ESTIMACIÓN DE LA MADUREZ FENÓLICA DE LAS UVAS TINTAS CON EL MÉTODO ITV ESTÁNDAR

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ESTÁNDAR

CAYLA Laure – ITV France – Centre de Recherche et d’expérimentation sur les vins rosés – 70 av du Président Wilson – 83550 Vidauban

RENARD Romain – ITV France – Station Régionale Midi-Pyrénées – V’innopôle – BP 22 – 81310 Lisle sur Tarn

La determinación de la fecha óptima de cosecha, es decir el momento en el que la uva presenta el potencial enológico más elevado, sigue siendo después de todo una de las principales preocupaciones del moderno viticultor, ya que una parte no indiferente de la calidad de un vino está determinada por la calidad de la materia prima. Para ayudar al productor en la elección del momento más adecuado, se han desarrolladas herramientas de determinación de la calidad de las uvas basadas en el seguimiento de un marcador cualitativo a lo largo del periodo de maduración.

Los criterios analíticos clásicos, como son el contenido de azúcares, la acidez total, el pH han prevalecido como indicadores privilegiados del estado de madurez de la cosecha, a causa de la sencillez de su análisis. Sin embargo en numerosas situaciones no representan un reflejo exacto de la realidad, especialmente en aquellas situaciones en donde una variedad es cultivada en unas condiciones que no le permiten expresarse completamente. Se observa entonces un fuerte desfase entre la información ofrecida por los indicadores y la realidad cualitativa de la uva (materia colorante, taninos, aromas). En el caso particular de las variedades tintas, la observación de la evolución de los compuestos fenólicos a lo largo de la maduración se impone como una técnica complementaria interesante, por no decir necesaria.

El ITV France, a través de una red de cinco unidades ITV regionales localizadas en las principales zonas vitícolas francesas ha trabajado durante varios años en la puesta a punto y en la validación de un método estandarizado de evaluación de la riqueza polifenólica de las variedades tintas francesas que respondiese a unos imperativos ineludibles de fiabilidad, simplicidad y rapidez de aplicación (tratamiento de un elevado número de muestras), de seguridad y de coste. Actualmente proponemos al sector un método validado que permite delimitar de forma totalmente satisfactoria el óptimo de madurez de las variedades estudiadas y vendimiar respetando las realidades de la añada y del terroir.

1 – Los antocianos y la madurez fenólica: algunos conceptos

Los antocianos y los taninos son los principales representantes de los compuestos fenólicos presentes en las uvas y en los vinos tintos. Participan de forma importante en sus características organolépticas. Los antocianos pertenecen a la familia de los flavonoides, caracterizados por un esqueleto carbonado de tipo 2-fenilbenzopirona (1,2); los antocianos presentes en las uvas tintas de Vitis vinifera son monoglucosidos de núcleo flavilio que se diferencian en función del grado de hidroxilación/metoxilación del núcleo lateral y de la naturaleza del ácido que esterifica la glucosa (ácido acético, cumárico o cafeico). Se cuentan actualmente 17 formas de antocianos, de los cuales 5 glucosilados, 5 acetilados, 5 cumarilados y 2 esterificados por el ácido cafeico (3). Las formas agliconas de los antocianos se denominan antocianidinas. El color de estas moléculas depende de su estructura química, de las condiciones del medio (pH) y de sus interacciones con otros componentes (4,5,6). Estas particulares características cromáticas han sido utilizadas para el desarrollo de los principales métodos de detección de los antocianos totales. Así, el método Stonestreet utiliza la capacidad del anhídrido sulfurosos para combinarse con los antocianos dando un producto incoloro, y el método Puissant-Léon aplica el principio según el cual a pH muy ácido, la mayor parte de los antocianos se encuentran presentes en forma de catión flavilio, de color rojo (7).

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Los antocianos se encuentran localizados en las vacuolas de las células del hollejo en la primera capa celular del hipodermo (8). A nivel de uvas, aparecen al inicio de la fase de envero y sufren una evolución a lo largo de la maduración constituida por tres etapas: una fase de acumulación rápida, una fase de estancamiento en la que la concentración pasa por un máximo, y por último una fase decreciente. Este modelo teórico presenta algunas excepciones, especialmente en el caso de una mala adaptación de la viña a su ambiente (9). La distribución y la calidad de los diferentes antocianos en Vitis vinifera varían en función de las variedades, de las condiciones pedoclimáticas y de los modos de cultivo. De aquí se desprende que el 3-glucosido de malvidol es el principal antociano y que la cepa Pinot Noir no contiene ningún antociano acilado (10 y 11). Las cantidades totales en la madurez oscilan entre 500 y 3000 mg/kg (12).

