Universidad de Buenos Aires Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica
Desafíos de la pluripotencia y
la reprogramación celular: obstáculos en una especie refractaria y organización dinámica de los
factores de transcripción Oct4 y Sox2
Tesis presentada para optar al título de Doctora de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Biológica
Lic. Camila Vázquez Echegaray
Directora de tesis: Dra. Alejandra Guberman Consejero de estudios: Dr. Juan Carlos Calvo Buenos Aires, Diciembre 2020
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Desafíos de la pluripotencia y la reprogramación celular: obstáculos en una especie refractaria y organización dinámica de los factores de
transcripción Oct4 y Sox2
Las células madre embrionarias (CME) derivan del macizo celular interno del blastocisto y presentan dos características únicas: poder auto-renovarse indefinidamente en cultivo y dar lugar a todos los tipos celulares del organismo adulto, propiedad conocida como pluripotencia. Por otro lado, es posible reprogramar células terminalmente diferenciadas obteniendo así células madre pluripotentes (CMP) inducidas (CMPI), muy similares a las CME.
Las CMP son utilizadas actualmente en diversas áreas de estudio como biología del desarrollo, biotecnología y medicina regenerativa. Sin embargo, aún no se han logrado establecer líneas de CMP para algunas especies de interés biotecnológico como, por ejemplo, el bovino. En este trabajo nos propusimos contribuir al entendimiento de los mecanismos moleculares relevantes en el mantenimiento de la pluripotencia, y que favorecen la reprogramación celular. Para esto integramos el estudio, por un lado, de la modulación de vías de señalización asociadas a la diferenciación y pluripotencia, y por otro, de la organización dinámica de los factores de transcripción (FT) fundamentales para las CMP.
En una primera parte de este trabajo, intentamos generar CMP bovinas, utilizando dos estrategias complementarias: la derivación de CME y la generación de CMPI. Caracterizamos marcadores moleculares, estudiamos las vías de señalización asociadas a la pluripotencia en embriones bovinos y analizamos diferentes condiciones de reprogramación de células somáticas. Aunque no logramos establecer CMP, identificamos marcadores y vías de señalización relevantes en esta especie.
Una etapa fundamental, y que es cuello de botella del proceso de reprogramación, es la reactivación de los FT endógenos de pluripotencia en el genoma de las células terminalmente diferenciadas. Estos FT inducen genes necesarios para preservar el estado indiferenciado y reprimen otros involucrados en la diferenciación. Además de los niveles de expresión de estos FT, su distribución y dinámica de interacción con la cromatina impactan
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sobre la expresión génica; por lo que, en una segunda parte de esta tesis, nos centramos en el estudio de la organización dinámica de los FT Oct4 y Sox2, en diferentes contextos celulares en un modelo de ratón. Para ello, generamos líneas estables de CME, CMPI y fibroblastos que codifican los FT Oct4 o Sox2 fusionados a una proteína fluorescente. En estas líneas estudiamos la organización dinámica de estos FT en CMP indiferenciadas, al inicio de la diferenciación y en fibroblastos. Analizamos cuantitativamente la distribución subnuclear de Oct4 y Sox2, junto con la de la histona H2B y la proteína asociada a heterocromatina HP1.
Asimismo, exploramos la dinámica de interacción de estos FT, mediante espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS).
Nuestros resultados muestran que el inicio de la diferenciación dispara cambios en la organización de Oct4 y Sox2 dentro del espacio nuclear y modifica las interacciones entre estos FT y la cromatina en CMP. Esta reorganización podría contribuir a modular su función en etapas tempranas de la diferenciación antes de la disminución de sus niveles. Asimismo, encontramos diferencias entre los diferentes tipos celulares analizados. Finalmente, encontramos que el tratamiento con moléculas pequeñas que son utilizadas para aumentar la eficiencia de reprogramación promueve una reorganización de la cromatina, por lo que nos proponemos analizar la dinámica de Oct4 en presencia de las mismas, a lo largo del proceso de reprogramación.
Creemos que las herramientas generadas y los resultados de este trabajo contribuyen al entendimiento de los procesos subyacentes a la pluripotencia y relevantes durante la reprogramación celular.
