Diagnóstico molecular de tuberculosis

Diagnóstico molecular de

tuberculosis

Santiago Atehortúa Muñoz MD Microbiólogo

Hospital Universitario de San Vicente Fundación.

Amplificación y detección de Ácidos nucleicos

Es la amplificación de ADN por PCR

una solución para el diagnóstico de

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

› Replicación de ácidos nucleicos basados en cambios de temperatura mediados por una enzima.

› Consiste en tres pasos: Extracción – Amplificación - Detección

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PCR convencional

Ventajas de los métodos moleculares

›

Pruebas rápidas a partir de muestras clínicas.

›

Diferencian e identifican microorganismos.

›

Detectan microorganismos viables y no viables.

›

Alta sensibilidad y especificidad.

IDENTIFICACIÓN Y DETECCIÓN

GENES DE RESISTENCIA

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• 511.000 casos de TB-MDR (Resistencia INH – RIF).

290 .000 nuevos casos

221 .000 casos previamente tratados para TB

Epidemiología de la resistencia

• De acuerdo a la resistencia a los medicamentos antituberculosos M. tuberculosis puede ser:

MDR XDR

Resistente al menos a Isoniazida y Rifampicina

MDR con resistencia una Quinolona ( Ofloxacina,

Levofloxacina) y algunos de los medicamentos inyectables: Kanamicina, Amikacina o Capreomicina TB monorresistente: Resistente a un solo fármaco.

Bases genéticas de la resistencia en

M. tuberculosis

específicos.

› La mayoría son cambios en un solo nucleótido (mutaciones puntuales).

› > 95% de la resistencia a RIF tienen un único punto de mutación en el gen rpoB

› 70 – 90 % de cepas resistentes a INH se detectan con la

secuenciación de la región promotora inhA, el gen inhA y el gen

katG.

MTBDR Plus – Detección de genes de resistencia

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Rifampicina

Ventajas de la detección rápida de resistencia

› Iniciar un tratamiento eficaz desde el principio.

› Reducir los periodos de contagio en los casos MDR hasta por 8 semanas

› Mejorar la respuesta clínica en los pacientes

› En EEUU se estima que la prevención de un solo caso de TB MDR le ahorra al sistema mas de $ 250.000

Pruebas de biología molecular para diagnóstico de

tuberculosis y detección de genes de resistencia

disponibles

Muestras baciloscopia negativas

1. Licuefacción del esputo 2. 2ml muestra al cartucho. 3.Cartucho se inserta dentro plataforma 4. Muestra automáticamente es lavada y filtrada

5. Lisis por ultrasonido filtro-captura organismos para liberar el ADN 6. amplificación y detección en tiempo real 7. Impresión de resultados

PRUEBA genexpert MTB/rif

Tiempo del resultado, 1 hora y 45min

M. tuberculosis

positivo

Resultados

MTBDR

plus

S

E

N

S

I

B

L

E

R

E

S

I

S

T

E

N

T

E

Oscar Iván Quirós Gómez, Santiago Atehortúa Muñoz, Gloria Elena Durango, Ana Milena Herrera, Sigifredo Ospina Ospina.

HUSVP – CES 2010

Utilidad de una técnica de biología molecular para el

diagnóstico de tuberculosis pulmonar. Hospital Universitario San Vicente de Paúl 2010

Pruebas de sensibilidad determinadas por PCR

n %

Sensible 10 50

Resistente RIF + INH 3 15

Indeterminada 7 35 Total 20 100 Sensibilidad: 86.7 % Especificidad: 93.7 % VPP: 72.2% VPN: 97.4%

sensibilidad en muestras con baciloscopia positiva fue 100% y de 60% en muestras con baciloscopia negativa

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Anyplex™ II MTB / MDR / XDR Detection

TOCE ™ es una nueva tecnología de lectura en tiempo real que se basa en el análisis de temperatura de fusión.

Anyplex™ II MTB / MDR / XDR Detection

› Permite la amplificación simultánea y la detección de secuencias diana de M. tuberculosis y genes de resistencia.

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Anyplex MTBDRplus Xpert

Principio PCR TR multiplex de dos pasos.

Hibridación inversa PCR en Tiempo real

Resultado final MTBC, RIF, INH, Quinolonas, Aminogl

MTBC, RIF, INH MTBC, RIF

Tiempo 3.5 h 5.35 h 2 h

Infraestructura

requerida Sistema abierto (3 áreas separadas) Sistema abierto (3 áreas separadas) Sistema cerrado (área control temperatura)

Sensibilidad global (cultivo positivo MTB) 65.5% 70.9% 89.1% Baciloscopia Positiva 91.3% 100% 100% Baciloscopia Negativa 46.2% 46.2% 80.8%

Xpert: Fue superior en muestras BK negativas.

Interpretación pruebas moleculares

M. tuberculosis

› CDC (Centros de Control y Prevención de Enfermedades):

Directo positivo Prueba molecular positiva Diagnóstico confirmado TB pulmonar. Directo positivo Prueba molecular negativa Buscar inhibidores, otras Mycobacterias

Directo negativo Alta sospecha clínica Prueba molecular (dx presuntivo) Directo negativo Baja sospecha clínica Prueba molecular no recomendada

Limitaciones de las pruebas moleculares

›

Falsos Positivos:

›

Contaminación de la muestra.

›

Mal diseño de

primers.

›

Dx antiguo de Tb tratados

›

Falsos negativos:

›

Degradación del material genético.

›

Mala preparación, transporte y almacenamiento de la

muestra.

›

Problemas con los reactivos.

›

Carga bacilar baja, elección inadecuada de la técnica.

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Discrepancias en las pruebas moleculares comparada

con pruebas convencionales de susceptibilidad

Prueba molecular

Prueba

convencional

Interpretación

- Mutaciones codificadas por fuera región evaluada. - Otros mecanismos de

resistencia.

- Bajo nivel de resistencia. - Poblaciones mixtas.

En quiénes pueden estar indicadas las pruebas?

› Paciente con HIV ó SIDA.

› Inmunosuprimidos (Esteroides, anti TNF)

› Sospecha de fracaso, recaída o reingreso por abandono.

› Sospecha de Tuberculosis extrapulmonar

› Contacto de paciente con multi-resistencia

› Pacientes pediátricos

› Personas privada de la libertad, indigentes y personal de la salud.

› PACIENTES CON ALTA SOSPECHA CLÍNICA Y SIN CONFIRMACIÓN MICROBIOLÓGICA.

› La biología molecular es una buena herramienta en el apoyo diagnóstico de la Tuberculosis.

› Gran impacto para el control de la tuberculosis en especial la MDR.

› Los resultados deben interpretarse siempre en conjunto con las características clínicas, epidemiológicas y de laboratorio.

Conclusiones

OPS/OMS hace especial énfasis en que NINGUNO de estos

métodos reemplaza los que hasta el día de hoy son considerados de referencia (BK, cultivo, PSF convencionales)

GRACIAS.

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