UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO FACULTAD DE QUÍMICA
“
ELABORACIÓN DE QUESO TIPO PORO CON CULTIVOS INICIADORES OBTENIDOS DURANTE LA PRODUCCIÓN
ARTESANAL DEL ALIMENTO
”TESIS INDIVIDUAL
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO QUÍMICO EN ALIMENTOS
PRESENTA
ALEJANDRA CASTILLO CARBAJAL
DIRIGIDA POR
Dra. MONTSERRAT HERNÁNDEZ ITURRIAGA
SANTIAGO DE QUERÉTARO, QUERÉTARO, 2014.
ÍNDICE GENERAL
Contenido Página
ÍNDICE GENERAL i!
ÍNDICE DE CUADROS v!
ÍNDICE DE FIGURAS vii!
RESUMEN
1! ANTECEDENTES 1!
1.1! Leche 1!
1.1.1! Importancia socioeconómica 1!
1.1.2! Generalidades 4!
1.1.3! Características microbiológicas de la leche cruda. 6!
1.2! Queso 8!
1.2.1! Etapas de la fabricación del queso 9!
1.2.2! Aspectos tecnológicos del procesamiento 10!
1.2.3! Microbiología de los quesos 15!
1.2.4! Quesos artesanales 18!
1.2.4.1! Queso de Poro de Balancán 20!
1.3! Cultivo iniciador 24!
1.3.1! Bacterias ácido lácticas no iniciadoras 28!
1.4! Caracterización de la flora microbiana en alimentos 28!
1.4.1! Técnicas dependientes de cultivo 29!
1.4.2! Técnicas independientes del cultivo 30!
1.4.2.1! Análisis del espaciador intergénico ribosomal (RISA) 32!
2! OBJETIVOS 34!
2.2! Específicos 34!
3! MATERIALES Y MÉTODOS 35!
3.1! Materiales y equipo 35!
3.1.1! Caracterización de quesos de poro 35!
3.1.2! Elaboración del queso 35!
3.1.3! Análisis microbiológicos 36!
3.1.4! Análisis sensorial 36!
3.1.5! Análisis moleculares 36!
3.2! Reactivos 37!
3.2.1! Elaboración de queso 37!
3.2.2! Medios de cultivos 37!
3.2.3! Análisis moleculares 37!
3.2.3.1! Extracción de ADN 37!
3.2.3.2! Electroforesis 38!
3.2.3.3! Amplificación por PCR 38!
3.3! Metodología 38!
3.3.1! Caracterización microbiológica de quesos de Poro de
Balancán, Tabasco. 38!
3.3.1.1! Análisis microbiológicos 38!
3.3.1.1.1! Bacterias mesófilas aerobias (BMA) 39!
3.3.1.1.2! Bacterias ácido lácticas (BAL) 39!
Se hizo el recuento por el método de extensión en superficie en agar MRS. Las placas se incubaron a 30º C por 48 h. 39!
3.3.1.1.3! Hongos y levaduras 39!
3.3.1.1.4! Coliformes totales, fecales y E. coli 40!
3.3.1.1.5! Salmonella spp. 40!
3.3.1.1.6! Staphylococcus aureus 40!
3.3.1.1.7! Listeria monocytogenes 40!
3.3.2! Elaboración del queso tipo poro. 41!
3.3.2.1! Prueba preliminar 41!
3.3.2.1.1! Preparación del queso 42!
3.3.2.1.2! Análisis microbiológico 43!
3.3.2.1.3! Prueba sensorial 43!
3.3.2.2! Prueba definitiva 43!
3.3.2.2.1! Estabilización del inóculo para la elaboración del
Lote 2 de queso tipo Poro. 43!
3.3.2.2.2! Preparación del queso tipo Poro 44!
3.3.2.2.3! Análisis microbiológico 44!
3.3.2.2.4! Análisis sensorial 45!
3.3.2.2.5! Análisis molecular de las muestras lácteas 47!
3.3.2.2.5.1! Extracción de ADN 47!
3.3.2.2.5.2! Análisis de integridad de ADN extraído 49!
3.3.2.2.5.3! Pureza del ADN 49!
3.3.2.2.5.4! PCR-RISA 49!
3.3.3! Análisis estadístico 51!
4! RESULTADOS Y DISCUSIÓN 52!
4.1! Caracterización microbiológica de quesos de Poro elaborados
en Balancán, Tabasco. 52!
4.2! Elaboración del queso tipo poro con leche pasteurizada y
adición de inoculo controlado. 56!
4.2.1! Prueba preliminar 56!
4.2.2! Prueba definitiva 65!
4.2.2.1! Estabilización del inóculo 65!
4.2.2.2! Análisis sensorial 68!
4.2.2.3! Análisis molecular de las muestras lácteas 69!
4.2.2.3.1! Pureza del ADN 70!
4.2.2.3.2! RISA 71!
5! CONCLUSIONES 74!
6! REFERENCIAS 76!
7! ANEXOS 82!
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro Página
1. Composición típica de la leche cruda de vaca (Inda, 2000). 5! 2. Clasificación de quesos conforme la norma A6 del Codex
Alimentarius según consistencia, contenido de grasa y características de maduración (% HSMG-humedad del queso
desgrasado, GES-grasa en el extracto seco) (FAO, 2000). 9! 3. Microorganismos patógenos humanos asociados con la leche y los
productos lácteos (Marth y Steele, 2001). 17! 4. Diagrama de elaboración de queso de Poro. 23! 5. Principales especies de lactobacilos asociados a productos lácteos
agrupados según el tipo de fermentación (Martin- Platero, 2008). 27! 6. Técnicas moleculares más frecuentes. 31! 7. Origen del inóculo empleado para la producción de quesos tipo
poro elaborados con leche pasteurizada. 41!
8. Formato de selección de panelistas para análisis sensorial 45! 9. Formato de encuesta para prueba dúo-trío. 46! 10. Descripción de muestras analizadas mediante la técnica RISA. 47!
11. Comparación de medias 61!
12. Análisis de varianza del contenido de BAL en queso tipo Poro elaborado con leche pasteurizada, inoculado con tres tipos de
cultivos y almacenado 49 días a temperatura ambiente. 62! 13. Análisis de varianza del contenido de BMA en queso tipo Poro
elaborado con leche pasteurizada, inoculado con tres tipos de
cultivos y almacenado 49 días a temperatura ambiente. 63! 14. Análisis de varianza del contenido de levaduras en queso tipo
Poro elaborado con leche pasteurizada, inoculado con tres tipos de cultivos y almacenado 49 días a temperatura ambiente. 64! 15. Contenido de microorganismos indicadores en queso tipo Poro
elaborado con leche pasteurizada empleando el inóculo A. 68!
Cuadro Página
A1. Número mínimo de respuestas correctas necesarias para concluir que existe diferencia significativa, basado en un ensayo
dúo-trío. 84!
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
1. Producción Nacional de Leche Fluida 2003-2011 (SAGARPA, 2012). 1! 2. Participación en la producción de leche por estado (SAGARPA, 2012) 2! 3. Transformación y distribución de la leche (SIAP/SAGARPA, 2012). 3!
4. Queso de Poro de Balancán. 21!
5. Organización estructural de genes de ARN ribosomal en bacterias
(Sachse, 2003). 33!
6. Contenido de microorganismos indicadores de cuatro queserías del
queso de Poro en dos periodos del año. 54!
7. Análisis de pH y de Aw el queso de Poro en dos periodos del año. 55! 8. Contenido de microorganismos indicadores en quesos elaborados
con leche pasteurizada e inoculados con tres tipos de inoculo
(prueba preliminar). 59!
9. Efecto del tipo de empaque en el contenido de BAL en queso tipo Poro elaborado con leche pasteurizada. P= queso empacado con
parafina; V= queso empacado al vacío. 62!