Palabras clave: Células madre embrionarias, Células madre pluripotentes inducidas, Pluripotencia, Diferenciación, Reprogramación, Distribución subnuclear, Dinámica de interacción.
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Challenges of pluripotency and cell reprogramming: roadblocks in a refractory species and dynamical organization of the transcription
factors Oct4 and Sox2
Embryonic stem cells (ESCs) are derived from the inner cell mass of the blastocyst and have two main properties: they can self-renew indefinitely in culture and give rise to all cell types of the adult organism, a property known as pluripotency. On the other hand, it is possible to reprogram terminally differentiated cells, thus obtaining induced pluripotent stem cells (iPSCs), which are remarkably similar to ESCs.
Pluripotent stem cells (PSCs) are currently used in various areas of study such as developmental biology, biotechnology, and regenerative medicine. However, PSC lines have not yet been established for some species of biotechnological interest, such as cattle. In this work, we proposed to contribute to the understanding of the molecular mechanisms relevant to pluripotency, and that enhance cell reprogramming. For this purpose, we integrated the study, on the one hand, of the modulation of signaling pathways associated with differentiation and pluripotency, and on the other, of the dynamic organization of transcription factors (TFs) fundamental to PSCs.
In the first part of this work, we aimed at generating bovine PSCs, using two complementary approaches: ESCs derivation and iPSCs generation. We characterized molecular markers, studied the pluripotency-associated signaling pathways in bovine embryos and analyzed different conditions for somatic cell reprogramming. Although we were unable to establish PSCs, we identified relevant markers and signaling pathways in this species.
A fundamental stage and bottleneck in the reprogramming process, is the endogenous reactivation of the pluripotency TFs in the genome of terminally differentiated cells. These TFs induce genes required to preserve the undifferentiated state and repress others involved in differentiation. In addition to the expression levels of these TFs, their distribution and dynamics of interaction with chromatin impact on gene expression. Therefore, in a second
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part of this thesis, we focused on the study of the dynamic organization of Oct4 and Sox2 TFs, in different cellular contexts using a mouse model. To do this, we generated stable cell lines of ESCs, iPSCs and fibroblasts that encode Oct4 or Sox2 TFs fused to a fluorescent protein. In these cell lines, we studied the dynamical organization of these TFs in undifferentiated PSCs, in early differentiation and in fibroblasts. We quantitatively analyzed the subnuclear distribution of Oct4 and Sox2, together with the histone H2B and the heterochromatin- associated protein HP1. Moreover, we explored the interaction dynamics of these TFs by fluorescence correlation spectroscopy (FCS).
Our results show that early differentiation triggers changes in the organization of Oct4 and Sox2 within the nuclear space and modifies the interactions between these TFs and chromatin in PSCs. This reorganization could contribute to modulate their function at early stages of differentiation before their levels are downregulated. We also found differences among the different cell types analysed. Finally, we report that the treatment with small molecules that are used to increase the reprogramming efficiency promotes a chromatin reorganization. Consequently, we propose to analyze Oct4 dynamics in presence of these small molecules, throughout the reprogramming process.
We believe that the generated tools and results obtained in this work contribute to the understanding of the processes underlying pluripotency and are relevant during cell reprogramming.
Keywords: Embryonic stem cells, Induced pluripotent stem cells, Pluripotency, Differentiation, Reprogramming, Subnuclear distribution, Dynamical interaction.
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AGRADECIMIENTOS
“Gracias por el aguante”
Que agradecida y afortunada me siento de tener tantas personas a las cuales decirle gracias por el aguante durante todos estos años, en esta montaña rusa que fue el doctorado.
A Ale, por dejarme ser parte de su laboratorio, donde aprendí a amar la ciencia en todas sus formas.
Gracias por ser una directora increíble, una jefa codo a codo, una amiga, una mama, una optimista de todos los días. Como siempre digo, y seguiré repitiendo, es un privilegio ser parte de tu grupo.