El seguimiento de la dinámica de acumulación de los antocianos y de los polifenoles totales durante la fase de maduración de las uvas, ha demostrado ser una herramienta interesante para la determinación de la madurez de las uvas tintas. Se puede observar así que un nivel de madurez satisfactorio se alcanza cuando se registra una caída significativa del contenido de antocianos. En este estadio, los pigmentos se encuentran en menor concentración, pero la degradación de las paredes de las células de los hollejos favorece su difusión en la fase líquida. Además, en las pepitas se registra una caída importante de la cantidad de taninos extraíbles de marcado carácter astringente (13).

Actualmente existen numerosos métodos para la determinación cualitativa o cuantitativa del potencial fenólico de las uvas tintas (13, 14, 15, 16, 17, 18, 19). Estos se diferencian entre ellos por los objetivos que persiguen – seguimiento del potencial fenólico total o parcial a lo largo de la maduración, ayuda a la determinación de la madurez óptima, estima del potencial fenólico extraíble y de la contribución de las pepitas a este potencial, ayuda a la gestión de las vinificaciones… - pero también por las técnicas empleadas durante el tratamiento de las uvas. Los principales puntos de divergencia de estos métodos son los siguientes:

 El muestreo de las uvas en la parcela : racimos enteros, fracciones de racimos, uvas sueltas  El tratamiento de la muestra : molienda, centrifugación, muestra tratada en fresco o después de

liofilización

 La extracción de los compuestos fenólicos: sin otro tratamiento que la molienda o centrifugación o maceración en condiciones diferentes (duración, temperatura, naturaleza de la solución de extracción, agitación,…)

 Los métodos de determinación de las diferentes fracciones fenólicas

Estas divergencias en la elección de los principios y de los materiales aplicados tienen un efecto fundamental sobre la sencillez y rapidez de ejecución del método, sobre su coste y sobre todo sobre la información que de él deriva.

2 – OPTIMIZACIÓN Y FIABILIDAD DE LA METÓDICA ITV ESTÁNDAR

Las principales etapas del método ITV estándar – muestreo, conservación y tratamiento de las uvas, condiciones de maceración, método de determinación de los antocianos – han sido objeto de un importante trabajo de optimización y de validación por parte de las cinco unidades ITV regionales, que ha incluido diversas variedades regionales.

2.1 – Elección de un método de muestreo de las uvas

El muestreo de las uvas en la parcela no puede ser considerado al margen del método ITV ; es un punto crucial en el que merece detenerse un poco.

Existen varias maneras de recoger una muestra de uvas representativa de una parcela determinada: racimos enteros, porciones de racimos y uvas sueltas.

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El primer método es relativamente destructivo si se desea obtener una muestra representativa durante el seguimiento de la maduración. Por ello, en 1995 y 1996, se compararon sólo los métodos de muestreo de fracciones de racimos y de uvas.

La comparación consideró los siguientes parámetros: peso de 200 uvas, contenidos de azúcares (o GAVP, Grado alcohólico volumétrico potencial), acidez total, pH, concentración de antocianos e índice de polifenoles totales. Los resultados están presentados en las tablas 1 y 2.

Parámetros analizados

Coeficiente de determinación (r²) entre los métodos « Porciones de racimos » y « Uvas

sueltas »

Peso 200 uvas (g) 0.94

Grado Alcohólico Volumétrico Potencial (GAVP)

0.92

Acidez Total 0.88

Antocianos 0.76

Compuestos fenólicos totales (CPT) 0.72

Tabla 1 : correlación entre dos modos de muestreo de las uvas en la parcela para 5 parámetros analíticos 1995/1996

Repetibilidad de los métodos de muestreo (10 muestreos) « Porciones de racimos » « Uvas sueltas » Parámetros analizados Media Desviación estándar CV (%) Media Desviación estándar CV (%) Peso 200 uvas (g) 296.3 4.80 1.60 201.5 7.5 3.7 Azúcares reductores (g/L) 193.3 0.88 0.45 218.8 2.32 1.1 Acidez Total (g/L) 4.9 0.78 1.59 5.4 0.023 0.4 Antocianos (g/kg) 1.6 0.038 2.33 1.8 0.051 2.8 Compuestos Fenólicos Totales (CPT) 5.3 0.16 3.00 9.2 0.24 2.6

