ESTUDIO COMPARATIVO DE DIFERENTES PARÁMETROS PARA LA OPTIMIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE BIFIDOBACTERIAS Y LACTOBACILLUS, COM O ORGANISMOS PROBIÓTICOS, EN UN
MEDIO NO LÁCTICO
VERONICA JARAMILLO ARBELÁEZ
ANDREA DEL PILAR M ILLÁN OBANDO
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍM ICA BOGOTÁ, ENERO 2005
Estudio comparativo de diferentes parámetros para la optimización del crecimiento de Bifidobacterias y Lactobacillus, como organismos
probióticos, en un m edio no láctico
Verónica Jaramillo Arbeláez Andrea del pilar M illán Obando
Proyecto de grado como requisito parcial para optar al título de Ingenieros Químicos
Asesor
Ingeniero Edgar Mauricio Vargas Solano
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE NGENIERÍA QUÍM ICA BOGOTÁ, ENERO 2005
Nota de Aceptación ________________________________ ________________________________ ________________________________ ________________________________ Asesor ________________________________ Jurado ________________________________ Jurado Bogotá, Enero 2005
A mis padres y hermanos,
por estar siempre junto a mí
guiándome y apoyándome.
Gracias por todo….
A Vero por su valiosa amistad.
A ndrea Millán Obando
Gracias a mi familia
por la confianza y el apoyo.
A Andre por brindarme una
amistad incondicional siempre
.
Verónica Jaramillo A rbeláez
AGRADECIMIENTOS
El autor expresa su agradecimiento a:
Edgar M. Vargas Solano, Ingeniero Químico, profesor de la Universidad
de los Andes, y asesor de este proyecto, por su gran apoyo durante la realización de esta investigación, y orientación para lograr los objetivos propuestos.
A todos los profesores del departamento de Ingeniería Química por su sus enseñanzas, y por la formación académica.
A Ingenios Manuelita, Incauca y Providencia, por su amabilidad y atención a todas nuestras dudas.
Al Centro de Investigaciones de la facultad de ingeniería, CIFI, por su apoyo en la investigación de este proyecto de grado.
A Clara Juliana Gómez, Ingeniera Química, por su inmensa asesoría en
la experimentación del proyecto.
A José María Robles, y a todo el personal del Centro de Innovación y
Desarrollo Tecnológico CITEC, por su gran colaboración durante todo el proyecto.
Al Centro de Investigación de Microbiología, CIMIC, por su ayuda y colaboración.
Al centro de investigación en Ingeniería Ambiental, CIIA, por permitirnos acceder a sus instalaciones y equipos cuando se necesitaron.
TABLA DE CONTENIDO Página ABSTRACT... 18 RESUMEN... 19 1. INTRODUCCIÓN ... 21 2. OBJ ETIVOS ... 24 2.1 General ... 24
2.2. Es pec ífic os... 24
3. A NTECEDENTES ... 25
4. MARCO TEÓRICO ... 27
4.1. PROB IÓTICOS ... 27
4.1.1. Beneficios de probiótic os en la s alud ... 30
4.1.2 BA CTERIAS PROB IÓTICA S... 33
4.1.2.1 BIFIDOBACTERIA S... 33
4.1.2.1.1 Generalidades ... 33
4.1.2.1.2 Condic iones y Característic as de crecimiento ... 33
4.1.2.2 LACTOBACILLUS ... 37
4.1.2.2.1 Generalidades ... 37
4.1.2.2.2 Condic iones y característic as del crecimiento ... 39
4.2 FERMENTACIONES ACIDOLA CTICA S... 40
4.3. FERMENTACIONES A NAEROBICAS ... 42
4.4 MELAZA DE CAÑA ... 45
4.5 CRECIMIENTO CINÉTICO DE MICROORGANISMOS ... 49
4.5.1 Fas es de crec imiento microbiano ... 50
4.5.2 Factores que afectan el crecimiento... 52
4.5.3 Ex pres iones c inétic as de crecimiento ... 53
5. MATERIALES Y EXPERIMENTCIÓN ... 58
5.1.1 Aislamiento ... 58
5.1.2 Conservac ión de la c epa... 61
5.1.3 Identificac ión de la cepa ... 62
5.1.4 Shaker ... 64
5.1.5 Bioflo ... 65
5.1.6 Dis eño de la experimentac ión ... 65
5.2 LACTOBA CILLUS ... 68
5.2.1 Aislamiento e identificación... 68
5.2.2 Cultiv o en medio líquido ... 70
5.2.3 Preparación del inóc ulo ... 71
5.2.4 Adaptación en s haker ... 73
5.2.5 Fermentac ión en Biorreactor Bioflo ... 73
5.2.6 Dis eño de ex perimentac ión... 75
6. RES ULTA DOS EXPERIMENTA LES Y A NÁ LISIS ... 77
6.1. BIFIDOBA CTERIAS ... 77
6.1.1 PRIMERA PARTE: EXPERIMENTACIÓN CON TRES MELAZA S ... 78
6.1.1.1 Datos Experimentales ... 78
6.1.1.1.1 Melaz a manuelita... 78
6.1.1.1.2 Melaz a Incauca ... 79
6.1.1.1.3 Melaz a Providencia ... 81
6.1.1.2 OBTENCIÓN CINÉTICA DE CRECIMIENTO ... 82
6.1.1.2.1 Melaz a Incauca ... 83
6.1.1.2.2 Melaz a Providencia ... 86
6.1.1.2.3 Melaz a Manuelita... 89
6.1.1.3 MEJOR MELAZA COMO SUSTRA TO ... 92
6.1.2 SEGUNDA PARTE: EXPERIMENTACIÓN CON DIFERENTES MEDIOS ... 94
6.1.2.1 Datos Experimentales ... 95
6.1.2.1.1 Medio con 15 gramos de Levadura por litro ... 95
6.1.2.1.3 Medio con 20 gramos de Levadura por litro ... 98
6.1.2.2 OBTENCIÓN CINÉTICA DE CRECIMIENTO SEGUNDA PA RTE... 100
6.1.2.2.1 Medio con 10 gramos de Levadura por litro ... 100
6.1.2.2.2 Medio con 15 gramos de Levadura por litro ... 103
6.1.2.2.3 Medio con 20 gramos de Levadura por litro ... 106
6.1.2.3 MEJOR MEDIO DE CRECIMIENTO... 109
6.1.3 TERCERA PARTE: VELOCIDADES DE AGITA CIÓN... 111
6.1.3.1 Datos ex perimentales ... 111
6.1.3.1.1 100 rpm... 111
6.1.3.1.2 150 rpm... 112
6.1.3.2 OBTENCIÓN CINÉTICA DE CRECIMIENTO TERCERA PA RTE... 114
6.1.3.2.1 100 rpm... 114
6.1.3.2.2 150 rpm... 117
6.1.3.3 ESCOGENCIA MEJOR V ELOCIDA D DE AGITA CIÓN... 120
6.2. LA CTOBA CILLUS... 123
6.2.1 PRIMERA PARTE: EXPERIMENTACIÓN CON LAS TRES MELAZA S ... 123
6.2.1.1 Datos ex perimentales ... 123
6.2.1.1.1Melaza Manuelita ... 124
6.2.1.1.2 Melaz a Incauca ... 125
6.2.1.1.3 Melaz a Providencia ... 127
6.2.1.2 OBTENCIÓN CINÉTICA DE CRECIMIENTO PRIMERA PA RTE... ……….. 128 6.2.1.2.1 Melaz a Manuelita... 129 6.2.1.2.2 Melaz a Incauca ... 132 6.2.1.2.3 Melaz a Providencia ... 135
6.2.2 SEGUNDA PARTE: EXPERIMENTACIÓN CON DIFERENTES
MEDIOS ... 141
6.2.2.1 Datos ex perimentales ... 141
6.2.2.1.1 Medio con 15 g/L de extracto de lev adura... 141
6.2.2.1.2 Medio con 10 g/L de extracto de lev adura... 143
6.2.2.1.3 Medio con 20 g/L de extracto de lev adura... 144
6.2.2.3 OBTENCIÓN CINÉTICA DE CRECIMIENTO SEGUNDA PA RTE... 146
6.2.2.3.1 Medio con 10 g/L de extracto de lev adura... 146
6.2.2.3.2 Medio con 15 g/L de extracto de lev adura... 149
6.2.2.3.3 Medio con 20 g/L de extracto de lev adura... 152
6.2.2.4 MEJOR MEDIO DE CRECIMIENTO... 155
6.2.3 TERCERA PARTE: VELOCIDADES DE AGITA CIÓN... 157
6.2.3.1 Datos ex perimentales ... 158
6.2.3.1.1 150 rpm... 158
6.2.3.2 OBTENCIÓN CINÉTICA DE CRECIMIENTO TERCERA PA RTE... 160
6.2.3.2.1 150 rpm... 160
6.2.3.3 ESCOGENCIA MEJOR V ELOCIDA D DE AGITA CIÓN... 162
7. DIS CUCIÓN DE RESULTA DOS ... 166
8. ESTIMA CIÓN PRELIMINAR DE COS TOS ... 170
9. CONCLUSIONES Y RECOMENDA CIONES ... 171
10. BIBLIOGRAFÍA... 174
11. ANEXOS ... 180
ANEXO A : PROCEDIMIENTO TINCION DE GRAM ... 180
ANEXO B: ANALISIS DE LAS MELAZAS DE CAÑA. LABORATORIO BIOCONTROL... 182
ANEXO C: MEDIO MINIMO DE SALES ... 185
ANEXO D: PRUEBA S... 186
ANEXO E: PRUEBA ESTA DISTICA T PA RA BIFIDOBACTERIA S... 191
Lista de Figuras:
Figura 1. Bac terias dominantes de la flora intestinal ... 28