10. Efecto del tipo de empaque en el contenido de BMA en queso tipo Poro elaborado con leche pasteurizada. P= queso empacado con
parafina; V= queso empacado al vacío. 63!
11. Efecto del inóculo en el contenido de BAL en queso tipo Poro
elaborado con leche pasteurizada. 64!
12. Efecto del tipo de empaque y del inoculo en el contenido de
levaduras en queso tipo Poro elaborado con leche pasteurizada.
P= queso empacado con parafina; V= queso empacado al vacío;
A, B C= tipos de inóculos 65!
13. Acidez del suero durante 20 trasferencias sucesivas
(ºD: Grados Dornic) 66!
14. pH del suero durante 20 transferencias sucesivas 67! 15. Gel de integridad de ADN extraído de muestras lácteas de queso
Figura Página
16. Bandas de muestras lácteas obtenidas del proceso de
producción del queso tipo poro elaborado con leche pasteurizada 72! 17. Bandas secuenciadas de muestras lácteas obtenidas del proceso
de producción del Queso de Poro del productor El Bejucal en
temporada de lluvias 73!
.
RESUMEN
El queso de Poro es un queso artesanal de corta maduración que se produce en el Estado de Tabasco y generalmente se elabora a partir de leche cruda y mediante la incorporación de suero fermentado de un lote previo como cultivo iniciador. La actividad metabólica de la microbiota autóctona presente en la leche cruda o suero genera los aromas y sabores característicos del queso. Sin embargo, el uso de leche no pasteurizada y la ausencia de un cultivo iniciador estandarizado genera variabilidad en la calidad, y puede representar un riesgo para la salud de los consumidores. En este trabajo se caracterizo microbiológicamente el queso de Poro elaborado en Balancán, Tabasco, elaborado por dos épocas en el año ( lluvias y secas) a lo largo de la maduración del queso. Se elaboraron dos lotes de queso tipo Poro, con el fin de adicionar un cultivo iniciador estable (pH, acidez); se observó si había diferencia en la flora del cultivo a lo largo del tiempo mediante técnicas moleculares; para ello se extrajo ADN del queso elaborado con leche pasteurizada y se realizó la amplificación por PCR de la región espaciadora intergénica ribosomal 16S-23S del operón ADNr con los primers ITSF e ITSReub. Se hizo un análisis microbiológico (se cuantifico bacterias mesófilas aerobias, coliformes totales, bacterias ácido lácticas, hongos y levaduras) para observar el comportamiento de microorganismos indicadores a lo largo del tiempo de maduración del queso además de la diferencia entre el empacado con parafina (tradicional) y al vacío.
Los cuales se muestra que el desarrollo de microorganismos no se altera con el empaque, además que los valores de los microorganismos indicadores se comportan de manera similar a los del queso de origen. Se realizó un análisis sensorial por la prueba dúo-trío (p<0.05), el cual se observó que existía una diferencia perceptible en el queso elaborado con leche pasteurizada y el de origen.
1 ANTECEDENTES
1.1 Leche
1.1.1 Importancia socioeconómica
En México la producción de leche de bovino es muy heterogénea desde el punto de vista tecnológico, agroecológico y socioeconómico, incluyendo la gran variedad de climas regionales y características de tradiciones y costumbres de las poblaciones.
Según cifras del Servicio de Información Estadística Agroalimentaria y Pesquera (SIAP) de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), durante el período 2003-2011 la producción nacional de leche de bovino ha tenido una tasa media de crecimiento de 1.3 % (Figura 1).
Figura 1. Producción Nacional de Leche Fluida 2003-2011 (SAGARPA, 2012).
En México la producción lechera se desarrolló en todo su territorio, pero durante el periodo de 2005 a 2010 se concentró en cuatro Estados (Jalisco, Coahuila,
producción nacional en este período. Cabe señalar, que los estados de Coahuila y Durango se encuentran ubicados en la región Lagunera, que es la más importante cuenca lechera del país, y que ocupa el primer lugar en producción a nivel nacional (Figura 2).
Figura 2. Participación en la producción de leche por estado (SAGARPA, 2012)
En México los productos lácteos como son los quesos y los yogurts, así como las leches industrializadas (pasteurizada, ultra pasteurizada y en polvo), ocupan los primeros lugares de comercialización en las zonas urbanas, ya que estas poseen vías de comunicación. La transformación y distribución de la leche se lleva a cabo tal como se muestra en la Figura 3.
Figura 3. Transformación y distribución de la leche (SIAP/SAGARPA, 2012).
Entre 2005 y 2011, la producción industrial de leche y derivados lácteos registró un comportamiento favorable en la mayoría de los productos, con base en información del INEGI, destacan la producción de yogurt y quesos, con una tasa de crecimiento promedio de 7.3 y 5.7 por ciento.
La mayor producción de derivados se encuentra asociada entre otros factores, al comportamiento de la demanda de estos productos, apoyada en la estabilidad de la economía en general y en modificaciones en las preferencias de algunos segmentos de la población, lo que ha influido en un aumento del consumo de productos lácteos de mayor valor, en comparación con el consumo de las leches líquidas.
1.1.2 Generalidades
La leche se define como la secreción mamaria normal de animales lecheros, obtenida mediante uno o más ordeños sin ningún tipo de adición o extracción, destinada al consumo en forma de leche líquida o la elaboración ulterior (CODEX STAN 206-1999). La propiedad fundamental de la leche es la de ser una mezcla compleja, tanto física como químicamente, de sustancias definidas:
agua, lactosa, lípidos, proteínas (caseínas, proteínas de suero), sales y micronutrientes.
Desde el punto de vista físico, coexiste en varios estados: emulsión, suspensión y solución (Alais, 2000). La composición de la leche varía considerablemente con la raza de la vaca, el estado de lactancia, alimento, época del año y muchos otros factores. Aun así, algunas de las relaciones entre los componentes son muy estables y pueden ser utilizados para indicar si ha ocurrido alguna adulteración en la composición de la leche (Cuadro 1) (Inda, 2000).
Cuadro 1. Composición típica de la leche cruda de vaca (Inda, 2000).
Proteínas 3.10%
Caseínas 2.40%
Proteínas de suero 0.70%
Grasas 3.40%
Lactosa 4.70%
Minerales 0.90%
Sólidos totales 12.10%
Gracias a su amplio contenido de nutrientes es considerada como un alimento completo y equilibrado, tiene una gran capacidad para ser procesada y generar una gran variedad de productos lácteos; esto da lugar a que las personas puedan consumirlos según sus diferentes hábitos y necesidades nutricionales.
La leche al ser un alimento con un alto contenido en nutrientes y agua, y por tener la capacidad para sustentar la actividad microbiana, es fácilmente alterable. Los principales agentes de alteración son los microorganismos que se encuentran presentes en la leche, aun obtenida mediante una ordeña higiénica.
Entre estos la microflora acidógena es la más activa (Villegas, 2011).
Debido a las excelentes propiedades nutricionales de la leche y al aumento en su producción a nivel mundial, se propició la innovación de productos lácteos (crema, mantequilla, yogurt, quesos). Uno de los productos más importantes a nivel mundial debido a la variedad de subproductos y a su elevada comercialización son los quesos. En la actualidad existen por lo menos 2000 variedades de queso en el mundo, muchos de los cuales tienen producción limitada.
La calidad de la leche es el factor de mayor importancia en la fabricación de queso, ya que es la materia prima principal para su producción. Por lo tanto se
debe garantizar el cuidado en los procedimientos de manejo de esta a través de las fases de elaboración de queso (Chandan y Kilara, 2011).