Tabla 2 : medida de la repetibilidad de dos métodos de muestreo para 5 parámetros analíticos - 1996 Los resultados obtenidos para los 5 parámetros analíticos determinados presentan una buena correlación entre los dos métodos de muestreo (tabla 1). Las correlaciones son particularmente altas para los criterios analíticos clásicos (GAV, AT) y para el peso de las uvas ; se mantienen satisfactorias en el caso de los contenidos de antocianos y de compuestos fenólicos totales.

La repetibilidad de los modos de muestreo fue estudiada en 10 lotes de uva muestreados consecutivamente por la misma persona. Las diferencias observadas entre las muestras para los 5 parámetros analíticos son bajas, los coeficientes de variación (CV) no superan el 4 %.

Estos resultados han sido confirmados ampliamente por los registrados en Midi-Pirineos por la Estación Regional ITV con el método « uvas sueltas» (CVpeso uvas = 3.2 % ; CVantocianos = 4 % ; CVCPT =

4.1 %).

Estas observaciones muestran que los dos modos de muestreo estudiados ofrecen unas informaciones de contenidos y de fiabilidad comparables (fuerte correlación y CV bajo). Al final, hemos adoptado para el método ITV estándar el muestreo de « uvas sueltas » ya que permite una aplicación simple y rápida.

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Hemos intentado del mismo modo determinar la reproducibilidad del modo de muestreo de uvas sueltas. Cuando el muestreo es realizado respetando unas normas (§ 3.1) con un mínimo de minuciosidad los coeficientes de variación para los principales parámetros (peso de las uvas, GAVP, AT, antocianos, CPT) son inferiores a 5%.

Por el contrario, un muestreo realizado por una persona que no conoce las normas, o que muestra poca voluntad de seguirlas, conduce a un resultado muy poco reproducible; en estos casos hemos podido observar coeficientes de variación superiores a 15%.

En conclusión, para obtener resultados fiables, es recomendable que todas las personas que se ocuparán del muestreo se sometan al inicio de la campaña a un test de repetibilidad, y en cualquier caso, es indispensable que una parcela sea muestreada por una sola y única persona a lo largo de la campaña.

2.2 – El problema de la conservación de las muestras

El tratamiento de las muestras al cabo de poco tiempo después de su llegada al laboratorio, es vivamente aconsejable para obtener un buen nivel de fiabilidad del método.

Conscientes de la dificultad de respetar esta regla, se estudió la influencia sobre la calidad de los resultados analíticos de una conservación prolongada de las muestras – en forma de uvas o de filtrado después de la maceración de las uvas (ver § 3.3) – a temperatura controlada (refrigeración, congelación) para proponer un tratamiento diferente sin perder información.

2.2.1 – Conservación 24 horas a 4°C como uvas enteras

Diez lotes de doscientas uvas fueron muestreados consecutivamente por la misma persona. Cinco lotes fueron sometidos inmediatamente a tratamiento y cinco lotes fueron tratados después de veinticuatro horas de conservación en nevera a 4°C en el envase usado para el muestreo. La composición de las uvas y su peso sufren modificaciones importantes después de una conservación prolongada. En nuestras condiciones, se registró una pérdida de peso de un 12 %, una disminución de las concentraciones de antocianos de un 25 %. Los compuestos fenólicos totales muestran un comportamiento estable. Hay que señalar que estas modificaciones son relativamente reproducibles, los coeficientes de variación registrados en las 24 h de intervalo fueron prácticamente idénticos (tabla 3).

2.2.2 – Uvas congeladas

Cuarenta y tres lotes de 400 uvas provenientes de diversas parcelas fueron divididos cada uno de ellos en dos muestras representativas de 200 uvas, el primero fue tratado nada más llegar al laboratorio, el segundo después de un periodo de congelación.

La figura 1 muestra una relación poco estrecha entre los resultados observados en las uvas frescas y su duplicado congelado para los parámetros antocianos y compuestos fenólicos totales. El comportamiento de las muestras no es estable; en algunos lotes se observó una pérdida en el contenido de antocianos a veces considerable, mientras que en otros lotes se observó la evolución contraria.

