Fecha emisión: 06-10-2010 Revisión: 0

1. OBJETIVO

Determinar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) de Listeria monocytogenes en matrices de alimentos.

2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

Aplicable a muestras correspondientes a matrices de alimentos.

3. FUNDAMENTO

Listeriosis es una de las enfermedades más importantes transmitidas por los alimentos.

Conforme a su comportamiento en matrices alimentarias, se definen criterios microbiológicos diferentes para: alimentos listos para el consumo (LPC), en los que no puede crecer L.

monocytogenes y alimentos LPC, en los que si puede crecer L. monocytogenes.

El crecimiento de L. monocytogenes puede ser controlado, con factores tales como, un pH menor a 4,4; una actividad de agua (a

) menor a 0,92; o una combinación de ambos factores, un pH menor de 5.0 con una a

menor de 0,94, a través de la congelación, siempre que esta condición se mantenga durante todo el período, hasta antes de ser consumido, o por la refrigeración por un lapso de menos de 5 días.

Los métodos convencionales siguen siendo el patrón de oro con el que se comparan los restantes métodos.

Este método ISO requiere 6 etapas sucesivas:

- Preparación suspensión inicial - Resucitación por 1 hora a 20º C

- Siembra en placa en superficie en duplicado en medios de cultivo selectivos.

- Incubación a de las placas a 37º C y examen a las 24 y 48 h.

- Confirmación de las colonias presuntivas de L. monocytogenes

- A partir de las colonias confirmadas, calcular el número de L. monocytogenes por gramo o por mililitro de muestra.

4. REFERENCIAS

4.1 ISO 11290-2: 01/07/1998 “Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes - Part 2:

Enumeration method”.

4.2 ISO 6887 “Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Preparation of test

samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination --

Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products,

meat and meat products, and fish and fishery products”o cualquier norma estándar

apropiada para los productos involucrados).

4.3 ISO 11290-2: 1998 Enmienda 1: 15/10/2004 “Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes- Part 2: Enumeration method”.

4.4 ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- General requirements and guidance for microbiological examinations.

4.5 PRT-712.03-086 “Procedimiento para identificación bioquímica de cepas de Listeria monocytogenes aisladas en alimentos y ambiente”.

5. TERMINOLOGÍA No aplica.

6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 Equipos

6.1.1 Autoclave

6.1.2 Horno de secado regulado a 25 ºC ± 1 ºC 6.1.3 Horno de secado regulado a 50 ºC ± 1 ºC 6.1.4 Incubadora regulada a 37 ºC ± 1 ºC

6.1.5 Incubadora regulada a 20 ºC ± 1 ºC (opcional) 6.1.6 Baño de agua regulado a 44 a 47 ºC

6.1.7 pH-metro capaz de realizar lecturas lo más cercano a 0,01 unidad de pH a 25 ºC, permitiendo medidas de precisión ± 0,1 unidad de pH.

6.1.8 Microscopio preferiblemente con contraste de fase 6.1.9 Equipo para prueba de iluminación de Henry (opcional)

6.2 Materiales e Insumos

6.2.1 Asas de platino/iridio o níquel/cromo. Pipeta Pasteur o asas desechables 6.2.2 Rastrillos estériles

6.2.3 Pipetas graduadas en divisiones de 0,1 mL de 1mL y graduadas en divisiones 0,5 mL de 10 mL.

6.2.4 Tubos y frascos de capacidad suficiente para los medios de cultivo 6.2.5 Placas de Petri de 90 mm y 140 mm de diámetro

6.2.6 Agar ALOA (Agar Listeria Ottaviani–Agosti) o medio preparado completo

comercial.

