Cadherinas atípicas FAT1 y FAT4 actúan como supresores de tumores en el desarrollo y progresión del cáncer pancreático : ¿una posible interacción con la vía transduccional Hedgehog?

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(1)Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular. CADHERINAS ATÍPICAS FAT1 Y FAT4 ACTÚAN COMO SUPRESORES DE TUMORES EN EL DESARROLLO Y PROGRESIÓN DEL CÁNCER PANCREÁTICO: ¿UNA POSIBLE INTERACCIÓN CON LA VÍA TRANSDUCCIONAL HEDGEHOG?. FELIPE ANDRÉS SANDOVAL CORTÉS. Tesis para optar al Grado Académico de Licenciado en Química y Farmacia y al Título Profesional de Químico y Farmacéutico. Directores:. Dr. Cristián Salas Sánchez Dr. Jaime Meléndez Rojel. Correctores:. Dr. Mario Faúndez Cáceres Dr. Marco Soto Arriaza. Santiago, Diciembre 2019.

(2) DEDICATORIA. Dedico esta tesis y su trabajo a mi familia, pilar fundamental, que siempre inculcó en mí la curiosidad y pasión por el conocimiento y sabiduría. A mi mamá por enseñarme su don en el lenguaje y de cierto modo la sencillez. A mi papá por enseñarme la dedicación y compromiso en lo que me enfoco. A mi hermana por compartir durante todos los años y ser la primera con quien puedo conversar. Mención especial a mis mascotas, que lo son todo para mí..

(3) AGRADECIMIENTOS. Quiero mostrar mi gratitud a las amistades que he hecho desde que ingresé a la Católica. El camino ha sido difícil para muchos, pero nos hemos mantenido juntos desde el comienzo, como una pequeña familia. -. Constanza Kemp. -. Francisca Parra. -. Ignacio Monsálvez. -. Valery Flández. -. Itsamar Jiménez. Quiero agradecer la gran ayuda en la realización de esta tesis, por el compromiso y apoyo incondicional. -. Katherina Rodríguez. -. Emilia Flores. -. Dr. Jaime Meléndez. Y por último, quiero agradecer enormemente a los siguientes programas: -. Proyecto FONDECYT Regular Nº 1161816. -. FONDEQUIP Nº 160042.

(4) LISTA DE ABREVIACIONES. . CRISPR:. Repeticiones. palindrómicas,. cortas,. regularmente interspaciadas. . IDH: Índice de Desarrollo Humano.. . Hh: Hedgehog.. . Ptch: Patched.. . Smo: Smoothened.. . PAM: Motivo adyacente de protoespaciador.. . ADN: Ácido Desoxirribonucleico.. . ARN: Ácido Ribonucleico.. . dNTP: Desoxirribonucleótido Trifosfato.. . gARN: Ácido Ribonucleico Guía.. . NHEJ: Unión de extremos no homólogos.. . KO: Knock out (deleción).. . WT: Wild type (nativo).. . PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa.. . IWB: Inmunowestern Blot.. . SFB: Suero Fetal Bovino.. . PBS: Buffer Fosfato Salino.. . TBE: Buffer de Tris/Borato/EDTA.. . SRB: Sulfo-Rodamina B.. . GFP: Proteína Fluorescente Verde.. . kDa: Kilo Dalton.. . GA3PDH: Gliceraldehído-3-Fosfato-Deshidrogenasa.. . ANOVA: Análisis de la Varianza.. . DS: Desviación Estándar.. agrupadas. y.

(5) ÍNDICE DE CONTENIDOS. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN…………………………………………………...1 1.1. Cáncer de Páncreas………………………………………………..2. 1.2. Familia de las Cadherinas………………………………………...6. 1.3. Vía Hedgehog……………………………………………………...11. 1.4. Ingeniería Genética……………………………………………….13. CAPÍTULO II: HIPÓTESIS Y OBJETIVOS……………………………………..16 2.1. Hipótesis…………………………………………………………...17. 2.2. Objetivos Generales……………………………………………...17. 2.3. Objetivos Específicos……………………………………………17. CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………18 3.1. Materiales…………………………………………………………..19 3.1.1 Línea Celular Parental……………………………………19 3.1.2 Constructos CRISPR-Cas9……………………………...19 3.1.2.1 Plasmidio FAT1 KO………………………………19 3.1.2.2 Plasmidio FAT4 KO………………………………19 3.1.3 Reactivos …………………………………………………..20 3.1.3.1 Cultivo Celular ……………………………………20 3.1.3.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa……….20 3.1.3.3 Anticuerpos……………………………………….21 3.1.3.4 Inmunowestern Blot……………………………..21 3.1.4 Disoluciones ………………………………………………22 I.

(6) 3.2. Metodología………………………………………………………..25 3.2.1 Cultivo Celular …………………………………………….25 3.2.1.1. Descongelamiento,. Expansión. y. Crio-. preservación de células MIA-PaCa-2………………….25 3.2.1.2 Conteo de células y Viabilidad celular……….26 3.2.2 Obtención de células knock out………………………..26 3.2.2.1 Transfección………………………………………26 3.2.2.2 Selección de células MIA-PaCa-2 knock out...27 3.2.2.3 Línea celular MIA-PaCa-2 FAT1 KO……………28 3.2.2.4 Línea celular MIA-PaCa-2 FAT4 KO……………28 3.2.3 Inmunowestern Blot……………………………………...29 3.2.3.1 Preparación de las muestras…………………..29 3.2.3.2 Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección …………………………………………………..29 3.2.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa………………...32 3.2.4.1 Preparación de las muestras…………………..32 3.2.4.2 Concentración y Pureza del ADN……………..33 3.2.4.3 Termociclado, Electroforesis y Detección de Bandas……………………………………………………...33 3.2.5 Microscopía………………………………………………..34 3.2.5.1 Microscopía Óptica………………………………34 3.2.5.2 Microscopía de Fluorescencia…………………35 3.2.6 Ensayo de Proliferación Celular………………………..35 3.2.7 Ensayo de Invasión Celular……………………………..36 3.2.8 Ensayo de Adhesión Celular……………………………36. II.

(7) 3.2.9 Ensayo de Migración de Wound-Healing……………..37 3.2.10 Análisis Estadístico………………………………………37. CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………38 4.1. Obtención y validación de la generación de un linaje celular knock out para FAT1 y FAT4 mediante el sistema de edición genética CRISPR-Cas9…………………………………………..40. 4.2. Linajes celulares FAT1 KO y FAT4 KO tienen un fenotipo más agresivo de carcinoma pancreático…………………………...47 4.2.1 La deleción de FAT1 y/o FAT4 se asocia con cambios en la morfología celular y no de viabilidad en células de cáncer pancreáticas…………………………………..49 4.2.2 La ausencia de FAT1 y/o FAT4 se asocia con un aumento de la proliferación celular in vitro…………..50 4.2.3 FAT1 KO y FAT4 KO promueven la migración celular en células pancreáticas MIA-PaCa-2 in vitro…………53 4.2.4 FAT1 KO y FAT4 KO promueven la invasión celular en células pancreáticas MIA-PaCa-2 in vitro…………….56 4.2.5 FAT1 KO y FAT4 KO promueven la adhesión celular en células pancreáticas MIA-PaCa-2 in vitro…………….59. 4.3. No existe relación entre la vía Hedgehog y la señalización mediada por FAT1 y/o FAT4…………………………………….63. CAPÍTULO V: CONCLUSIONES Y PROYECCIONES……………………….66 CAPÍTULO VI: REFERENCIAS………………………………………………….69 III.

(8) ÍNDICE DE TABLAS. Tabla 1:. Resumen de los riesgos no modificables asociados con el cáncer pancreático…………………………………………………………...4. Tabla 2:. Resumen de los riesgos modificables asociados con el cáncer pancreático…………………………………………………………...5. Tabla 3:. Incidencia de mutaciones y deleciones informadas en distintos tipos de cáncer humano…………………………………………….8. Tabla 4:. Anticuerpos utilizados para Inmunowestern Blot……………….21. Tabla 5:. Disoluciones utilizadas para la técnica de Inmunowestern Blot.22. Tabla 6:. Preparación de geles de electroforesis al 10 % en condiciones denaturantes………………………………………………………..23. Tabla 7:. Disoluciones utilizadas para la técnica de PCR…………………24. Tabla 8:. Disoluciones utilizadas para las muestras de PCR……………..24. Tabla 9:. Preparación de geles de electroforesis al 3 %………………….24. Tabla 10: Condiciones utilizadas en las reacciones de PCR………………25. IV.