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Figura 1- Relación entre los resultados analíticos (antocianos y compuestos fenólicos totales) registrados con las uvas frescas y con las uvas congeladas, 1994 /1995.

2.2.3 – Conservación del filtrado después de molienda, maceración y filtración durante 24 horas a 4°C.

El método I.T.V. estándar prevé una etapa de maceración de las uvas después de la molienda en una solución hidroalcohólica (ver § 3.3.). La masa de uva molida macerada es filtrada a continuación a través de algodón de vidrio, recuperando una fase líquida límpida que vienen utilizada para el análisis. Se estudió la evolución de las características analíticas de esta fase líquida (o filtrado) cuando se somete a una conservación de 24 h a 4°C.

Los resultados obtenidos mediante la determinación de los antocianos y de los compuestos polifenólicos totales antes y después de la conservación muestran una correlación lineal perfecta (figura 2). Las pendientes de las rectas de regresión son próximas a la unidad, lo que significa que el filtrado presenta sólo una ligera modificación de su composición cuantitativa de antocianos y de compuestos fenólicos totales.

Figura 2- Relación entre los resultados analíticos (antocianos y compuestos fenólicos totales) registrados en el filtrado fresco y en el filtrado después de 24h de conservación a 4°C, 1999

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2.2.4 – Conclusión sobre la conservación de las muestras

Las condiciones de conservación de las muestras son, según hemos podido comprobar, muy importantes. Una conservación poco adecuada puede perjudicar de forma considerable la veracidad de los resultados analíticos. Por ello, la técnica basada en la congelación de las uvas antes del tratamiento debe ser evitada, los resultados obtenidos con uvas congeladas fueron muy poco reproducibles. La conservación de las uvas o del filtrado durante 24 h en nevera puede ser tenida en cuenta, sabiendo de todas formas que se registra una pérdida cuantitativa, pero reproducible, de antocianos en las uvas mientras que el comportamiento del filtrado es muy estable en este intervalo de tiempo pero requiere una preparación previa de las muestras. En cualquier caso, la elección del modo de conservación de las muestras antes del análisis deberá ser efectuada al inicio de la campaña y aplicada de manera constante hasta el último control de madurez.

2.3 – Determinación de los tiempos de maceración 2.3.1- ¿Maceración larga o corta?

Para determinar el tiempo mínimo necesario para la total difusión de los antocianos en nuestras condiciones de trabajo, realizamos medidas cinéticas de extracción de los antocianos a lo largo de una maceración de dos horas. Como se puede observar en la figura 3, los contenidos de antocianos después de una hora de maceración no siguen prácticamente evolucionando; el 95 % de los antocianos difundibles en este estadio se encuentran ya presentes en la fase líquida. Un suplemento de maceración de una hora no está justificado. Las medidas de repetibilidad de la fase de maceración nos permitieron registrar unos coeficientes de variación que no superaban el 5 % para la determinación de los antocianos y de los polifenoles totales. Esta técnica caracterizada por un importante rendimiento de extracción permite una estima fiable del contenido de antocianos de las uvas y esto para cualquiera que sea su potencial.

Figura 3- Evolución de los contenidos de antocianos a lo largo de la maceración de la uva molida en una solución hidroalcohólica. Resultados obtenidos con seis variedades de Midi Pirineos, 1999

2.3.2 - ¿Podemos evitar la maceración?

La determinación de los antocianos y de los compuestos fenólicos totales se realizó inmediatamente después de la molienda. En este estadio, la concentración de antocianos en la fase líquida representó, según la variedad, entre un 46 y un 64 % de la concentración observada después de dos horas de maceración. La repetibilidad es muy buena ya que se encuentra por debajo del 5 %. Si se quiere ahorrar tiempo durante la aplicación del método, se puede considerar este tipo de extracción. Sin

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de uva con un fuerte potencial en antocianos.

2.4 – Métodos de determinación de los antocianos: ¿decoloración con SO2 o Puissant-Léon ? La optimización de este método pasa por la utilización de una técnica de determinación de los antocianos precisa, adecuada y rápida. Desde esta óptica, comparamos los dos métodos principales de determinación de los antocianos totales por espectrofotometría visible – el método Stonestreet (decoloración con anhídrido sulfuroso) y el método Puissant-Léon (acidificación del medio) (20) – en relación al contenido y a la fiabilidad de la información que deriva de ellos.