El potencial de la leche para ser empleada en la fabricación de queso está determinado principalmente por tres factores:
• El contenido de proteínas coagulables (caseínas)
• El contenido de materia grasa
• La calidad sanitaria y microbiológica
El principal factor es el contenido de caseínas, estas mediante la acción del cuajo y la acidez, retienen prácticamente toda la humedad del queso. El contenido de materia grasa también es importante ya que nos aporta propiedades de conservación y características organolépticas (Inda, 2000). La calidad sanitaria y microbiológica puede estar afectada por la presencia de materia fecal, pastizales, suciedad y otros materiales en la piel exterior de la ubre al tiempo de ordeñar, dando lugar a la contaminación con microorganismos tanto patógenos como deterioradores. El empleo de leche de mala calidad microbiológica tiene como consecuencias la degradación parcial de grasas y proteínas y termina manifestándose en una disminución del rendimiento de producción de queso (Inda, 2000).
1.1.3 Características microbiológicas de la leche cruda.
La leche contiene una cantidad de microorganismos muy variable, y pueden tener un origen tanto intramamario como extramamario. Se pueden encontrar bacterias como coliformes, Pseudomonas, Micrococus, Staphylococcus y además de esporulados como Clostridium y Bacillus que se encuentran en la leche debido a contaminación del ambiental o a problemas de higiene de las ubres o de saneamiento de equipo empleado durante la ordeña (Dunand, 1999).
Los diferentes microorganismos alcanzan la leche por dos vías principales: la vía mamaria y el medio externo.
• Mamaria. Los microorganismos que pueden alcanzar la ubre, igualmente pueden llegar a contaminar la leche antes o después del ordeño.
• Medio externo. La contaminación de la leche ocurre cuando ha sido extraída de la glándula mamaria. Los utensilios, tanques de almacenamiento, transporte e incluso el personal que manipula la leche, donde se pueden encontrar bacterias, hongos, levaduras (Amiot, 1991).
La diversidad microbiológica en la leche cruda es considerada esencial para la riqueza sensorial y la variedad de los quesos tradicionales. Algunos son los responsables de los defectos en los quesos o los constituyentes de riesgos a la salud de los consumidores (Delbes y col., 2007). Las bacterias ácido lácticas constituyen el conjunto de microorganismo más importantes presentes en la leche debido a sus propiedades benéficas. Son las encargadas de la fermentación de la lactosa. Estas bacterias causantes de la fermentación pueden ser:
• Homofermentativos: que producen casi exclusivamente ácido láctico y cantidades mínimas de otras sustancias.
• Heterofermentativos: que producen además de ácido láctico cantidades apreciables de productos volátiles (Jay, 2000; Axelsson, 2004).
La calidad microbiológica de la leche y productos lácteos está influenciada por la flora inicial de la leche cruda, las condiciones del procesamiento y la contaminación post-pasteurización (Pouch e Ito, 2001).
A lo largo del tiempo, se ha observado que la leche puede llegar a las industrias lácteas con una alta y variada población microbiana, probablemente debido a una ordeña deficiente, o a falta de control de la temperatura durante el transporte y almacenamiento. Muchas de estas bacterias producen enzimas que degradan parcialmente las proteínas y la grasa de la leche dando lugar a sabores y aromas inaceptables para la producción de derivados de la leche (Inda, 2000).
La aplicación de tratamientos térmicos a la leche principalmente la pasteurización, tiene como objetivo eliminar los microorganismo patógenos presentes, y en consecuencia parte de la microflora deterioradora también se elimina contribuyendo a salvaguardar sabores y nutrientes en el producto.
1.2 Queso
Desde el punto de vista de su composición el queso puede definirse como un producto fermentado o no, obtenido por coagulación de la leche, en forma de gel más o menos deshidratado que retiene casi toda la materia grasa, si se trata de un queso graso, un poco de lactosa en forma de ácido láctico y fracción variable de sustancias minerales (Veisseyre, 1988). Según la NOM-121-SSA1-1994 son los productos elaborados con la cuajada de leche estandarizada y pasteurizada de vaca o de otras especies animales, con o sin adición de crema, obtenida por la coagulación de la caseína con cuajo, gérmenes lácticos, enzimas apropiadas, ácidos orgánicos comestibles y con o sin tratamiento ulterior por calentamiento, drenada, prensada o no, con o sin adición de fermentos de maduración, mohos especiales, sales fundentes e ingredientes comestibles opcionales, dando lugar a las diferentes variedades de queso pudiendo por su proceso ser: fresco, madurado o procesado.
El queso es uno de los derivados más importantes de la leche y aunque su clasificación resulta un tanto difícil por el incremento en el número de variedades existentes, la más completa de ellas es la de la FAO (Cuadro 2) que clasifica a los quesos según la consistencia respecto a la humedad del queso desgrasado, contenido de grasa y características de maduración. Otro tipo de clasificación es según la textura, el tipo de microorganismo empleado, y el tiempo de maduración (Orozco, 2004).
Cuadro 2. Clasificación de quesos conforme la norma A6 del Codex Alimentarius según consistencia, contenido de grasa y características de maduración (%
HSMG-humedad del queso desgrasado, GES-grasa en el extracto seco) (FAO, 2000).
1.2.1 Etapas de la fabricación del queso
En la ciencia de la fabricación de quesos hay que considerar cinco factores principales: la composición de la leche, la velocidad de acidificación, el desarrollo de la acidificación, el contenido de humedad y la manipulación de la cuajada (Lucey, 2003).
La fabricación de un queso comprende tres fases esenciales:
a) Cuajado o coagulación de la leche. La formación del gel de caseína.
b) Desuerado de la cuajada. La deshidratación parcial de este gel por sinéresis, es decir, por la contracción de las micelas que lo forman.
c) Afinado o maduración de la cuajada. Comprende una serie de cambios de las propiedades físicas y químicas adquiriendo aspecto, textura y consistencia, así como su aroma y sabor característicos.
%HSMG Designación % GES Designación
Designación según características de
maduración
< 51 % Extra duro > 60% Extra graso Madurado
49-56 Duro 45-60 Graso Madurado por mohos
54/69 Firme/Semid
uro 25-45 Emigrase No madurado Fresco
>67 Blando <10 Desnatado En salmuera
1.2.2 Aspectos tecnológicos del procesamiento
Preparación de la leche.: Previamente al comienzo de la fabricación de queso es necesario tener una leche homogénea, con parámetros óptimos establecidos para la obtención del queso que se trate de fabricar. De esta manera se eliminará la variabilidad de calidad en cada proceso. Entre los tratamientos se tienen:
Filtrado. Es un método físico mediante el cual se eliminan las impurezas visibles tales como pelos, partículas de excremento, partículas de vegetales y polvo que pueden haber tenido acceso a la leche, pudiendo hacerlo a través de filtros fibrosos, tamiz, mallas, paño, etc.
Pasteurización. El principal objetivo de la pasteurización es destruir las bacterias patógenas que eventualmente se pueden encontrar en la leche.
La pasteurización se aplica también por razones técnicas como la de destruir, al menos en parte, la flora indeseable de la leche que puede producir defectos en el queso. De esta manera las fermentaciones ocurren de forma regular y son más fáciles de controlar y por tanto, se puede obtener un producto de calidad uniforme. Por otra parte, en la pasteurización se destruyen las sustancias antibacterianas que contiene la leche cruda, lo que favorece el desarrollo de algunas cepas de bacterias lácticas que son sensibles a estas sustancias. En general, todos los estreptococos mesofílicos se desarrollan mejor en una leche que ha sufrido pasteurización (Flores y López, 1998).
La pasteurización produce importantes modificaciones en la estructura de las proteínas solubles. Por acción del calor, y de forma proporcional a la intensidad del tratamiento, las proteínas se desnaturalizan y precipitan junto con las micelas de caseína quedando retenidas en la cuajada. Como estos componentes tienen la propiedad de captar y retener fuertemente el agua, su inclusión en el coágulo dificulta el desuerado y el endurecimiento (Amiot, 1991).
