Aislamiento e identificación de Micobacterias No Tuberculosas (MNT) a partir de alimentos de venta callejera como posible fuente de exposición.
Introducción
Las micobacterias fueron los primeros microorganismos en ser reconocidos como los agentes causantes de las enfermedades en los humanos. Mycobacterium leprae fue descrito como el agente causal de la lepra en 1874 por Armauer Hansen, mientras Robert Koch en 1882 determinó que Mycobacterium tuberculosis (MTB) era el agente etiológico de la tuberculosis (TB).
Las micobacterias, de acuerdo al tipo de enfermedad que producen, se han dividido en micobacterias tuberculosas (CMT) y Micobacterias No Tuberculosas (MNT); las CMT forman el llamado complejo tuberculosis, que se encuentra integrado por M. tuberculosis, M. bovis, M.
microti, M. africanum y M. canettii, estas especies se caracterizan por producir tuberculosis en diferentes huéspedes. Las MNT producen una serie de enfermedades diferentes a tuberculosis tales como micobacteriosis diseminada, linfadenitis, osteomielitis, abscesos de piel y partes blandas; entre otras.
La existencia de MNT se advirtió poco después que Koch describió el bacilo tuberculoso.
Originalmente se denominaron “micobacterias atípicas” ya que se creía que eran cepas inusuales de MTB; no obstante, eran típicos bacilos ácido alcohol resistente. En esta etapa fueron considerados como contaminantes ambientales o simples colonizadores. A partir de 1950 se reconocieron como patógenos potenciales y se les cambio el nombre de atípicas por el de MNT o micobacterias ambientales (Crespo y col., 1997). Las MNT comprenden a más de 100 especies identificadas que son fuentes potenciales de enfermedad entre las que se encuentran:
M. avium, M. intracellulare, M. smegmatis, M. leprae, M. ulcerans, M. asiaticum, M. marinum, M.
kansasii, M. gastri, M. haemophilum, M. branderi, M. lentiflavum, M. scrofulaceum, M. shimoidei, M. interjectum, M. malmoense, M. triples, M. xenopi, M. chelonae, M. fortuitum, M. simiae, M.
terrea, M. celatum y M. gordonae, entre otras.
Tradicionalmente las micobacterias son clasificadas como micobacterias de crecimiento rápido o micobacterias de crecimiento lento, de acuerdo al tiempo que tardan en aparecer las colonias en los medios sólidos; 5 días para las de crecimiento rápido y más de cinco días para las de crecimiento lento (Wayne y Kubica, 1986). Dentro de las MNT existen tanto especies de crecimiento lento (ejemplo: M. avium) como de crecimiento rápido (ejemplo: M. fortuitum).
Runyon (1970) clasificó a las MNT de acuerdo con sus características de crecimiento y pigmentación, esta clasificación ha sido la base fundamental para identificarlas y diferenciarlas.
El propósito inicial de esta clasificación fue recalcar la diferencia entre MTB y las MNT, basándose solo en su hábitat y en la capacidad para producir pigmentos. La clasificación consta de 4 grupos: Grupo I: Fotocromógenos: producen pigmento amarillo en presencia de la luz.
Ejemplo: M. kansasii, M. marinum. Grupo II: Escotocromógenos: producen pigmento amarillo a naranja en la oscuridad. Ejemplo: M. scrofulaceum, M. gordonae. Grupo III: No fotocromógenos:
no producen pigmento. Ejemplo: M. avium. Grupo IV: Rápidos crecedores: crecen en menos de una semana. Ejemplo: M. fortuitum.
Antes de la llegada del SIDA, las enfermedades causadas por MNT eran pulmonares, confinadas a nódulos linfáticos cervicales, limitadas a piel y, en casos raros, diseminadas (Wolinsky, 1979). Actualmente las enfermedades producidas por las MNT han cambiado radicalmente debido a la epidemia del SIDA en el mundo. En los Estados Unidos y Europa del 20 al 50% de los pacientes con SIDA son infectados por MNT (Horsburgh, 1992; Horsburgh, 1991;
Horsburgh y Selik, 1989; Peters y col., 1989; Selik y col., 1987). El aumento de incidencia de
enfermedades debidas a MNT se ha acelerado rápidamente desde el primer reporte de MNT en pacientes con SIDA en 1982 (Zakowski y col., 1982).