(9) ÍNDICE DE FIGURAS. Figura 1:. Relación de FAT1 y FAT4 con la genética del cáncer……………9. Figura 2:. Esquema de disrupción genética y correctiva usando CRISPRCas9…………………………………………………………………15. Figura 3:. Genotipificación representativa de los linajes wild type y knock out mediante PCR………………………………………………….41. Figura 4:. Esquema de los plasmidios usados para la transfección y posterior deleción de FAT1 y/o FAT4…………………………….43. Figura 5:. Evaluación de la expresión de GFP en células de cáncer pancreático humano transfectadas con plasmidios para obtener KO para FAT1 y FAT4……………………………………………..46. Figura 6:. FAT1 KO y FAT4 KO no afectan la viabilidad pero induce cambios en la morfología celular de células pancreáticas in vitro…………………………………………………………………..49. Figura 7:. FAT1 KO y FAT4 KO promueven la proliferación celular en células pancreáticas MIA-PaCa-2 in vitro………………………..51. Figura 8:. FAT1 KO y FAT4 KO promueven la migración celular en MIA-PaCa-2 in vitro………………………………………………...54. Figura 9:. FAT1 KO y FAT4 KO promueven la invasión celular en MIA-PaCa-2 in vitro………………………………………………...57. Figura 10: FAT1 KO y FAT4 KO promueven la adhesión celular en MIAPaCa-2 I……………………………………………………………..60 Figura 11: FAT1 KO y FAT4 KO promueven la adhesión celular en MIAPaCa-2 II…………………………………………………………….61 V.

(10) Figura 12: Evaluación de una interacción indirecta entre las proteínas de adhesión FAT1 y/o FAT4 con la vía de señalización Hedgehog.64. VI.

(11) RESUMEN. El cáncer de páncreas es una de las patologías con mayor mortalidad, su incidencia en el mundo desarrollado ha aumentado paulatinamente y ha sido motivo de preocupación en contextos epidemiológicos. Debido a su tardío diagnóstico, la falta de sintomatología específica y un limitado tratamiento farmacológico y no farmacológico, se hace urgente el desarrollo de nuevas estrategias que garanticen un mejor abordaje del diagnóstico y comprensión de las bases moleculares y celulares de este tipo de cáncer. Recientemente la investigación ha estado centrada en la identificación de nuevas moléculas de adhesión celular que expliquen su posible papel en el desarrollo y progresión del cáncer de páncreas con el fin de optimizar el abordaje clínico y terapéutico. El estudio de la familia de las cadherinas atípicas FAT en otros tipos de cáncer humano ha demostrado una participación novedosa en la regulación del proceso canceroso y dentro de ellas se han identificado a las isoformas FAT1 y FAT4 como una de las mejores candidatas. para. explicar. el. comportamiento. atípico. entre. distintos. subclasificaciones del cáncer de páncreas y que podrían predecir la prognosis de la enfermedad. En este trabajo se evaluó la hipótesis que las proteínas FAT1 y FAT4 poseen un papel como supresores de tumores en el desarrollo del cáncer pancreático, regulando los procesos celulares de proliferación, adhesión, migración e invasión celular y si se relacionan a vías celulares morfogenéticas, entre ellas, la vía transduccional Hedgehog. Con este objetivo, se evaluó la función de estas proteínas in vitro mediante la creación de dos linajes knock out en una línea celular de cáncer pancreático utilizando el método de deleción genética CRISPR-Cas9.. VII.

(12) Los resultados demostraron que en la línea celular MIA-PaCa-2, las líneas celulares deficientes en FAT1 y/o FAT4 mostraron un perfil celular más agresivo que las células parentales. En los ensayos de proliferación, las células deficientes en FAT1 y FAT4 proliferaron sobre 1,5 veces frente al control parental en el mismo periodo de tiempo (72 h). En los ensayos de adhesión celular, la deleción respectiva del gen FAT1 o FAT4 indujo una cinética de adhesión 15 veces mayor en el intervalo de los tiempos 5 a 20 minutos y 1,4 veces a las 2 h en comparación con las células parentales. En los experimentos de wound-healing, para evaluar la capacidad de migración celular, las células knock out cerraron la herida más rápido y antes que las células control. Finalmente en los ensayos de invasión celular, las células KO para FAT1 y FAT4 presentaron una tasa 1,7 veces mayor de migración que las células control. Por último, para evaluar una posible relación entre la vía transduccional de FAT1 y/o FAT4 con la vía transduccional Hedgehog, se evaluó la abundancia relativa de las proteínas Gli1, SUFU, E-cadherina y ρ-ERK. Los resultados de los IWB no mostraron cambios en la expresión de ninguna de estas proteínas en células pancreáticas deficientes en FAT1 o FAT4, demostrando que no hay una relación entre ambas vías. Se concluye de esta forma que las cadherinas atípicas FAT1 y FAT4 actúan como supresores de tumores en el desarrollo y progresión del cáncer pancreático inhibiendo la proliferación, adhesión, migración e invasión celular. Este trabajo aporta nueva evidencia a nivel celular y molecular de los mecanismos involucrados en la génesis y desarrollo tumoral en el cáncer pancreático y que FAT1 y FAT4 pueden ser utilizados como biomarcadores para evaluar la prognosis de esta enfermedad.. VIII.

(13) ABSTRACT. Pancreatic cancer is one of the diseases with highest mortality rate, its incidence in the developed world have grown gradually and have become a cause of concern in epidemiology context. Due to its late diagnostic, lack of specific symptoms and limited pharmacological and no pharmacological treatment, it becomes urgent the developing of new strategies that guarantee a better approach of the diagnostic and understanding the molecular and cell bases of this kind of cancer. Recently the research has been focused on the identification of new cell adhesion molecules that explain the possible role in the development and progression of the pancreatic cancer with the goal of optimizing the clinical and therapeutic approach. The study of the atypical cadherin family FAT in other types of human cancer have demonstrated a novel role in the regulation of cancerous behavior and isoforms FAT1 and FAT4 have been identified as the best candidates for explaining the atypical behavior between many subclassifications of the pancreatic cancer. In this research the hypothesis was FAT1 and FAT4 proteins have a role as tumor suppressor in the development of pancreatic cancer, regulating the cell behavior of proliferation, adhesion, migration and invasion and that they are related with morphogenetic pathways, such as the Hedgehog transductional pathway. With this purpose, the function of these proteins was evaluated in vitro through the development of two knock out pancreatic cancer cell lines (FAT1 KO and FAT4 KO) using the CRISPR-Cas9 method for genetic deletion. The results showed that the FAT1 and/or FAT4 deficient cell lines exhibited a more aggressive cancer cell profile than the control cells. In the proliferation assays, the FAT1 KO and FAT4 KO cells increased the cell number more than. IX.

(14) 1.5 times than the control in the same time period (72 hr.). In adhesion assays, the deletion of the FAT1 or FAT4 genes induced a 15 fold kinetic adhesion faster than the control cells between 5 to 20 minutes and 1.4 fold faster than control at 2 hr. of adhesion. In wound-healing assays, to evaluate the migration capacity, the FAT1 and FAT4 knock out cells induced a healing process faster than the control cells. In invasion assays the knock out cells showed a rate of 1.7 times of bigger migration than the control cells. Lastly, for evaluating a possible relation between the FAT1 or FAT4 signal transduction pathway with the Hedgehog pathway the relative abundance of Gli1, SUFU, E-cadherin and ρ-ERK proteins was assessed in FATs deficient cells. The results did not show significant changes in none of the proteins mentioned above, suggesting a no relation between both pathways. It is concluded that the atypical cadherins FAT1 and FAT4 have a role as tumor suppressor in the development and progression of pancreatic cancer inhibiting cell proliferation, adhesion, migration and invasion. This research provides new molecular and cell evidence of the mechanisms involved in the development of pancreatic cancer and postulates that FAT1 and FAT4 may be used as a biomarker for evaluating the prognosis of this disease.. X.

(15) Capítulo I:. Introducción. 1.