2.4.1- Correlación entre los dos métodos de determinación

Las observaciones plurianuales realizadas en la red I.T.V. France muestran una fuerte relación entre los dos métodos (R2 > 0,95) en relación a la determinación de los antocianos (figura 4). Los resultados obtenidos son comparables pero no idénticos en valor absoluto. El método Puissant-Léon subestima en alrededor de un 20 % los contenidos de antocianos. Esta constatación encuentra su explicación no en el principio mismo del análisis, sino en el valor de los coeficientes de conversión de los valores de absorbancia a 520 nm en contenidos de antocianos expresados en mg/L característicos de cada uno de los métodos. (Notar: Cuando el análisis es realizado según el método Stonestreet, es necesario sustituir en la fórmula de cálculo el coeficiente 870 por 701 para obtener unos valores comparables con los obtenidos con el método Puissant-Léon; Por el contrario, para expresar los resultados obtenidos con el método Puissant-Léon según la escala de valores del método Stonestreet se sustituirá el coeficiente 22,76 por 28,25).

Figura 4- Ejemplo de relación entre los contenidos de antocianos determinados por los métodos Stonestreet y Puissant-Léon, 1999

2.4.2 – Repetibilidad de los métodos de determinación

Se estudió la fiabilidad de cada uno de los métodos de determinación de los antocianos a lo largo de dos campañas consecutivas. A partir de una solución de extracción, se realizaron diez

determinaciones consecutivas. El tratamiento de los datos nos ha permitido estimar la precisión (intervalo de confianza) para una probabilidad del 95 % y la variabilidad (coeficiente de variación) de

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los dos métodos. En la tabla 4 se muestran los resultados de las determinaciones efectuadas utilizando dos soluciones de extracción diferentes en 2000.

Media (antocianos en mg/L) Desviación estándar Intervalo de confianza (en %) C.V. (en %) Serie n°1 10 repeticiones Puissant-Léon Stonestreet 321.9 438 2.98 9.4 2.2 4.9 1 2.3 Serie n°2 10 repeticiones Puissant-Léon Stonestreet 318 439 1.95 10.6 1.4 5.5 0.6 2.5

Tabla 4 – repetibilidad de los métodos de determinación de los antocianos - 1999

Los dos métodos presentan un buen nivel de fiabilidad con un coeficiente de variación que no supera el 3 %. El método Puissant-Léon demuestra ser sin embargo más preciso con un intervalo de confianza más estrecho comprendido entre ± 2 % y ± 5 %. Con una veracidad y fiabilidad equivalentes, el método Puissant-Léon se impone a causa de su más rápida y simple aplicación.

2.5 – Automatización de la determinación de los antocianos y de los compuestos fenólicos totales

En el marco de la utilización rutinaria del protocolo de estimación de la riqueza polifenólica, la gestión de los análisis manuales se vuelve delicada. Por ello hemos adaptado y optimizado este método a la utilización de un preparador de muestras Gilson. El robot Gilson realiza la preparación de las muestras (dilución a 1/100 y preparación de los tubos para la determinación de los antocianos), y asegura la distribución en la cubeta del espectrofotómetro. Una conexión en serie RS 232 entre el espectrofotómetro y un programa adaptado a un microordenador permite la adquisición en continuo de los datos. Una vez transferidos a una hoja de cálculo, los resultados pueden ser fácilmente leídos. Este método automatizado permite un ahorro importante de tiempo (60 muestras tratadas en 6 h), y mejora la fiabilidad de los análisis. De todas formas es necesario el control de un técnico para asegurar la conexión entre las diferentes etapas (preparación de las muestras, lectura de las absorbancias). No obstante, el coste del equipo (Robot Gilson: 80 KF y espectrofotómetro: 50 KF) puede ser considerado sólo en el caso de análisis rutinarios.

2.6 – Repetibilidad del método I.T.V. en su totalidad

Después de haber pasado revisión a las etapas del método I.T.V., estudiamos su repetibilidad global, es decir el conjunto de etapas desde el tratamiento de las uvas a su llegada al laboratorio hasta la determinación de los compuestos fenólicos. Este trabajo fue realizado a lo largo de dos campañas consecutivas (1999 y 2000) según el siguiente protocolo: un lote considerable de 2000 uvas muestreadas por la misma persona fue dividido en 10 muestras representativas de 200 uvas. Cada muestra fue tratada independientemente el mismo día por la misma persona. A partir de los resultados del análisis de los antocianos, calculamos la media de las series, las desviaciones estándar, así como el intervalo de confianza y el coeficiente de variación (tabla 5). Esta manipulación fue repetida dos veces en 2000.