Las razones para este aumento de las infecciones por MNT no son muy claras, pero pueden estar relacionadas con distintos factores según la región geográfica, entre ellos podemos mencionar a: la baja prevalencia de infección por MTB, el aumento de la eficiencia de los laboratorios para conocer, aislar e identificar este tipo de micobacterias, el alza en el número de individuos inmunosuprimidos a causa de la epidemia de SIDA; y el aumento en la sobrevivencia de individuos con enfermedades como cáncer, diabetes, transplantes, tratamientos con corticoesteroides y enfermedades autoinmunes, entre otras (Sanders y Horowitz, 1995; Choudhri y col., 1995; Haulik y col., 1992; Horsburgh, 1991).
El SIDA tiene un impacto directo sobre las enfermedades producidas por las MNT (Benson, 1994; Choudhri y col., 1995; Claydon y col., 1991; Selik y col., 1987). Antes de la epidemia del SIDA, y aun hoy en las personas inmunocompetentes, las infecciones por MNT son pulmonares. En contraste, en los pacientes con SIDA e individuos inmunodeficientes, las enfermedades causadas por las MNT son diseminadas, además de que se presentan más infecciones por MNT en piel. Respecto a la edad, en pacientes VIH positivos se ha visto un predominio de la infección en los más jóvenes, mientras que, en personas sin infección por VIH el mayor predominio de infección por MNT se presenta en mayores de 50 años. Sin embargo, en cuanto a sexo o a raza no se han observado diferencias estadísticamente significativas (Sanders y Horowitz, 1995; Choudhri y col., 1995; Haulik y col., 1992; Horsburgh, 1991).
Las MNT pueden encontrarse en diversos ambientes y exhibir un estilo de vida saprófito.
Sin embargo, poseen mecanismos por los cuales pueden invadir y crecer dentro de células hospederas y por lo tanto tienen la capacidad para infectar animales, aves y humanos.
Aunque la interrelación entre el sistema inmune del huésped y las micobacterias tuberculosas se conoce cada día más, no se sabe con exactitud cuál es el tipo de interacción entre el huésped y las MNT; no obstante se considera que debe ser más profundo que una simple colonización porque la exposición a ellas puede producir una respuesta intermedia a la PPD, que es un tipo de reacción cruzada pues hay antígenos comunes entre las micobacterias.
Por ello, la prevalencia de MNT varía de acuerdo con la presencia de MTB. Así en países donde la TB es endémica, la prevalencia de MNT se podría ver disminuida o incluso enmascarada debido a que los linfocitos de memoria sensibilizados contra MTB generan una respuesta protectora inmune celular contra otro tipo de micobacterias. Así mismo se ha visto que cuando un organismo ha estado expuesto a M. avium, los linfocitos T alfa beta (a b)+ CD4- CD8- reconocen antígenos comunes de diferentes cepas de micobacterias en el contexto del HLA clase I (Grange, 1987; Okello y col., 1990; Thomssen y col., 1995; Wolinsky, 1992).
Aunque todavía faltan datos por aclarar sobre la patogénesis de la infección y la enfermedad producida por las MNT, diversos estudios sugieren que la transmisión persona- persona es rara, produciéndose la mayoría de los casos a partir de MNT distribuidas en el ambiente y alimentos. El mecanismo de la transmisión más aceptado es el de la aerosolización de microorganismos en la infección respiratoria y su ingestión por vía digestiva (alimentos) en el caso de linfadenitis en niños y en las formas diseminadas en pacientes con SIDA. En pacientes con infecciones en partes blandas se ha descrito la colonización directa de MNT a partir del consumo de agua (Caminero, 2001). Las formas clínicas de presentación más habitualmente descritas han sido la pulmonar, linfadenitis, abscesos de piel y partes blandas; osteomielitis y enfermedad diseminada, siendo los agentes más frecuentemente involucrados: M. avium, M.
intracellulare, M. kansaii, M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae y M. scrofulaceum (Caminero, 2001).