A toda la banda del labo QB71: Aye, Vicky, Mark, Pau y Cami. Por ser incondicionales, y aguantarme en las buenas y en las no tan buenas, por hacer que ir a trabajar también incluya los infinitos mates compartidos, las risas, la música de fondo y la amistad. A Clau, que me enseñaste la “mesada” y sos una amiga de fierro. A Ari, por transmitirme con toda su genialidad la locura y la pasión que tienen hacer ciencia, y ser el rey del brainstorming. A Sole, por compartir los hobbies y enseñarme que, en el labo, ¡hay que usar la practicidad! A Jesi, que apostó en mí y me abrió el camino a aprender cosas nuevas. A Vale y todo su grupo en QB6 por la buena onda y gran predisposición siempre.
A todas y todos los integrantes del Departamento de Química Biológica y el IQUIBICEN, por la ayuda en innumerables ocasiones, las charlas en el pasillo, el compañerismo todos estos años. A Ricardo Alberio y las chicas de Agronomía por su ayuda. A Santiago y la gente del FLENI, por su solidaridad y gran soporte. Gracias al CONICET por otorgarme la beca para realizar mi doctorado. Gracias a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y a la Universidad de Buenos Aires por ser mi segundo hogar durante muchos años, y a la educación pública, libre y gratuita, que me formó desde el inicio.
A mi gran, gran familia que amo tanto. No hubiese llegado hasta acá sin ustedes. A mi mamá y mi papá, por ser incondicionales, por siempre acompañarme y enseñarme a ser libre, sensible y perseverante. A mis hermanas Luli y Mili y hermano Rodri, que siempre me dan energía para seguir y son mi sostén. A mis abuelas y mis abuelos, que son simplemente lo más de lo más. A mi numerosa familia de tías, tíos, primas, primos, sobrino, sobrina, etc, etc. Gracias por siempre estar presentes y hacer la vida mucho más linda. A mis amigas y amigos de la vida y de la facultad.
A Home y Coco, mis amigos de aventuras y estudio. Gracias a Luis, mi gran compañero y amigo en este camino, mi confidente y el que siempre me empuja a seguir. No lo hubiese logrado sin vos, te amo y nunca me van a alcanzar las palabras para agradecerte tu incondicionalidad. A Benja, que es lo mejor que me pasó en la vida, gracias por venir a dar vuelta mi mundo y enseñarme todo de nuevo.
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Para Mari y el Osqui, Que me dan fuerza todos los días, Y sé que festejan conmigo el cierre de esta etapa.
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INDICE
RESUMEN ... 1
ABSTRACT ... 3
AGRADECIMIENTOS ... 5
INDICE ... 7
PUBLICACIONES Y FINANCIAMIENTO ... 9
ABREVIATURAS ... 10
1. INTRODUCCION ... 12
1.1. Desarrollo embrionario de mamíferos ... 12
1.2. Células madre pluripotentes ... 17
1.3. Cromatina y compartimentalización del núcleo ... 29
1.4. Reprogramación celular ... 36
2. HIPOTESIS Y OBJETIVOS ... 48
3. RESULTADOS - PARTE I | Pluripotencia y reprogramación en células bovinas ... 50
3.1. Modulación de vías de transducción de señales involucradas en la pluripotencia en embriones bovinos ... 51
3.2. Reprogramación de fibroblastos embrionarios bovinos ... 66
4. RESULTADOS - PARTE II | Organización dinámica de Oct4 y Sox2 en células madre pluripotentes y en la reprogramación celular ... 76
4.1. Generación de líneas celulares inducibles ... 79
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4.2. Reorganización dinámica de la cromatina y los FT Oct4 y Sox2 durante la
diferenciación temprana de CME ... 93
4.3. Organización dinámica de la cromatina y Oct4 en CMPI y en fibroblastos embrionarios ... 109
4.4. Distribución de H2B y HP1α en MEF en condiciones que favorecen la reprogramación celular ... 118
5. DISCUSION ... 129
6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS ... 146
7. MATERIALES Y METODOS ... 147
7.1. Cultivo de embriones de producción in vitro ... 147
7.2. Cultivo celular ... 148
7.3. Técnicas microbiológicas ... 154
7.4. Protocolos de reprogramación ... 155
7.5. Generación de líneas estables ... 161
7.6. Análisis de modificaciones en el genoma ... 163
7.7. Técnicas de análisis de expresión génica ... 163
7.8. Análisis de ciclo celular ... 169
7.9. Microscopía Confocal ... 170
7.12. Análisis estadísticos ... 173
8. BIBLIOGRAFIA ... 174
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PUBLICACIONES Y FINANCIAMIENTO
Los resultados de este trabajo de Tesis forman parte de las siguientes publicaciones:
“Exogenous human OKSM factors maintain pluripotency gene expression of bovine and porcine iPS‑like cells obtained with STEMCCA delivery system.” Canizo, J; Vazquez Echegaray, C; Klisch, D; Aller, J; Paz, D; Alberio, R. H; Alberio, R; Guberman, A. BMC Res Notes 11:509 (2018). https://doi.org/10.1186/s13104-018-3627-8.