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1a Serie 2a Serie Muestras de 200 uvas 10 10 10 Media (antocianos en mg/kg 315.7 299.1 302.9 Desviación estándar 11.7 8.6 7.9 C.V. % 3.7 3.0 2.7 Intervalo Confianza % (5%) 8.5 6.9 6.2

Tabla 5 – repetibilidad del método I.T.V. estándar en 1999 y en 2000 para el parámetro “antocianos” Se observa que para el primer parámetro estudiado – contenido de antocianos – la fiabilidad del método es muy buena ya que es inferior a 5 %. La precisión global es inferior a 10 %. Señalar que estos valores integran la variabilidad debida a la composición de los lotes de 200 uvas. Al final, para un muestreo dado, se puede esperar obtener de la metódica unos resultados con un buen grado de fiabilidad.

2.7 – El método I.T.V. y los análisis corrientes

Comparamos, para los parámetros analíticos clásicos – azúcares, acidez total y pH – los resultados obtenidos con el zumo del fondo del tanque (zumo inicial antes de la fermentación alcohólica) con los obtenidos por una parte con el zumo de molienda (método I.T.V.), y por otra con el zumo de estrujado (las uvas son aplastadas con la ayuda de una miniestrujadora).

La tabla 6 muestra un ejemplo de los resultados obtenidos con la variedad Mourvèdre.

Azúcares (g/L) pH AT (g H2SO4/L)

Estrujado molienda Fondo de tanque

Estrujado Molienda Fondo de tanque

Estrujado Molienda Fondo de tanque 225.2 226.4 232.3 3.59 3.97 3.57 4 3.6 4.6 240.3 235.8 246.4 3.5 4.05 3.69 3.6 4 3.6 202.2 204.5 209.1 3.57 3.99 3.60 4.2 3.8 4.4 217.2 224.1 206.8 3.36 3.82 3.51 4.8 3.9 3.8 174.9 180.5 172.6 3.29 3.67 3.28 5.3 4.2 5.8

Tabla 6 : comparación de los valores azúcar, pH y acidez total de un zumo estrujado, zumo de molienda y zumo de fondo de tanque - 2000

El efecto más marcado se registra para el pH. El estrujado permite obtener una buena estimación del pH del mosto. La molienda extrae demasiado potasio, lo que aumenta considerablemente el pH. El potasio presente en los hollejos reacciona rápidamente con el ácido tartárico de la pulpa, lo que supone una estima errónea de la acidez, como resultado de las precipitaciones. Una comparación de las técnicas de molienda y estrujado utilizando 370 muestras de 200 uvas mostró que la molienda sobreestima los valores de pH en un 14 % de media y subestima los valores de acidez total de un 16 % de media. Para los contenidos de azúcares, los resultados de las dos técnicas son comparables. El método I.T.V. no permite por tanto evaluar directamente la madurez de la pulpa, ya que los valores de acidez total y de pH obtenidos con el zumo de molienda están demasiado alejados de los encontrados en los mostos durante el encubado. Para realizar esta estima es necesario por tanto efectuar los análisis corrientes utilizando un zumo proveniente del estrujado previo de la muestra destinada al método I.T.V..

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3 – Veracidad del método I.T.V. estándar para la determinación de la madurez fenólica

La determinación de la fecha de cosecha apropiada se apoya en la observación de la evolución de los contenidos de antocianos en las uvas a lo largo de la maduración. Se considera que la madurez fenólica se alcanza durante los primeros momentos de la fase de sobremadurez de las uvas, que corresponde a una caída considerable de las concentraciones de antocianos una vez que ha alcanzado un máximo. La construcción de una curva que represente la evolución de los antocianos en las uvas en función del tiempo facilita la visualización de esta fase.

Hemos querido comprobar la veracidad del método I.T.V. estándar para la determinación de la madurez fenólica realizando un seguimiento en varios sitios de la evolución de los antocianos a lo largo de la maduración y llevando a cabo varias cosechas sucesivas (5 fechas) seguidas de microvinificaciones estándar. Los resultados presentados fueron obtenidos en Midi Pirineos con las variedades Duras y Syrah en 1998.