Figura 2. Probióticos que tienen efecto terapéutico en las siguientes enfermedades. ... 31
Figura 3. Características de subgrupos del género Lac tobacillus... 38
Figura 4. Fases de crec imiento bacteriano ... 50
Figura 5. Efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de crec imiento... 54
Figura 6. Es quema General de un proceso de Fermentación ... 169
Lista de Imágenes: Imagen 1.Bifidobacterias ... 34
Imagen 2. Lactobacillus ... 37
Imagen 3. Cepas de Bifidobacterias en agar TPY ... 61
Imagen 4. Bifidobacterias vistas en el microscopio del CIMIC ... 62
Imagen 5. fermentac ión en shaker con alimentación de Nitrógeno... 65
Imagen 6. Ex perimentación fermentaciones Bifidobac terias ... 65
Imagen 7. Apariencia de las colonias luego de hacer conteo en Agar MRS. ... 70
Imagen 8. Fermentación en el Bioflo... 74
Lista de Tablas
Tabla 1. Reacciones fermentativas del genero Bifi dob acterium... 35
Tabla 2. Estudio de los efectos de las bifidobacterias en diversos estudios de c áncer. ... 37
Tabla 3. Composición aproximada de la miel de caña (porcentaje en peso de la miel)... 46
Tabla 4. Medio TPY ... 59
Tabla 5. Cantidad de melaza por litro para Bifidobacterias ... 63
Tabla 6. Medio de cultiv o primera parte... 67
Tabla 7. Medios de c ultivo segunda parte ... 67
Tabla 8. Medio de c ultivo tercera parte... 67
Tabla 9. Cantidades de melaz a por litro para Lactobacillus ... 72
Tabla 10. Medio de c ultivo primera parte ... 76
Tabla 11. Medio de c ultivo s egunda parte... 76
Tabla 12. Medio de c ultivo terc era parte... 77
Tabla 13. Fermentación Melaz a manuelita Primera Parte... 78
Tabla 14. Fermentación Melaz a Incauca Primera Parte ... 80
Tabla 15. Fermentación melaz a Providencia Primera Parte... 81
Tabla 16. Velocidad es pec íf ica de crecimiento M. Incauc a... 83
Tabla 17. Parámetros cinéticos Melaza Incauca... 84
Tabla 18. Velocidad es pec íf ica de crecimiento Melaza Providencia ... 86
Tabla 19. Parámetros Cinéticos Melaza Prov idencia... 87
Tabla 20. Velocidad de Crecimiento Melaza Manuelita ... 89
Tabla 21. Parámetros cinéticos Melaza Manuelita ... 90
Tabla 22. Co mposición Peptona c aseína ... 94
Tabla 23. Co mposición extracto de levadura... 94
Tabla 24. Fermentación con 15 gramos de levadura por litro... 96
Tabla 25. Fermentación usando 10 gramos de levadura por litro ... 97
Tabla 27. Velocidad específica de crecimiento con 10 gr/l de levadura por
litro... 100
Tabla 28. Parámetros cinéticos us ando 10gr/l de levadura por litro... 101
Tabla 29. Velocidad específica de crecimiento usando 15 gramos/l de levadura por litro ... 103
Tabla 30. Parámetros cinéticos us ando 15gr/l de levadura por litro... 104
Tabla 31. Velocidad específica de crecimiento con 20 gramos de levadura por litro... 106
Tabla 32. Parámetros Cinéticos 20 gr/l de levadura... 107
Tabla 33. Fermentación a 100 rpm... 111
Tabla 34. Fermentación a 150 rpm... 113
Tabla 35. Velocidad es pec íf ica de crecimiento 100 rpm... 114
Tabla 36. Parámetros cinéticos a 100 rpm... 115
Tabla 37. Velocidad es pec íf ica de crecimiento a 150 rpm ... 117
Tabla 38. Parámetros cinéticos a 150 rpm... 118
Tabla 39. Mejor medio de c ultivo para Bifidobac terias... 123
Tabla 40. Fermentación melaz a Manuelita primera parte ... 124
Tabla 41. Fermentación melaz a Incauca, primera parte... 126
Tabla 42. Fermentación melaz a Providencia primera parte... 127
Tabla 43. Datos c inétic os, melaza Manuelita, primera parte. ... 129
Tabla 44. Parámetros cinéticos , melaza Manuelita, primera parte. ... 130
Tabla 45. Datos c inétic os, melaza Inc auca, primera parte... 132
Tabla 46. Parámetros cinéticos , melaza Inc auc a, primera parte... 133
Tabla 47. Datos c inétic os, melaza Providencia, primera parte. ... 135
Tabla 48. Parámetros cinéticos , melaza Providenc ia, primera parte... 136
Tabla 49. Fermentación melaza Manuelita con 15 g/L de extracto de lev adura... 141
Tabla 50. Fermentación de melaza Manuelita con 10 g/L de extracto de lev adura... 143
Tabla 51. Fermentación melaza Manuelita con 10 g/L de extracto de lev adura... 145
Tabla 52. Datos cinéticos melaza Manuelita con 10 g/L de extracto de
lev adura... 146
Tabla 53. Parámetros cinéticos con 10 g/L de ex tracto de lev adura. ... 147
Tabla 54. Datos c inétic os c on 15 g/L de extracto de lev adura. ... 149
Tabla 55. Parámetros cinéticos con 15 g/L de ex tracto de lev adura. ... 150
Tabla 56. Fermentación de con 20 g/L de ex trac to de lev adura. ... 152
Tabla 57. Parámetros cinéticos con 20 g/L de ex tracto de lev adura. ... 153
Tabla 58. Fermentación con 15 g/L de extracto de lev adura y 150 rpm. ... 158
Tabla 59. Datos c inétic os c on 15 g/L de extracto de lev adura y 150 rpm. .. 160
Tabla 60. Parámetros cinéticos con 15 g/L de extracto de levadura y 150 rpm. ... 161
Tabla 61. Mejor medio de c ultivo para Lactobacillus... 166
Tabla 62. Es timación preliminar de c ostos de dos medios diferentes ... 170
Tabla 63. Datos c urva calibrac ión DNS ... 188
Lista de Gráficas Gráfic a 1. Concentración Vs Tiempo Melaza manuelita Primera Parte ... 79
Gráfic a 2. Concentración Vs Tiempo Melaza Incauc a primera parte... 80
Gráfic a 3. Concentración Vs Tiempo Melaza Providenc ia Primera parte ... 82
Gráfic a 4. Veloc idad Es pecific a de crecimiento M. Inc auca ... 84
Gráfic a 5. Veloc idades de crec imiento en Melaz a Incauca ... 85
Gráfic a 6. Modelo Gompertz Vs Datos experimentales Melaz a Incauca ... 85
Gráfic a 7. Veloc idad es pec ific a de crecimiento melaza providencia ... 87
Gráfic a 8. Veloc idad de crecimiento Melaza providencia ... 88
Gráfic a 9. Modelo Gompertz Vs Experimental Melaza providenc ia... 88
Gráfic a 10. V eloc idad de crec imiento Melaz a Manuelita ... 90
Gráfic a 11. V eloc idades de crecimiento Melaza manuelita ... 91
Gráfic a 12. Modelo Gompertz Vs Experimental Melaz a manuelita ... 91
Gráfic a 14. Curv a de crecimiento en las 3 melaz as ... 93
Gráfica 15. Concentración Vs Tiempo usando 15 gramos de levadura por litro... 96
Gráfic a 16. Conc entrac ión Vs tiempo us ando 10 gramos de levadura ... 98
Gráfica 17. Concentración Vs tiempo usando 20 gramos de levadura por litro. ... 99
Gráfica 18. Velocidad de crecimiento usando 10 gramos/l de levadura por litro... 101
Gráfica 19. Velocidad de crecimiento Vs Tiempo con 10 gramos de lev adura por litro ... 102
Gráfica 20. Modelo Gompertz Vs Experimental usando 10 gramos de lev adura por litro ... 102
Gráfica 21. Velocidad específica de crecimiento con 15 gramos/l de lev adura por litro ... 104
Gráfica 22. Velocidad de crecimiento Vs Tiempo con 15 gramos/l de lev adura por litro ... 105
Gráfica 23. Modelo Gompertz Vs Experimental usando 15 gramos/l de lev adura... 105
Gráfica 24. Velocidad de crecimiento Vs sustrato con 20 gramos de lev adura por litro ... 107
Gráfica 25. Velocidad de crecimiento Vs Tiempo con 20 gramos/l levadura por litro... 108
Gráfica 26. Modelo Gompertz Vs Experimental con 20 gramos/l de lev adura por litro ... 108