(16) 1.1. Cáncer de Páncreas. El adenocarcinoma ductal pancreático es el séptimo cáncer más letal en el mundo. En el 2018 se estimó que hubo más de 450.000 diagnósticos y 430.000 muertes en todo el mundo por esta enfermedad [1]. Existe disparidad en la incidencia de esta patología en el mundo: la mayor incidencia se encuentra en Europa y América del Norte, y las más bajas en África y el sudeste asiático [2]. Estudios han demostrado que los países con mayor índice de desarrollo humano (IDH) tienen una mayor incidencia de cáncer de páncreas tanto en mujeres como en hombres [2]. Estas largas disparidades sugieren que los factores ambientales juegan un rol significativo en los factores de riesgo de esta enfermedad [2]. Además, actualmente existe preocupación debido al alza sostenida de la tasa de incidencia en países desarrollados, en consecuencia, se ha demostrado que desde 1973 al 2014 la tasa de incidencia en los Estados Unidos ha crecido un 1,03 % por año. Esto predice que el cáncer de páncreas pasará de la cuarta a la segunda causa más común de mortalidad relacionado a cáncer para el 2030 [3]. En nuestro país, en el año 2018 se diagnosticaron 1.635 casos nuevos de cáncer de páncreas, la mortalidad fue de 1.579 personas y este tipo de cáncer representa el 3,1 % de todas las neoplasias diagnosticadas [4]. Por último se informa que la mayoría de los casos y muertes por esta enfermedad se presentan en pacientes mayores de 50 años [3, 4]. En forma global, la tasa de supervivencia a 5 años es aproximadamente 6 %, sin embargo, ésta varía desde el 2 al 9 % según el país de origen [3]. Los factores que impactan en la sobrevida son la edad, sexo, calidad de prestación de salud, presencia de co-morbilidades y estilos de vida. No obstante, el factor principal que influye en la evolución de la enfermedad es el estadío del tumor al momento del diagnóstico [1, 2].. 2.

(17) Frecuentemente el cáncer de páncreas se diagnostica tardíamente y sólo al 20 % de los pacientes con esta patología es viable la cirugía para extraer el tumor [5]. En pacientes donde se pudo extraer el tumor la sobrevida a 5 años es de un 27 %, mientras que pacientes con tumores locales avanzados o con presencia de metástasis la mediana de sobrevida es 6 a 11 meses y 2 a 6 meses respectivamente [2, 5]. Debido a la baja incidencia y una baja tasa de supervivencia, los factores de riesgo asociados con el desarrollo de esta enfermedad han sido históricamente investigados usando estudios caso-control [5]. No obstante, con el paso del tiempo y un mayor tamaño de muestra, se ha podido identificar con mayor certeza los riesgos modificables y no modificables resumidos en la Tabla 1 y Tabla 2, respectivamente. Además, hay evidencia preliminar que algunos factores del estilo de vida pueden influir en la sobrevida, sin embargo, aún se necesita mayor investigación en esta área [5]. El cáncer pancreático corresponde a un desafío en términos de diagnóstico. Las razones para este comportamiento es multifactorial: síntomas no específicos con la patología y ubicación del órgano cercana a vasos sanguíneos importantes que son rápidamente invadidos, por lo que plantean complicaciones para su detección y tratamiento [3]. Hasta el momento la única potencial cura que existe para esta enfermedad es la extracción completa del tumor y la adición de quimioterapia [1, 3, 5]. En el primer caso el procedimiento corresponde a una pancreo-duodenoctomía dependiendo del sitio de localización del tumor o los tumores. La reserción vascular local también se mantiene dentro de las opciones para aumentar la seguridad de extirpación total del tumor aumentando así las tasas de sobrevida [5]. En el segundo caso este tipo de cáncer responde muy mal a los agentes quimioterapéuticos. Se ha reportado la aparición temprana de quimiorresistencia y una alta tasa de metástasis al momento de diagnóstico que dificulta aún más el tratamiento [3, 4].. 3.

(18) Tabla 1: Resumen de los riesgos no modificables asociados con el cáncer pancreático [5]. Factor. Dirección de la Asociación. Fuerza de Asociación. Edad. Positivo.  Incremento de riesgo al aumentar la edad..  90 % de pacientes diagnosticados son mayores de 55 años.. Variable.  Mayor incidencia en población masculina..  5,5  Incidencia en población masculina.  4,0  Incidencia en población femenina.. Variable.  Mayor incidencia en afro-americanos frente a caucásicos en EE.UU..  Afroamericanos tienen mayor incidencia de riesgos modificables que otros grupos..  Mayor incidencia en grupos sanguíneos A, B y AB..  Estudios hechos en EE.UU. han sugerido mecanismos en alteración de especificidad de glicosiltransferasa y estado inflamatorio del paciente.. Variable.  Mayor incidencia en pacientes con disrupciones en flora intestinal..  Menor presencia de Neisseria elongate y Streptococcus mitis aumentan el riesgo.  Mayor presencia de Porphyromonas gingivalis y Granulicatella adiacens aumentan el riesgo.. Positivo.  Incremento de riesgo en 9 veces en pacientes con familiares en primer grado..  Nuevos casos con historia familiar se estiman en 5-10 %..  Incremento de riesgo en 50 % frente a diabéticos tipo 1 y no diabéticos..  El cáncer pancreático se puede manifestar por sí como comienzo de DM2.  Sugerencia de HbA1C como potencial biomarcador en detección temprana.. Sexo. Etnicidad. Grupo Sanguíneo. Microbiota Intestinal. Historia Familiar. Diabetes. Variable. Positivo. Hallazgos importantes. 4.

(19) Tabla 2: Resumen de los riesgos modificables asociados con el cáncer pancreático [5] Factor. Tabaco. Alcohol. Obesidad. Dieta. Helicobacter pylori. Dirección de la Asociación. Fuerza de Asociación. Positivo.  Incremento de riesgo en 74 % en fumadores.  Incremento de riesgo en 20 % en ex-fumadores..  Incremento es dosis respuesta.  Riesgo se mantiene 10-20 años luego de cese.. Positivo.  Incremento de riesgo entre 15-43 %..  Incremento es dosis respuesta.  Asociación con pancreatitis crónica (también factor de riesgo).. Positivo.  Incremento de riesgo en 10 % por cada 5 puntos de IMC..  Asociación con diabetes tipo 2 (también factor de riesgo)..  Incremento de riesgo en 17 % por consumo de 50g/día de carne procesada vs 20g/día.  Sin asociación al consumo de carnes rojas..  Evidencia sugestiva de potencial daño a ADN y formación de compuestos carcinogénicos.  Asociación con diabetes tipo 2 (también factor de riesgo)..  Riesgo incrementado..  Aumento incidencia de comorbilidades (cáncer gástrico y esofágico).. Variable. Positivo. Hallazgos importantes. Los tratamientos usados internacionalmente y en Chile son a base de gemcitabina con o sin asociación con capecitabina [3-5]. Ambos fármacos han demostrado mejorías en la mediana de sobrevida y de calidad de vida de los pacientes [3-5]. Tratamientos paliativos como erlotinib asociados con gemcitabina o FOLFIRINOX, una combinación de oxalipatino, irinotecan, fluoro-uracilo y leucovorina han demostrado mejor perfil de sobrevivencia que gemcitabina [3, 4]. No obstante, los antecedentes de un crecimiento en la. 5.

(20) prevalencia, reporte de quimiorresistencia y estadíos tardíos de la enfermedad hacen urgente incorporar nuevas estrategias de detección temprana y tratamiento [3, 5]. El adenocarcinoma pancreático y sus variantes corresponden al 90 % de todos los carcinomas pancreáticos [1, 3]. El sitio tumorigénico se da con mayor frecuencia en la cabeza del páncreas. Al momento del diagnóstico, la mayoría de los adenocarcinomas ya se han propagado fuera del páncreas y metástasis nodulares a partir del tumor primario son comunes [3]. La Organización Mundial de la Salud. reconoce distintas variantes morfológicas del. adenocarcinoma pancreático, y varias de ellas tienen distintas cualidades histológicas [3]. Estas variantes hacen además diferir en términos de prognosis y por lo tanto una base molecular puede ser significativa en términos de mecanismos tumorigénicos. Es por esto que en los últimos años ha existido investigación exhaustiva en encontrar nuevas variantes moleculares que expliquen dichas diferencias [3, 5]. Uno de los hallazgos más novedosos corresponde a la familia de las cadherinas, las cuales corresponden a proteínas involucradas en procesos de remodelación y transformación celular. Destaca el posible papel de estas proteínas en la progresión de la metástasis a partir de un tumor primario ya que, procesos celulares como adhesión, proliferación y migración se encuentran regulados por moléculas de adhesión celular y su desregulación puede modificar el comportamiento del cáncer pancreático.. 1.2. Familia de las Cadherinas. Las cadherinas son proteínas de transmembrana dependientes de calcio que tienen actividad en la adhesión célula-célula y como mediadores en la señalización intracelular [6]. Este grupo se divide en varias subfamilias: 6.

