantas cultivos la exitosa regenera¿ión de de años 50rs, varios cientos si no niles de especies pertenecientes a una gran variedad de fanilias, se han sunado a la lista de plantas que han podido ser regeneradas. A principÍos tle los años 80's la regeneración de gramíneas y leguEn 1os ninosas de grano era considerado como algo imposible. últimos años han aparecido sin embargo numerosos reportes de regeA nedída que 1os Procesos neración de plantas de estas famil-ias. en La regeneración son fisiológicos, involucrados noleculares esclarecidos, se va confirmando 1a hipótesis de que la totipotencla es una capacidad presente en 1as familias de todo el reino vegetal. (e).. -. En repetidae Estabiliatad genética de 1as plaotas regeneradas. ocasiones se há reportado Ia ocurrencia de cambios genéticos espontáneos en cultivos celulares y la regeneración de plantas genétlcamente diferentes a aquellas de 1as cuales se ha iniciado e1 cultivo. Este fenóneno es conocido con e1 nombre de variación sonaclonal y es tratado más a fondo en un capítulo aparte.. 47.
(10) -i. ".I. ti". Aunque la vari.ación sonaclonal ha sido reconocida cono una via para generar variabilidad genética y obtener variedades nuevas con caracnegativo puede tener teres agronómicamente deseables, un efecto donde se requiere en el caso de la propagación vegetativa de plantas, la uniformidad genétíca en las plantas regeneradas (9).. ... V.. APIJCACIONES DBL CIJLTIVO DI] CELIIIJIS EI{ LA BIOTECNOI,OGIA. permi1. Producción de netabolitos Células cultivadas secundarios. ten la difusión a1 medio de cultivo de una gran variedad de sustancias que forman parte de su metabolismo, entre 1as que se encuentran las conocidas cono metabolitos secundarios. productividad Líneas celulares de alta pueden ser inducldas, y seleccionadas fermentadores. Del nedio de cultivo 1a sustancia deseada. .. '. '2.i. ,. ':'.. :... t. compuestos de deterninados a cultivadas I,ran escala en extraída es posteriornente. ,'. celulares de cultivos Bioconversión. Consiste en elutilizamiento para la realización en compuestos químicos de reacciones bioquimicas que son adiciónados es útí1 La bioconversión al nedio de cultivo. en caso de que éstas reacciones sean imposibles o muy costosas de por rnétodos convencionales. realizar. reprecelulares Los cultivos 3. Propagaci6n vegetativa de pla¡tas. o clonaje' sentan una via efj-caz para 1a propagación vegetativa de manera rápÍda y a gran escala, de una gran variedad de plantas ornarnentales y espede iroportancia econórnÍca cono Io son frutales, ( 2 , cíes forestales 5, 8). para la propagacÍón de -plantas Esta técnica tanbién es apiicada en las cuales e1 ciclo sexual no ocurre naturalrnente o no es deseado' realizadas cono en híbridos valiosos resultantes de polinizacÍones manualnente, mutantes, etc. de esta técnica es 1a Una variante 41 igual produccióon de 1as denorninadas semillas artificiales' que sus homólogos naturales, 1os enbriones somáticos, después de un proceso de rnáduración pueden ser inducidos a entrar en un estado durante el cual de dormancia, parecido a1 de la semilla sexual, estos tienen la capacidad de sobrevivir 1a disecación y el almacena1os enbriones somámiento. Encapsulaáos en sustancias gelificantes pueden continuar con 1a humedad' ticos al su tlesarrollo contacto en un proceso parecido a Ia gérrninación. en e1 rnundo En la actualidad numerosas compañías biotecnológicas para Ia comercialivienen i-nvestigando en e1 desarró11-o de técnicas zación de esta forna de propagaci-ón vegetatl-va.. 48. {.