Gráfic a 27. Conc entrac ión Vs tiempo de los 3 medios ... 109
Gráfic a 28. Curv a de crecimiento para los 3 medios ... 109
Gráfic a 29. Conc entrac iones Vs Tiempo a 100 rpm ... 112
Gráfic a 30. Conc entrac ión Vs tiempo a 150 rpm... 113
Gráfic a 31. V eloc idad de crec imiento a 100 rpm... 115
Gráfic a 32. V eloc idad de crec imiento Vs Tiempo 100 rpm... 116
Gráfic a 34. V eloc idad de crec imiento a 150 rpm... 118
Gráfic a 35. V eloc idades de crecimiento Vs Tiempo a 150 rpm ... 119
Gráfic a 36. Modelo Gompertz Vs experimental a 150rpm... 119
Gráfic a 37. Conc entrac ión de c élulas para ambas agitaciones ... 120
Gráfic a 38. Curv a de crecimiento ambas agitac iones ... 120
Gráfic a 39. Peptona Vs Medio con Levadura ... 122
Gráfic a 40. UFC/gr para peptona Vs medio c on lev adura... 122
Gráfic a 41. Conc entrac ión vs Tiempo, melaza Manuelita, primera parte. ... 125
Gráfic a 42. Conc entrac ión vs Tiempo, melaza Incauca, primera parte... 126
Gráfic a 43. Conc entrac ión vs Tiempo, melaza Prov idencia, primera parte. 128 Gráfica 44. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato, melaz a Manuelita... 130
Gráfic a 45. Modelo de Monod, melaza Manuelita, primera parte... 131
Gráfic a 46. Modelo de Gompertz, melaza Manuelita, primera parte. ... 131
Gráfica 47. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato, melaz a Incauca ... 133
Gráfic a 48. Modelo de Monod, melaza Incauca, primera parte... 134
Gráfic a 49. Modelo de Gompertz, melaza Incauca, primera parte... 134
Gráfica 50. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato, melaz a Providencia ... 136
Gráfic a 51. Modelo de Monod, melaz a Providencia, primera parte. ... 137
Gráfic a 52. Modelo de Gompertz, melaza Prov idencia, primera parte... 137
Gráfica 53. Comparativo de concentración celular de las melazas, primera parte... 139
Gráfica 54. Comparativo de unidades formadoras de colonias de las melaz as, primera parte... 139
Gráfica 55. Concentración vs Tiempo melaza Manuelita con 15 g/L de extracto de lev adura... 142
Gráfica 56. Concentración vs Tiempo melaza Manuelita con 10 g/L de extracto de lev adura... 144
Gráfica 57. Concentración vs Tiempo melaza Manuelita con 10 g/L de
extracto de lev adura... 145 Gráfica 58. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato con 10
g/L de ex trac to de levadura. ... 147 Gráfic a 59. Modelo de Monod c on 10 g/L de extracto de levadura. ... 148 Gráfic a 60.Modelo de Gompertz c on 10 g/L de extracto de lev adura. ... 148 Gráfica 61. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato con 15
g/L de ex trac to de levadura. ... 150 Gráfic a 62. Modelo de Monod c on 15 g/L de extracto de levadura. ... 151 Gráfic a 63. Modelo de Gompertz c on 15 g/L de extracto de levadura... 151 Gráfica 64. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato con 20
g/L de ex trac to de levadura. ... 153 Gráfic a 65. Modelos de Monod con 20 g/L de extracto de levadura. ... 154 Gráfic a 66. Modelo de Gompertz c on 20 g/L de extracto de levadura... 154 Gráfica 67. Comparativo de concentración celular con 10, 15 y 20 g/L de
extracto de lev adura... 155 Gráfica 68. Comparativo de unidades formadoras de colonias con 10, 15 y
20 g/L de extracto de levadura. ... 155 Gráfica 69. Comparativo unidades formadoras de colonia con peptona
caseína y con 15 g/L de extracto de levadura. ... 156 Gráfica 70. Concentración vs Tiempo con 15 g/L de extracto de levadura y
150 rpm. ... 159 Gráfica 71. Velocidad de crecimiento vs Concentración de sustrato con 15
g/L de ex trac to de levadura y 150 rpm... 161 Gráfica 72. Modelos de Monod con 15 g/L de extracto de levadura y 150
rpm. ... 162 Gráfica 73. Modelo de Gompertz con 15 g/L de extracto de levadura y 150
rpm. ... 162 Gráfica 74. Comparativo de concentración celular con 15 g/L de extracto
Gráfica 75. Comparativo de unidades formadoras de colonias con 15 g/L
de ex trac to de levadura a 100 y 150 rpm. ... 163
Gráfica 76. Comparativo de concentración celular con peptona caseína y con 15 g/L de extracto de lev adura a 150 rpm. ... 164
Gráfica 77. Comparativo de unidades formadoras de colonia con peptona caseína y con 15 g/L de extracto de levadura a 150 rpm. ... 165
Gráfic a 78. Curv a c alibración DNS ... 189
Lista de ecuaciones Ec uac ión 1. V elocidad especifica de crec imiento ... 53
Ec uac ión 2. Modelo de Monod Simple... 54
Ec uac ión 3. Modelo Inhibic ión no c ompetitiv a por formación de producto.... 56
Ecuación 4. Coeficiente de rendimiento de utilización de sustrato para el crecimiento celular... 56
Ecuación 5. Coeficiente de rendimiento de utilización de sustrato para la producción ... 56
Ec uac ión 6. Coeficiente de mantenimiento c elular ... 57
Ec uac ión 7. Tiempo de generación celular ... 57
Ec uac ión 8. Constante de velocidad de muerte ... 57
ABSTRACT
This thesis w ork is the continuation of the w ork done by Clara Juliana Gomez named: “Obtention of probiotic microorganisms in a non dairy medium”, w here w as studied a good medium made by cane molasse, 10 gr/l of casein peptone and 5gr/l of yeast extract, obtaining high concentrations (CFU/gr) of Lactobacillus and Bifidobacteria; how ever, this medium w as really expensive due to the casein peptone cost, making more difficult the economical viability of the final product.
The investigation done in this project complements the w ork named above, searching an inexpensive medium, studying three parameters: Agitation speed, three types of molasses (Incauca, Providenia and Manuelita), and Caseine peptone and yeast extract concentration.
It w as found that the best molasse w as Manuelita w ith an agitation speed of 150rpm, and a yeast extract concentration of 15gr/l for Bifidobateria as w ell as Lactobacillus avoiding the use of caseine peptone, reducing quite a lot the culture medium total costs, and obtaining up to 1010 CFU/gr, overcoming the 107 limit necessary for being healthy to the host.
The grow th kinetics follow ed the simple Monod model w ithout product inhibition, understanding as product only the lactic acid.
RESUMEN
Este trabajo es la continuación del proyecto de grado “Obtención de microorganismos probióticos en un medio no láctico”, realizado por la Ingeniera Química Clara Juliana Gómez, que surgió como iniciativa para el reemplazo del uso de antibióticos en la alimentación animal, por un concentrado para ganado vacuno que incluya bacterias benéficas para la salud (probióticos), usando como sustrato melaza de caña. Tal trabajo arrojó excelentes resultados de crecimiento tanto para Lactobacillus como para Bifidobacterias usando melaza de caña Incauca, con una concentración de 10gr/l de peptona caseína y 5gr/l de extracto de levadura; sin embargo, aunque la peptona caseína es un excelente agente de crecimiento, tiene un costo elevado, lo cual dificulta la viabilidad económica del producto terminado.