(21) cadherinas clásicas, cadherinas desmosómicas, protocafinas, Flamingo/Celsr, Dachsous y cadherinas atípicas [6]. Cambios dinámicos en la adhesión celular son necesarios para establecer y reestablecer los contactos célula-célula en múltiples contextos, incluyendo el movimiento celular, renovación de tejido y reparación de heridas [6, 7]. En este contexto las células requieren procesos de integración y procesamiento de señales externas e internas, por lo que se ha informado en que las cadherinas sirven como base para promover o inhibir vías de señalización [6]. Otros mecanismos propuestos y estudiados corresponden a que las cadherinas participan en la regulación de la homeostasis intracelular, como lo son: la proliferación, diferenciación y apoptosis [7]. La alteración de la adhesión celular mediada por las cadherinas conduce a una arquitectura tisular desorganizada [6]. Debido a que muchos tumores sólidos son de origen epitelial, la cadherina epitelial (E-cadherina) es un blanco terapéutico atractivo en el cáncer [8]. E-cadherina es un supresor tumoral que puede estar desregulado por múltiples mecanismos que incluyen la pérdida de heterocigosidad, mutaciones hereditarias y somáticas, hipermetilación del promotor, silenciamiento transcripcional, endocitosis y proteólisis [6, 7]. Sin embargo, un alto porcentaje de neoplasias invasivas epiteliales humanos con disfunción de la adhesión celular mediada por E-cadherina no tienen alteraciones genéticas y estructurales en la proteína, y el mecanismo subyacente de la desregulación de la cadherina sigue siendo desconocido [8, 9]. Esta brecha en el conocimiento ha impulsado a la identificación de otros mecanismos moleculares de (des)regulación de las cadherinas en el cáncer. En un camino paralelo un nuevo grupo de cadherinas, las atípicas de la familia FAT, ha tomado fuerza en los últimos años por su relación con el cáncer en distintos tejidos. FAT1, FAT2, FAT3 y FAT4 son homólogos humanos de Drosophila Fat, y constituyen una familia de cadherinas atípicas que están implicadas en la supresión de tumores y la polaridad celular planar [10, 11].. 7.

(22) Las cadherinas FAT son receptores de transmembrana únicos, que se distinguen por presentar 32-34 repeticiones de cadherina extracelular alternados y similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF) [10]. FAT1 y FAT4 contienen 34 repeticiones de cadherina, mientras que FAT2 y FAT3 contienen 32 y 33 repeticiones respectivamente [11]. Por lo general, el tipo de interacción proteína-proteína en el dominio citoplasmático de las cadherinas FAT difiere de la de sus dominios funcionales [10]. En particular, FAT1 y FAT4 parecen estar más frecuentemente alterados. Ambos genes albergan mutaciones y deleciones recurrentes en múltiples tipos de cáncer humano, como se resume en la Tabla 3. Tabla 3: Incidencia de mutaciones y deleciones informadas en distintos tipos de cáncer humano [11-13]. Tipo de Cáncer. Tipo de FAT. Incidencia. Glioblastoma. FAT1. 20 %. FAT1. 9%. FAT4. 20 %. Células escamosas. FAT1. 12 %. de cabeza y cuello. FAT4. 10 %. Gástrico. FAT4. 20 %. FAT1. 7%. FAT4. 3%. FAT1. 4%. FAT4. 8%. Colorrectal. Ovárico. Pancreático. Dentro de los mecanismos específicos descritos para FAT1 se encuentran la unión a las proteínas atrofina que mediante la activación de β-catenina y Ena/VASP inducen polimerización de actina para producir la migración celular; la unión a la proteína Scribble donde se induce fosforilación e inhibición funcional de la vía YAP1 que suprime el crecimiento y proliferación celular [14]. 8.

(23) [15]. Por otro lado, FAT4 está involucrado en el mantenimiento de la polaridad celular planar mediante la señalización PCP y la inhibición de la proliferación celular mediante la interacción directa con las proteínas MPDZ al igual que FAT1 mediante la vía YAP1 [14, 15] (Figura 1).. Figura 1: Relación de FAT1 y FAT4 con la genética del cáncer. La cadherina FAT1 interacciona con Ena/VASP para inducir la polimerización de la actina; paralelamente la proteína atrofina activa a β-catenina la cual está involucrada en la promoción del movimiento celular. FAT1 interactúa con la proteína Scribble mediante la cascada Hippo/Wnt para inducir la fosforilación de YAP1, la cual está involucrada en la inhibición de la proliferación y crecimiento celular. FAT4 interactúa con MPDZ para reclutar la kinasa MPP5 y con ello fosforilar YAP1 e inhibir la proliferación y el crecimiento celular. FAT4 pertenece a la familia de las cadherinas y a través de la señalización PCP mantiene la polaridad planar celular.. 9.

(24) Para FAT1, recientemente ha surgido evidencia genómica, funcional y mecanística más completa, que revela las bases moleculares de su función supresora de tumores. Este gen es un blanco dentro de una región altamente prevalente de deleción en 4q35 observada en muchos cánceres humanos [15]. Tanto in vivo como in vitro, la disminución en la expresión de FAT1 conduce a una proliferación celular marcadamente acelerada, mientras que en otros contextos celulares suprime el crecimiento tumoral [14, 15]. Estos efectos supresores del crecimiento se anulan cuando las mutaciones observadas en los tumores están presentes [15]. Así como las cadherinas clásicas pueden unirse a β-catenina y regular su actividad transcripcional, FAT1 también se une a la β-catenina y limita su translocación al núcleo de la célula [15]. Las mutaciones en el dominio intracitoplásmico de FAT1 dan como resultado una pérdida de esta capacidad para regular la β-catenina. Por lo tanto, la pérdida de FAT1 en las células activa la vía de señalización de Wnt, desencadenando la. actividad. transcripcional dependiente. de. β-catenina. y regulando. positivamente los blancos de transcripción de Wnt favorables al crecimiento [15]. Paralelamente, FAT4 parece tener propiedades supresoras de crecimiento e invasión en varias líneas celulares cancerígenas, pero los mecanismos permanecen sin dilucidar [14, 15]. La baja expresión de FAT4 en tejidos de cáncer gástrico en comparación con los tejidos normales adyacentes se ha correlacionado con un mayor grado de metástasis y una prognosis muy baja en los pacientes [15]. La eliminación de FAT4 promueve el crecimiento y la invasión de las células del cáncer gástrico mediante la activación de la señalización Wnt/β-catenina e induce la transición mesénquimo-epitelial en las células cancerosas gástricas, un proceso clave en el inicio de la metástasis [14]. Además, en el cáncer gástrico y pulmonar hay evidencia que una baja expresión de FAT4 está regulada vía señalización Src. 10.