(11) 4. Selección in vitro. I-a variabilidad genética generada espontáneamente en los cuLtivos celulares o aquellas que por medio de tratanientos mutagénicos es posible de ser inducida, puede generar entre 1os nillones de cambios genéticos estad ísticamente posibles, letales o sin ninguna inportancia práctica, células y potencialmente plantas con características nuevas explotables agronónicanente. E1 cultivo in vitro abre la posibilidad de realizar tarizados para la obtención de plantas con determinadas caracterlsticas genéticas a nivel celular, peruitiendo eI seleccionar individuos entre nilloneg en un espacio tan reducido cono el que puede ocupar un cultivo celu1ar . para 1a apllcación l¡s principales requisitos el mejoramiento vegetal son: l.. Lá dÍsponibilidad de nétodos eficientes de pLantas de cul,tivos ceLulafes. La expresión de 1a característica en e1 cultivo.. c. de esta para la. a seleccionar. técníca. regeneración. a nivel. La disponibilidad de r¡é¿odos de tamizado para la las Iíneas celulares deseadas.. en. celular. selección. de. 11 i¡,árodo nás conún de realizar selección in vitro es e1 soneter un cultivo a un estrée fLsico o químico en 1a presencia de1 cual sólo las célul-as deseadas pueden seguir creciendo. Ia Figura 3 muestra un ejemplo de un programa de inducción de mutagénesis y selección 1n vitro.. ..+ MUTAGENESIS PLAMAS 2n.J.EXPLA¡NIE'SUSPENSIONES CELULARES +EXPRESION DE IA MUTACION I Y PROGENIE PLANTAREGENERA¡A AISL,AI.,|IENI0 <_ SELECCIoN \. \ororrr*./. GENETICO. Figura 3.. \. DE VARIANTES. \. mnrsrs ./. .,r. BIOQUIMICO. Programa de nuLagénesisy selección (Green et a1, 1987).. 49.
(12) Dentro de 1os estreses rnás comunes que vienen siendo utilizados en la selección in vitro cabe enumerar: alta salinidad, herbicidas, toxinas de hongos o bacterias, metales pesados o anáIogos de aminoácidos.. I..a Tabla 3 presenta una lista de plantas con resistencia a diferentes patógenos que ha sido posible de obtener por medio de 1a seLección in vitro, Un ejemplo práctico de la utilidad de esta técnica es el de una variedad de maíz que actualnente se encuentra en e1 mercado de fos Estados Unidos, que se caracteriza Por contener una IDaYor cantidad triptófano, deI aminoáci-do esencial Y que fué obtenida de líneas celuLares resisLentes a1 análoso deI triptófano, 5- metiltriptófano '. Tabla 3.. Ejemplos de selecciones exitosas de plantas resistentes a patógenos a partir de células somáticas in vitro.. Planta. Enfermedad. Referencia. CLavel. Fusarium. Buiatti. c^..^. Phytophthora. EDeI et ar,. l4aíz. Ilelminthosporiun. Gegenbachet aI, 1977. Attarta. Fusarium. Hartrnann et al'. Avena. Helminthosporium. Briggs et at, 1984. Papa. FusarÍum Phytophthora. Schuchmann2985 IJennke rv /v. Uva. Phona. Sacristan 1985. Arroz. Ilelninthosooriun. Ling et al,. Tabaco. Al-ternaria Phytophthora Pseudomonas. Thanutong et a1, 1983 Helgeson et aI, 7972 Thanutong et a1, 1983. Fuente:. Según Green et al,. et al,. 1985 rvlo 1984. 1985. 1987.. - Transforrnación genética. Diferentes métodos se han desarrollado pagenes provenient.es de ra la i¡troducción de otros organismos, como otras plantas, animales, bacterias, virus, etc,, en forma de ¡ro1écuAdearás de la expresión en la las de ADN, en célu1as vegetales. es posible obtener la integración cé1ula de1 gen introducido estabLe alcanzando de esta for¡na la perpetuade éste en e1 genorna ce1ular,. 50.