Se pueden distinguir dos métodos de pasteurización. Baja y alta. La pasteurización baja se define por un calentamiento a 64-65ºC durante 30 minutos. Es un método lento discontinuo, pero presenta la ventaja de no modificar las propiedades de la leche. No se coagulan las albúminas, ni las globulinas y el estado de los glóbulos grasos permanece inalterado. Por otra parte, aun en la actualidad, la baja calidad bacteriológica de la leche exige un tratamiento térmico más severo. Este es tanto más conveniente cuanto que algunos gérmenes termófilos pueden crecer a 63ºC y desarrollarse en la leche pasteurizada.
Adición de cloruro de calcio. El calcio soluble de la fase acuosa de la leche está en constante equilibrio con el calcio coloidal ligando a las micelas de caseína.
Para conseguir una buena coagulación, las micelas deben estar saturadas de calcio. La refrigeración prolongada de la leche a 3-4ºC y especialmente la pasteurización, provocan el aumento del contenido de calcio coloidal a expensas del calcio soluble. Para restablecer el equilibrio, normalmente se añade a la leche cloruro de calcio después del tratamiento térmico. Una parte de este compuesto pasa a la forma coloidal con las caseínas. La dosis que se añade es variable, en función de la intensidad del tratamiento térmico que ha recibido la leche. Es importante que el cloruro de calcio se distribuya homogéneamente en la masa de leche para lo cual se disuelve previamente en agua. Se debe añadir unos minutos antes del cuajo. La adición de cloruro de calcio evita las pérdidas de caseína durante la coagulación y hace que la textura del queso sea más firme. Si el lactosuero tiene una apariencia lechosa, quiere decir que faltó calcio.
Generalmente el calcio se añade incluso para elaborar quesos a partir de leche que solo ha sido precalentada porque así se obtienen coágulo con una mejor consistencia (Amiot, 1991).
Coagulación. Los pasos iniciales en la elaboración de quesos involucra la coagulación de micelas de caseína por la vía de dos posibles métodos:
proteólisis limitada (usando renina u otros coagulantes), acidificando (con cultivos iniciadores o adición de ácidos) y calentando; o la combinación de estos
formar un gel compacto aprisionando el liquidó de dispersión que constituye el suero.
Coagulación láctica o ácida. Es la que se lleva a cabo acidificando la leche por vía biológica en el seno de la leche mantenida en reposo, siendo el único método que permita obtener un gel homogéneo. Al reducirse el pH de la leche provoca la alteración de las micelas de caseína, modificando su dispersabilidad.
Cuando el pH de la leche llega a ser 5.2 a 20ºC, las micelas se han desestabilizado suficientemente para aglomerarse y formar un gel láctico. Sin embargo, la desmineralización no es total. Para alcanzar este estado es necesario acidificar la leche hasta un pH de 4.6 que corresponde al punto isoeléctrico de la caseína que quedan suspendidos en el lactosuero que contiene todo el calcio micelar en estado disuelto.
Coagulación enzimática. Es el sistema de coagulación más ampliamente empleado en quesería. El mecanismo de acción de la enzima es como sigue: la enzima provoca una proteólisis limitada de la caseína " con lo cual pierde sus propiedades estabilizantes en presencia de calcio respecto a las caseínas #s1 y
$. Las micelas de caseína, cuya estructura se ha modificado, se agregan en flóculos y después en fibras que finalmente constituyen una red tridimensional cuya estructura se elabora progresivamente. La red retiene en su interior lactosuero y los glóbulos grasos de manera semejante a un líquido que impregna una esponja. La rigidez del gel está asegurada principalmente por el fosfato cálcico coloidal que constituye una verdadera armadura. La caseína se encuentra en forma de un complejo de fosfoparacaseinato de calcio, es decir, en una forma muy mineralizada (Veissyre, 1988).
Los factores de los que depende la coagulación enzimática son los siguientes:
• La dosis de cuajo. Depende de la fuerza del mismo.
• La temperatura. La velocidad de coagulación es máxima entre 30 y 35ºC.
• El pH de la leche. Cuando el pH es inferior a 7 se observa una aceleración de la gelificación porque se acerca al pH óptimo de la
actuación de la enzima que es 5.5, y porque se reducen las cargas eléctricas de las micelas de caseína con lo que disminuye su estabilidad.
Corte de la cuajada. Después de que la leche ha coagulado la primera operación que se realiza es el corte de la cuajada formada. El propósito del cortado es el de permitir la salida de una gran proporción del suero de la cuajada. El contenido de agua en la cuajada se reduce rápidamente cuando se realiza el cortado en cubos pequeños (Webb, 1999).
En el momento del cortado, la cuajada debe tener una firmeza suficiente y resistencia al corte (que corresponde a la tensión de la cuajada). Las cuajadas muy blandas se desmenuzan durante el trabajo, formándose el polvo de cuajada, que hace disminuir el rendimiento. Las cuajadas muy duras son difíciles de trabajar y se forma una capa seca sobre la superficie de los trozos, y el desuerado es imperfecto. Es importante hacer el cortado de forma homogénea, para evitar pérdidas y de esta manera se cuidan los rendimientos queseros.
Desuerado de la cuajada. La concentración se consigue eliminando una cantidad mayor o menor de agua y elementos solubles. La pasta que queda está formada esencialmente por la caseína y la materia grasa adherida a ella físicamente. El lactosuero que se extrae contiene la mayor parte de la lactosa y de las sustancias nitrogenadas no coaguladas y una proporción variable de minerales. Fundamentalmente la menor cantidad de suero queda retenido en la cuajada lo que determina muchas de las características de las distintas variedades de queso; dureza, textura, velocidad e intensidad de la maduración, etc. Por esta razón la operación de desuerado tiene una gran importancia en el proceso de fabricación y además, controlando esta etapa se regula el extracto seco total exigido por la legislación para cada tipo de queso (Amiot, 1991).
Moldeado. Después de la eliminación de gran parte del suero, los granos de leche coagulada se colocan en moldes de diferentes tamaños y formas, que son
los que dan apariencia final al queso. Estos moldes pueden ser de madera, plástico o metal (Madrid, 1990).
Prensado. La operación de prensado en la cuajada y desuerada tiene varios fines:
• El queso se individualiza en piezas y adquiere su apariencia típica.
• Con el prensado en moldes, el queso adquiere una superficie firme que le permite conservar su estructura en las operaciones posteriores de salado, maduración, etcétera.
• Se consigue una eliminación adicional de suero.
El prensado tiene lugar en condiciones distintas de tiempo, temperatura, presión y pH (según tipo de queso), que son los factores más importante que intervienen en esta operación (Madrid, 1990).
Salado. El salado es la adición de cloruro de sodio al queso, y se lleva a cabo principalmente mediante la inmersión directa en baños de salmuera o a través de la aplicación de sal sódica a la corteza o mezclada con la masa. También se puede efectuar el salado cuando los granos aún están en el contenedor, pero ello tiene el inconveniente de que también se incorpora sal al suero, con lo que se limita su posible aprovechamiento. Muchos son los objetivos del salado en los quesos, entre ellos se tienen (Madrid, 1990):
• Realzar el sabor del queso
• Regular el desarrollo microbiano, tanto suprimiendo bacterias indeseables como controlando el crecimiento de los agentes de maduración.
• Mejorar la apariencia y consistencia de los quesos.
• Facilitar la perdida de suero tras el desuerado
Maduración. En algunos quesos denominados quesos frescos, la fabricación se interrumpe en esta fase. Los demás tipos de quesos sufren una maduración biológica, destinada a desarrollar su sabor, al mismo tiempo que se modifica su aspecto, textura y consistencia. Cada tipo de queso se caracteriza por su propio
proceso de maduración o afinado. Sin embargo, se dan tres grandes fenómenos, aunque en diverso grado, en todos los procedimientos de afinado:
• Fermentación de la lactosa a ácido láctico, y producción de pequeñas cantidades de ácido acético y propiónico, CO2 y diacetilo.
• Hidrólisis de la grasa, la cual influye en el aroma y sabor del queso.