La investigación desarrollada en este proyecto complementa el trabajo anteriormente mencionado buscando un medio óptimo de crecimiento, evaluando nuevos parámetros de cultivo de Lactobacillus y Bifidobacterias como son: velocidad de agitación, tipos de melaza (Incauca, Providencia y Manuelita), y concentración de peptona caseína y/o extracto de levadura como fuente de nitrógeno, con el fin de economizar la producción sin que ello disminuya significativamente el crecimiento de los microorganismos.
Se encontró que para ambas bacterias la melaza bajo la cual crecían favorablemente fue Manuelita con una velocidad de agitación en el Biorreactor de 150 rpm, y que la peptona caseína fue reemplazada por el extracto de levadura en su totalidad sin presentar efectos negativos sobre el crecimiento, obteniendo aproximadamente 1010 UFC/gr tanto para
UFC/gr necesario para colonizar el intestino de los animales una vez sea ingerido1.
La concentración celular máxima para Lactobacillus fue de 7.9 gr/lt que es un 63% mayor que el máximo reportado por la investigación de la Ingeniera Clara Gómez, y para Bifidobacterias fue de 5.1 gr/lt, siendo un 68% superior.
Las cinéticas de crecimiento siguieron el modelo de Monod Simple sin inhibición por la generación de producto representado por el ácido láctico, confirmando la similitud de comportamientos reportado por Clara Gómez.
1. INTRODUCCIÓN
El uso de antibióticos para la prevención y tratamiento de enfermedades en los animales, es una buena alternativa para la preservación de la salud y protección ante la presencia de microorganismos patógenos, sin embargo trazas de estos antibióticos no son asimiladas por el organismo del animal y se acumulan en la carne y en la leche, productos que después serán consumidos por el hombre, y que en el momento de ser ingeridos hacen que este sea más propenso a enfermedades bacterianas, presentándose un problema de salud pública. Por esta razón países de Europa, Asia y Norte América están generando una tendencia a restringir tanto la producción como la importación de carnes y productos lácteos provenientes de animales que fueron tratados con antibióticos.
Los antibióticos además de actuar sobre microorganismos patógenos, también afectan la flora intestinal destruyendo las bacterias benéficas que posee el organismo y las cuales son las que influyen en el equilibrio digestivo e inmunológico del huésped en que se encuentren.
Es por esta razón que últimamente el desarrollo de alimentos funcionales está en auge. Estos alimentos se definen como aquellos a los cuales se les incluye algún compuesto, como vitaminas, calcio, minerales, agentes antioxidantes, fibra, betacarotenos, probióticos, etc, con el fin de cumplir una función benéfica en la salud del consumidor, reemplazando los aditivos y químicos por compuestos naturales.
La gran mayoría de estudios que se están realizando sobre estos alimentos, son aquellos que contengan una alta concentración de probióticos, además que estos microorganismos sean capaces de llegar vivos al tracto digestivo para que puedan cumplir con sus beneficios.
Las principales bacterias denominadas probióticos, corresponden a los Lactobacillus, Bifidobacterias y Streptococos. Estos microorganismos son bacterias acido lácticas, que se encuentran principalmente en productos lácteos, usando la lactosa como sustrato, transformándola en ácido láctico y energía. Esto no quiere decir que la lactosa sea la única fuente de carbono que estos puedan usar, es por eso que se busca una alternativa más económica y que pueda ser posteriormente consumida por el ganado vacuno, como es el caso de la melaza de caña, un subproducto de la industria azucarera de muy bajo costo y que en Colombia es un alimento frecuente para el ganado.
En este orden de ideas, se escogieron 3 melazas de los principales ingenios azucareros del país como son, Incauca S.A., Providencia S.A., y Manuelita, con el fin de encontrar si existe alguna incidencia en el crecimiento de los probióticos al variar la melaza y poder escoger la de mejores rendimientos.
Un medio adecuado de sustrato (fuente de carbono), nitrógeno ya sea suministrado por la peptona caseína o por extracto de levadura y una adecuada agitación en el biorreactor lleva a obtener los mejores parámetros de crecimiento de estos microorganismos.
Es importante que el medio en el que los mircroorganismos van a ser cultivados sea económico sin bajar la calidad, para que así en un futuro al
tener estos probióticos en un concentrado, este se vuelva una excelente alternativa de nutrición para el ganado vacuno, y así aumentar las exportaciones de carne, las cuales han disminuido en la actualidad por las razones mencionadas en un comienzo sobre el uso de los antibióticos.
2. OBJETIVOS
2.1 General
Estudiar diferentes parámetros para la optimización del crecimiento de Bifidobacterias y Lactobacillus como organismos probióticos en un medio no láctico.
2.2. Específicos
• Realizar el aislamiento de las Bifidobacterias y Lactobacillus de medios lácticos comerciales y caracterizar las cepas.
• Estudiar el efecto de diferentes sustratos para fomentar el crecimiento de las Bifidobacterias y Lactobacillus a escala de laboratorio.
• Estudiar el crecimiento cinético de las Bifidobacterias y Lactobacillus variando la agitación en un medio no láctico.
• Seleccionar la mejor combinación de los parámetros mencionados anteriormente para el crecimiento óptimo de estas bacterias.
3. ANTECEDENTES
Los probioticos se definen como células microbianas vivas que tienen efectos benéficos en la salud sin causar daños en el organismo que los posee.2
Desde que sus propiedades benéficas fueron encontradas, como son la disminución de diarreas, estimulación del sistema inmune, desconjugación del colesterol, inhibición del crecimiento de agentes patógenos, alivio de la respuesta inflamatoria del intestino, prevención de tumores etc, se comenzaron a usar como parte de la alimentación de las personas y posteriormente de los algunos animales.
Existen alimentos como la leche y el yogurt que ya vienen naturalmente con una cierta cantidad de estos microorgasnismos probióticos, sin embargo es tan poca la cantidad de ellos que sería necesario tomar muchos litros de estas bebidas para poder tener el efecto benéfico que ellos aportan. Debido a esto, ya existe en el mercado los yogures probioticos, a los cuales se les adiciona una mayor cantidad de probióticos, también se encuentran leche, queso, helados con probióticos para consumo humano, y se están realizando más investigaciones para incluirlos en una mayor cantidad de alimentos.
En Colombia la producción de probióticos es muy reducida, siendo el yogurt la principal fuente de probioticos para consumo humano. Respecto al consumo animal, diferentes productos ya pueden ser conseguidos a
nivel comercial como son, Probiomin, Prokura rumicell y Prokura pasta probiótica, sin embargo estos productos son costosos y tienen un máximo de 7x108 UFC/gr de Lactobacillus y Bifidobacterias.
4. MARCO TEÓRICO
4.1. PROBIÓTICOS
Los probióticos son células microbiales que tienen un efecto benéfico en la salud y bienestar del huésped donde se encuentran3, pueden ser llamados también agentes terapéuticos ya que se han realizado estudios en el que se han usado para el tratamiento de algunas enfermedades gastrointestinales.
Estos microorganismos son habitantes del tracto digestivo, colonizando la parte final del intestino grueso y delgado, constituyen la flora intestinal, ayudando a la digestión ya sea descomponiendo la comida en sus diferentes compuestos para que sean absorbidos con mayor facilidad por el cuerpo. Mientras que las bacterias malas o patógenas crean un desbalance en la microflora causando enfermedades4.
En el momento en que nacemos, y mientras se es alimentado con leche materna, se tiene una gran cantidad de estas bacterias buenas, sin embargo el estilo de vida, el stress, la ansiedad, el alcohol y en general los malos hábitos conllevan a que esta cantidad de bacterias buenas disminuyan haciendo que las malas se aprovechen y comiencen a causar estragos, como son flatulencia, estreñimiento o diarrea. En la figura 1 se muestra la cantidad de bacterias que se encuentran en la flora intestinal.
3 Referencia [2] Página 1 4 Referencia [4]
Figura 1. Bacterias dom inantes de la flora intestinal5
El ácido gástrico y el flujo peristáltico normal del intestino delgado limitan la población bacteriana del tracto gastrointestinal alto.
Algunos de los efectos de la flora intestinal son6:
- Su papel sobre la degradación de los nutrientes. - La modificación cualitativa del intestino.
- La síntesis de vitaminas
- La producción de ácidos grasos volátiles y la reabsorción de metabolitos bacterianos.