6.2.7 Agar soya triptona extracto de levadura (TSYEA)

6.2.8 Agua peptona tamponada pH 7,0 ± 0,2 o caldo base ½ Fraser (media concentración)

6.2.9 Agar sangre de cordero

6.2.10 Cepa β- hemolítica de S. aureus ATCC 25923 o NCTC 1803 6.2.11 Cepa R. equi ATCC 6939 o NCTC 1621

6.2.12 Cepa L. monocytogenes NCTC 11994

6.2.13 Cepa L. innocua ATCC 33090 como control negativo en agar ALOA 6.2.14 Cepa Lactobacillo NCTC 12712

6.2.15 Cepa Streptococcus NCTC 10353 6.2.16 Ácido nalidíxico

6.2.17 Solución de ceftazidima 6.2.18 Solución de polimixina B 6.2.19 Solución de cicloheximida 6.2.20 Solución de anfotericina B 6.2.21 Suplemento L-α fosfatidilinositol

7. DESARROLLO 7.1 Muestreo:

7.1.1 No forma parte de este procedimiento. Si no hay una normativa específica sobre el muestreo de los productos involucrados, es recomendable que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre esta materia.

7.2 Preparación de las muestras

7.2.1 Preparar las muestras conforme con la apropiada normativa vigente estándar.

7.3 Procedimiento

7.3.1 Consideraciones: la elección de la temperatura de incubación está dada entre 35 ºC o 37 ºC, esta temperatura deberá ser acordada por las partes y registrada en el informe de ensayo.

7.3.2 Porción para el ensayo, suspensión inicial y diluciones:

7.3.2.1 Ver PRT-712.01-002 “Procedimiento Procesamiento de las muestras de alimentos y agua para análisis microbiológico”, (ISO 6887 o cualquier norma estándar apropiada para los productos involucrados).

7.3.2.2 Utilizar como diluyente agua peptonada tamponada o caldo base ½ Fraser (media concentración).

7.3.2.3 El caldo base ½ Fraser sin la adición de los agentes selectivos puede ser usado como diluyente para muestras de alimentos cuando ambos métodos detección (ISO 11290-1) y enumeración son llevado a cabo en la misma muestra. Este procedimiento evita la necesidad de preparar dos suspensiones iniciales, los agentes selectivos son añadidos a la suspensión una vez que la porción de ensayo para recuento se haya utilizado. El uso de este procedimiento debe ser indicado en el informe de resultado.

7.3.2.4 Dejar reposar la suspensión inicial por 1 h ± 5 minutos a 20 ºC ± 2 ºC para resucitar los microorganismos estresados.

7.3.2.5 Si se utiliza una serie de diluciones, prepararla después de la reanimación.

7.3.3 Inoculación e Incubación

7.3.3.1 Transferir con pipeta estéril 0,1mL de la suspensión inicial a dos placas de agar ALOA (placas previamente secadas en incubadora).

7.3.3.2 Repetir este procedimiento usando diluciones decimales consecutivas si es necesario.

7.3.3.3 Cuando para ciertos productos es necesario estimar bajos números de L.

monocytogenes, el límite de enumeración puede ser reducido por un factor de 10 examinado 1,0 mL de la suspensión inicial. Distribuya el inóculo de 1 mL sobre la superficie del agar en una placa de Petri grande (140 mm) o sobre la superficie del agar en placa de Petri pequeña (90 mm) pero en 3 porciones y disemine con rastrillo estéril. En ambos casos debe preparar duplicados de siembra usando 2 placas de 140 mm ó 6 en el caso de usar placas de 90 mm.

7.3.3.4 Cuidadosamente esparcir o diseminar el inóculo lo más pronto posible sobre la superficie del agar sin tocar los bordes de la placa con el rastrillo. Utilice un rastrillo estéril por cada placa.

7.3.3.5 Dejar las placas cerradas a temperatura ambiente por 15 minutos para que el inóculo sea absorbido en el agar.

7.3.3.6 Invertir las placas y colocar en la incubadora a 37 ºC ± 1 ºC por 24 h y una incubación adicional de 18 a 24 h.

7.3.3.7 Incubar las placas de agar ALOA en condiciones aeróbicas.

7.3.4 Enumeración

7.3.4.1 Después de la incubación por 24 horas si el desarrollo de las colonias es leve o no se observa desarrollo realizar una incubación adicional de 18 h a 24 h ± 3 horas.