• Degradación de las proteínas que afecta al sabor, aspecto y textura de la pasta (Medina, 1996).
Los agentes de afinado son numerosos y comprenden fundamentalmente: las enzimas presentes en la leche, el cuajo, que es el origen del coágulo, y las enzimas segregadas por la flora microbiana que se desarrolla en la cuajada.
Puesto que la maduración del queso depende esencialmente de la actividad microbiana se sigue que los factores que regulan esta tienen un papel determinante en el desarrollo del afinado. Entre estos factores tenemos: la aireación, la humedad, la temperatura, contenido de sal y el pH.
1.2.3 Microbiología de los quesos
El queso es un ecosistema en cambio continuo en cuanto a los factores externos de conservación-maduración como a los intrínsecos como la composición y la microbiología. El queso contiene elevados contenidos microbianos que juegan un papel importante en sus características de calidad (Inda, 2000).
En el queso se producen reacciones bioquímicas e interacciones microbianas.
La presencia de las bacterias en los quesos depende de la contaminación microbiana de la leche, la acidificación de la misma previa a la elaboración del queso, los tratamientos térmicos de la leche, el uso de cultivo iniciador, las condiciones del proceso, principalmente en cuanto a tiempo, temperaturas y condiciones higiénicas (Peláez y Requena, 2005).
Los microorganismos mayoritarios que aparecen en los quesos se han divido en dos grandes grupos: cultivos iniciadores y cultivos no iniciadores o microorganismos secundarios (Beresford y col., 2001). Los cultivos iniciadores son aquellos microorganismos que intervienen fundamentalmente en la producción de ácido láctico durante la primera etapa de fabricación, la coagulación de la leche, pudiendo intervenir de forma secundaria en la maduración del queso. Estos cultivos iniciadores pueden estar presentes de forma natural en la leche o ser añadidos intencionadamente.
Los cultivos no iniciadores son microorganismos que no intervienen en la acidificación, pero desempeñan un papel muy importante durante la maduración del queso. En estos últimos se incluyen las bacterias acido lácticas (BAL) no iniciadoras, otras bacterias no pertenecientes al grupo de las BAL, levaduras y mohos.
Los microorganismos secundarios se añaden a algunas variedades de queso en los que se busca proporcionar características muy concretas, como por ejemplo Penicillum roqueforti en quesos tipo roquefort. La presencia de bacterias potencialmente patógenas provenientes de una mala calidad de leche está bien documentada (Cuadro 3). Entre los patógenos reportados como los agentes más comúnmente implicados en enfermedades transmitidas por leche se incluyen Salmonella spp. Campylobacter spp., Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis y Listeria monocytogenes (Law y Tamime, 2010).
Como se mencionó previamente, el principal método destinado al control de patógenos es la pasteurización de la leche, aunque por sí sólo no asegura un producto libre de patógenos. Son además factores muy importantes el tiempo y temperatura de cocción del cuajo, así como la tasa de acidificación (Buyser y col., 2001). Algunos patógenos pueden ser eliminados durante la fase de cocción (Arocha y col., 1992), mientras que una tasa de acidificación lenta puede llegar a inducir una respuesta adaptativa al pH ácido y favorecer así su resistencia al pH ácido estomacal (Vernozy-Rozand y col., 2005).
Cuadro 3. Microorganismos patógenos humanos asociados con la leche y los productos lácteos (Marth y Steele, 2001).
Organismo Enfermedad
Escherichia coli
Gastroenteritis, síndrome urémica hemolítico
Salmonella Gastroenteritis, fiebre tifoidea Yersinia enterolitica Gastroenteritis
Aeromonas hydrophila Gastroenteritis
Brucella spp. Brucelosis
Campylobacter jejeuni Gastroenteritis Pseudomonas aeruginosa Gastroenteritis Bacillus cereus Gastroenteritis Bacillus anthracis Ántrax
Clostridium perfringens Gastroenteritis Clostridium botulinum Botulismo
Staphylococcus aureus Intoxicación emética Streptococcus agalactiae Dolor de garganta Streptococcus pyogenes Fiebre escarlatina Corynebacterium spp. Difteria
Listeria monocytogenes Listeriosis Mycobacterium bovis Tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Tuberculosis
Enterovirus Infección entérica
Mohos Micotoxinas
1.2.4 Quesos artesanales
Los quesos que actualmente se industrializan en grandes volúmenes en todo el mundo, se empezaron a elaborar con procedimientos artesanales, que se han venido mejorando obteniéndose mayor rentabilidad, mayor higiene y procesos cada vez más automatizados.
Hoy en día los quesos artesanales están recobrando el digno lugar que les corresponde, impulsándose la identidad nacional, reconociendo el ingenio de sus artesanos, vinculando sus tradiciones regionales, con su historia y geografía. Los sabores de los quesos, sus texturas, su forma de presentación, los cuidados para su conservación y maduración, son propiedades especiales que distinguen a una región de otra, un país o continente.
Estos quesos artesanales surgen por la necesidad de aprovechar la leche y ofrecer un producto que sea aceptado por la población consumidora. El producto comúnmente se enraíza en las zonas de consumo, convirtiéndose en un producto indispensable en la cocina regional y a veces hasta nacional; la mayoría de estos productos artesanales se elaboran con leche entera o semidescremada, con un sabor característico de cada región (Esquivel, 1995).
El queso artesanal, se elabora con una tecnología que dista mucho de aprovechar los grandes avances tecnológicos que en la actualidad se tienen (Esquivel, 1995). Sin embargo, es de importancia mencionar que la mayoría de los quesos producidos artesanalmente no se requieren equipos especiales o instalaciones con alto grado en tecnología para reducir los riesgos críticos de contaminación; lo único que se requiere son algunos cuidados, que constituyen el saneamiento básico para el mejoramiento de la calidad de estos productos. El carácter artesanal de esos quesos no justifica el incumplimiento de normas de calidad que aseguren la satisfacción del consumidor en el mercado, especialmente frente a la competencia tan cerrada que reciben de parte de los productores de quesos en volumen industrial, tanto locales como de origen extranjero.
La calidad sensorial típica de los quesos tradicionales depende de varios factores, incluyendo las prácticas de fabricación tradicionales (leche bronca), la alimentación de los animales lecheros, la diversidad y dinámica de las comunidades microbianas. La composición microbiana (cualitativa y cuantitativa) y su actividad durante el madurado juegan un papel muy importante en el desarrollo de características sensoriales (Pogacic y col., 2010).
Muchos quesos mexicanos genuinos, en la actualidad no tienen patrones muy claros de elaboración, no están estandarizados, ni puedan usarse como referencia o prototipo de los quesos de su especie para producirse de manera independiente (Santos y Villegas, 1997).
Es por lo anterior que los quesos elaborados con leche pasteurizada resultan en productos más uniformes y de mejor calidad sanitaria. Sin embargo, la pasteurización afecta negativamente la calidad sensorial, ya que elimina parte de la microflora autóctona de la leche, que es responsable del sabor típico del queso (Torres-Llanez, 2005).
Los consumidores aprecian los quesos artesanales por sus singulares características de sabor y aroma, que es generalmente atribuida a la actividad metabólica de la microbiota autóctona presente en la leche cruda. La utilización de cultivos lácticos comerciales ayuda a llevar a cabo el proceso de acidificación, pero generalmente se asocian con otras propiedades organolépticas, pues esos microorganismos han sido seleccionados de quesos de otras regiones. Además, el uso de cultivos lácticos industriales en substitución de la microbiota autóctona, podría llevar a la perdida de las cepas autóctonas a largo plazo. Generalmente, la selección de cepas lácticas autóctonas ha ayudado a obtener productos lácteos con características similares a los productos elaborados con leche cruda (Ramos-Izquierdo, 2009).