“A dose-dependent response to MEK inhibition determines hypoblast fate in bovine embryos.” Jesica R. Canizo, J; Ynsaurralde Rivolta, A. E.; Vazquez Echegaray, C; Suvá, M;
Alberio, V; Aller, J; Guberman, A; Salamone, D; Alberio, R. H; Alberio, R. BMC Developmental Biology 19:13 (2019). https://doi.org/10.1186/s12861-019-0193-9.
“Dynamical reorganization of pluripotency transcription factors Oct4 and Sox2 during early differentiation of embryonic stem cells.” Verneri, P.*; Vazquez Echegaray, C.*; Oses, C.;
Stortz, M.; Guberman, A.; Levi, V. Scientific Reports 10, 5195 (2020).
https://doi.org/10.1038/s41598-020-62235-0. *Primer autoría compartida.
Financiamiento:
Universidad de Buenos Aires CONICET
ANPCyT
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ABREVIATURAS
ACF Función de Autocorrelación
ADN Ácido Desoxiribonucleuico
ADNc ADN Complementario
ARN Ácido Ribonucleico
ARNm ARN mensajero
BMP Proteína Morfogénica del Hueso
FGF Fibroblast Grow Factor
BSA Seroalbúmina Bovina
ChIP Inmunoprecipitación de la Cromatina CME Células Madre Embrionarias
CMP Células Madre Pluripotentes
CMPI Células Madre Pluripotentes Inducidas
CRISPR Clustered regularly interspaced short palindromic repeats
DMSO Dimetil-sulfóxido
DNMTs Metiltransferasa de ADN
dNTPS desoxi-ribonucleótidos-trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) EpiLCs Epiblast-like Cells
EpiSCs Epiblast Stem Cells
FT Factor de Transcripción
FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy
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GSCs Germinal Stem Cells
GSK3 Glucógeno-Sintetasa Quinasa 3
HP1α Proteína Asociada a Heterocromatina 1α
IF Inmunofluorescencia
LIF Factor Inhibidor de Leucemia LLPS Liquid-Liquid Phase Separation
MCI Macizo Celular Interno
MEF Fibroblastos Embrionarios Murinos MET Transición Mesénquima-Epitelial PGCs Primordial Germinal Cells
qPCR Reacción en Cadena de la polimerasa Cuantitativa
RT-qPCR Reverse Transcriptase Quantitative Polimerase Chain Reaction
SFB Suero Fetal Bovino
TE Trofoectodermo
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1. INTRODUCCION
1.1. Desarrollo embrionario de mamíferos
Una de las preguntas más fascinantes de la biología es cómo a partir de la fertilización de una única célula es posible la formación de un organismo completo. El desarrollo de este organismo requiere una enorme diversificación y especialización celular que implican procesos complejos como la diferenciación celular, la morfogénesis de los tejidos y el crecimiento en el espacio. La coordinación temporal es regulada por la toma de decisiones en el destino celular, siendo las primeras durante el desarrollo temprano del embrión, antes de su implantación. Eventualmente, el cigoto totipotente sufre una pérdida concomitante de su potencial de desarrollo a medida que se diferencia, comenzando por la especificación de los linajes embrionarios [1]. Los mecanismos celulares y moleculares que gobiernan el balance entre el potencial de desarrollo y la especificación de los linajes es un gran campo de investigación, en el cual el embrión de ratón es un importantísimo modelo de estudio.