Dentro de las fuentes potenciales de exposición a MNT se encuentran el suelo, agua, aire, animales domésticos y salvajes, leche y alimentos (Falkinham, 1996).
Yoder y col. (1999) encontraron que aislados de MNT de alimentos fueron idénticos a aislados clínicos, además identificaron dos aislados de alimentos con una relación muy cercana a aislados de pacientes, sugiriendo que los alimentos son una fuente potencial de infección. Esta hipótesis posteriormente fue corroborada por diversos estudios en los que los genotipos de las cepas micobacterianas fueron iguales a los aislados de pacientes (Mediel y col., 2000).
Se ha reportado infecciones por MNT a través de de la ingestión de alimentos como leche, agua, carne de cerdo, frutas, verduras crudas, mariscos y pescado (Chapman y Speight, 1968; Bryan, 1969; Sweeney y col., 1992). Por ejemplo, en pescado destinado para el consumo humano de diferentes países como España, Israel y Brasil se ha reportado el aislamiento de: M.
chelonae, M. fortuitum y M. gordonae (Mediel y col., 2000; Ucko y Colorni, 2005).
Las Micobacterias No Tuberculosas (MNT) pueden afectar tanto a la población inmunosuprimida como a la inmunocompetente de una comunidad determinada, provocando una serie de enfermedades, entre las que se encuentran: micobacteriosis diseminada, linfadenitis, osteomielitis, y abscesos de piel y partes blandas, entre otras. En México un significativo porcentaje de población esta inmunosuprimida: 10.8% presenta diabetes mellitus tipo 2, de esta enfermedad cada año se diagnostican 300,000 casos nuevos (SSA, 2005), y un subestimado 2%
de la población se encuentra infectada con VIH (WHO, 2006). Además, el 0.05% de la población presenta cáncer, esta enfermedad es la segunda causa de muerte en la población general (SSA, 2005). Por otro lado el país cuenta con 4.86 millones de adultos mayores de 65 años y se estima que para el año 2050, cuando la población mexicana alcance casi 132 millones, uno de cada cuatro habitantes formará parte de la población de la tercera edad (González, 2000). Toda esta población es susceptible de ser infectada y desarrollar enfermedades causadas por MNT a través de alimentos contaminados, como ya ha sido demostrado en otros países (Sanders y Horowitz, 1995; Choudhri y col., 1995). En México no existen estudios de prevalencia de MNT en alimentos de venta callejera, que nos permitan determinar el riesgo a que esta expuesta la población antes mencionada
Objetivo General
Determinar la prevalencia de Micobacterias en salsas de venta callejera en la ciudad de México, con el fin de conocer cuales son las especies micobacterianas más frecuentemente aisladas y que podrían causar enfermedad a la población mexicana.
Material y Métodos
Metodología:
El estudio será transversal, protectivo y analítico.
Población de estudio. 51 muestras de salsas de diferentes tianguis así como de puestos de venta callejera, que serán seleccionados con base en su ubicación en la ciudad de México para tener muestras representativas de toda la ciudad.
Aislamiento. Aproximadamente 100 g del alimento serán suspendidos en 100 ml de agua ultrapura en una bolsa de polipropileno, posteriormente se homogenizará utilizando un agitador durante 10 min. El sobrenadante resultante será filtrado. Este filtrado será centrifugado y el precipitado se resuspenderá en caldo Middlebrook 7H9 suplementado con 500 μg/mL de cicloheximida y glicerol al 10%, las muestras se congelaran hasta su uso. Posteriormente 5 mL de cada muestra se descontaminara con 10 mL de una solución que contiene ácido oxálico al 5%, NaOH al 2% y citrato de sodio al 2.9%, incubándose a temperatura ambiente por 10 min. La reacción será neutralizada con 20 mL de regulador de fosfato. Continuando con una centrifugación, y el precipitado resultante será resuspendido en un 1 mL de regulador de fosfato.