7.3.4.2 Observar la presencia de colonias presuntivas de Listeria spp.

7.3.4.3 Las colonias en agar cromogénico (ALOA, Chromagar) para Listeria spp dentro de las 24 h ± 3 horas son pequeñas y verdes debido a la actividad de β- glucosidasa que produce cambio de color verde - azulado en las colonias.

7.3.4.4 Otros organismos los cuales también poseen la enzima β-glucosidasa tales como enterococos, son inhibidos por los agentes selectivos que posee el medio (sulfato de polimixina B, cicloheximida, ceftazidima, ácido nalidíxico).

7.3.4.5 Las especies patógenas como L. monocytogenes y L ivanovii son diferenciadas por la actividad de la fosfolipasa C, específica en el fosfatidil-inositol. Esta fosfolipasa (enzima: lecitinasa) hidroliza la lecitina en el medio produciendo un halo opaco alrededor de las colonias.

7.3.4.6 Las colonias de L. monocytogenes son azul-verdosa con un halo opaco. Las colonias de Listeria spp son azul- verdosas sin halo.

7.3.4.7 Algunas cepas de L monocytogenes pueden mostrar un halo muy débil (no halo) en casos de estrés, en particular de estrés ácido.

7.3.4.8 Algunas cepas de L. monocytogenes son caracterizadas por una lenta o retardada actividad de la fosfolipasa. Tales bacterias son detectadas cuando la duración total de incubación es mayor, por ejemplo 4 días.

7.3.4.9 Contar todas las colonias presuntivas o sospechosas de Listeria spp en cada placa que contiene menos de 150 de colonias características y no características.

7.3.5 Confirmación de Listeria spp.

7.3.5.1 Selección de colonias para confirmación

7.3.5.1.1 Después del período de incubación conservar las placas que contienen menos de 150 colonias presuntivas de Listeria spp, de todas las diluciones y si es posible de dos diluciones sucesivas.

7.3.5.1.2 Seleccionar 5 de las colonias presuntivas o sospechosas de cada placa retenida. Si en la placa hay menos de 5 colonias presuntivas seleccione para confirmación todas las existentes.

7.3.5.1.3 Traspasar y sembrar por aislamiento las colonias seleccionadas sobre la superficie seca de agar soya triptona extracto de levadura (TSYEA), de manera que se obtengan colonias bien aisladas.

7.3.5.1.4 Incubar las placas sembradas a 35 a 37 ºC ± 1ºC por 18 a 24 horas o hasta que el

desarrollo sea satisfactorio.

7.3.5.1.5 Las colonias típicas son de 1 mm a 2 mm de diámetro, convexas, sin color y opacas con bordes regulares o enteros.

7.3.5.1.6 Si las colonias no están bien separadas traspase una colonia típica a otra placa de agar TSYEA.

7.3.5.1.7 Realizar las pruebas confirmativas a partir de cultivo puro en agar TSYEA.

7.3.5.1.8 En la prueba de iluminación de Henry a partir del cultivo puro en agar TSYEA, las colonias de Listeria spp aparecen azuladas con una superficie granular.

7.3.6 Pruebas confirmativas

7.3.6.1 Aplicar el procedimiento PRT-712.03-086 “Procedimiento para identificación bioquímica de cepas de Listeria monocytogenes aisladas en alimentos y ambiente”.

7.3.7 Confirmación definitiva

7.3.7.1 Las cepas que han sido consideradas como L. monocytogenes pueden ser enviadas a un centro de referencia para estudio serológico, tipificación lisogénica o un confiable alternativo de tipificación molecular. El informe debe ir acompañado por toda la información posible de la cepa.

7.4 Expresión de los resultados

7.4.1 Recuento de colonias de L. monocytogenes

7.4.1.1 Calcule para cada una de las placas el número de colonias α de L. monocytogenes presentes, usando la siguiente fórmula:

α = _b _ x C A

Donde:

b : es el número de colonias confirmadas por el criterio de identificación A : es el número de colonias sometidas a confirmación

C : es el número total de colonias características en la placa.