Luego de la fecundación, el desarrollo de los mamíferos continúa mediante un proceso denominado segmentación. Éste consiste en una serie de divisiones mitóticas mediante las cuales el gran volumen del cigoto es dividido en numerosas células más pequeñas, denominadas blastómeros. De esta manera, el cigoto se divide primero a la mitad, luego en cuartos, en octavos y así sucesivamente hasta formar una masa compacta de células denominada mórula. Los embriones de mamíferos producen un conjunto de linajes extraembrionarios previo a generar las células ‘fundadoras’ del embrión propiamente dicho.
El rol principal de estos linajes es mediar la implantación en el útero materno, así como sostener el crecimiento del feto [2]. La mórula sufre una cavitación y da origen al siguiente estadío, el blastocisto, que consiste en una capa externa de células llamada trofoectodermo (TE) y una masa interna de células denominada macizo celular interno (MCI) [3]. Los destinos de las células que van a dar lugar al MCI y al TE son mutuamente excluyentes. Es decir, la etapa en que se define a cuál de estos dos grupos va a formar parte cada célula constituye el
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primer evento de diferenciación en el desarrollo embrionario de mamíferos [4]. El TE es responsable de la implantación del embrión en el útero y contribuye a la formación de la placenta [5]. En cuanto al origen de los tejidos tempranos del embrión propiamente dicho ocurre como consecuencia de la reorganización y diferenciación de las células del MCI. Esto sucede justo antes de la implantación del embrión en el útero materno, con la segregación en dos capas: el hipoblasto o endodermo primitivo, y el tejido remanente del MCI, el epiblasto o ectodermo primitivo [6]. Las células del hipoblasto se extienden desde el MCI revistiendo la cavidad del blastocisto, donde dan origen al endodermo visceral y el endodermo parietal luego de la implantación, los cuales forman la mayor parte del saco vitelino [7]. En tanto, el epiblasto responde a señales extrínsecas y originará al embrión, siendo el tejido del cual derivan absolutamente todas las células del organismo adulto [8], [9]. La Figura 1.1 muestra esquemáticamente los tipos celulares generados en el desarrollo embrionario.
Figura 1.1.- Esquema de los distintos tipos celulares generados durante el desarrollo embrionario de mamíferos. Luego de la fertilización, el cigoto comienza una serie de divisiones hasta el estadío de mórula, donde comienza la especialización de células hacia el macizo celular interno (MCI), de donde se obtienen las células madre embrionarias (CME), y el trofoectodermo (TE), que contribuirá a la
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implantación y a tejidos extraembrionarios. El MCI dará lugar al endodermo primitivo y al epiblasto, que a su vez se diferencia hacia células de las tres capas germinales (endodermo definitivo, mesodermo y ectodermo). A partir del epiblasto, se segregan las células germinales.
En ratón, los factores de transcripción (FT) Oct4 y Cdx2 han sido identificados como proteínas requeridas en la primera especificación celular del embrión, en células del MCI [10]
y del TE [11], respectivamente. Oct4 es expresado en todas las células del embrión (blastómeros) en las etapas tempranas de desarrollo, pero posteriormente, durante la formación del blastocisto, se expresa únicamente en las células del MCI. La diferenciación de las células externas de la mórula en células del TE comienza con anterioridad a la disminución de Oct4 en dichas células, y es promovida por la expresión de Cdx2 [12]. Los marcadores moleculares identificados en la segunda diferenciación celular del embrión de ratón, es decir aquella que se lleva a cabo en el MCI para generar las células del hipoblasto y el epiblasto, se muestran en la Figura 1.2. Nanog es un FT que se expresa en el MCI del embrión, y durante la segunda diferenciación continúa expresándose únicamente en las células del epiblasto [13].
Este factor reprime la diferenciación a hipoblasto de las células del epiblasto, así como Oct4 inhibe la diferenciación del MCI hacia TE en la primera etapa. En las células del MCI el FT Gata6 inicia y promueve la diferenciación hacia hipoblasto, que dará lugar al endodermo parietal y visceral que forman el saco vitelino [14]. En la Figura 1.2 se encuentra una breve esquematización de estos procesos.