(13) ción de su presencia en la célula. fornación genética.. Este proceso es deno¡¡lnado trans-. la clave de la ingeníería Benética, la técnica que esta revolucionando el nejoraoiento veBetal, está en obtener plantaa completas de células transfornadas genéticamente, procediniento en e1 cual el cultivo in vitro juega un papel inportante. Este tema será tratado nás a fondo en el capítulo nación genética en este nismo libro. Vt.. sobre Ia tranafor-. PROIOPLASfi)S. A diferencia de 1as células aninales, las cétulas vegetalee están provistas de una pared extracelular rígida, La cual está conpuesta principaLmente de polísacá¡idos como flbras de ce1u1osa, he¡ricelulosa y pectinas. Protopl-astos son células de la pared celular.. 'desnudas' 1as cualee han sido desproviatas. Estos, cultivados adecuadanente, bienen capacidad de regenerar una pared celuiar, de noscrar dÍvÍsionee y la fornación de agrega<ioe celulares, de 1os cuales en un gran número de especies ha sido posible 1a regeneración de plantas cor¡pletas. de una serie de nanipulacionea que Ellos perniten 1a realización no son posibles en céIulas enteraB y que tienen un aupllo rango de aplicaciones en biotecnología. - Aislaniento de protoplastos. En el estado norrDal de 1a céIula, el citoplasna ejerce, por nedio de la nerobranace1ular, una presión Esta es generada hidrostática sobre 1a pared, conocida co¡no turgor. por 1a di.ferencia en el potencial esmótico de los fluldos intra y extracelulares. Es posible eliminar 1a pared celular y recuperar protoplastos estables si es que previanente se ha disminuldo eL turgor inte¡no de las células por xoédio de1 uso de soluciones de sustanclas osnótlcanente agtívas (plasnolisís, Figura 4). E1 método rqás común para elÍninar Ia pared celular es el enzimático, enzinas deSradantes introducido por Cocking en I960' que utiliza de 1a pared celular como 1as celulasas, pectinasas y hemlcelulasa.. 5l.
(14) a. Figura. 4.. para del nétodo enzimático esquenática Representación a)Célu1a de un tejido. el aislamíento de protoplastos. c) Degradación de Ia pared celular d) b) Plasmolisis ProtoDlasto aislado '. Para el- ajuste de la presión osnótica de las soluciones pueden ser utilizadas sales minerales, azúcares o azúcar-alcoholes. Inportante para la estabilización de los protoplastos' adenás de una aLta presión osmótica del nedio, es e1 uso de cationes divalentes, especialmente el calcio, que tienen 1a propiedad de hacer más resÍstente 1a menbrana celular a estreses necánicos. Otros factores que juegan un papel irnportante en e1 aislamiento son 1a temperatura de incubación y eI pH ya que 1as enzimas degradantes de Ia pared tienen un pH y una temperatura óptinos de actividad. E1 pH puede ser nantenido estable por nedio del uso de un buffer, etanosulfónico de los cuales e1 más conún es e1 ácido norfolino i/MFe \. y Ia conbinación de las enzinas a usar dependen l€ concentración ya que 1a adenás de 1a especie, de la fuente y edad de1 naterial, y la edad de a tejido con composición de la pared varía de tejido éste. cuyo tamaño oscífa entre los Una vez aislados los protoplastos, no degradado 20 y 80 um, pueden ser separados de reslos de tejido y lavados por medio y células por nedio de filtraciones nuertas en soluciones aiustadas osmóticamente. de centrifugaciones - Cultivo de protoplastos. utilizados conúnl,os medÍos nutritivos de 1a siguiente manera dlfieren de protoplastos mente para e1 cultivo de células enteras: de aquellos usados para el cultivo - La presencia de sustancias osmóticamente activas. - Altas concentraciones de cationes divalentes: por ejemplo 5-10 mM de Ca*+.. 52.
(15) - Un reducido contenido de fuentes inorgánicas de amonio a cambio de un aumento del contenido de 1as fuentes orgánicas (aminoácidos). - El contenido de sustancías que ocupan un lugar central en e1 meEabolÍsno celular cono ácidos orgánicos y algunas vítanínas. - El contenido de un buffer, regularmente el lfES - El contenido de sustanclas que puedan ser utillzadas en 1a resíntesis de la pared celular cono celobiosa, xyloea, etc. Protoplaetoe son altanente seneibles a esEreBes necánicos coEo la agítación y requieren de un culdado Eayor que céLulas normales para 8u cultivo. Estos pueden aer cultlvadoe se presenta en La Figura 5.. de muchas ¡nsneras dlferentes. ta1 cottro. en Ia actualídad ' Este l¡1timo método es el nás conúnmente utilizado debido al fácil nanejo que permite de los cultivos y a que ha nostraen especies o genotipos con los que otros nétodos do ser eficiente la alta presión osnótica del medio de cultivo puede han fallado. enpezar a ser reducida gradualmente después de que 1a pared celular haya sido resintetizada. visibles a sinple vista, éstos Una vez se han formado nicrocallos, pueden ser rnanejados y cultivados ocmo ca1los provenientes de otras fuentes ' "'i'ir rr':' '. Figura. 5.. Métodos para el cultivo Sobre medios de protoplastos. (Figura senisól-idos 5a), suruergidos en medios líquídos que (Figura 5b), en pequeñas gotas de nedj.o de cultivo cuelgan de tapas de cajas petri (Figura 5c), en ninúscugotas en gofas las de medio de cultivo incrustadas (Figura 5d) o incrustados en bloques de aceite mineral que flotan en medios o lentes de agarosa (un gelificante) y que pueden contener o no cé1u1as en suspensiÓn líquidos a manera de cultivo nodríza (Figura 5e).. 53.