Redondear α a un número entero.

7.4.1.2 Las que contienen menos de 150 colonias de L. monocytogenes, una de las cuales contiene al menos 15 colonias de L. monocytogenes.

7.4.1.3 Calcular el número N de L. monocytogenes en 1 mL o 1 g de producto, usando la

fórmula siguiente:

N= ____∑α_______

V (n

+ 0,1 n

) d

Donde:

∑α : es la suma de colonias de L. monocytogenes calculada después de la confirmación de todas las placas seleccionadas de las dos diluciones consecutivas, una de las cuales contiene al menos 15 colonias identificadas.

V: es el volumen en mL del inóculo aplicado en las placas

n

: es el número de placas de la primera dilución

n

: es el número de placas de la segunda dilución

d : es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución seleccionada

7.4.1.4 Redondear los resultados obtenidos a dos cifras significativas (Ver ISO 7218 para un ejemplo).

7.4.1.5 Tomar como resultado el número de L. monocytogenes por mililitro (productos líquidos) o por gramo (otros productos), expresado como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10 apropiada.

7.4.2 Estimación de números pequeños

7.4.2.1 Si las dos placas, en el nivel de la suspensión inicial, contiene menos de 15 colonias de L. monocytogenes calcule el número de colonias confirmadas en cada placa, usando la fórmula dada en el numeral 7.4.2.3.

7.4.2.2 Calcular la media aritmética “y” de las colonias contadas en dos placas.

7.4.2.3 Expresar los resultados como sigue:

El número estimado de L. monocytogenes por gramo o mililitro: N

= __ y___

d x V

Donde:

d: es el factor de dilución de la suspensión inicial

V: es el volumen del inóculo en cada placa

7.4.2.4 Si dos de las placas del nivel de la suspensión inicial no contienen ninguna colonia, exprese el resultado como sigue:

Menos que ___1___ L. monocytogenes por gramo o mililitro

d x V Donde:

d : es el factor de dilución de la suspensión inicial V: es el volumen del inóculo en cada placa

7.4.3 Precisión 7.4.3.1 Ver ISO 7218.

7.5 Control de calidad de los medios de cultivo

7.5.1 Comprobar la capacidad de los medios de cultivo para el desarrollo de L.

monocytogenes como sigue:

7.5.1.1 Introducir una dilución del cultivo de una cepa de referencia recientemente aislada de L. monocytogenes y de una cepa como control negativo (ejemplo:

Lactobacillo, Streptococcus) en un frasco o contenedor con el medio de enriquecimiento primario selectivo.

7.5.1.2 Añadir 10 a 100 ufc de L. monocytogenes.

7.5.1.3 Realizar la misma operación para las cepas del control negativo por frasco.

7.5.2 Proceder con los frascos de controles como un cultivo de prueba o ensayo para demostrar que el cultivo positivo es recuperado.

7.6 Informe

7.6.1 El informe deberá especificar el método utilizado, la temperatura de incubación y los resultados obtenidos. Esto también es válido para todos los detalles que no se especifican en esta parte del ISO 11290 o consideradas como opcional, junto con los detalles de cualquier incidente que puede haber influenciado el resultado.

7.6.2 El informe deberá contener toda la información necesaria para la completa identificación de la muestra.

8. REGISTROS

8.1 Registro Resultados análisis Listeria monocytogenes

9. ANEXOS

Anexo Nº 1: Diagrama del procedimiento (Normativo)

Anexo Nº 2: Composición y preparación de medios de cultivo y reactivos. (Normativo) Anexo Nº 3: Diagrama iluminación de Henry (Informativo)

Anexo Nº 4: Características bioquímicas Listeria spp

Anexo Nº 5: “Registro Resultados análisis Listeria monocytogenes”, RG-712.00-077

ANEXO Nº 1

Diagrama del procedimiento (Normativo)