- Síntesis de aminas activas y poliaminas.
- El papel sobre los productos de secreción endógena. - La producción de gases.
- La acción sobre el metabolismo de los xenobioticos
5 Referencia [7] 6 Referencia [5]
Es por esto que las bacterias prebióticas se deben tener en cuenta como alimento diario para que siempre haya en nuestro organismo una cantidad adecuada que prevenga estas enfermedades, y mantenga la flora intestinal balanceada para que pueda cumplir con sus funciones sin problemas.
Para que un microorganismo pueda ser considerado probiótico debe cumplir con varios de estos criterios7:
1. Saludable para el huésped.
2. Resistencia a la acidez gástrica y secreciones pancreáticas 3. Adhesión a las células epiteliales
4. Actividad antimicrobial
5. Inhibición a la adhesión de bacterias patógenas 6. Resistencia a los antibióticos
7. Resistencia a los aditivos de las comidas
Los microorganismos más estudiados y que cumplen con la mayoría de estos criterios son: Lactobacillus, Bifidobacterium, y Streptococos, nombrados bacterias acido lácticas, las cuales ayudan a la inhibición del crecimiento de varios agentes patógenos como son la Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Clostridium perfringens and C. Saccharomyces boulardii.
La cantidad adecuada que se deben tener de estos microorganismos en el cuerpo para que desarrollen los beneficios que estos dan, es de 109 –
1010 organismos por día, lo que correspondería a tomar aproximadamente
3 tazas y media de yogurt, ya que típicamente están formulados con 106 UFC/ml8.
4.1.1. Beneficios de probióticos en la salud
El consumo regular de los microorganismos probióticos, trae un sinnúmero de beneficios, ya sea para consumo humano o para consumo animal según las investigaciones que se han hecho.
Beneficios en humanos
Sistema Inmune9
Los probióticos aumentan la respuesta inmune específica y no específica, activando macrófagos que aumenten el nivel de inmunoglobinas, el nivel de citokinas, o la actividad de muerte celular natural.
Intolerancia a la Lactosa
Especies de Lactobacillus como el L. Bulgaricus y algunos otros que se encuentran en leches fermentadas ayudan a las personas que no toleran la lactosa proporcionando lactasa al intestino y al estomago.
Alergias
Los probióticos podrían proteger contra las alergias al mejorar la función de las barreras mucosas.
Cáncer:
8 Referencia [7] 9 Referencia [6] Página 2
La influencia de los probióticos en el cáncer es promisoria, hasta ahora se han hecho estudios sólo in-vitro y en animales donde parece que estos microorganismos reducen el riesgo de cáncer de colon al disminuir la incidencia del número de tumores.
Figura 2. Probióticos que tienen efecto terapéutico en las siguientes enfermedades10.
Otros beneficios son los siguientes:
- Resistencia a la Salmonella
- Inhibición de invasividad y crecimiento bacteriano
- Prevención de la pérdida de densidad ósea por descalcificación - Desconjugación del Colesterol
Beneficios en animales
En animales de experimentación se ha visto que el consumo de probióticos reduce en la masa fecal la cantidad de enzimas microbianas como la b-glucuronidasa, nitroreductasa y ureasa que parecen estar involucradas en la producción de sustancias cancerígenas y mutagénicas11.
Otros beneficios que se han estudiado son12:
-Prevención de las diarreas por inhibición de la flora causante.
-Disminución de la mortalidad que estas diarreas provocan en animales de corta edad.
-Prevención de las enfermedades pulmonares, anorexias, etc, ligadas al estado sanitario deficiente del animal con tránsito intestinal acelerado o que ha padecido diarreas.
-Mejor absorción de los nutrientes de los formulados alimenticios con el consiguiente aumento del índice de conversión y su significado económico en ganancia de peso.
-Correctas fermentaciones intestinales, se logra homogeneizar y mejorar la textura y olor de las heces siendo estas aptas como fertilizantes.
- Al mejorar la resistencia inmunológica del animal, se disminuye la utilización abusiva de antibióticos, su costo y dificultad de administración.
1 1 Referencia [8] Página 2 1 2 Referencia [10]
Y muchos más beneficios que se pueden ver a continuación, según cada microorganismo probiótico estudiado en este proyecto.
4.1.2 BACTERIAS PROBIÓ TICAS
4.1.2.1 BIFIDO BACTERIAS
4.1.2.1.1 G eneralidades
Las Bifidobacterias son microorganismos que miden entre 0.5-1.3 x 1.5-8 µm, usualmente son ligeramente bifurcados (forma de Y) y a menudo son ramificados; estas bacterias pueden arreglarse en forma solitaria, en parejas, en arreglos de V, y algunas veces en cadena13.
4.1.2.1.2 Condiciones y Características de crecimiento
Son bacterias gram positivas, inmóviles, no esporuladas y no presentan ningún crecimiento bajo pH menores a 4.5 o mayores a 8.5; la mayoría de las especies son anaerobias, sin embargo hay especies que pueden crecer en aire mientras haya presencia de CO2. Su temperatura de óptimo crecimiento se encuentra en un rango de 37 – 41ºC, y mínimo crecimiento entre 25-28ºC.14
En la imagen 1 se aprecian las bifidobacterias:
1 3 Referencia [11] Página 573 1 4 Referencia [12] Página 1418
Im agen 1.Bifidobacterias
Se encuentran 24 especies de Bifidobacterias, en la tabla 1 se pueden observar cuales son y algunas de sus reacciones fermentativas que las distinguen:
Tabla 1. Reacciones fermentativas del genero Bifidobacterium15
Las bifidobacterias son habitantes normales del tracto gastrointestinal, y son los microorganismos abundantes en la materia fecal de bebés recién nacidos alimentados con leche materna, ejerciendo actividad probiótica en el huésped.
Varios de sus beneficios son16:
• Metabolizan azúcares a ácido láctico y ácido acético, mejorando el peristaltismo intestinal, aliviando así el estreñimiento.
• Favorecen la normalización de la flora intestinal después de un tratamiento con antibióticos.
• Renueva la flora después de una diarrea
• Inhiben el crecimiento de bacterias patógenas, y la producción y absorción de amonio, lo cual ayuda a la detoxificación hepática.
• Sintetizan vitaminas: B1, B2, B6, B12, ácido fólico y biotina.
Debido a que con el paso del tiempo y el estilo de vida que se lleve la cantidad de bifidobacterias va diminuyendo, y sabiendo todos los beneficios que estos traen a la salud, ya existen varios alimentos que las traen incluidas en ellos como leches, quesos y helados.
Las leches fermentadas por bifidobacterias se han desarrollado en varias partes del mundo, como son norte y Suramérica, Asia, y Europa, Estos productos contienen con frecuencia B. bifidum, B. longum,B. lactis, B. breve, o B. infantis; algunos utilizan Bifidobacterium sp.17
1 5 Referencia [12] Página 1430 1 6 Referencia [13]
Otros de los beneficios que estas presentan son:
• Reducción del riesgo de cáncer de colon • Actividad Antimicrobiana
• Efectos inmunomodulantes
• Aumentan las defensas del cuerpo
En la tabla 2 se puede observar algunos de los estudios sobre la prevención del cáncer relacionado con las bifidobacterias que se han hecho ya sea en animales o en humanos:
Tabla 2. Estudio de los efectos de las bifidobacterias en diversos estudios de cáncer18.
4.1.2.2 LACTO BACILLUS
4.1.2.2.1 G eneralidades
Los lactobacillus son bacterias acidolácticas anaerobias facultativas de tipo Gram positivo en forma de bastones alargados y en ocasiones como cocobacilos y sin movilidad y en muy raras ocasiones, aunque en realidad es casi nulo su efecto patógeno.
En la imagen 2 se pueden observar los Lactobacillus al microscopio:
Im agen 2. Lactobacillus
Cuando una bacteria es gram positiva quiere decir que tiene una membrana celular interna rodeada de peptidoglicano confiriendo rigidez y forma a la célula. Al momento de llevar a cabo la tinción de gram (Ver
ANEXO A), las bacterias gram positivas absorben el violeta el cual no puede ser después removido por la adición del alcohol observándose en el microscopio los microorganismos coloreados de morado19.
El género Lactobacillus se ha divido en tres grandes grupos (Homofermentativos que crecen a 45 ºC, Homofermentativos que crecen a 15 ºC y Heterofermentativos) y cerca de 70 especies se han reconocido hasta el momento20. Los homofermentativos llevan a cabo fermentaciones
homolácticas usando la ruta Embden-Meyerhof y en la que se tienen pocos productos secundarios y los heterolácticos por la ruta de la pentosa fosfato. Estas rutas metabólicas se explicarán más a fondo en el capítulo 4.4.