(25) mediante la cascada MEK/ERK, donde la depolimerización de la actina estaría involucrada en el proceso de tumorigénesis [15]. Se desconocen las funciones de FAT1 y FAT4 en la tumorigénesis y desarrollo del cáncer pancreático y no existen mayores antecedentes en la literatura. También existe información muy limitada de la posible conversación cruzada (crosstalk) que pudiera existir entre las cadherinas FAT1 y FAT4 con otras vías de señalización, como la vía de señalización morfogénica Hedgehog.. 1.3. Vía Hedgehog. La vía Hedgehog es una familia de ligandos de moléculas esenciales que se secretan para procesos de embriogénesis y homeostasis tisular en un adulto sano en casos como la mantención de células madre totipotenciales y pluripotenciales y en mecanismos de reparación de tejidos [16]. Esta vía de señalización fue originalmente identificada por su rol en el desarrollo de los embriones de Drosophila, y posteriormente varios de los componentes de la vía han sido encontrados de forma activada en varios tipos de cáncer humano por lo que varios estudios han concluido sobre su relación carcinogénica en varios de los estadíos tumorales [16]. En un adulto la vía Hedgehog se encuentra mayormente inactiva, sin embargo, publicaciones destacan la activación de esta vía en estadíos tempranos y tardíos en el cáncer de páncreas y esofágico y existe evidencia que confirma que esta vía está implicada en procesos de invasión y aumento del potencial metastásico [16, 17]. En consecuencia ha existido interés en el desarrollo de fármacos con el fin de inhibir esta señalización [16]. Tres proteínas se encuentran ligadas a la activación de esta vía: el ligando Hedgehog (Hh), y los receptores Patched (Ptch) y Smoothened (Smo) [16, 17]. Una vez activado la vía, Gli-1, un factor transcripcional clave en la vía 11.

(26) Hedgehog, promueve la transcripción de ciertos genes diana, donde destacan la activación de la transición epitelio-mesenquimal en adenocarcinomas de pulmón humano, que actúa a través de Snail y E-cadherina para promover la señalización nuclear por β-catenina y facilitar la migración y la invasión de células de cáncer de páncreas por atenuación de la expresión de E-cadherina [16]. Gli-2, a su vez, es un regulador de la β-catenina y está asociado con la pérdida de E-cadherina, la invasión celular y la regeneración epidérmica a largo plazo [16]. Por otra parte, la señalización Hedgehog regula la expresión de E-cadherina para la mantención del citoesqueleto de actina y las uniones estrechas, por lo que la inhibición de esta vía de señalización atenúa la carcinogénesis in vitro, aumentando la necrosis del carcinoma colangiocelular [16]. El correcto equilibrio entre Gli y E-cadherina, de esta manera, representa una importante herramienta con valor pronóstico como se ha postulado en el cáncer gástrico [16, 17]. También otros estudios han reportado que otras proteínas efectoras dependientes de la activación de la tirosina kinasa y su cascada de señalización como RAS, RAF, MEK y ERK aumentan la actividad de Gli mediante un aumento de la estabilidad a través de una activación de la actividad transcripcional de esta proteína con el fin de generar un microambiente tumoral favorable para el cáncer mediante una comunicación de esta vía entre las células neoplásicas y células adyacentes fisiológicas [17]. Por último, ha sido asociado que a través de la señalización MAPK/ERK existe un aumento del comportamiento agresivo del cáncer donde las tasas de invasión y metástasis se encuentran aumentadas por una regulación positiva debido a un incremento de la expresión de Hedgehog en el cáncer pancreático [18]. No existen antecedentes que demuestren la interacción específica de FAT1 y/o FAT4 como cadherinas atípicas con la vía Hedgehog en términos de activación o inhibición, sin embargo es amplia la literatura que conecta esta. 12.

(27) vía con E-cadherina, β-catenina y ρ-ERK lo que hace muy interesante el estudio de posibles interacciones entre ellas [19].. 1.4. Ingeniería Genética. El cáncer es una enfermedad caracterizada por una acumulación de múltiples alteraciones genéticas y epigenéticas en el genoma [20]. Los genes mutados del cáncer activados usualmente dominan el comportamiento canceroso y determinan el futuro de la tumorigénesis [20]. De esta idea nace la necesidad de la manipulación del genoma para recrear el inicio y progreso del cáncer. Usualmente la herramienta más usada para el estudio del cáncer son los ratones modificados genéticamente que han entregado información valiosa sobre los mecanismos y posterior tratamiento de distintos tipos de esta enfermedad, no obstante, dicho modelo tiene un alto costo monetario, técnico y de tiempo [20, 21]. Es por esto que herramientas de modificación genética como la novedosa técnica de repeticiones palindrómicas, cortas, agrupadas y regularmente interspaciadas (CRISPR) han cobrado fuerza el último tiempo para facilitar la generación de animales modificados genéticamente para el estudio in vivo y líneas celulares modificados genéticamente para el estudio in vitro [21]. La herramienta CRISPR-Cas9 es un componente del sistema inmune adaptativo presente en microorganismos como bacterias y árqueas que usan nucleasas con ARN guías para clivar elementos genéticos exógenos [20, 21]. Han sido identificados tres tipos (I, II y III) de sistemas de CRISPR donde cada tipo consiste en un núcleo de genes codificantes para una proteína Cas que hará el corte del ADN diana, ARN no codificante como guía al sitio de clivaje y un distintivo conjunto de elementos repetitivos de 2 a 6 pares de bases que se encuentran separadas por secuencias variables cortas de origen viral o. 13.

(28) plásmido invasor que le da la función de memoria inmune, conocidos como motivo adyacente de protoespaciador (PAM) [21]. Este mecanismo de defensa procarionte está diseñado para contener una secuencia guía de 20 pares de base el cual recluta al complejo Cas9/gARN y PAM. La proteína Cas9 corta ambas hebras de ADN causando un quiebre de la doble hebra, hasta el punto donde PAM se ha emparejado [21]. Posteriormente el ADN dañado es reparado por mecanismos celulares propios como el mecanismo de unión de extremos no homólogos (NHEJ) el cual está propenso a errores, resultando en una generación de inserciones o deleciones que pueden llevar a cambios de secuencia o aparición prematura de codones de término (stop), los cuales más tarde van a interrumpir la secuencia del gen original o la adición de nuevos pares de bases generando un reemplazo de un gen defectuoso o ausente (Figura 2) [21]. Los mecanismos anteriores han hecho atractivo en los últimos años el uso de esta técnica para realizar inserciones o deleciones en experimentación in vivo e in vitro. La proteína Cas9 es una endonucleasa que no posee una especificidad intrínseca a la secuencia genética de corte, por lo tanto se ha utilizado el diseño e ingeniería de pequeños gARN para cambiar los objetivos de clivaje [22]. Las ventajas de esta herramienta radican en la facilidad de generar distintos targets en el gen de interés y así generar las deleciones. CRISPR/Cas9 tiene una alta especificidad y hay evidencia que el emparejamiento es prácticamente exclusivo a la diana [22]. Además, los menores tiempos de experimentación y costos han masificado el uso de esta técnica. La composición química de CRISPR y su eficiencia en la forma de entrega hacia el target son las desventajas principales de CRISPR, área donde actualmente hay investigación para mejorar la técnica [23]. En este trabajo se utilizará la ventaja de deleción genómica que otorga CRISPR-Cas9 para realizar una disrupción en los genes codificantes para las cadherinas FAT1 y FAT4 en una línea celular de carcinoma pancreático.. 14.

(29) Figura 2: Esquema de disrupción genética y correctiva usando CRISPR/Cas9. En la zona superior se encuentran los participantes del proceso, la secuencia de ADN target, motivo adyacente de protoespaciador (PAM) y la proteína cortante Cas9. Cas9 corta ambas hebras de ADN causando un quiebre de la doble hebra 3 a 4 nucleótidos adyacentes a la secuencia de PAM, los cuales pueden ser utilizados más tarde en una disrupción del ADN causando una mutagénesis (izquierda) o un reemplazo y corrección de un gen mutado (derecha).. Con esta ventaja, se logrará evaluar el impacto de la ausencia de FAT1 y/o FAT4 en este tipo de cáncer a través de la evaluación de los procesos de proliferación, adhesión, migración e invasión celular en ensayos in vitro.. 15.

(30) Capítulo II:. Hipótesis y Objetivos. 16.

(31) 2.1. Hipótesis. Las cadherinas atípicas FAT1 y FAT4 actúan como supresores de tumores en células cancerígenas pancreáticas inhibiendo la progresión del cáncer a través de una alteración en los procesos de proliferación, adhesión, migración e invasión celular y se relacionan con la vía transduccional Hedgehog.. 2.2. Objetivos Generales. Evaluar si las cadherinas atípicas FAT1 y FAT4 actúan como supresores de tumores en células cancerígenas pancreáticas inhibiendo la progresión del cáncer a través de una alteración en los procesos de proliferación, adhesión, migración e invasión celular y si se relacionan con la vía transduccional Hedgehog.. 2.3. Objetivos Específicos. 1. Caracterizar las líneas celulares de cáncer de páncreas MIA-PaCa-2 WT, KO FAT1 y/o KO FAT4, mediante microscopía de epifluorescencia e IWB. 2. Evaluar el efecto de la deficiencia de FAT1 y/o FAT4 en la adhesión y proliferación celular en un modelo de cáncer de páncreas in vitro. 3. Evaluar el efecto de la deficiencia de FAT1 y/o FAT4 en la migración e invasión celular en un modelo de cáncer de páncreas in vitro. 4. Evaluar la interacción de FAT1 y/o FAT4 con mediadores de la vía de señalización Hedgehog mediante estudios de IWB.. 17.