Porción para el ensayo (x g o x mL)

Diluyente para la preparación de la suspensión inicial (agua peptonada tamponada) o medio base para ½ caldo Fraser (9 partes diluyente x g o 9 partes de diluyente x mL)

Resucitación por 1 hora ± 5 minutos a 20 ºC ± 2 ºC

Inoculación en superficie de agar ALOA

Incubación a 37ºC ± 1 hora por 24 h a 48h

Identificación y enumeración de Listeria spp

Confirmación del género Listeria spp:

•

Inoculación en agar TSYEA e incubación a 35ºC o 37ºC ± 1ºC por 18 a 24 horas

•

Prueba de la Catalasa

•

Tinción GRAM

•

Test de motilidad (si es necesario)

Confirmación Listeria monocytogenes:

•

Prueba de la hemólisis.

•

Utilización carbohidratos

Se puede reemplazar por API Listeria

•

Test de CAMP

ANEXO Nº 2

Composición y preparación de medios de cultivo y reactivos (Normativo)

1. Agua peptonada tamponada 1.1. Composición:

Digerido enzimático de tejido animal....10,0 g Na Cl………..5,0 g Na

HPO

x 12 H

O...9,0 g KH

PO

1,5 g Agua...1 L

1.2. Preparación:

- Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario.

- Ajustar a pH (medido con pH- metro), si es necesario de modo que después de la esterilización éste sea 7,0 ± 0,2 a 25ºC.

- Dispensar el medio en frascos o contenedor de capacidad adecuada para obtener porciones apropiadas para el ensayo.

- Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ºC.

2. Medio base para caldo ½ Fraser con citrato de amonio hierro (III) 2.1 Medio base para caldo ½ Fraser

2.1.1 Composición

Digerido enzimático de caseína...……5,0 g Digerido enzimático de tejido animal....5,0 g Extracto de malta………5,0 g Extracto de levadura ………..5,0 g Na Cl...20,0 g Na

HPO

x 2 H

O...12,0 g KH

PO

...1,35 g Esculina...1,0 g Agua...1 L 2.1.3 Preparación

- Disolver en agua los componentes o la base completa deshidratada por calentamiento si es necesario.

- Ajustar a pH si es necesario de modo que después de la esterilización éste sea 7,2 ± 0,2 a

25 ºC.

- Dispensar el medio en frascos o contenedor de capacidad adecuada para obtener porciones apropiadas para el ensayo.

- Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ºC.

2.2 Solución de citrato de amonio hierro (III):

2.2.1 Composición

Citrato de amonio hierro (III) ………5 g Agua:………100 mL 2.2.2 Preparación

- Disolver el citrato de amonio hierro (III) en el agua.

- Esterilizar por filtración

2.2.3 Preparación del medio completo

Inmediatamente antes del uso, añada 1,0 mL de la solución de citrato de amonio hierro (III) a cada 100 mL de medio base del caldo ½ Fraser.

3. Agar Listeria según Ottaviani y Agosti (ALOA

)

3.1 Medio Base 3.1.1 Composición

Digerido enzimático de tejido animal……….18 g Digerido enzimático de caseína………6 g Extracto de levadura ……….10 g Piruvato de sodio………..2 g Glucosa……….2 g Glicerofosfato Magnesio……….1 g Sulfato de Magnesio (anhidro)...0,5 g Cloruro de Sodio... 5 g Cloruro de litio...10 g Di-Sodio Hidrógeno Fosfato (anhidro)………..2,5 g 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranósido...0,05 g Agar...12 a 18 g

Agua...930 mL

a

Dependiendo de la consistencia del agar

b

925 mL si es usada Amfotericina B (ver 3.5.2)

1

ALOA es un ejemplo de la disponibilidad del medio comercialmente. Esta información es

otorgada para la conveniencia de los usuarios de esta parte de la ISO 11290 y no constituye

un respaldo de la ISO de este producto. El uso de otro medio con la misma formulación es permitido.

