ANÁLISIS MOLECULAR EN FIBROBLASTOS PROCEDENTES DE TEJIDO CONECTIVO GINGIVAL

ANÁLISIS MOLECULAR EN FIBROBLASTOS

PROCEDENTES DE TEJIDO CONECTIVO

GINGIVAL

Albert Ramírez*_{, Jaume Miranda}*_,

Pepita Giménez-Bonafé¤ _{y Carles Mendieta}*

Departament d'Odontostomatologia*_.

Departament de Ciències Fisiològiques ¤

_________________________________________________________________________________ • Fibrosis tisular (FT) es un resultado histopatológico ocasional en la respuesta reparativa a una lesión, consistente en un exceso de fibras colágenas.

Diferentes causas: fármacos, infecciosas, tóxicas,

radiaciones, genéticas, reacciones autoinmunes, mecánicas,…

• Inflamación local -- elementos de la Matriz Extracelular (ECM) se obtiene :

resolución, inflamación crónica o FT.

• Agente lesivo -fármaco- : citocinas y factores de crecimiento (GF) pro-inflamatorios como mediadores

resultados histológicos similares.

________________________________________________________________________

• La FT se puede producir en diversos órganos de la

economía: hígado, riñón, pulmón, corazón, páncreas…

• En la encía, consecuencia clínica es el

Agrandamiento Gingival (AG): Dismorfismo de la encía

queratinizada.

• Distintos tipos, AG inducido por fármacos. Otras causas:

placa bacteriana, inflamación crónica

predisposición genética: fibroblastos fenotipo

secretorio y profibrótico

manifestaciones gingivales afecciones sistémicas:

_____________________________________________________________________________________________

• Exámen histológico, alteración característica:

-epitelio: acantótico escamoso y paraqueratinizado crestas epiteliales interdigitadas con … -conectivo: aumento densidad fibras colágenas

________________________________________________________________________

• FT en AG es consecuencia de factores:

-Liberación anormal de mediadores de inflamación.

-Cambios en la proporción GF/citocina efecto celular alto. -Fenotipo celular miofibroblástico.

• AG se asocia a actividad reducida y expresión metaloproteinasas (MMP) de la matriz.

• Fibroblasto se diferencia a miofibroblasto por acción de Factor de crecimiento tumoral (TGF-β),

señales paracrinas céls. inflamatorias, lipoproteínas,

DNA bacteriano

(Wynn J Clin Invest 2007)

• Secreta GF, en estrés capacidad contráctil, expresión proteica de ECM por integrinas.

_________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

OBJETIVOS

1-Determinar si cultivos de fibroblastos de encía humana son

sensibles a la acción de fármacos inductores de AG.

2-Observar el efecto de estos fármacos en cultivos primarios

de fibroblastos procedentes de las muestras examinadas

___________________________________________________________________________________

3-Cuantificar si hay efecto farmacológico en el RNAm del

(TGFß), del colágeno y de la colagenasa.

4-Observar si hay efecto farmacológico en la síntesis del

colágeno y del TGFß.

_____________________________________________________________________________________________ DNA inf genética RNA m RNA m TRANSCRIPCIÓN NÚCLEO RNA m PROTEÍNAS Colágeno, TGF, MMP TRADUCCIÓN m nuclear ribosomas

____________________________________________________________________________________________

• Estudio histológico

2 muestras gingivales caso y control

--1 y 2: Sensibilidad a los fármacos y efecto en su viabilidad

• Establecimiento de cultivos primarios

• Pruebas de viabilidad:

1/Aplicación de los fármacos en los cultivos, 24h:

2000 cel/100µl medio 8 dosis progresivas/fármaco:

Fenitoína (Ft) Nifedipina (Nf) Ciclosporina (CsA)

2/Aplicación del MTT, 4h

10 µl sal/100µl

3/Lectura por reducción del MTT

MATERIAL Y MÉTODO

_____________________________________________________________________________________________

RESULTADOS VIABILIDAD CELULAR

--1 y 2: Sensibilidad a los fármacos y efecto en su viabilidad

• Encía sana -a 24h-       Fenitoína  0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 30 35        Dosis μM %   Via bilida d       Nifedipina  0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Dosis nM %   V ia bilida d      Nifedipina  0 20 40 60 80 100 120 0 0,1 0,3 0,6 1 3 6 10 13 Dosis μM %   V ia b ilid ad Ciclosporina A  0 20 40 60 80 100 0 100 200 300 400 500 600 700 Dosis ng/ml %   Via bilida d