(32) Capítulo III:. Materiales y Métodos. 18.

(33) 3.1. Materiales. 3.1.1 Línea Celular Parental Se utilizó la línea celular MIA-PaCa-2 que corresponde a carcinoma de páncreas humano (ATCC® CRL-1420TM, Virginia, EE.UU.). Esta línea celular proviene de tejido pancreático obtenido desde un paciente de sexo masculino, caucásico y 65 años en 1975. 3.1.2 Constructos CRISPR-Cas9 3.1.2.1 Plasmidio FAT1 KO El vector FAT1 double nickase plasmid (h): sc-410778-NIC, fue obtenido desde Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California, EE.UU.). Este plasmidio está diseñado para hacer una disrupción en la expresión genética mediante un doble corte en el gen humano de FAT1 el cual imita un quiebre de la doble hebra de ADN. FAT1 double nickase (h) consiste en un par de plasmidios, donde cada uno codifica la nucleasa Cas9 mutada D10A y un guía target-específico de 20 nucleótidos. Un plasmidio del par contiene el marcador GFP para visualizar la transfección de forma confirmatoria y el otro plasmidio contiene el gen de resistencia a puromicina para la selección. 3.1.2.2 Plasmidio FAT4 KO El vector FAT4 double nickase plasmid (h): sc-405268-NIC, fue obtenido desde Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California, EE.UU.). Este plasmidio está diseñado para hacer una disrupción en la expresión genética mediante un doble corte en el gen humano de FAT4 el cual imita un quiebre de la doble hebra de ADN. FAT4 double nickase (h) consiste en un par de plasmidios, donde cada uno codifica la nucleasa Cas9 mutada D10A y un guía target-específico de 20 nucleótidos. Un plasmidio del par contiene el marcador. 19.

(34) GFP para visualizar la transfección de forma confirmatoria y el otro plasmidio contiene el gen de resistencia a puromicina para la selección. 3.1.3 Reactivos 3.1.3.1 Cultivo Celular Línea celular MIA-PaCa-2 derivada de carcinoma de páncreas de origen humano (ATCC® CRL-1420TM). Medio de cultivo liofilizado DMEM/F-12™ (Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12, GIBCO©), Agua MilliQ,. Aminoácidos. no. esenciales. (NEEAS©. Solution),. Penicilina-. Estreptomicina, Suero Fetal Bovino inactivado (SFB) (Biowest, Nuaillé, Francia), Tripsina, Bicarbonato de Sodio, Fosfato Dibásico de Sodio, Fosfato de Potasio Monobásico, Cloruro de Sodio, Cloruro de Potasio, Dimetilsulfóxido de grado cultivo celular (AppliChem GmbH, Darmstadt, Alemania). 3.1.3.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Agua libre de nucleasas, Agua MilliQ, Tris Base, Ácido Bórico, EDTA, Agarosa calidad Biología Molecular, MaestroSafe (MAESTROGEN, República de China), Desoxirribonucleótidos, Cloruro de Magnesio, Buffer PCR 10x, Taq Polimerasa, EZ Load Precision Molecular Mass Standard (Bio-Rad, EE.UU.), Primer Forward 1-FAT1, 5´-CATCCTGTCAAGATGGGTGGTT-3´ (Integrated DNA Technologies Inc – Coralville, Iowa); Primer Reverse 1-FAT1, 5´-TCCG AGAATGTACTCTCCAGCTT-3´. (Integrated. DNA. Technologies. Inc. –. Coralville, Iowa); Primer Forward 2-FAT1, 5´-TAGGAACCAACGGGGATTTTT AC-3´ (Integrated DNA Technologies Inc – Coralville, Iowa); Primer Reverse 2-FAT1, 5´-GCAGCGAGGATTTCCATCTCA-3´ (Integrated DNA Technologies Inc – Coralville, Iowa); Primer Forward 1-FAT4, 5´-GCTCCCGTTGCACACTC TATC-3´ (Integrated DNA Technologies Inc – Coralville, Iowa); Primer Reverse 1-FAT4, 5´-GTACAGGGCTCCGGTGCTA-3´ (Integrated DNA Technologies Inc – Coralville, Iowa); Primer Forward 2-FAT4, 5´-AGACGGGACTTATC ACGGTG-3´ (Integrated DNA Technologies Inc – Coralville, Iowa); Primer 20.

(35) Reverse 2-FAT4, 5´-GGAACTTCACTACGGGGTCATT-3´ (Integrated DNA Technologies Inc – Coralville, Iowa). 3.1.3.3 Anticuerpos Tabla 4: Anticuerpos utilizados para Inmunowestern Blot Anticuerpo. Proveedor. Isotipo. Reactividad. Usos. Diana. Anti E-cadherina. Santa Cruz. Mouse IgG1, monoclonal. Ratón, Humano. IWB, ICQ, IF, ELISA. E-cadherina (132 kDa). Anti ρ-ERK. Santa Cruz. Mouse IgG2A, monoclonal. Ratón, Humano. IWB, ICQ, IF, ELISA. ρ-ERK (44 kDa) (42 kDa). Anti GFP. Santa Cruz. Mouse IgG2A, monoclonal. Ratón, Humano. IWB, ICQ, IF, ELISA. GFP (27 kDa). Anti Gli1. Cell Signaling. Rabbit IgG policlonal. Conejo, Humano. IWB, ICQ, IF, ELISA. Gli1 (160 kDa). Anti SUFU. Cell Signaling. Rabbit IgG policlonal. Conejo, Humano. IWB, ICQ, IF, ELISA. SUFU (54 kDa). Anti GA3PDH. Santa Cruz. Mouse IgG1, monoclonal. Ratón, Humano. IWB, ICQ, IFI, FC. GA3PDH (37 kDa). Bio-Rad. Goat IgG policlonal conjugado a peroxidasa de rábano. Ratón. IWB. H+L Mouse IgG1. Bio-Rad. Goat IgG policlonal conjugado a peroxidasa de rábano. IWB. H+L Rabbit HRP Conjugate IgG. Anti Mouse. Anti Rabbit. Conejo. 3.1.3.4 Inmunowestern Blot Tris base, SDS, Ultrapure™ Glicerol, Ponceau S. (Merck, Alemania), Precision Plus Protein™ All Blue ladder (Bio-Rad, EE.UU.), Desoxicolato de Sodio,. 21.

(36) IGEPAL-CA630™, TRITON X-100, Etilenglicol-bis(2aminoetileter)-N,N,N’,N’ácido. tetracético. (EGTA),. Fluoruro. de. Fenilmetilsulfonio. (PMSF),. Ortovanadato de Sodio, Fluoruro de Sodio, Tween-20™, Fosfato Dibásico de Sodio, Fosfato de Potasio Monobásico, Cloruro de Sodio, Cloruro de Potasio, Dodecilsulfato de Sodio, Azul de Bromofenol 0,1 %, 2-Mercaptoetanol, Ultrapure™ Glicina, Metanol, Leche descremada en polvo, Butanol, Persulfato de Amonio (APS), Reactivo de Bradford™ (AppliChem GmbH, Darmstadt, Alemania), Solución Acrilamida/Bis-Acrilamida (19:1) 40 % p/v (Sigma-Aldrich, EE.UU.)., Kit de Quimioluminiscencia EZ-ECL (Biological Industries, Israel).. 3.1.4 Disoluciones Tabla 5: Disoluciones utilizadas para la técnica de Inmunowestern Blot Disolución. PBS 1x. Mezcla de Inhibidores. Buffer de Lisis. NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 PBS 10x Agua destilada Trizma™- HCl DOC IGEPAL CA-630 TRITON X-100 NaCl EGTA Na3VO4 PMSF NaF Pepstatina E PBS 1x (pH 7,4). Buffer de Lisis RIPA. PBS 10x. Reactivos. PBS/ Tween-20 0,1 %. Tween-20. Cantidad o Concentración. 80 g 2,0 g 14,4 g 2,0 g 100 mL 900 mL 394 mg 125 mg. Volumen. pH final. 1L. Sin ajuste. 1L. 7,4. 50 mL. Sin ajuste. 1L. 7,4. 500 µL 500 µL 438 mg 19 mg 1 mM (10 µL c/1000 µL) 1 mM (10 µL c/1000 µL) 1 mM (10 µL c/1000 µL) 1 µg c/1000 µL 1L 1000 mL. 22.