1.2.4.1 Queso de Poro de Balancán
El queso “de poro” se elabora en forma artesanal en el municipio de Balancán, Tabasco, México. El de poro es un queso fresco, o ligeramente maduro, de pasta blanda y prensada, elaborado con leche entera y cruda de vaca.
El producto final se obtiene después de un corto proceso de maduración de siete días, después de los cuales puede conservarse sin refrigeración. La elevada concentración de bacterias lácticas, así como su alta acidez permiten mantener sin refrigeración el queso de poro.
Se presenta al mercado en piezas pequeñas, prismático-rectangulares. El queso de poro se comercializa a los pocos días de producido; sin embrago, por problemas de distribución puede ocurrir que su venta se retarde varias semanas y durante ese tiempo la pasta del queso continúa un proceso de maduración, hasta llegar al consumidor (Cervantes y col., 2006).
En cuanto al rendimiento, en este producto se obtienen cifras que oscilan entre 9 y 10 kg de queso por 100 L de leche procesada planas, con un peso que oscila entre 250 g y 1 kg (Figura 4). Las piezas vienen parafinadas (cubiertas con parafina transparente) y envueltas en papel celofán amarillo, bajo el cual luce su etiqueta. La envoltura le imprime una presentación muy atractiva para el comprador.
La pasta de este queso se encuentra fuertemente desmineralizada debido al reposo prolongado (varias horas) de la cuajada húmeda en el molde. Durante el proceso de desmineralización la acidez de la pasta aumenta, constituyéndose ésta en un factor para su conservación.
Figura 4. Queso de Poro de Balancán.
Otra característica notable de la pasta es su friabilidad (se desmorona fácilmente) cuando ya ha perdido mucha humedad; por ejemplo, si el queso ha madurado algunas semanas.
El queso de poro es un producto meramente regional que se elabora en la Zona de Los Ríos en el estado de Tabasco; concretamente en los municipios de Balancán y Tenosique. En su fabricación se emplea leche de ganado cruzado cebú-pardo suizo.
Algunos pasos notables en la elaboración de este queso son (Cuadro 4):
• Adición de suero ácido a la leche. A la leche cruda y fresca de fabricación se le agrega alrededor de 5 % en volumen de suero ácido, de la víspera.
El suero ácido cumple la función de un cultivo láctico, aunque rústico; su propósito es desarrollar rápidamente acidez en la pasta durante el reposo y moldeo de la cuajada.
• Reposo de la cuajada. Después del cortado del gel en bloques, se permite un reposo de 2-4 horas. El propósito de esta operación es propiciar la multiplicación de microorganismos acidificantes nativos en la leche, y consecuentemente, el desarrollo de acidez en la masa. Los
• Moldeado. Se efectúa disponiendo la cuajada en moldes de madera, prismático- rectangulares. Ahí la cuajada se auto-prensa. Por auto- compresión la pasta exuda suero gradualmente el cual escapa por los orificios laterales del molde y por la apertura inferior del mismo.
• Reposo de la cuajada en moldes. Tras el moldeado se efectúan cuatro vires o inversiones de los moldes, en un lapso de 2-4 horas; el propósito es continuar acidificando (y desmineralizando) la pasta y lograr una buena consistencia en las piezas, antes del prensado.
• Después del último “vire”, la cuajada permanece dentro de los moldes durante un tiempo prolongado, entre 15 y 20 horas.
• Prensado. Este se lleva a cabo empleando prensas rústicas de madera resistente. En ellas cada “queso verde” queda sujeto a la pesa de concreto o metal.
• Maduración parcial de pasta. Se efectúa colocando las piezas de queso recién desmoldado, en un armario de madera, cerrado. Dentro de este se mantienen las piezas en pilas durante dos días. Debido a la elevada temperatura que reina dentro del armario (entre 30 y 40ºC), se produce una maduración acelerada de la pasta; esto repercute en el fuerte olor- sabor, característico del queso de Poro.
• Salado. El salado final del queso se realiza frotando cada pieza con sal fina, en sucesivas aplicaciones, durante 3 días, Después de cada frotado, las unidades se reintroducen en el armario de maduración.
• Raspado de la costra. Posteriormente al salado se imparte a las piezas un oreo de 2-4 horas a temperatura ambiente; luego empleando un cuchillo o una espátula se limpia el “limo” que se ha generado en la corteza de cada queso por la actividad microbiana de superficie.
• Parafinado. Se lleva a cabo sumergiendo las piezas de queso, previamente lavadas y oreadas, en un baño de parafina blanca fundida.
El objetivo es formar una barrera contra la deshidratación del producto y la invasión de mohos.
• Empacado. Las piezas de queso, ya parafinadas, se envuelven en papel celofán amarillo debajo del cual se coloca una etiqueta de identificación
Cuadro 4. Diagrama de elaboración de queso de Poro.
1.3 Cultivo iniciador
En 1873 Lister aisló un cultivo iniciador puro y confirmó el papel de los microorganismos en la fabricación de los quesos (Powell y col., 2002), a partir de 1890 cuando comienza a desarrollarse la tecnología de los cultivos iniciadores.
Tradicionalmente los cultivos iniciadores que se usaban era la microflora autóctona que contiene la leche, esta proporcionaba la producción de ácido láctico y daba las características organolépticas específicas de cada queso, sin embargo como la microflora es variable, la producción de ácido no era la misma, dando como resultando quesos con calidades diferentes.
Los iniciadores lácteos son cultivos inofensivos de bacterias activas que crecen en la leche o en el suero, los cuales imparten ciertas características y calidades a varios productos lácteos. Los cultivos pueden ser de una o varias especies de microorganismo. Consisten en bacterias ácido lácticas, propionibacterias, bacterias superficiales maduradoras, levaduras y mohos. Los cultivos iniciadores son ahora liofilizados con componentes de la leche y nutrientes y son distribuidos comercialmente (Kosikowski, 1977).
Los fermentos lácticos dan lugar a:
a) Acidificación de la leche, con la consiguiente disminución del pH.
b) Segregación de enzimas proteolíticas que ayudan a la descomposición de las proteínas durante la posterior maduración.
c) Segregación de enzimas lipolíticas que ayuda a la descomposición de las grasa, lo que facilita la maduración del queso.
d) Aparición de sustancias aromáticas típicas de los quesos (Madrid, 1999).
Los cultivos iniciadores también pueden tener un papel importante durante la maduración, debido fundamentalmente a la producción de compuestos aromáticos a partir de la lactosa, el citrato y las proteínas y péptidos de la leche,
además de contribuir a cambios en la textura, como consecuencia de la degradación de proteínas y grasas.
El grupo más importante empleado en los cultivos iniciadores son las BAL.
Consiste en un grupo filogenéticamente diverso de géneros de bacterias Gram positivas de morfología cocoidea o bacilar, catalasa negativa, no esporulantes y anaerobios-aero tolerantes, que originan ácido láctico como producto final de la fermentación de azúcares (Makarova y Koonin, 2007).
El grupo de las BAL está constituido por los siguientes géneros:
1. Bacterias en forma de coco: Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus, Enterococcus, Pediococcus, Aerococcus, Tetragenococcus, Leuconostoc y Atopobium.
2. Bacterias en forma de bacilo: Lactobacillus y Carnobacterium.
3. Otros géneros afines: Bifidobacterium, Micrococcus, Brevibacterium y Propionibacterium.
De estos géneros de BAL los más utilizados en la industria láctea como cultivos iniciadores pertenecen los géneros: Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus y Leuconostoc. Un quinto género, Enterococcus, es encontrado ocasionalmente en cultivos iniciadores de mezclas.
Lactococcus. Células en forma de coco dispuestas en cadenas de longitud variable. Poseen un metabolismo homofermentativo, produciendo ácido L-láctico a partir de la lactosa. Su temperatura de crecimiento es de 30ºC. Las especies de lactococos comúnmente encontradas en la leche son: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris y Lc. raffinolactis (Mundt, 1986). Los Lactococcus completan la acción del cuajo, liberando péptidos de pequeño tamaño y aminoácidos libres, los cuales son el origen de compuestos que intervienen directamente en el sabor de los quesos o constituyen precursores de los aromas.