3.1.2 Preparación

- Disolver en agua por ebullición los componentes deshidratados o la base deshidratada completa.

- Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC.

- Ajustar pH, si es necesario, de manera que después de la esterilización se de 7,2 ± 0,2.

3.2 Solución ácido nalidíxico 3.2.1 Composición

Acido nalidíxico sal de sódio... 0,02 g Hidróxido de sodio... 5 mL

3.2.2 Preparación

- Disolver el ácido nalidíxico sal de sodio en 5 mL del hidróxido de sodio y esterilizar por filtración.

3.3 Solución de ceftazidima 3.3.1 Composición

Ceftazidima... 0,02 g Agua………... 5 mL

3.3.2 Preparación

- Disolver la ceftazidima en 5 mL de agua y esterilizar por filtro de membrana de 0,45 µm.

3.4 Solución de Polimixina B 3.4.1 Composición

Sulfato de polimixina B...76700 IU Agua………... …5 mL

3.4.2 Preparación

- Disolver la polimixina B en 5 mL de agua.

- Esterilizar por filtración a través de filtro de membrana de 0,45 µm.

3.5 Suplemento de Antibiótico 3.5.1 Solución de cicloheximida 3.5.1.1 Composición

Cicloheximida ...0,05 g Etanol………2,5 mL Agua………...2,5 mL

3.5.1.2 Preparación

- Disolver la cicloheximida en 2,5 mL de etanol y luego añadir 2,5 mL de agua.

- Esterilizar por filtración a través de filtro de membrana de 0,45 µm.

3.5.2 Solución de Anfotericina B 3.5.2.1 Composición

Anfotericina B ...0,01 g HCl (1 mol/L)………2,5 mL Dimetilformamida (DMF)………...2,5 mL 3.5.2.2 Preparación

- Disolver la anfotericina en la solución HCl/DMF.

- Esterilizar por filtración a través de filtro de membrana de 0,45 µm.

- Precaución: la solución HCl/DMF es tóxica, manipular con cuidado.

3.6 Suplemento 3.6.1 Preparación

- Disolver 2 g de L- α-fosfatidilinositol (Sigma P 6636

) en 50 mL de agua fría.

- Revolver por al rededor de 30 minutos hasta obtener una suspensión homogénea.

- Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos y enfriar entre 48ºC a 50ºC.

- Nota:

P6636 es el nombre comercial del producto suministrado por Sigma. Esta información es otorgada para la conveniencia de los usuarios de esta parte de la ISO 11290 y no constituye un respaldo de la ISO de este producto. Productos equivalentes pueden ser usados si ellos pueden demostrar los mismos resultados.

3.7 Medio completo 3.7.1 Composición

Agar base……….930 mL

Solución Acido Nalidíxico...5 mL

Solución Ceftazidima...5 mL

Solución Polimixina B ………...5 mL

Solución de Cicloheximida ………5 mL

o Solución de Anfotericina B……….10 mL

Suplemento...……….50 mL

a

925 mL si la solución de Anfotericina es usada 3.7.2 Preparación

- Añadir las soluciones al agar base fundido a 50ºC, mezclando bien entre cada adición.

- El pH del medio completo debe ser de 7,2 ± 0,2 a 25ºC.

- El medio debe ser homogéneamente opaco.

3.7.3 Preparación de placas de agar

- Dispensar a cada placa 15 mL a 20 mL del medio fresco preparado completo, luego dejar solidificar.

4. Medio de cultivo sólido: Agar triptona soya extracto de levadura: (TSYEA) 4.1 Composición:

Digerido enzimático de caseína………17,0 g Digerido enzimático de soja...3,0 g Na Cl………...5,0 g K

HPO

………..2,5 g D- Glucosa...2,5 g Extracto de levadura ...6 g

Agar...9 g a 18 g * Agua ...1 L

* Dependiendo de la consistencia del agar

4.2 Preparación:

- Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua por ebullición.