100 μL del precipitado resuspendido será sembrado en medio Middlebrook 7H10 con verde de malaquita al 0.002% y se incubará de 2 a 8 semanas a 37°C.
Identificación de la especie de las MNT: La identificación de las especies de los aislados se realizará utilizando en primer lugar una PCR que permitirá identificar si el aislado pertenece al género Mycobacterium, para ello, los aislados serán sembrados en caldo Dubos-OADC, de donde se tomaran 100 μL del cultivo de las micobacterias, se centrifugaron a 14000 x g durante 2 min, se decantará el sobrenadante y el precipitado se resuspenderá en 100 μL de agua estéril.
Esta suspensión se hervirá durante 10 min y se utilizara como plantilla de DNA (100 μL del cultivo se pondrán en contacto con 100μL de perlas de vidrio, las células serán mecánicamente desintegradas en un rybolyser, después de 10 min de centrifugación a 13,000 x g el sobrenadante será trasferido a un tubo nuevo, este sobrenadante será utilizado como plantilla de DNA). Los iniciadores que se usarán son RAC1 y RAC8, los cuales amplifican un fragmento que abarca desde los últimos 99 codones del gen murA a la posición 357 del gen rDNA 16S y cuyo tamaño puede variar entre 900 a 1500 pb dependiendo de la especie micobacteriana; hasta ahora este fragmento se ha encontrado en todas las especies micobacterianas que se han estudiado (González y Merchand y col., 1996, 1997; Kempsell y col., 1992).
Una vez que hayamos comprobado que el aislado es una micobacteria, se realizará otra PCR para diferenciar las especies que pertenecen al complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT) o las MNT; para esta PCR se utilizaran los iniciadores MTB-F/MTB-R que amplifican un fragmento de 488 pb, exclusivo de los miembros del CMT (González y Merchand y col., 1996;
Kirschner y col., 1993).
Los aislados que no amplifiquen la banda de 488 pb, son las MNT, las cuales se someterán a la técnica de Telenti y col. (1993) para identificar la especie, dicha metodología consiste en amplificar por PCR el gen de la proteína de 65 kDa utilizando iniciadores comunes a todas las micobacterias. Posteriormente el producto amplificado será sometido a una digestión con las enzimas de restricción BstEII y HaeIII, las especies se identificaran con base en los patrones de restricción del producto de PCR, de acuerdo al algoritmo descrito por Telenti y col.
(1993).
Análisis estadístico:
Para la identificación de la especies de MNT, los patrones de restricción del producto de PCR serán interpretados con el programa de computadoras LANE MANAGER. Los resultados se analizarán utilizando el algoritmo Devallosis (1997) para la diferenciación de las especies micobacterianas.
Resultados
Aislamiento de las micobacterias a partir de alimentos.
Aproximadamente 100 g de las salsas fueron suspendidos en 100 mL de agua ultrapura estéril en una bolsa de polipropileno, posteriormente se homogenizó utilizando un agitador durante 10 min. El sobrenadante resultante fue filtrado. Este filtrado fue centrifugado y el precipitado se resuspendió en caldo Middlebrook 7H9 suplementado con 500 μg/mL de cicloheximida y glicerol al 10%, las muestras se congelaron hasta su uso. Posteriormente 5 mL de cada muestra se descontaminaron con 10 mL de una solución que contiene ácido oxálico al 5%, NaOH al 2% y citrato de sodio al 2.9%, incubándose a temperatura ambiente por 10 min. La reacción fue neutralizada con 20 mL de regulador de fosfato. Continuando con una centrifugación, y el precipitado resultante fue resuspendido en un 1 mL de regulador de fosfato. 100 μL del precipitado resuspendido fue sembrado en agar Middlebrook 7H10 con verde de malaquita al 0.002% y se incubó de 0 a 8 semanas a 37°C (Figura 1), posteriormente se realizó una resiembra en Lowestein-Jensen (Figura 2).
Figura 1. Colonias de aisladas de muestras de salsa en medio Middlebrook 7H10.
Figura 2. Colonias micobacterianas resembradas en Lowestein-Jensen.