En la figura 3 se aprecia algunas características de los subgrupos del género Lactobacillus:
Figura 3. Características de subgrupos del género Lactobacillus.21
1 9 Referencia [16].
2 0 Referencia [17]. Página 542. 2 1 Referencia [17] Página 724
Por lo general son más resistentes a condiciones de acidez que las otras bacterias acidolácticas, lo que permite que sigan creciendo durante las fermentaciones lácticas normales cuando el pH ha decaído hasta un nivel muy bajo que otras bacterias no podrían resistir.
Se encuentran principalmente en productos lácteos como leche, yogures o quesos, en granos, carne, cerveza, vegetales, entre otros productos alimenticios. Igualmente, hacen parte de la flora normal de animales monotérmicos, incluyendo al humano, encontrándose en la boca, el tracto intestinal y vagina.
4.1.2.2.2 Condiciones y características del crecimiento
Pueden crecer óptimamente bajo condiciones microaerofílicas con cantidades de oxígeno entre un 2 y un 10%.
Las condiciones adecuadas de pH son medios ligeramente ácidos en un rango de 4.5 a 6.422 bajo condiciones de temperatura entre los 30 y los 40ºC. Cuando el medio de cultivo ha alcanzado la neutralidad o incluso la alcalinidad, la tasa de crecimiento disminuye23.
Debido a que tienen limitadas capacidades biosintéticas, no es suficiente proveer a los lactobacillus con carbohidratos fermentables para dar paso al crecimiento. Son necesarios medios complejos y ricos en minerales, nitrógeno, fósforo, azufre, aminoácidos, péptidos, derivados de ácido nucleicos, vitaminas (principalmente la riboflavina), sales, ácidos grasos, entre otros nutrientes los cuales son vitales para su bienestar24.
2 2 Referencia [18[. Página 529. 2 3 Referencia [12]. Página 1210. 2 4 Referencia [12]. Página 1209.
El fósforo es necesario para la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos. El azufre tiene un importante rol estructural a nivel de ciertos aminoácidos y vitaminas. El potasio es requerido por todos los organismos y gran variedad de enzimas. El magnesio tiene la función de estabilizar los ribosomas, la membrana celular y ácidos nucleicos25.
A nivel comercial es posible encontrar medios de cultivo ya preparados que tengan todas los compuestos necesarios para tener condiciones nutritivas de crecimiento, como es el caso específico del medio MRS (de Man, Rogosa y Sharpe), el cual puede encontrarse en agar (para cultivos sólidos) o en caldo (cultivos en medio líquido). Este medio contiene carbohidratos, nucleótidos, aminoácidos, vitaminas, extracto de peptona, extracto de levadura y de carne, manganeso, Tw een 80, los cuales son estimulantes del crecimiento de los lactobacillus.
En medio sólido las colonias son pequeñas, redondas y lechosas. El crecimiento de los lactobacillus en medio líquido se caracteriza principalmente por la presencia de un polvo suave, homogéneo y blanco a través de todo el líquido, encontrándose un sedimento cuando las células han dejado de crecer26. Esta característica ayuda al momento de la experimentación a tener un indicio del crecimiento que se está observando del microorganismo, y en cierta forma es un indicativo de la pureza del medio.
4.2 FERMENTACIONES ACIDOLACTICAS
Las fermentaciones ácidolácticas son llevadas a cabo principalmente por bacterias ácido lácticas, principalmente Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus y Leuconostoc, entre otros, que por lo general
2 5 Referencia [17]. Página 113. 2 6 Referencia [18]. Página 128.
son bacterias gram positivas, no esporuladas, no mótiles27 las cuales consiguen la energía necesaria para su crecimiento a partir de la fermentación de carbohidratos produciéndose principalmente ácido láctico28, aunque también es posible encontrar etanol y dióxido de
carbono.
Prácticamente cualquier carbohidrato o alguno de sus derivados pueden hacer las veces de fuente de carbono para la generación de energía por parte de los microorganismos aquí mencionados. Entre ellos se encuentra almidón, celulosa, lactosa, sacarosa, glucosa, fructosa, entre otros29.
Es muy probable encontrar un sinnúmero de bacterias activas en pequeño trozo de vegetal, pero particularmente las bacterias acido lácticas tienen la capacidad de instalarse con prioridad en el vegetal puesto que gracias a la fermentación de la glucosa y posterior transformación en ácido láctico el pH disminuye convirtiendo el medio en el que se encuentran inadecuado para el crecimiento de los otros microorganismos allí presentes.
Luego, el crecimiento de las bacterias ácido lácticas se da en forma continua hasta que la fuente de carbohidratos se agote o las condiciones de temperatura o pH no sean las adecuadas para continuar con su crecimiento.
La ruta Embden-Meyerhof es la ruta glicolítica más común para la degradación de la glucosa en piruvato que se lleva a cabo en la matriz citoplasmática. También conocida como fermentación homoláctica, requiere de dos moléculas de ADP por cada molécula de hexosa y se
2 7 Referencia [18]. Página 529. 2 8 Referencia [19]. Página 109. 2 9 Referencia [20].
producen dos moléculas de piruvato y dos de ATP30, y tal piruvato posteriormente se transforma en ácido láctico.
Glucosa + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ → 2 Piruvato + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+
Ruta Embden-M eyerhof31
La ruta heteroláctica o la ruta de glucosa 6-fosfato en la que por cada mol de hexosa se producen una mol de gas carbónico, una mol de etanol o ácido acético y una mol de ácido láctico32, siendo un producto intermedio
el piruvato.
3 glucosa 6-fosfato + 6NADP+ + 3H2O → 2 fructosa 6-fosfato + gliceraldehído 3-fosfato + 3CO2 + 6NADPH + 6H+
Ruta glucosa 6-fosfato33.
4.3. FERMENTACIONES ANAEROBICAS34
Las fermentaciones anaerobias han sido usadas desde hace mucho tiempo atrás para muchas fermentaciones industriales importantes como son: la producción de etanol mediante las levaduras, preservación ácido láctica de las comidas, y digestión anaeróbica de polisacáridos, proteínas y tratamiento de desechos. 3 0 Referencia [18]. Página 177. 3 1 Referencia [18]. Página 177. 3 2 Referencia [12]. Página 1212. 3 3 Referencia [18]. Página 177. 3 4 Referencia [15]. Páginas 139 - 145
Este último esta cogiendo gran auge en los últimos años ya que esta incrementando el rol de detoxificación de desechos peligrosos y contaminantes a través de digestión anaeróbica.
Los microorganismos anaerobios no utilizan oxígeno molecular en la biosíntesis, ni son capaces de usar oxígeno como un aceptor de electrones, en cambio sí usan varios donores y aceptores de electrones de compuestos orgánicos e inorgánicos para su metabolismo.
Debido a que los microorganismos anaerobios presentan diversos patrones metabólicos, las fermentaciones anaerobias tienen varias propiedades que no se encuentran en los procesos aerobios. Esto hace que existan ventajas y desventajas en las fermentaciones anaerobias.
Ventajas de las fermentaciones anaerobias:
• La producción de producto puede ser más alta
• Se requiere de menor entrada de masa y energía que en los procesos aerobios haciéndolo más económico.
• Los anaerobios catabolizan sustratos complejos y producen productos únicos.
Desventajas de las fermentaciones anaerobias:
• Varias fermentaciones anaeróbicas que envuelven cultivos puros son más propensos a contaminarse, a tener una infección bacteriófaga o a degenerarse espontáneamente.
• Comunidades microbiales requeridas para procesos industriales pueden ser inestables.
• Se necesitan de medios especializados al igual que de instrumentación para cultivar los anaerobios a nivel de laboratorio o industrial.
• Muchos anaerobios son difíciles de manipular genéticamente
• La inhabilidad de los anaerobios a utilizar oxigeno en la biosíntesis limita la producción de algunos metabolitos primarios y de algunos secundarios.
• Los anaerobios pueden formar compuestos nocivos y tóxicos como algunas aminas putrefactas o compuestos de sulfuro.
Dentro de los microorganismos anaerobios se encuentran los que son obligados, los facultativos, o microaerofílicos; los anaerobios obligados tiene una energía del metabolismo que es independiente del oxígeno, y pueden cumplir su ciclo de vida en ausencia de oxígeno; los anaerobios facultativos pueden crecer por fosforilación oxidativa o en ausencia de oxígeno, y los organismos microaerofílicos necesitan de poco oxígeno para crecer.