3.1 – Evolución de los antocianos a lo largo de la maduración

El aspecto de las curvas es parecido para las dos variedades (figura 5); se observa un rápido aumento de los antocianos durante los primeros veinte días de maduración. Este aumento continua todavía durante algunos días pero con una menor intensidad. En este estadio, el comportamiento de las dos variedades se diferencia; son necesarios quince días en la Syrah para alcanzar una concentración máxima de antocianos, mientras que son suficientes diez días en la Duras. A continuación la caída de los antocianos en la Duras es más rápida que en la Syrah, lo que indica una maduración más lenta de esta última. Las cinco fechas de cosecha se colocaron en la fase de acumulación de los antocianos (D1 y D2), alrededor del máximo (D3 y D4) y en la fase decreciente (D5). Después del análisis de la curva, la madurez fenólica se consideró óptima el 22 septiembre (D4) para la Duras y el 6 octubre (D5) para la Syrah.

Figura 5 – Evolución de los antocianos a lo largo de la maduración para dos variedades tintas de Midi Pirineos (Syrah curva roja, Duras curva azul), 1999

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vinos

Existe una buena relación entre la concentración de antocianos de las uvas, estimada a través del método I.T.V. y la encontrada en los vinos para las fechas de cosecha precoces. Por el contrario, si se comparan las fechas de cosecha correspondientes por una parte a un máximo de acumulación de antocianos, y por otra parte a la fase de sobremaduración, la correlación entre uvas y vinos no se verifica. Así, los vinos elaborados con las uvas recogidas en ligera sobremaduración (D4 para la Duras y D5 para la Syrah) al presentar unos contenidos de antocianos superiores a los obtenidos en los vinos procedentes de vendimias más precoces presentan el potencial en antocianos más elevado. Esto ilustra el concepto de evolución de la extraibilidad de los pigmentos durante la fase de maduración de los frutos. Los resultados de la degustación de los vinos muestra el interés de los catadores por los vinos procedentes de uvas recogidas con una madurez fenólica óptima (tabla 7).

DURAS SYRAH Antocianos Antocianos Fechas de cosecha Uvas (mg/kg) Vinos (mg/L) Clasificación de los vinos en función del criterio

« calidad global » Uvas (mg/kg) Vinos (mg/L) Clasificación de los vinos en función del criterio « calidad global » D1 995 543 3 1090 690 4 D2 1200 607 2 1400 840 5 D3 1310 627 3 1430 836 3 D4 1180 685 1 1590 929 2 D5 980 601 4 1450 1058 1

Tabla 7 : relación entre la fecha de cosecha y las cualidades analíticas y organolépticas de los vinos - 1998 Estos vinos fueron descritos como poseedores de buenos e intensos aromas de frutos, una boca densa y bien equilibrada, y un color subido. Una cosecha demasiado tardía (Duras D5) parece perjudicar la expresión aromática con notas de frutas cocidas y confitadas demasiado pronunciadas. Las cosechas más precoces pecan de un ligero desequilibrio en boca con la presencia de taninos rugosos.

4 – Descripción del método (figura 1)

El método I.T.V. estándar se basa en una micromaceración, en medio hidroalcohólico ácido, a temperatura ambiente. Este último “modeliza” los fenómenos que intervienen durante una vinificación “estándar”. De esta forma, al cabo de algunas horas se estima la cantidad total de compuestos fenólicos, pero también su capacidad para ser extraídos de los hollejos. Un seguimiento regular de esta evolución de los polifenoles, a razón de un muestreo por semana y después dos cuando estamos próximos a la vendimia, permite determinar la fase óptima de madurez. Teóricamente, corresponde al momento en el que las concentraciones de antocianos en las uvas caen significativamente después de haber pasado por un valor máximo.

4.1- Muestreo de las uvas en la parcela

De dos hileras consideradas representativas de la parcela en la que el seguimiento de la maduración debe ser realizado, se seleccionan e identifican 100 cepas libres de enfermedades de la madera o de virosis. Se muestrea dos uvas por cepa, a razón de una uva por cada cara de hilera, alternando el tipo

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de muestreo para respetar la heterogeneidad de composición de las uvas en el seno de una planta – localización de la uva en el racimo, localización del racimo en la rama, colocación de la rama en la planta. Las doscientas uvas recogidas de esta forma son colocadas en una caja para la congelación cubiertas por una hoja de papel absorbente. El transporte se realiza en una nevera en presencia de refrigerante.