Aislamiento del DNA
De los cultivos crecidos en Lowestein-Jensen, se tomó una asada y se sembraron en botellas estériles de 500 mL, se centrifugaron a 8670 x g durante 20 min a 4ºC; se decantó el sobrenadante y la pastilla obtenida se resuspendió en 3 mL de regulador de lisis. Posteriormente la suspensión se transfirió a tubos de 2 mL con tapón de rosca. Inmediatamente después se sometió a tres ciclos de choques térmicos, cada uno de 10 min a -70°C (Ultracongelador) y de 10 min a 65 °C.
Posteriormente, se adicionó 1 volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), se agitó suavemente en vortex y se centrifugó a 16000 x g a temperatura ambiente durante 5 min. Se recuperó la fase acuosa y se agregaron dos volúmenes de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1), se agitó en un vortex y se centrifugó nuevamente en las mismas condiciones. Se recuperó nuevamente la fase acuosa y se precipitó con 2 volúmenes de etanol absoluto.
Inmediatamente después se colocaron los tubos a -70 °C durante 24 horas para favorecer la precipitación. Los tubos se centrifugaron durante 15 min a 16000 x g a temperatura ambiente, después de los cuales se eliminó el sobrenadante y se lavó la pastilla con 500 µL de etanol al 70%, se centrifugó nuevamente. El DNA se secó a 43 °C por 10 min en el secador “DNA110 Speed Vac”. El DNA se cuantificó por espectroscopia (260 nm), y se determinó su integridad por
medio de electroforesis en gel de agarosa al 1 % (Figura 3); finalmente se almacenó a -20 °C hasta su uso.
1 Kb 1 2 3 4 5 6
Figura 3. Electroferogramas en gel de agarosa para corroborar la integridad del DNA, que se observa como una única banda de alto peso molecular en los carriles 1,2,3,4,5,6. El marcador de peso molecular usado es de una Kilobase.
Estandarización de la PCR para identificar el género de las micobacterias
Se utilizó una PCR para amplificar el DNA de las especies que pertenecen al género Mycobacterium; esta PCR se realizó usando la combinación de los iniciadores RAC1/RAC8. Los iniciadores RAC1 y RAC8 amplifican un fragmento que abarca desde los últimos 99 codones del gen murA a la posición 357 del gen rDNA 16S y cuyo tamaño puede variar entre 900 a 1500 pb dependiendo de la especie micobacteriana; hasta ahora este fragmento se ha encontrado en todas las especies micobacterianas que se han estudiado (González y Merchand y col., 1996, 1997; Kempsell y col., 1992). Las condiciones empleadas en la PCR fueron las siguientes: 36 ciclos, a 94°C/30 seg, 56.2°C/1 min y 72°C/2 min; además, se adicionó un ciclo final a 72°C/5 min; el volumen final de la mezcla de reacción fue de 50 µL. Dicha mezcla contenía MgCl2 1.5 mM; 100 µM de la mezcla de dNTP's, dimetil sulfoxido (DMSO) al 10%, 0.3 µM de los iniciadores RAC1/RAC8, 1.5 U de Taq polimerasa y 2.0 µL del DNA de la micobacteria aislada.
Los productos de amplificación se separaron en un gel de agarosa al 1.5% (Figura 4) en TBE 1X (Tris 89mM, ácido bórico 89 mM y EDTA 2 Mm) adicionado de bromuro de etidio al 0.83%; se utilizó como marcador la escalera de 100 pb (Life Technologies, Rockville, MD, USA).
Una vez que comprobado que el aislado es una micobacteria, se realizará otra PCR para diferenciar las especies que pertenecen al complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT) o las MNT; para esta PCR se utilizaran los iniciadores MTB-F/MTB-R que amplifican un fragmento de 488 pb, exclusivo de los miembros del CMT (González y Merchand y col., 1996; Kirschner y col., 1993).