Leuconostoc. Células con forma esférica o lenticular dispuestas en pares y cadenas y se encuentran comúnmente en cultivos mesófilos. Fermentan los azúcares de forma heterofermentativa, produciendo cantidades equimolares de lactato, etanol y CO2. Las especies de Leuconostoc que más comúnmente se encuentran asociadas a la leche, y por tanto, al queso, son: Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Ln. mesenteroides subsp. dextranicum, Ln. desenteroides subsp. cremoris, Ln. paramesenteroides y Ln. lactis. Al ser bacterias heterofermentativas, producen etanol, ácido acético y diacetilo, contribuyendo de forma importante a la formación del aroma.
Streptococcus. Bacterias lácticas mesófilas homofermentativas, tolerante, capaz de crecer a 52ºC y fermentan solo un número de carbohidratos. Las dos únicas especies mesófilas de gran importancia en quesería son Streptococcus lactis y Streptococcus cremoris.
Lactobacillus. Células en forma de bacilo que pueden ser largos, o cortos y normalmente aparecen en forma de cadenas. Este género se divide en tres: 1) homofermentativo, que fermentan exclusivamente las hexosas a ácido láctico; 2) heterofermentativos facultativos, producen solo ácido láctico, etanol y ácido fórmico cuando la glucosa es limitada; y 3) heterofermentativos obligados, fermentan hexosas a ácido láctico, ácido acético (o etanol) y dióxido de carbono.
Pueden causar sabores indeseables y formación de gas en madurado de quesos (Cuadro 5) (Vernozy-Rozand y col., 2005).
Los cultivos iniciadores usados en productos lácteos se dividen en mesófilos y termófilos, basados en su temperatura óptima de crecimiento. Los cultivos mesofílicos crecen a temperaturas de 10-40 ºC con temperatura óptima de alrededor 30ºC. Los cultivos termófilos tienen temperatura óptima de crecimiento alrededor de los 40 y 50ºC. Cada uno de estos grupos se puede subdividir a su vez en cultivos de cepas definidas y cultivos mixtos.
Cuadro 5. Principales especies de lactobacilos asociados a productos lácteos agrupados según el tipo de fermentación (Martin- Platero, 2008).
Homofermentativos Heterofermentativos Facultativos Obligados
Lb. Acidophilus Lb.casei Lb.bifermentans
Lb. Helveticus Lb. Coryneformis Lb. Brevis Lb. Delbreckii subsp.Delbreckli Lb.curvatus Lb. Buchneri Lb. Delbreckii subsp. Lactis Lb.paracasei Lb.fermentum Lb. Delbreckii subsp.Bulgaricus Lb.plantarum Lb. Kefiri
Cultivos de cepas definidas: son cultivos puros cuyas características fisiológicas son conocidas y están identificadas. Estas cepas son aisladas de cultivos mixtos, o de productos fermentados por las bacterias lácticas de flora nativa.
Este tipo de cultivo puede tener iniciadores de cepa única o de múltiples cepas, la cual son elegida(s) con características específicas como resistencia a fagos o perfil óptimo proteolítico.
Cultivos mixtos: contienen diferentes cepas definidas de diferentes especies.
Aunque este tipo de cultivos contienen diferentes cepas, se conoce que finalmente una cepa será predominante a expensas de las otras (Salminen y Wright, 1993; Chandan y Kilara, 2011).
El cultivo iniciador es uno de los principales factores que determinan la calidad y propiedades del producto final, se agrega dependiendo del tipo de queso que se va a elaborar. Si el queso es de pasta blanda se usan cultivos de acidificación rápida, como el compuesto por Lactococcus lactis, subespecie lactis y Lactococcus lactis subespecie cremoris. Para obtener quesos de pasta dura y firme, se utilizan cultivos con capacidad proteolítica y lenta producción de ácido.
1.3.1 Bacterias ácido lácticas no iniciadoras
La microbiota láctica secundaria NSLAB por sus siglas en inglés (non starter lactic acid bacteria), son bacterias lácticas que contaminan la leche después de la pasteurización, o bien que sobreviven al tratamiento térmico aun en baja proporción o en un estado no cultivable. Estas bacterias se desarrollan espontáneamente en la etapa de maduración en todos los quesos, provocado por la autolisis por los organismos iniciadores, liberando sustratos de crecimiento y enzimas, dando lugar al incremento de NSLAB (Fitzsimons y col., 1999).
Las NSLAB no contribuyen significativamente a la producción de ácido láctico al comienzo de la fabricación (coagulación), y además están presentes en bajo número al inicio de la fermentación, sin embargo suelen ser microorganismos tolerantes a la sal y al pH ácido, por lo que pueden crecer bien durante la maduración del queso, las NSLAB suelen encontrarse en concentración de 102- 103 UFC/g tras el prensado, para alcanzar niveles de 107-108 UFC/g tras unos tres meses de maduración (Fox y col., 1998).
Estas bacterias son fundamentalmente cepas seleccionadas de especies de lactobacilos mesófilos. La causa de su adición como cultivos adjuntos a los iniciadores radica en que estas bacterias se han encontrado en elevados recuentos de queso maduro, es por eso que se cree que deben tener alguna función.
1.4 Caracterización de la flora microbiana en alimentos
La microbiología de alimentos ha tendido a dividir en partes la investigación de los microorganismos, enfocándose en el estudio o la detección de únicamente de ciertos grupos. Recientemente, se ha visto la necesidad de tomar en cuenta el ecosistema completo, ya que el crecimiento, la sobrevivencia de cualquier especie, pueden estar determinados por la presencia de otras especies (Díaz y Wacher, 2003).
Aunque las pruebas bioquímicas siguen siendo hoy día muy importantes en la identificación de los microorganismos, sin embargo tienen serios inconvenientes.
Algunos de ellos se enumeran a continuación:
• Las técnicas fenotípicas no siempre son reproducibles.
• Tampoco permiten obtener información sobre la diversidad genética de los distintos aislados ni por supuesto diversidad genética de la comunidad de la cual se han aislado.
• Sólo se pueden aplicar en aquellos microorganismos cultivables (Giraffa y Neviani, 2001).
Ya que el uso de métodos convencionales para la identificación de microorganismos resulta insuficiente, en los últimos años se han desarrollado numerosos métodos moleculares que permiten conocer a fondo la microbiota presente en los alimentos. El empleo de uno u otro, suele estar a menudo condicionado con el nivel de información requerido: detección, identificación, cuantificación y tipificación. Las tres primeras se pueden llevar a cabo tanto mediante la utilización de técnicas dependientes o independientes de cultivo, mientras que el análisis de tipificación sólo puede aplicarse a métodos dependientes de cultivo (Dahllöf, 2002; Giraffa, 2004).
1.4.1 Técnicas dependientes de cultivo
Las técnicas de identificación de los microorganismos dependientes de cultivo incluyen tanto las tradicionales técnicas microbiológicas, basadas en caracteres fenotípicos, como las genotípicas y filogenéticas. Mediante el uso de los métodos tradicionales, se realizan recuentos de microorganismos y se determina su diversidad en medios sintéticos con agar, pero en algunos casos se requiere un período de incubación en medio líquido, para promover el crecimiento de microorganismos específicos o seleccionarlos, ya que su aislamiento sería imposible sin este paso. El gran inconveniente de los métodos microbiológicos clásicos dependientes de cultivo es la imposibilidad de llegar a
utilizar los métodos de enriquecimiento y crecimiento en medios microbiológicos, la microbiota originalmente presente en la muestra es sometida a importantes cambios debido a la capacidad de ciertas especies para dominar el entorno y superar a los otros componentes microbianos. Por esta razón la población numéricamente menos importante, o en condiciones de estrés, apenas es recuperada e identificada. Con los métodos dependientes de cultivo hay un alto riesgo de errores de identificación de la ecología de los complejos ecosistemas microbianos (Hugenholtz y col., 1998). Aunque el cultivo tiene como resultado una visión general de la flora microbiana, solo las cepas que pueden crecer bajo las condiciones selectivas pueden ser monitoreadas y su caracterización fenotípica puede no ser confiable, pues ésta depende del medio de cultivo y las condiciones ambientales usados en el ensayo. Éste enfoque es limitado por su sensibilidad y no es apropiado para análisis de rutina para subespecies o cepas (Beresford y col., 2001).