- Ajustar a pH (medido con pH-metro), si es necesario de modo que después de la esterilización éste sea 7,3 ± 0,2 a 25 ºC.

- Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ºC.

- Dejar solidificar en tendido.

- En la preparación de placas de agar, dispensar el medio en placas estériles y en cantidades apropiada para el ensayo.

- Nota: Si la iluminación de Henry es realizada, es importante que la capa del agar del

medio sea delgada (aproximadamente 12mL por placa de 90mm de diámetro).

5. Medio de cultivo líquido: Caldo Triptona soya extracto de levadura (TSYEB) 5.1 Composición:

Digerido enzimático de tejido animal….17,0 g Digerido enzimático de soya…………...3,0 g Na Cl………...5,0 g K

HPO

………...2,5 g D- Glucosa...2,5 g Extracto de levadura ...6 g Agua ...1 L 5.2 Preparación:

- Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua por ebullición.

- Ajustar a pH, si es necesario de modo que después de la esterilización éste sea 7,3 ± 0,2 a 25 ºC.

- Dispensar el medio en frascos o tubos de capacidad adecuada para obtener porciones apropiadas para el ensayo.

- Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ºC.

6. Agar Sangre de cordero 6.1 Base

6.1.1 Composición:

Digerido enzimático de tejido animal…..15 g Digerido enzimático de hígado...2,5 g Extracto de levadura……….5,0 g Na Cl……….5,0 g

Agar...9 g a 18 g * Agua ...1 L

Dependiendo de la consistencia del agar 6.1.2 Preparación

- Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua por ebullición.

- Ajustar a pH, si es necesario, de modo que después de la esterilización éste sea 7,2 ± 0,2 a 25 ºC.

- Dispensar el medio en frascos de capacidad adecuada para obtener porciones apropiadas para el ensayo.

- Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ºC

6.2 Base completa:

6.2.1 Composición

Base……….100 mL Sangre desfibrinada de cordero……….5 a 7 mL 6.2.2 Preparación

- Añadir la sangre a la base previamente enfriado alrededor de 47 ºC. Mezclar bien - Dispensar el medio en placas estériles en porciones apropiadas para el ensayo.

7. Caldo utilización carbohidratos 7.1 Base

7.1.1 Composición

Digerido enzimático de tejido animal.…..10 g Extracto de carne ………...1,0 g Na Cl……….5,0 g Púrpura de bromocresol...0,02 g Agua...1 L 7.1.2 Preparación

- Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua por calentamiento si es necesario.

- Ajustar a pH, si es necesario de modo que después de la esterilización éste sea 6,8 ± 0,2 a 25 ºC.

- Dispensar el medio en tubos de capacidad adecuada para obtener porciones apropiadas para el ensayo.

- Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ºC

7.2 Solución de carbohidratos 7.2.1 Composición

Carbohidrato *……….5 g Agua………100 mL

* L- Ramnosa o D- Xylosa 7.2.2 Preparación

- Disolver separadamente cada carbohidrato em 100 mL de água.

- Esterilizar por filtración

7.3 Medio completo

Para cada carbohidrato, añada asépticamente x mL de solución de carbohidrato a 9x mL de base.

8. Agar Motilidad 8.1 Composición

Digerido enzimático de caseína..……..20,0 g Digerido enzimático de tejido animal….6,1 g Agar ...3,5 g Agua... 1 L 8.2 Preparación

- Disolver los componentes en el agua por calentamiento.

- Ajustar a pH, si es necesario de modo que después de la esterilización éste sea 7,3 ± 0,2 a 25 ºC.

- Dispensar el medio en tubos de capacidad adecuada para obtener porciones 5 mL - Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ºC

9. Medio de CAMP (Christie, Atkins, Munch-Paterson) y cepas de ensayo

Placas de agar sangre de cordero pueden ser usadas para este test, pero es preferible usar placas de agar en doble capa con una delgada capa de medio agar sangre.