(37) Buffer de Carga (4x). Buffer de Corrida SDSPAGE 10x Buffer de Corrida 1x Buffer de Transferencia 10x Buffer de Transferencia 1x Stripping Buffer de Bloqueo. Tris Base pH 6,8 Glicerol anhidro SDS Azul Bromofenol 2-Mercaptoetanol Agua MilliQ. 5 mL 6,4 mL 1,84 g Punta de espátula 4,0 mL 4,0 mL. Tris Base. 30,3 g. Glicina. 144 g. SDS. 10,0 g. Solución 10x. 100 mL. Agua destilada. 900 mL. Tris Base Glicina. 30,3 g 144 g. Agua MilliQ. Csp. Disolución 10x Metanol. 100 mL 200 mL. Agua destilada. 700 mL. Ácido Sulfosalicílico Ácido Tricloroacético Agua destilada PBS-Tween 0,05 % Leche Descremada. 3,0 g 3,0 g Csp Csp 3,0 % p/v. 20 mL. Sin ajuste. 1L. Sin ajuste. 1L. 8,3. 1L. Sin ajuste. 1L. 8,3. 10 mL. Sin ajuste. 250 mL. Sin ajuste. Tabla 6: Preparación de geles de electroforesis al 10 % en condiciones denaturantes Reactivo. 4 geles Separadores. 4 geles Concentradores. Acrilamida/ Bis-Acrilamida 40 % p/v. 7,0 mL. 1,9 mL. SDS 10 %. 300 µL. 300 µL. Tris [3 M] pH= 8,8. 3,75 mL. -. Tris [0.5 M] pH= 6,8. -. 5,0 mL. H2O MQ. 18,5 mL. 12,8 mL. APS 10 %. 150 µL. 120 µL. TEMED. 75 µL. 75 µL. 23.

(38) Tabla 7: Disoluciones utilizadas para la técnica de PCR Disolución. Cantidad o Concentración 108 g 55,0 g 7,5 g Csp 100 mL 900 mL. Reactivos Tris Base Ácido Bórico EDTA Agua MilliQ TBE 10 X Agua MilliQ. TBE 10x TBE 1x. Volumen. 1L. 1L. Tabla 8: Disoluciones utilizadas para las muestras de PCR. Agua. 1 muestra (µL) 34,3. 6 muestras (µL) 204. MgCl2 50 mM. 1,5. 9,0. dNTPs 2,5 mM. 4,0. 24,0. Buffer 10 X. 5,0. 30,0. Partidor F 10 µM. 1,5. 9,0. Partidor R 10 µM. 1,5. 9,0. Taq Polimerasa. 0,2. 1,2. ADN o cADN. 2,0. 12,0. Volumen Final. 50,0. 300. Reactivo. Tabla 9: Preparación de geles de electroforesis al 3 % Reactivo. Cantidad. TBE 1x. 48,5 mL. Agarosa. 1,5 g. 24.

(39) Tabla 10: Condiciones utilizadas en las reacciones de PCR. 3.2. Criterio. FAT1. FAT4. Desnaturalización del ADN. 95° C 5 minutos. 95° C 5 minutos. Alineamiento partidores. 53,3° C 30 segundos. 54,6° C 30 segundos. Extensión. 72° C 30 segundos. 72° C 30 segundos. Mantención. 4° C tiempo infinito. 4° C tiempo infinito. N° Ciclos. 35. 35. Metodología. 3.2.1 Cultivo Celular 3.2.1.1 Descongelamiento, Expansión y Crio-preservación de células MIA-PaCa-2 El descongelamiento de un criotubo de la línea celular de carcinoma pancreático MIA-PaCa-2 se realizó rápidamente a 37 °C en un baño termorregulado. Inmediatamente el contenido del vial fue transferido a un tubo cónico conteniendo medio de cultivo DMEM/F-12 suplementado al 1 % con Penicilina/Estreptomicina, al 1 % con aminoácidos no esenciales y 10 % de SFB para diluir el DMSO. Luego de homogenizar, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 380 xg a temperatura ambiente para obtener un pellet de células. Las células fueron resuspendidas en medio de cultivo DMEM/F–12 completo y sembradas en placas de cultivo, las que se mantuvieron en una incubadora a 37 °C, 95 % O2 y 5 % CO2. Una vez alcanzada confluencia, éstas se expandieron a un mayor número de placas de cultivo hasta obtener una cantidad suficiente de células para el desarrollo de los experimentos propuestos. 25.

(40) Para asegurar la preservación de la línea celular en estudio, una fracción de las células nativas expandidas fue congelada y mantenida en un freezer a –80 °C y suspendidas en medio crio-protector (SFB al 5 % v/v de DMSO). En cada réplica experimental se utilizaron células con igual número de pasajes. 3.2.1.2 Conteo de células y Viabilidad celular Para estimar la viabilidad y concentración celular, una muestra de 10 µL de células descongeladas fueron resuspendidas en medio de cultivo y se cargaron en una cámara de Neubauer. Para determinar la viabilidad celular de los cultivos, una alícuota de igual volumen se mezcló en una razón 1:1 con Azul de Tripán y se incubó por un minuto antes del conteo celular. Con ayuda de un contador manual y un microscopio óptico se contaron las células presentes en cuatro regiones de la cámara Neubauer. Posterior al conteo de las células se obtuvo un promedio y se multiplicó por el factor de dilución hasta obtener el valor de la población celular en el vial. Esto fue hecho tanto para las células vivas como para las células muertas. Con ambas estimaciones, se obtuvo la viabilidad de la línea celular mediante la división del número de células vivas sobre el total de células, multiplicando por 100 para obtener el porcentaje de viabilidad real. En todos los experimentos se utilizó una viabilidad celular mayor o igual a 95 %. 3.2.2 Obtención de células knock out 3.2.2.1 Transfección En placas de 6 pocillos se sembraron 50.000 células parentales hasta lograr una confluencia entre 60 – 80 %. Alcanzada la confluencia, se reemplazó el medio de crecimiento por uno en ausencia de antibióticos y se determinó experimentalmente la razón óptima de ADN plasmidial para la transfección celular (1 – 3 μg/100 μL medio ADN plasmidial). Posterior a la concentración óptima elegida se agregó el buffer EC (Santa Cruz Biotechnology Inc – Santa. 26.

(41) Cruz, California, EE.UU.) y luego el enhancer (3,2 μL/1 μg ADN) (Santa Cruz Biotechnology Inc – Santa Cruz, California, EE.UU.). Se vortexeó por 1 segundo y se incubó entre 2 a 5 minutos a temperatura ambiente. Una vez transcurrido ese tiempo, se agregó el agente de transfección Effectine (10 μg/1 μg ADN) (Santa Cruz Biotechnology Inc – Santa Cruz, California, EE.UU.), se vortexeó por 10 segundos e incubó 5 – 10 minutos a temperatura ambiente. Por último se completó a un volumen final de 2,5 mL por cada pocillo y se pipeteó suavemente para mezclar los componentes. Finalmente la mezcla de transfección se agregó gota a gota sobre las células a transfectar y se incubó a 37 °C y 5 % CO2 por un mínimo de 24 h La presencia inicial y sin selección de células positivas para GFP se evaluó mediante un lector multimodal Cytation™ 5 (BioTek Instruments, EE.UU.). 3.2.2.2 Selección de células MIA-PaCa-2 knock out La selección de células transfectadas se realizó utilizando el antibiótico Puromicina (Sigma-Aldrich, EE.UU.). Se determinó la mínima concentración que fuera letal para el 100 % de las células no transfectadas (1 – 10 μg Puromicina/2,5 mL medio). En este caso se utilizó una concentración de 1 μg Puromicina/2,5 mL medio. Se mantuvo a las células con puromicina entre 3 – 5 días. Se reemplazó el medio fresco selectivo una vez cada dos días durante el proceso de selección con el antibiótico para remover las células sensibles al antibiótico de selección. Finalizada la selección se cambió a medio estándar para permitir el crecimiento de las células resistentes a puromicina. Las células transfectadas fueron observadas posteriormente para evidenciar señal para GFP en modalidad microscopía de fluorescencia a una confluencia 50-70 % en un lector multimodal Cytation™ 5 (BioTek Instruments, EE.UU.). Las células seleccionadas fueron expandidas y utilizadas en los experimentos de este estudio.. 27.