Las técnicas dependientes de cultivo muy a menudo representan una desviación de la composición real de las comunidades dado que suelen proporcionarse condiciones que distan de las presentes en el medio del cual fueron extraídas.
En la mayoría de los casos la ausencia de interacciones con otras poblaciones, implica que solo presenten crecimiento poblaciones con la mayor representatividad o cuyo nicho ecológico incluye las condiciones representadas in vitro. Para resolver este tipo de problemas se ha planteado el uso de técnicas independientes del cultivo para el estudio de comunidades bacterianas complejas.
1.4.2 Técnicas independientes del cultivo
Las técnicas independientes de cultivo tratan de resolver algunos de los problemas asociados con la identificación bacteriana, ya que el porcentaje de recuperación de las bacterias mediante técnicas tradicionales es bajo, debido a la dificultad de obtener cultivos puros de cierto microorganismo por la dependencia de las actividades de otros microorganismos o por la falta de conocimiento de no las condiciones para su cultivo. Es por lo anterior que las
técnicas independientes de cultivo tratan de determinar la diversidad microbiana en los ecosistemas, tanto en el espacio como en el tiempo, sin necesidad de recurrir al aislamiento (Díaz y Wacher, 2003).
En los últimos años los métodos moleculares basados en la extracción del ADN han tenido una gran aplicación en el campo de trabajo de la microbiología, ya proporcionan una herramienta sobresaliente para la detección, identificación y caracterización de microorganismos encontrados en muestras ambientales, alimentos y otros ecosistemas complejos (Pogacic y col., 2010). Las limitaciones de estos procedimientos suelen estar asociados con aspectos técnicos, por ejemplo en la extracción de ADN/ARN de la muestra, los errores propios de la amplificación del ADN (Forney y col., 2004).
En el Cuadro 6 se muestran algunas de las técnicas moleculares mas usadas en la microbiología.
Cuadro 6. Técnicas moleculares más frecuentes.
Identificación
Hibridación
Métodos basados en la PCR (ARDEA-PCR, ITS o RISA, amplificación de genes metabólicos)
Secuenciación del ADN Tipado (Métodos
basados en la RFLP)
Ribotipado REA-PFGE Tipado (Métodos
basados en la PCR)
RAPD;Rep-PCR ITS o RISA
AFLP
Acronimos: ARDRA, Amplification Ribosomal DNA Restriction Analysis; ITS, Internal Transcribed Spacer;
RISA, rRNA gene Internal Spacer Analysis; RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism; REA-PFGE, Restriction Endonuclease Analysis-Pulses Fiel Gel Electrophoresis; RAPD, Randomly Amplified
Polymorphic DNA; Rep-PCR, Repetitive Extragenic Palindromic PCR; AFLP, Adaptor Fragment Length Polymorphism.
1.4.2.1 Análisis del espaciador intergénico ribosomal (RISA)
El uso de métodos moleculares para describir y controlar la diversidad microbiana ha mejorado considerablemente el conocimiento de la estructura de la población en las comunidades microbianas naturales. Entre todas las técnicas moleculares disponibles para estudiar las comunidades bacterianas, el análisis del espaciador intergénico ribosomal (Ribosomal Intergenic Spacer Análisis, RISA por sus siglas en ingles) ha demostrado ser un método fiable, y relativamente barato.
RISA es un método que proporciona estimaciones de la diversidad microbiana y la composición de la comunidad sin el sesgo que impone los enfoques basados en el cultivo o la labor de la construcción de librerías de clones del gen de la subunidad de ARNr. El método implica la amplificación por PCR a partir de todo el ADN de la comunidad bacteriana del espacio intergénico (ITS: internal transcribed spacer) dentro del operón que codifica para el ARN ribosomal (rARN). En particular, el fragmento analizado corresponde a aquel espacio entre los genes que codifican para la subunidad pequeña (16S) y grande (23S) del mismo (Fisher and Triplett 1999). Este espacio intergénico 16S-23S se caracteriza por ser heterogéneo tanto en su secuencia como en la longitud del mismo. Esta heterogeneidad se debe, principalmente, a la presencia (en bacterias Gram negativas ) o ausencia (en bacterias Gram positivas) de secuencias que codifican para ARN de transferencia (tARN) en esta región intergénica (Liao, 2000). Estos dos tipos de variación (i.e. secuencia y longitud) hacen a este espacio intergénico una región muy útil para la tipificación de cepas y separación entre especies bacterianas cercanas entre sí en aquellos casos donde la secuencia del gen ribosomal 16S rARN no permite suficiente resolución (Scheinert y col., 1996). La estructura del operón rARN en bacterias comprende tres secuencias de genes y dos regiones espaciadoras (Figura 5).
Debido a su tamaño manejable de aproximadamente 1500 pb, el gen 16S del rARN se ha convertido en la parte del operón mejor caracterizado con más de 33000 secuencias de fuentes bacterianas. Sin embargo, la detección y
diferenciación basada en rADN 16S, puede ser obstaculizado por la heterogeneidad secuencial intraespecies o por homología entre especies relacionadas. Los genes de la unidad grande ribosomal del ARN, el rADN 23s, ha sido menos usado debido a su mayor tamaño. El número de secuencias disponibles en base de datos es muy pequeña, comparada con los datos de 16S (Sachse, 2003).
Figura 5. Organización estructural de genes de ARN ribosomal en bacterias (Sachse, 2003).
En los perfiles obtenidos a partir de la técnica RISA (Fisher y Triplett ,1999) concluyeron que las relaciones entre el número de fragmentos en el perfil y la diversidad absoluta de la comunidad que el perfil representa debe ser realizada con cautela. Estos autores señalan que, por un lado la existencia de solapamiento en la longitud del espacio intergénico entre organismo no relacionados puede llevar a una subestimación de la diversidad mientras que, por otro lado, un mismo organismo puede estar aportando más de una señal al perfil como consecuencia de diferencias en las longitudes de los espacios intergénicos de las distintas copias del operón, dentro de un mismo genoma.
2 OBJETIVOS
2.1 General
Elaborar queso tipo Poro con cultivos iniciadores obtenidos durante el proceso tradicional de manufactura, que mantenga las características fisicoquímicas y sensoriales del queso elaborado artesanalmente.
2.2 Específicos
• Caracterizar microbiológicamente quesos Poro colectados en Balancán, Tabasco.
• Elaborar queso tipo Poro con la adición de cultivos iniciadores seleccionados.
• Determinar las características fisicoquímicas y microbiológicas del producto obtenido.
• Evaluar las características sensoriales del queso tipo Poro.
• Conocer la evolución de las poblaciones microbianas presentes en el queso mediante la técnica molecular RISA.
3 MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales y equipo
3.1.1 Caracterización de quesos de poro
• Hielera
• Refrigerantes
• Balanza
• Quesos de poro (7, 30 y 60 días de maduración)
• Hieleras
• Refrigerantes
• Cuchillo
3.1.2 Elaboración del queso
• Ollas de 80 L
• Tina Quesera
• Prensa vertical
• Mesas de trabajo
• Termómetro
• Cronómetro
• Estufa
• Moldes de 500 g
• Termómetro
• Cronómetro
• Liras verticales y horizontales
• Manta
• Agitadores