(16) a. - Regeneración. Por 1o general especies que son difíciles de regenerar a partir de cultivos celulares l-o son de igual manera a partir de protoplast.os. Un factor importante del que depende e1 éxito en 1a regeneración de plantas a part.ir de protoplastos, es 1a escogencia det te3.ido apropiado como fuente de protoplastos. El utiliza¡niento de suspensiones_ celulares enbriogénicas cono fuente de prot.oplastos ha co;ducido a1 éxito en especies en 1as cuales anterioimentl 1a reeeneración de éstos era considerado como algo inposible.. VII.ITÍJCAdOIES FRffiAS. l.. Tril. CT]tflIID IB IÍUI(PÍASICS AI IA EDMIXffiA. TransformacÍón genética. Protoplastos con su delgada y frágil nembrana celular cono única barrera entre e1 exteriór y e1 j.nterior de la céIu1a resultan aer fitiles de Dara la introducción molécu1as de ADN en céluIas vegetales con el fín de t¡ansformarlas genéticarnente. Diferentes métodos para la introducción deI ADN en protoplastos se han desarrollado. La transformación genética de protoplastos como vía para obtener plantas transgénicás es importÁnte principalmente en monocotiledóneas, en las cuales hasta el momento se.ha tenido poco éxito con e1 método de transfornación vía Agobectsirrn (véase capítulo sobre transforrnación genética).. 2.. Hibridización sonática. genéticanente Protoplastos de plantas diferentes pueden ser inducidos a fusionar, es decir a reunir sus contenidos dentro de una nisma membrana celular.. A1 igual que protoplastos normales, en nunerosas ocasiones los productos de fusión han demostrado tener Ia capacidad de regenerar una pared celular, mostrar divisiones y 1a forrnación de celulares cal1os, de los cuales ha sido posíble la regeneración de plantas híbridas, llamadas híbridos somáticos. Básicanente es posible no só1o 1a fusión de protoplastos de plantas de diferentes especies sino también de diferentes familias, órdenes, etc, La probabilidad de que los call-os formados por Ios productos de fusión sean genéticamente estables (es decir que no suceda 1a pérdida de cromosomas), de que de éstos sea posible 1a regeneración de plantas y de que éstas sean fértiles aumenta entre rnás cercano sea e1 parentesco de los protoplastos fusionados..
(17) Dos tipos diferentes. de hibridización. sonática se conocen:. somática en sl consiste en la fusión de doa protoI. la hibridización plastos genéticanente diferentes. Esto puede dar orígen a células y plantas que contenBan una nezcla de organelas de 1os dos aparentales y en caso ideal 1a suna de cromosonas ile los protoplastos fusionadoe (Figura 6a), que consiste en la fusíón de un protoplasto con 2. l¿ cibridización Esta técniotro a1 cual se le haya eli¡inado el núc1eo o citoplasto. ca pernite Ia transferencia única:¡enEe de olganelaa de una célula a otra (Figura 6b). En 1o que se refiere a su aplicación en proBranas de Eejoranlento vegeEal, la técnica de fusión de protoplastos abre doe posibilidadea: - La de obtener híbridos entre pl-antas en 1as cuales eI cruzaniento bioquímicas sexual no sea posibLe debido a barreras fisiológicas, o norfológicas. - la de transferir planta a otra.. caracterleticas. genéticas cltoplasmáticas. de una. a I. +. I. cit.. I PF. PF. /. Figura. 6.. y transferencia Hibridízación de organelas por nedio de la fusión de protoplastos. a) Hibridización b) Cibridización, Cit. cicoplasto, Pf producto de fusión, Hs Hlbrido sornático, Ci clbrido,. .l).