Durante el proceso de la fermentación se utiliza sustratos orgánicos y aceptores de electrones orgánicos, y se producen sustancias orgánicas reducidas. ATP es obtenido por fosforilación y este es influenciado por los productos finales de la fermentación; en las fermentaciones de bacterias acido lácticas, específicamente las homolácticas, donde se producen 2 moléculas de lactato, se produce 2 moléculas de ATP de hexosa fermentada.
Para lograr una buena fermentación de estos microorganismos anaerobios, es importante tener mucho cuidado durante todo el proceso de aislamiento, cultivación, etc., por ejemplo, es importante usar materiales que sean impermeables al aire evitando así que el oxígeno
llegue a contacto con los microorganismos, usar agentes reductores bajando así el potencia redox, también es posible remover el oxígeno de los gases, usar cámaras anaeróbicas, medios específicos para cultivar anaerobios, y usar aparatos especializados o fermentadores a gran escala que sean adecuados para anaerobios estrictos.
4.4 MELAZA DE CAÑA
La melaza se define como el subproducto o como uno de los “desechos” del proceso de producción de azúcar ya que no se le puede extraer más azúcar para ser cristalizada y tratada por los métodos convencionales de la industria azucarera.
Composición
De tal forma que en la melaza de caña es posible encontrar muchos de los constituyentes de la caña en términos de azúcar, materia orgánica e inorgánica en solución acuosa35. En la tabla 3 se observan los principales componentes de la melaza de caña.
CONSTITUYENTE PRINCIPAL COMPONENTES PORCENTAJES
Agua 17-25
Sacarosa 30-40 Glucosa (dextrosa) 4-9
Fructosa (levulosa) 5-12 Otras sustancias reductoras (como invertidos)
1-4 Azúcar
Total sustancias reductoras (como invertidos)
10-25
Otros carbohidratos
Gomas, almidón, pentosanas, trazas de hexitoles, D-manitol.
Como carbonatos % de ceniza K2O 30-50 CaO 7-15 MgO 2-14 Na2O 0.3-9 R2O3(Fe) 0.4-2.7 SO3 7-27 Cl 12-20 P2O5 0.5-2.5 Cenizas SiO2 e insolubles 1-7 7-15 Proteína cruda 2.5-4.5 Proteína verdadera 0.5-1.5 Aminoácidos (ácido aspártico y glutámico, alguna pirrolidina)
0.3-0.5 Compuestos nitrogenados
Compuestos nitrogenados sin identificar
1.5-3.0
Acidos no nitrogenados
Acido aconítico, cítrico, málico, oxálico, glicólico.
1.5-6.0
Mesacónico, succínico, fumárico,
tartárico.
0.5-1.5
Cera, esteroles y fosfátidos 0.1-1.0
Vitaminas
Vitamina A, biotina, niacina, ácido pantoténico, riboflavina, tiamina.
Cantidades variables
Tabla 3. Composición aproxim ada de la miel de caña (porcentaje en peso de la miel)36
Como se pudo ver en la tabla 3, uno de los principales componentes es la sacarosa, la cual se convierte en glucosa y fructosa por hidrólisis. Los microorganismos de tal forma pueden usar todo este tipo de azúcar para sus procesos metabólicos, así sean complejos.
La composición de la melaza de caña no es siempre constante puesto que varía con la variedad y su grado de madurez, los suelos o el clima. También depende del proceso de cristalización del azúcar en sí ya que si se tiene un proceso de molienda y extracción de la caña de azúcar eficiente, es posible tener niveles bajos de sacarosa en la miel final.
En la melaza de caña es posible encontrar entre un 2 y un 4 % de azúcares reductoras que no son fermentables. Estas azúcares tienen el mismo valor alimenticio para la nutrición animal que los azúcares reductores fermentables pero no pueden cumplir una función fermentativa para microorganismos.
Uno de los compuestos inorgánicos más significativos en la composición de la melaza de caña son el fósforo, el calcio y el potasio, siendo éste último el más influyente en la alimentación animal
Pasando a los compuestos nitrogenados, estos se encuentran en la melaza de caña en pequeñas cantidades entre ellos aminoácidos, amidas y otros compuestos simples de nitrógeno.
Los aminoácidos tienen una pequeña relevancia en la alimentación animal y son los responsables del color característico de la miel final37.
Las vitaminas también tienen pequeña relevancia en la alimentación animal. La biotina está presente en cantidades suficientes de tal forma que tiene gran importancia en los procesos de fermentación.
Las melazas han sido usadas durante mucho tiempo como ingrediente para la alimentación animal debido a su valor energético y sus propiedades físicas. De tal forma que la alimentación animal con melaza de caña ha sido aceptada en todo el mundo, tanto que aproximadamente el 60% de las melazas de caña se usan para tal fin, siendo la materia orgánica total y los azúcares considerados formas importantes de energía en la alimentación animal, mucho más económica que otros productos usados como cereales38.
La alimentación animal con melaza de caña en animales aumenta el consumo de agua, mayores vitaminas, sales minerales y proteínas lo que hace posible que los animales tengan una dieta balanceada favoreciendo sus niveles de nutrición y alimentación.
La melaza de caña es agradable para los animales debido a su sabor y olor con lo que se promueve el apetito del animal, de tal forma que con la melaza se puede mezclar y enmascarar otros productos usados para la alimentación animal de sabores desagradables o simplemente que no tienen un sabor particular como son por ejemplo ciertos cereales, minerales, vitaminas, medicinas o urea. Además debido a sus propiedades físicas, la melaza de caña es comúnmente usada para formar bloques de alimento para animales, lubricando los compuestos que abarca y manteniendo una estructura física estable con lo que el producto se puede almacenar con mayor facilidad.
Es importante introducir a los animales en la alimentación con melazas gradualmente, siendo un 4 % el adecuado para animales jóvenes y para animales mayores y más pesado usar un 10 % de melaza en su alimentación39.
Los microorganismos crecen en sustancias que contengan carbono, hidrógeno y oxígeno, en particular carbohidratos, como por ejemplo el azúcar. El azúcar en las melazas de caña es una fuente económica de carbohidratos. Azúcares reductoras de 6 carbonos son el sustrato de muchos microorganismos para la producción de enzimas, pero pequeñas cantidades de otros materiales como compuestos nitrogenados, trazas y vitaminas son necesarios para que una fermentación sea efectiva.
El nitrógeno presente en la melaza de caña es una forma muy digestiva de nitrógeno que se encuentra disponible y se comprara con la urea como fuente de nitrógeno no proteínico40.
4.5 CRECIMIENTO CINÉTICO DE MICROORGANISMOS
Para los microorganismos, el crecimiento es la respuesta principal a las condiciones fisicoquímicas del medio en el que se encuentran. De tal forma que el crecimiento es el resultado tanto de la replicación como de los cambios en el tamaño de la célula microbiana debido a la extracción de los nutrientes proveídos por el medio y posteriormente son convertidos en compuestos biológicos usados para producción de energía, la síntesis o la formación de productos.
3 9 Referencia [21]. Página 38. 4 0 Referencia [21]. Página 68.
Cuando se transfiere el inóculo al medio de fermentación, los microorganismos toman los nutrientes necesarios para su metabolismo y los convierte en biomasa. Aunque este proceso puede durar de minutos a horas, existen fases características de la curva de crecimiento de un microorganismo, como se muestra en la figura 4:
Figura 4. Fases de crecim iento bacteriano41
4.5.1 Fases de crecimiento microbiano
• Fase lag o de latencia: es la fase siguiente al momento de la inoculación de los microorganismos y se define como el período de adaptación al nuevo medio de cultivo pero la reproducción no se da inmediatamente. En esta fase se presenta síntesis o represión enzimas, formación de nuevo protoplasma (y por lo tanto incremento en el contenido de proteína por célula) y la masa celular se incrementa pero sin que esto quiera decir que hay aumento en el número de células viables, todo gracias a una serie
de cambios químicos en el interior de la célula. El tamaño promedio de la célula se incrementa dos o tres veces, lo cual también se encuentra asociado con el mayor contenido de agua en el interior de la célula. Es posible reducir este tiempo de latencia si el inóculo está fresco, las células numerosas, jóvenes y activas42 y la transferencia del inóculo se hacen hacia un medio similar, ya que las células tienen un complemento ya formado de su metabolismo y enzimas para usar las fuentes de nitrógeno, carbono y vitaminas presentes en el medio, lo que disminuye el tiempo de adaptación.