9.1 Base Ver 6.1

9.2 Medio agar Sangre de cordero Ver 6.2

9.3 Medio completo

- Dispensar el medio base en placas estériles en cantidades aproximadas de 12 mL por placa de 90 mm de diámetro y dejar solidificar. Vierta uniformemente una delgada capa del medio sangre de cordero, usando cantidades no mayores que 3 mL por placa. Deje solidificar.

- Si el medio de sangre de cordero es agregado a placas que contienen la base la cual ha

sido preparada de antemano, pude ser necesario entibiar las placas por 20 minutos en una

incubadora regulada a 35 ºC o 37 ºC antes de poner en la capa del medio de sangre de

cordero.

9.4 Cepas para prueba de CAMP

- Una cepa β- hemolítica de S. aureus (Ejemplo NCTC 1803 o ATCC 25923), una cepa de R. equi (ejemplo NCTC 1621 o ATCC 6939) y una cepa de L. monocytogenes (ejemplo NCTC 11994) son requeridas para realizar el test de CAMP. No todas las cepas de S.

aureus y L monocytogenes son aptas para el test de CAMP.

- Mantenga cultivos de almacenamiento de S. aureus, R. equi, L. monocytogenes, L.

innocua y L. ivanovii para cultivar en tendido en agar TSYEA, incubándolos a 35 ºC o 37 ºC por 24 a 28 horas o hasta que el desarrollo se haya producido y almacene en le refrigerador a +3 ºC ± 2 ºC. Subcultivar al menos una vez por mes y confirme la pureza por cultivo en estría en placa de agar TSYEA.

10. Solución de peróxido de hidrógeno

Use a 3% (m/m) ejemplo solución de 10 volúmenes.

11. Solución salina fosfato tamponada 11.1 Composición

Na

HPO

x 2 H

O………..8,98 g Na

HPO

………...2,71 g Na Cl...8,5 g Agua...1 L 11.2 Preparación

- Disolver los componentes en agua

- Ajustar el pH, si es necesario de tal manera que después de la esterilización se 7,2 ± 0,2 a 25 ºC.

- Esterilizar en el autoclave por 15 minutos a 121ºC

12. Suspensión de glóbulos rojos de cordero

- Mantener los glóbulos rojos de cordero a +3 ºC ± 2 ºC antes de su uso.

- Examinar antes de su uso signos de hemólisis (enrojecimiento) en la capa superior del suero.

- Si nos hay evidencia de hemólisis, tome 2 mL de la capa inferior de glóbulos rojos en 98 mL de tampón PBS.

- Si algo de hemólisis ha ocurrido, suspenda alrededor de 4 mL de los glóbulos rojos en 10 mL del tampón PBS y mezcle suavemente. Luego centrifugue. Si el sobrenadante está obviamente enrojecido significa que ha ocurrido hemólisis., no use y descarte la suspensión de almacenada. De lo contrario recoja el sobrenadante y añada 2 mL de esta suspensión de glóbulos rojos a 98 mL de tampón PBS.

- Almacenar la suspensión por hasta 5 días a +3 ± 2 ºC. Descarte si se produce hemólisis.

ANEXO Nº 3

Prueba de iluminación de Henry (Informativo)

Examine las placas usando una fuente de luz blanca, lo suficientemente potente para iluminar bien las placas de tal forma que golpee en el fondo de éstas en un ángulo de 45º.

Cuando examine bajo esta luz transmitida oblicuamente (Iluminación Henry) directamente desde arriba de la placa, las colonias de Listeria spp, presentan un color azulado y una superficie granular.

ANEXO Nº 4

Características Bioquímicas Listeria spp

Acido a partir de CAMP

N0

Manitol Ramnosa Xilosa Hemólisis S. aureus R. equi

L. monocytogenes

- - + - + + -

L. innocua

- - V - - - -

L. ivanovii

- - - + + - +

L. welshimeri

- - V + - - -

L. seeligeri

- - - + + + -

L. denitrificans

+ - - + - - -

L. grayi

- + - - - - -

L. murray

+ + V - - - -