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Figura 1.2.- Desarrollo embrionario de ratón desde la fertilización hasta el estadío de blastocisto, previo a su implantación. En la parte superior se muestran imágenes de microscopía de campo claro de distintas etapas del desarrollo embrionario temprano de ratón, identificando los distintos tipos celulares y los días desde la fecundación (E0.0). Debajo se muestra una representación de los 2 primeros eventos de diferenciación celulares que dan lugar a la segregación de los linajes. Cada color representa los marcadores de cada linaje. Modificado de Schrode et al [15].
Diferencias en el desarrollo temprano de mamíferos
El desarrollo pre-implantatorio ha sido exhaustivamente estudiado en ratón, principalmente por razones técnicas y éticas. Se han logrado describir con gran detalle las distintas etapas del desarrollo, y los factores involucrados en la especificación de los linajes hasta el estadío del blastocisto. Sin embargo, el desarrollo embrionario temprano previo a la formación del epiblasto no sigue temporalmente el mismo programa en ratón que en otros mamíferos [16]. Si bien todas las especies atraviesan etapas similares en el desarrollo, y
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forman un blastocisto compuesto por el epiblasto, el hipoblasto y el TE, muchos estudios han revelado diferencias en cuanto a los patrones de expresión de algunos marcadores de linaje y en la modulación de las vías de señalización [16]–[18].
En la tabla 1.1 se encuentran enumeradas distintas especies de mamífero y la caracterización de eventos relevantes durante el desarrollo embrionario pre-implantatorio.
Tabla 1.1- Comparación de las características del desarrollo embrionario entre mamíferos. E: día embrionario; EGA: activación del genoma del embrión; MCI: macizo celular interno, ND: no determinado; TE: trofoectodermo. Adaptado de Alberio et.al. [16]
Como mencionamos previamente, en ratón, el primer evento de diferenciación se caracteriza por la formación del MCI y el TE en el día 3.5. Luego, Entre los días 3.5 y 4.5 (E3.5- E4.5), se forma el hipoblasto en la base del MCI, y eventualmente delimita la cavidad blastocélica. En humanos, cerdos y vacas la formación del blastocisto ocurre varios días después. Todos los procesos, como la activación del genoma del embrión en la transición materno-embrionaria, la polarización, la compactación, e implantación ocurren en tiempos más cortos en el ratón que en el resto de los mamíferos. Asimismo, en la mayoría de los mamíferos, la especificación del TE y el MCI parece preceder la formación del epiblasto y el
Característica
Estadío embrionario
Ratón Humano Conejo Cerdo Vaca
EGA 2 células 4-8 células 4-8 células 4-8 células 8-16 células Polarización 8 células 8-16 células 32 células 16 células 16 células Compactación 8 células 16-20 células 32 células 32 células 32 células
Segregación de linajes
1°: CMI-TE 2°: Epi-Hipo
1°: CMI-TE
2°: Epi-Hipo ND 1°: CMI-TE
2°: Epi-Hipo
1°: CMI-TE 2°: Epi-Hipo Restricción de
linajes
MCI: 32-64 células TE: 16-32 células
MCI: ¿?
TE: Blastocisto(?) ND ND MCI: ¿?
TE: Blastocisto(?)
Implantación E4.5 E7-9 E6-7 E11-13 E12
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hipoblasto. Sin embargo, en el embrión humano se ha reportado que estos procesos ocurren simultáneamente [16].
Otra diferencia importante para destacar es lo que sucede en los embriones de cerdo y vaca, al momento de la implantación. Una fina capa de células del TE que rodea al epiblasto se degenera y expone al epiblasto hacia el lumen uterino, y por consiguiente, en contacto directo con el epitelio del útero. Esta exposición coincide con la iniciación de un período de rápido crecimiento del embrión. En el cerdo, por ejemplo, el blastocisto expandido se elonga adoptando una forma filiforme de hasta un metro de largo en unos pocos días. Este crecimiento y reorganización afecta principalmente al TE e hipoblasto, pero no al epiblasto, y probablemente refleja la necesidad creciente de nutrientes por parte del embrión, por lo que aumenta el área de contacto con la madre. Finalmente, mientras que las células del TE de ratón se adhieren e invaden el endometrio en el día 4.5 después de la fecundación, el período de implantación es retrasado hasta el día 12-14 en cerdo y vaca, y termina entre los días 17- 19 en cerdo y 19-20 en vacas. En resumen, en estas especies, el período pre-implantatorio es mayor que en humanos y ratones, y corresponde a una expansión de las células de TE y a un retraso del crecimiento del embrión. Por lo tanto, resulta lógico pensar que las condiciones necesarias para el establecimiento de los cultivos celulares de células madre derivadas de vacas y cerdos no corresponden con el de otras las especies más estudiadas [19].