(42) 3.2.2.3 Línea Celular MIA-PaCa-2 FAT1 KO La línea parental MIA-PaCa-2 fue transfectada con FAT1 double nickase plasmid (humano): sc-410778-NIC (Santa Cruz Biotechnology Inc - Santa Cruz, California, EE.UU.) y seleccionada con Puromicina de acuerdo al protocolo proporcionado por el proveedor y descrito anteriormente en la selección para crear una línea celular pancreática knock out para el gen FAT1. Las células transfectadas fueron evaluadas para GFP mediante microscopía de fluorescencia en un lector multimodal Cytation™ 5 (BioTek Instruments, EE.UU.) y validadas mediante PCR y IWB para luego ser expandidas a una cantidad suficiente para llevar a cabo todos los experimentos. La línea celular fue mantenida en medio DMEM/F12 conteniendo 10 % de Suero Fetal Bovino, 1 % de aminoácidos no esenciales, y 1 % de Penicilina/Estreptomicina. 3.2.2.4 Línea Celular MIA-PaCa-2 FAT4 KO La línea parental MIA-PaCa-2 fue transfectada con FAT4 double nickase (humano): sc-405268-NIC (Santa Cruz Biotechnology Inc - Santa Cruz, California, EE.UU.) y seleccionada con Puromicina de acuerdo al protocolo proporcionado por el proveedor y descrito anteriormente en la selección para crear una línea celular pancreática knock out para el gen FAT4. Las células transfectadas fueron evaluadas para GFP mediante microscopía de fluorescencia en un lector multimodal Cytation™ 5 (BioTek Instruments, EE.UU.) y validadas mediante PCR y IWB para luego ser expandidas a una cantidad suficiente para llevar a cabo todos los experimentos. La línea celular fue mantenida en medio DMEM/F12-F12 conteniendo 10 % de Suero Fetal Bovino, 1 % de aminoácidos no esenciales, y 1 % de Penicilina/Estreptomicina.. 28.

(43) 3.2.3 Inmunowestern Blot (IWT) 3.2.3.1 Preparación de las muestras Las células fueron incubadas hasta lograr un 95 – 100 % de confluencia para posteriormente ser lavadas dos veces con PBS 1x (Buffer de Fosfato Salino) pH 7,4 e incubadas con 5 mL de Tripsina-EDTA 1x en PBS temperado a 37° C por 10 minutos. Las células desprendidas del plástico por la acción enzimática de la tripsina fueron colectadas y centrifugadas a 380 xg por 5 minutos hasta obtener el pellet de células. Para determinar la expresión de proteínas asociadas a la vía de señalización Hedgehog, las células control y transfectadas fueron lisadas utilizando el buffer de lisis descrito en la Tabla 5. La mezcla resultante se homogenizó y centrifugó a 13.000 xg a 4° C por 10 minutos. La fracción total de proteínas obtenida se transfirió a un tubo Eppendorf y se mantuvo en hielo. La concentración de proteínas totales se determinó mediante el método de Bradford (Bio-Rad, California, EE.UU.). Para ello se utilizó un estándar comercial de albúmina de suero bovino (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE.UU.). En dicho ensayo las curvas de calibrado utilizadas siempre superaron un coeficiente de correlación (R2) mayor o igual a 0,950. Para caracterizar las proteínas GFP, E-cadherina, Gli1, SUFU y ρ-ERK, las muestras de proteínas de cada línea celular se mezclaron con un tercio de buffer de carga para electroforesis de concentración 4x (Tabla 5) y se hirvieron durante 10 minutos para luego ser almacenadas a -20° C o ser resueltas electroforéticamente en el momento.. 3.2.3.2 Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección Se prepararon geles de Acrilamida/Bis-Acrilamida al 10 % según la Tabla 6 en los cuales se cargaron 80 µg de proteína total para cada condición experimental. Se utilizó un sistema electroforético vertical Mini-Protean (Bio29.

(44) Rad, California, EE.UU.). Las proteínas fueron concentradas a 70 V por aproximadamente 30 minutos y luego resueltas a 120 V durante 2 h. Finalizada la separación de las proteínas, éstas fueron transferidas a una membrana de Nitrocelulosa Whatman Protran® BA83, con un tamaño de poro de 0,2 µm (GE Healthcare, EE.UU.). Para ello se utilizó un voltaje de 80 V durante 2 h. Finalmente, las membranas fueron bloqueadas con leche descremada al 3 % p/v en PBS-T (Tween-20 en PBS al 0.1 %) durante toda una noche. La detección de E-cadherina se realizó indirectamente utilizando un anticuerpo monoclonal. Anti-E-cadherin. antibody. (G-10):. sc-8426. (Santa. Cruz. Biotechnology – Dallas, Texas) en una dilución 1:500 y utilizando un anticuerpo secundario anti-mouse conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (1:2.500). Para ambos anticuerpos se utilizó el mismo buffer de bloqueo y para la normalización de la carga, las membranas fueron tratadas con una solución de stripping preparada de acuerdo con la Tabla 5. Luego la membrana fue nuevamente bloqueada e incubada esta vez con un anticuerpo primario de origen de ratón, GA3PDH a una dilución 1:2.500, y posteriormente con un anticuerpo anti-mouse conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (1:3.000). La detección de ρ-ERK se realizó indirectamente utilizando un anticuerpo monoclonal Anti-ρ-ERK antibody (E-4): sc-7383 (Santa Cruz Biotechnology Inc - Santa Cruz, California, EE.UU.) en una dilución 1:500 y utilizando un anticuerpo secundario anti-mouse conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (1:2.500). Para ambos anticuerpos se utilizó el mismo buffer de bloqueo y para la normalización de la carga, las membranas fueron tratadas con una solución de stripping preparada de acuerdo con la Tabla 5. Posteriormente la membrana fue bloqueada e incubada con el anticuerpo primario de origen de ratón, GA3PDH a una dilución 1:2.500, y luego con el. 30.

(45) anticuerpo anti-mouse conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (1:3.000). La detección de GFP se realizó indirectamente utilizando un anticuerpo monoclonal Anti-GFP antibody (B-2): sc-9996 (Santa Cruz Biotechnology – Dallas, Texas, EE.UU.) en una dilución 1:500 y utilizando un anticuerpo secundario anti-mouse conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (1:2.500). Para ambos anticuerpos se utilizó el mismo buffer de bloqueo y para la normalización de la carga, las membranas fueron tratadas con una solución de stripping preparada de acuerdo con la Tabla 5. Posteriormente la membrana fue bloqueada e incubada con el anticuerpo primario de origen de ratón, GA3PDH a una dilución 1:2.500, y luego con el anticuerpo anti-mouse conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (1:3.000). La detección de Gli1 y SUFU se realizó indirectamente utilizando un Hedgehog Signaling Antibody Sample kit (8358) (Cell Signaling, Danvers, Massachusetts, EE.UU.) en una dilución 1:500 para cada anticuerpo y utilizando un anticuerpo secundario anti-rabbit conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (1:2.500). Para ambos anticuerpos se utilizó el mismo buffer de bloqueo y para la normalización de la carga, las membranas fueron tratadas con una solución de stripping preparada de acuerdo con la Tabla 5. Posteriormente la membrana fue bloqueada e incubada con el anticuerpo primario de origen de ratón, GA3PDH a una dilución 1:2.500, y luego con el anticuerpo anti-mouse conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (1:3.000). El revelado se realizó mediante del uso del kit SuperSignal West Pico Chemioluminiscent Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante, y digitalizado con un ChemiDoc Uvitec (Uvitec Ltd, California, EE.UU.). Los tiempos de exposición fueron ajustados en cada lectura hasta el punto anterior a la saturación de las bandas.. 31.