_____________________________________________________________________________________________

RESULTADOS VIABILIDAD CELULAR

--1 y 2: Sensibilidad a los fármacos y efecto en su viabilidad

ANÁLISIS MOLECULAR EN FIBROBLASTOS PROCEDENTES DE TEJIDO CONECTIVO GINGIVAL 15 _____________________________________________________________________________________________ DNA inf genética RNA m RNA m TRANSCRIPCIÓN NÚCLEO RNA m PROTEÍNAS Colágeno, TGF, MMP TRADUCCIÓN m nuclear ribosomas C-DNA RT-PCR RT-PCR RT-PCR

_____________________________________________________________________________________________

MATERIAL Y MÉTODO

--3: Cuantificar RNAm de TGFß, colágeno y colagenasa

• Expresión del RNAm de las proteínas mediante PCR* a tiempo real (Real time-PCR)

106 fibroblastos + fármacos (11 dosis progresivas 72h)

EXTRACCIÓN DEL RNA

cDNA PCR cuantitativa expresión RNAm

colágeno TGFβ

_________________________________________________________________ RESULTADOS TRANSCRIPCIÓN --3: Cuantificar RNAm de TGFß Nº veces de  expresión/ control

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

tg

f

Ct

tg

f

Ft

nM

D1

tg

f

Ft

nM

D2

tg

f

Ft

µM

D1

tg

f

Nf

nM

D1

tg

f

Nf

nM

D2

tg

f

Nf

µM

D1

tg

f

Cs

D1

tg

f

Cs

D2

____________________________________________________________________________________________ 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 col   Ct col   Ft   nM   D1 col   Ft   nM   D2 col   Ft   µM   D1 col   Nf   nM   D1 col   Nf   nM   D2 col   Nf   µM   D1 col   Cs   D1 col   Cs   D2 Nº veces   expresión/ control * = p<0,05 RESULTADOS TRANSCRIPCIÓN

--3: Cuantificar RNAm de colágeno

*

*

*

_____________________________________________________________________________________________

--3: Cuantificar RNAm de colagenasa Nº veces expresión/ control 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00

mmp

Ct

mmp

Ft

nM

D1

mmp

Ft

nM

D2

mmp

Ft

µM

D1

mmp

Nf

nM

D1

mmp

Nf

nM

D2

mmp

Nf

µM

D1

mmp

Cs

D1

mmp

Cs

D2

_____________________________________________________________________________________________

MATERIALY MÉTODO

--4: Comprobar síntesis colágeno y TGFß

• Expresión a nivel de proteína de colágeno y TGFß

2x106 _{fibroblastos + fármacos: 10 dosis progresivas* 72h}

EXTRACCIÓN PROTEÍNAS TOTALES ELECTROFORESIS

IDENTIFICACIÓN PROTEÍNAS Anticuerpos

-Western-Blott-_____________________________________________________________________________________________

Ft Nf Cs

15 35 15 35 40 80 1 13 300 700

Ct nM nM μM μM nM nM μM μM ng/ml ng/ml

RESULTADOS TRADUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________

CONCLUSIONES

• Los fibroblastos gingivales de cultivos primarios son sensibles a fármacos inductores de AG -Ft, Nf, CsA-.

• Estos fármacos no han provocado hiperplasia gingival por proliferación celular de fibroblastos.

• Se ha obtenido un incremento significativo de la transcripción del TGFß, colágeno y colagenasa.

• No se ha producido un incremento de la traducción del colágeno, con repercusión en la matriz extracelular por la acción de los fármacos inductores.

_____________________________________________________________________________________________________

• Gracias por su atención

Albert Ramírez*_{, Jaume Miranda}*_,

Pepita Giménez-Bonafé¤ _{y Carles Mendieta}*

Departament d'Odontostomatologia*_.

Departament de Ciències Fisiològiques ¤