1.2. Células madre pluripotentes
Propiedades fundamentales y tipos de células madre
Las células madre son células que cumplen con dos propiedades fundamentales: la auto-renovación y la capacidad de diferenciarse [20]. Se denomina auto-renovación al proceso mediante el cual una célula se divide mitóticamente generando dos células hijas similares a ella misma, conservando la pluripotencia por largos períodos de tiempo. La diferenciación, por otra parte, implica la conversión fenotípica de una célula con una dada identidad a otro tipo celular, en la mayoría de los casos con un grado de especialización mayor que le permite cumplir una determinada función.
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Existen distintos tipos de células madre que pueden clasificarse según su potencial de diferenciación (Figura 1.3). El cigoto y los primeros blastómeros se consideran totipotentes dado que presentan el mayor potencial y pueden dar el organismo completo. En cambio, las células madre adultas o somáticas son multipotentes, ya que presentan un grado menor de potencialidad y sólo se diferencian a un tipo celular específico. Estas células están ampliamente distribuidas en el organismo adulto, siendo algunos ejemplos las células madre hematopoyéticas y las células madre mesenquimales de la médula ósea. Presentando potencial intermedio se encuentran las células madre pluripotentes (CMP), como por ejemplo las células madre embrionarias (CME) y las células madre pluripotentes inducidas (CMPI).
Figura 1.3.- Tipos de células madre y su potencial de diferenciación. A medida que avanza el desarrollo de un individuo, disminuye el potencial de diferenciación. El cigoto tiene la capacidad de generar un organismo entero, y por lo tanto es totipotente. Las células madre embrionarias son pluripotentes dado que pueden generar todos los tejidos del organismo, y las células madre adultas son multipotentes, por lo que pueden diferenciarse a tipos celulares acotados. Por otro lado, las células
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madre pluripotentes inducidas son células pluripotentes generadas a partir de la reprogramación de células terminalmente diferenciadas del individuo adulto.
Las CMP representan un tipo celular de gran interés por su gran potencial de diferenciación, ya que, si bien no pueden generar un organismo completo por sí mismas, pueden diferenciarse a todos los tipos celulares del individuo adulto. Existen muchos tipos de CMP que pueden ser aisladas, y se las clasifica según el tipo de célula del cual se originan. Son representadas por las CME, las células madre epiblásticas (EpiSCs), las células germinales primordiales (PGCs), las células madre germinales derivadas de espermatogonias (GSCs), las CMP obtenidas por transferencia nuclear a oocitos (NT-CME) y por las células madre pluripotentes inducidas (CMPI), obtenidas a partir de reprogramación de células terminalmente diferenciadas, las cuales describiremos en profundidad más adelante.
Figura 1.4.- Distintos tipos celulares pluripotentes pueden ser derivados en distintos estadíos del desarrollo, tanto a en embriones de ratón como de humano. Alernativamente, las células somáticas
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también pueden ser reprogramadas a través de distintos abordajes para adoptar un fenotipo pluripotente. Modificado de Weiberger et al [21].
La clasificación de los distintos tipos de CMP resulta sumamente interesante para el estudio de los diversos estados de pluripotencia, un concepto que ha cobrado mucha relevancia en los últimos años [21]–[24], y que destaca la idea de que no todos los tipos de CMP son equivalentes.
El estado pluripotente es un continuo que se extiende por un período acotado en el desarrollo embrionario, y gradualmente disminuye a medida que avanza la diferenciación, siendo la gastrulación el momento donde las células del epiblasto toman la identidad de las 3 capas germinales principales: el mesodermo, el endodermo y el ectodermo. Este período de transición se encuentra gobernado por programas transcripcionales y marcas epigenéticas que cambian durante el desarrollo de la población celular pluripotente. Los aspectos de este continuo pueden ser capturados in vitro para conformar cultivos celulares de los distintos tipos de CMP [25].