(18) I-os nétodos existentes cialnente dos pasos:. para 1a fusi6n. de proEoplastos incluyen esen-. - E1 establecimiento de un contacto estrecho de nebrana a tneEbrana entre los protoplastos que se quieran fusionar. - El rompiniento. y fusión de Iae membranas en el 6ltio. de contacto.. Ia fusión se puede alcanzar con nétodos físlcos o qufnicos, cono por medi.o del uso de soluciones con alto pH y altae concentraciones de calcio, de sustancias aglutinantes coEo el PEG o de deecargas eléctricas. Dentro de 1os carácteres citoplasnáticoe de jmportancia que ha sido posible de transr0itir de esta nanera, cabe enumerar la nachoeeterflly la resistencia al herbícida atrazina. dad citoplasnática Actualnente 1a técnica de 1a hibridizaclón sonática ae vietre aplícany con éxito en prograoae de nejorernl ento de papa do rutinariame¡te en dlferentes palses (10). VIII.. OONCLT'SIONES. Básicamenüe son ttes las manipulaclonee poslbles en' lae vegetales que pernite el cultivo de células y protoplastoe. - La inducción de prollferación. celular. cé1u1as. potencialnente ilinitada.. - La inducción dirigida de canbios genéticos y 1a obtenclón de célugenéticas nuevas. las con caracterlsticas - La regeneración de plantas conpletas de célulae cultivadas. I€ explotación de éstas conjuntanente con otros Détodoa biotecnológicos tiene una anplia aplicación en la agricultura e industria p¡incipalrnente en tres ca$pos: -. E1 mejoraroiento veSetal, permitiendo genéticaa nuevas. con características. -. la propagación vegetativa ráplda y a gran escala.. -. La producción induslrial de sustancias quínicas y protelnas sintetizadas en las células vegetales.. 56. la. generación de plantas.
(19) I[.. REFERENCIAS. 1. Bhojvani, S.S., Razdan, M.K. 1986. plant tissue culture: theorv an practice. Elsevier Science Publishers 8.V., Ansterdan, Netherlands. 2. Chuong, P., Bewersdorf, t{,D., powell, A.D., pauls, K.p. l9gg. So_ natic transfer of cytopLasnic traits in Brassica napus L. by haploid protoplast f usion. Mol . Gen. GñEE,:-tl :-lFZ_ZOt . 3. Evans, D.A., Sharp, W.R., Annirato, p.V., yanada, y. 19g3. Hanrt_ book of plant celL culture. Volu¡e I, Technlques for propaga_ tion and breedlng. Macnillan PublÍshing Co., Newyort, ú.S.¡. 4. Green, Soners, Hackett, Biesboer, 1987. plant tissue and cell ture. Alan R. Liss Inc., Netherlands.. cu1_. 5. Kao, K.N., Michayluk, M.R, 1975. Nutrirional requerÍments for grorr'th of Vicia haiastana celLs and protoplast at a very low density in liquid nedia. Planta 126: IO5-110. 6. Reinert, J., Binding, H. f986. Differentiation of protoplast and of transformed plant cel1s. Springer Verlag Beilin, HeideLberg, West Gernany. 7 . S c h w e i g e r ,H . G . , D i r k , J . , K o o p . H . U . , K r a n z , 8 . , N e u h a u e ,G . , S p a n genberg, G,, lfolff , D. 1987. Individual- selection culture and nanipulation of higher plant ceIls. Iheor. Appl. Genet. 73 : 769-783. "8.. Szabados, L., Roca, \¡l.l'1. 1986. Regeneration of isolated nesophyll cells and cell suspension protoplast to plants in Stvlosanthás plant cell ié[oitE-5: gg+a{rgnsis. A rropical forage legune. L74-t77.. 9. Vasil, Indra K. 1986. Cell culture and sonatic cell genetics of plants, Volume 3, Plant regeneration and genetÍc v a r i a b i l i g y . Acadenic Press, Inc., Orlando, Florida, U.S.A. lo.l,Iebb, K.J. 1988. Recent development in the regeneration of agronoplant €e1l, Tiisue mically inportant crops fron protoplast. and Organ Culture. l2z 727-138.. 57.
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