4.2 – Preparación de las muestras para el análisis 4.2.1- Conteo, pesada de las uvas y molienda

Si el muestreo debe ser realizado después de una lluvia, se secan las uvas con la ayuda de un papel absorbente y después con un secador. Las uvas después son contadas y pesadas de forma precisa con el fin de poder expresar el contenido de antocianos por uva o por unidad de masa. A continuación son molidas con la ayuda de una batidora doméstica de tipo “blender” durante dos minutos a velocidad reducida.

4.2.2 – Extracción de los compuestos fenólicos por maceración

Se muestrea una fracción de uva molida – alrededor de 50 g – que viene pesada de forma precisa y que se hace macerar en una solución hidroalcohólica (15 ml de etanol al 95 %, 85 ml de HCl al 0,1 %) durante 1 h a temperatura ambiente con agitación cada cuarto de hora. El molido macerado es entonces filtrado a través de algodón de vidrio o centrifugado. Se recupera una solución de extracción límpida, condición necesaria para poder efectuar bien las medidas sucesivas por espectrofotometría. La filtración con algodón de vidrio genera algunas modificaciones del contenido de polifenoles de la solución de extracción.

4.3 – Cuantificación de los antocianos y medida del IPT

Los compuestos fenólicos totales son determinados mediante la medida de la absorbancia, a 280 nm con un paso óptico de 1 cm (cubeta de cuarzo), de la solución de extracción después de una dilución a 1/100. La concentración de antocianos es determinada por el método “Puissant-Léon”, que corresponde a la medida de la absorbancia, a 520 nm bajo 1 cm de paso óptico, de la solución de extracción después de acidificación (dilución de la solución a 1/20 con HCl al 1 % en peso). El potencial de antocianos está expresado en miligramos por kilogramo de uva.

5 - Conclusión

El método de determinación de la riqueza en antocianos de las uvas puesto a punto por el I.T.V. es interesante por más de un motivo. Es el resultado de una colaboración entre varios centros I.T.V. Ha sido puesto a punto y validado a partir de datos procedentes de diferentes viñedos representativos de tantas variedades, condiciones pedoclimáticas y métodos de cultivo. No se trata por tanto de una herramienta sometida a un material vegetal o a una región vitícola en particular. Su aplicación es simple y rápida. Todas las manipulaciones que podían ser objeto de un ahorro de tiempo han sido optimizadas, con la constante preocupación de mantener la integridad de la información. De esta forma, los tiempos de análisis de los antocianos y los tiempos de maceración han sido reducidos a la mitad – se puede, además, considerar el abandono razonable de la maceración en el caso de variedades con fuerte potencial en antocianos. Hemos demostrado también que el método podría ser, en parte, automatizado. Las etapas principales del método han sido estudiadas con detalle a fin de determinar su precisión y su repetibilidad. Se ha llegado a un método en el que la variabilidad global no supera el 5 % en las condiciones normales de aplicación. Permite conocer con un buen grado de fiabilidad la zona óptima de madurez fenólica, de informar sobre las potencialidades de una añada en función de los datos de las temporadas precedentes (añada de referencia) o de una parcela en el seno de una explotación (parcela de referencia). Un estrujado de las uvas antes de la molienda permite un

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muestras durante el muestreo. El método I.T.V. no sustituye los criterios clásicos de determinación de la madurez, se propone sin embargo aportar una información complementaria útil.

Agradecimientos

Los autores quieren dar las gracias a las personas que han participado en este programa :

C. Liadouze, E. Vinsonneau unité I.T.V. Bordeaux, J. Marsault, F. Etienne unité I.T.V. d’Angers, J. Beguin, A. Bruetchy, P. Poupault unité I.T.V. de Tours, S. Grivot, V. Bouckenooghe de l’unité de Nîmes, J.Y. Cahurel unité I.T.V. de Villefranche sur Saône, B. Barthelemy, F. Davaux, E. Serrano unité I.T.V. de Gaillac, B. Labarbe de la SICAREX Beaujolais.

Así como a los colaboradores franceses :

ANDA, ONIVINS, Conseils Régionaux dentro del marco de los contratos Estado / Regiones, Comités interprofesionales y sindicatos vitícolas …

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