• Fase de crecimiento logarítmico o exponencial: una vez las células se han adaptado al nuevo medio se empieza a dar la multiplicación y por lo tanto la masa celular y la densidad de células se incrementa de manera exponencial. Hay generación de metabolitos primarios. En esta fase de crecimiento es de vital importancia tener control tanto de la temperatura como de los constituyentes del medio de cultivo, puesto que todo se ve reflejado en la tasa de crecimiento bacteriano. Microorganismos que sean biosintéticamente estrictos, es necesario añadir al medio metabolitos o nutrientes esenciales para tener un crecimiento óptimo.
• Fase estacionaria: la velocidad de crecimiento como la de mortandad se igualan, se estabiliza la concentración celular másica y decrece el número de células viables. En esta fase se empiezan a producir metabolitos secundarios debido a una desregulación metabólica. Esta disminución en el crecimiento se debe principalmente a que la fuente de alimento se ha agotado o la
concentración de productos finales se han vuelto tóxicos o han cambiado el pH y las condiciones del medio.
• Fase de muerte: se presenta una interrupción del balance de la fase estacionaria y la mortandad no se compensa por la formación de nuevas células de ahí que el número de células vivas empieza a decaer.
4.5.2 Factores que afectan el crecimiento
Factores como la temperatura, el pH, concentración de sustrato y producto afectan significativamente los patrones de crecimiento y la formación de productos asociados con el metabolismo del microorganismo.
• Temperatura: Tener un medio de cultivo fuera de los rangos de temperatura óptimos para el crecimiento de las células puede incidir en la muerte de las mismas, así como afectar la formación de producto. Por ejemplo, si la temperatura se encuentra por encima de la temperatura óptima los requerimientos de mantenimiento celular se incrementan y por lo tanto se requiere mayor energía para reparar componentes celulares, transferir nutrientes y productos desde la célula hacia el medio43. Por
encima de los niveles óptimos de temperatura puede presentarse destrucción o desnaturalización de proteínas y por encima puede darse inactivación de proteínas enzimáticas.
• pH: Este factor afecta tanto la actividad de las enzimas como la tasa de crecimiento microbiano. Igualmente, si el pH se encuentra
fuera del rango óptimo, los requerimiento de energía de mantenimiento aumenta, incluso hasta la muerte de las células.
• Concentración de sustrato o producto: Puede presentarse inhibición del crecimiento si hay exceso (limita el crecimiento) o defecto total (no es suficiente para el crecimiento) de sustrato, así como de ciertos productos metabólicos.
4.5.3 Expresiones cinéticas de crecimiento
Es importante aclarar que en este capítulo se mencionan las expresiones matemáticas usadas para la descripción cinética de Lactobacillus y Bifidobacterias asociadas con modelos de crecimiento simple sin inhibición y con inhibición por formación de producto, en este caso, ácido láctico.
El crecimiento microbiano se ve descrito por el término de velocidad específica de crecimiento44 definida como:
dt dX X 1 = µ
Ecuación 1. Velocidad especifica de crecimiento
Donde:
µ = velocidad específica de crecimiento (hr-1)
X = concentración celular (g/L) t = tiempo (horas)
El crecimiento microbiano puede verse descrito por diferentes modelos matemáticos que ya han sido estudiados, como son:
• MODELO DE MONOD SIMPLE45: En este modelo se tiene una
relación clara entre la velocidad específica de crecimiento y la concentración de sustrato, en términos de una cinética de saturación, siendo el sustrato la especie limitante.
S Ks S m + = µ µ
Ecuación 2. Modelo de Monod Simple
En la figura 5 se aprecia claramente el comportamiento de la velocidad de crecimiento respecto a los cambios en la concentración de sustrato.
Figura 5. Efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de crecim iento46
Donde:
µm = Velocidad máxima de crecimiento cuando S >> Ks (hr-1)
4 5 Referencia [25]. Página 169. 4 6 Referencia [26] Página 84
Ks = Constante de saturación o constante de velocidad media (g/L). Se define también como la concentración de sustrato cuando la velocidad de crecimiento es la mitad del valor máximo.
S = Concentración de sustrato (g/L)
El modelo de Monod simple es una expresión empírica que se acomoda satisfactoriamente y es la expresión que se usa comúnmente en modelos de crecimiento microbiano.
La ecuación de Monod describe el crecimiento limitado por la concentración de sustrato y sólo cuando el crecimiento es lento y la densidad de la población celular es baja. Si el consumo de la fuente de carbono es rápido la producción de compuestos tóxicos es más frecuente. De tal forma que en poblaciones de alta densidad, la formación de productos tóxicos es de mayor importancia que en cultivos pequeños
• MODELO CON INHIBIDORES DE CRECIMIENTO47: A altas
concentraciones de sustrato o de producto y en presencia de sustancias inhibidoras en el medio, el crecimiento se ve afectado y por lo tanto la tasa de crecimiento depende de la concentración del inhibidor.
o Inhibición por producto: La inhibición por formación y acumulación de producto puede ser de tipo competitivo o no competitivo.
Inhibición no competitiva: ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ + = Kp P S Ks m 1 1 µ µ
Ecuación 3. Modelo Inhibición no competitiva por form ación de producto
Para describir de manera estequiométrica el crecimiento cinético se han definido diferentes parámetros con el fin de estudiar el rendimiento del sustrato para convertirse bien sea en masa celular o en producto.
Estas son las siguientes:
S X YX S ∆ ∆ − = /
Ecuación 4. Coeficiente de rendimiento de utilización de sustrato para el crecimiento celular
S P YP S ∆ ∆ − = /
Ecuación 5. Coeficiente de rendimiento de utilización de sustrato para la producción
Las células mientras están en el proceso de crecimiento requieren de una energía proveniente del sustrato para cumplir funciones de mantenimiento celular, como por ejemplo reparación de estas células por daños causados por sustancias tóxicas, para mejorar la transferencia de nutrientes y productos desde y hacia las células, entre otras.
Este coeficiente de mantenimiento se define de la siguiente manera:
[
]
X dt dS m= /Ecuación 6. Coeficiente de m antenimiento celular
El tiempo requerido para duplicar la masa microbiana se define como:
µ 2 ln = d T
Ecuación 7. Tiempo de generación celular
La constante de velocidad de muerte Kd se establece de la siguiente forma: t Kd
e
Xs
X
=
*
−Ecuación 8. Constante de velocidad de muerte
• MODELO DE GOMPERTZ
Otro modelo cinético que se puede seguir asociado con las Unidades formadores de colonia es el modelo de Gompertz, este modelo se encuentra definido por la siguiente ecuación:
Donde48:
N = número de microorganismos al tiempo t
A = valor asintótico cuando el tiempo decrece indefinidamente (aproximadamente equivalente al logaritmo decimal del número inicial de microorganismos),
C = representa el incremento en el logaritmo del número de microorganismos cuando el tiempo se incrementa indefinidamente (número de ciclos de crecimiento),
B = es la velocidad de crecimiento máxima relativa al tiempo M y
M = es el tiempo requerido para alcanzar la máxima velocidad de crecimiento.
5. M ATERIALES Y EXPERIMENTCIÓN
5.1 BIFIDOBACTERIAS
Antes de dar comienzo a las fermentaciones fue necesario aislar las cepas de bifidobacterias, y posteriormente ir haciendo repiques cada cierto tiempo adecuado para evitar que estos murieran o que llegaran a contaminarse, el procedimiento a seguir fue el siguiente:
5.1.1 Aislamiento
Para el aislamiento de las bacterias fue necesario tener un agar específico en el que ellas pudieran aislarse, para el caso de las Bifidobacterias su agar ideal es el TPY, por sus siglas en inglés, (Triptone, Peptone, Yeast).
Este tipo de Agar no estaba en venta, ni fue posible conseguirlo para que fuese importado, por esta razón el agar fue realizado con la preparación descrita en el manual de medios microbiológicos de Ronald M. Atlas.
Según este manual, para preparar el agar TPY se deben agregar los siguientes compuestos en las siguientes cantidades por litro:
Com puesto Cantidad (gramos)
Caseína Pancreática 10
Glucosa 5
Extracto de soya pancreático 5
Extracto de levadura 2.5 K2HPO4 2.0 Agar 15 Cysteina.HCl 0.5 MgCl2.6H2O 0.5 ZnSO4.7H2O 0.25 CaCl2 0.15 FeCl3 1 µg Tw een TM 80 1 ml
Tabla 4. M edio TPY49
El extracto de soya pancreático tuvo que ser reemplazado por extracto de carne propuesto en el handbook, debido a que este tardaba casi 2 meses en ser importado, sin embargo esto no presentó ningún inconveniente ya que estos dos extractos tienen un valor nutritivo similar, respecto a la fuente de nitrógeno que poseen.