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 4.- Electroferograma de los amplificados con los iniciadores RAC1/RAC8 de cepas tipo y colonias aisladas de las salsas. La muestra en cada carril es: 1 Marcador de peso molecular de 1 Kb, 2 testigo positivo M. avium, 3 Testigo negativo,
4 M. celatum, 5 M. avium, 6 M. abscessus, 7-8 Amplificado de DNA de Micobacterias aisladas de alimentos
Estandarización de la metodología de la técnica de PRA: amplificación del gen hsp65 y digestiones con enzimas de restricción
Utilizando cepas de referencia se estandarizó la técnica de Telenti y col. (1993) para identificar la especie, dicha metodología consiste en amplificar por PCR el gen de la proteína de 65 kDa (hps65) utilizando iniciadores comunes a todas las micobacterias, los cuales son: Tbll (5'- ACCAACGATGGTGTGTCCAT) y Tb12 (5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT), con el siguiente programa de amplificación: 45 ciclos de amplificación (1 min a 94°C, 1 min a 60°C, 1 min a 72°C); seguido de un ciclo final de 10 min a 72°C. , la composición de la mezcla de PCR fue de 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 10% glicerol, 200 µM de dNTP´s, 0.5 µM de cada iniciador y 1.25 U de Taq polimerasa (Boehringer Mannheim). El producto de 439 pb (figura 5) fue sometido a una digestión con las enzimas de restricción BstEII y HaeIII, las especies se identificaron con base en los patrones de restricción del producto de PCR (Figura 6), de acuerdo al algoritmo descrito por Telenti y col. (1993).
1 2 3 4 5 6 7
Figura 5. Electroferograma que muestra los productos de amplificación del gen hsp65 utilizando los iniciadores TB11 y Tb12. Carril 1 y 7 Marcador de peso molecular de 100 pb, 2, control positivo: M. tuberculosis H37Rv, 3
Control negativo, carriles 4-6 DNA de M. tuberculosis, 3 M. chelonae, 4 M. intracellulare .
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Figura 6. Electroferograma que muestra los patrones de restricción de las cepas tipo sometidas a la técnica de PRA para su estandarización. Las cepas usadas son: en el carril 1 y 8 Marcador de peso molecular, 2 M.
tuberculosis, 3 M. chelonae, 4 M. intracellulare digeridas con la enzima BstEII y en los carriles 5, 6 y 7 se encuentran en el mismo orden las mismas cepas digeridas con la enzima HaeIII.
Muestreo
Un total de 51 muestras de salsa (Figura 7) de venta callejera fueron colectadas en diferentes puntos de la Ciudad de México, se colectaron salsas de tomate, salsas de chile pasilla, salsas de chile huajillo, salsas de aguacate, salsas de jitomate, salsas de cacahuate, las cuales fueron adquiridas de puestos donde venden quesadillas, tortas, en tortillerías y en puestos ubicados en las afueras de las estaciones del metro.
Figura 6. Salsas muestreadas de distintas partes de la ciudad de México y en puntos estratégicos de confluencia poblacional micobacterias utilizando la técnica de PRA.
Micobacterias identificadas
Donde en 3/51 (6%) salsas se aislaron micobacterias, las cuales fueron identificadas por baciloscopia, se realizó la identificación del genero, con lo que se comprueba que son micobacterias, por lo cual se procedió a realizar la amplificación del gen hsp65 y su posterior digestión con las enzimas de digestión (figura 7), dándonos como resultado el aislamiento de M.
mucogenicum en las tres colonias identificadas.
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Figura 7. Electroferograma de la digestión con las enzimas de restricción del amplificado del gen hsp65 de las micobacterias aisladas en las salsas.
Se estima que en países como México del 20-30% del gasto familiar es gastado en alimentos de venta callejera, por lo cual el identificar el 6% de micobacterias en estos alimentos nos indican que son una fuente potencial de estos patógenos, por lo tanto un riesgo para la salud de la población en general y de personas inmunosuprimidas en particular. Este trabajo es el primero en México en buscar micobacterias en alimentos de venta callejera en México.
Impacto
Este trabajo demuestra que las salsas de venta callejera son vehículos de transmisión de micobacterias, y por lo tanto un riesgo para la salud de la población en general y en especial de personas inmunosuprimidas en especial. Este trabajo demuestra la importancia de plantear medidas con el fin de evitar la dispersión de estas bacterias patógenas.
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