En base a esto, el epiblasto pre-implantatorio (en ratón, en E3.5) está conformado por una población homogénea de células a la que normalmente se la refiere como en un estado
‘ingenuo’ (naïve), ya que aún no poseen ninguna predisposición a la diferenciación hacia algún linaje específico [6], [26]. El epiblasto así formado es un conjunto de 10-20 células no especializadas que se encuentran rodeadas por el hipoblasto y el TE. Cuando las células en este estadío temprano son aisladas y luego microinyectadas en otro blastocisto pueden contribuir a todos los linajes del organismo, formando un animal quimera. Debido a esto, se dice que el epiblasto pre-implantatorio representa el estado fundamental o basal del desarrollo (del inglés, developmental ground state) [2].
Luego de la implantación, estas células evolucionan en el epiblasto post-implantatorio temprano (en ratón, en E4.5) que son influenciadas por un gran número de factores inductores provenientes del endodermo primitivo y el TE adyacentes, como FGF (fibroblast growth factors), proteínas BMP (bone morphogenic proteins), WNT y sus respectivos antagonistas [27]. De esta manera, las células comienzan a especificarse dependiendo de su localización, generando un conjunto heterogéneo celular [28]. Si bien estas especificaciones
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no son definitivas y pueden manipularse artificialmente mediante el trasplante celular a otros embriones [29], las células en esas condiciones ya no se encuentran en un estadio naïve, sino que se las refiere como en un estado primed de pluripotencia, en el cual no pueden contribuir a la formación de quimeras luego de la microinyección en blastocistos receptores.
Finalmente, con la gastrulación, las células del embrión temprano de ratón ya no pueden generar todos los tipos del organismo, es decir, pierden su pluripotencia y pasan a ser multipotentes [30].
La transición del estado de pluripotencia naïve a primed ha centrado la atención en los últimos años dado que es un paso crucial en el desarrollo de mamíferos, donde entra en escena la aparición de las capas germinales y la eventual generación de órganos. A partir del año 2017, varios trabajos han descripto una población de células pluripotentes denominadas como intermediarias naïve-primed (naïve-primed intermediate) [31], pausadas (poised) [32] o formativas (formative) [33], generadas in vitro. Este nuevo estadío de pluripotencia se ubica como puente entre los ya caracterizados estados naïve y primed, presentando rasgos propios que las diferencian, siendo todas etapas transitorias en el desarrollo temprano. Si bien se hipotetizaba sobre la existencia real de este tercer estado [24], [34], muy recientemente han salido a la luz varios trabajos donde reportan y caracterizan la obtención en cultivo de este tipo celular tanto con embriones de ratón como de humano [35], [36]. Estos trabajos revelan la existencia de las llamadas células FS (formative stem cells) o RSC (rossete-like stem cells), que co-expresan marcadores tanto del estado naïve como primed, y responden a la inducción de diferenciación hacia células germinales, una capacidad que no se presenta en las EpiSC o en las CME, a menos que atraviesen por 24-48 h por el estadío de epiblast-like cells (EpiLCs), que corresponde a células similares a epiblasto. Serían entonces intermediarios de alta plasticidad, con potencial de desarrollo bidireccional (Figura 1.5).
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Figura 1.5.- Etapas de pluripotencia según avanza el desarrollo embrionario. Comenzando con la aparición de las CME, atraviesan el estado naïve hasta su capacitación e instrucción hasta el estado primed. A partir de allí asumen el compromiso de su linaje celular. El período de pluripotencia formative abarca desde el epiblasto post-implantatorio temprano en la etapa E5.0 hasta el epiblasto en “cilindro” alrededor del estadío E6.5, en el desarrollo del ratón. Modificado de Smith et. al [24].
Por último, se ha descripto la obtención de las EPSC (expanded pluripotent stem cells), tanto de ratón, humano y cerdo, que corresponden a células provenientes de embriones de 8 células, y que representan una etapa muy temprana de pluripotencia, previo al estadío naïve [37]–[39]. Estas células son estables en el tiempo en cultivo y pueden generar células tanto del linaje embrionario como del extraembrionario.
Dentro de este fascinante mundo de posibilidades de pluripotencia, determinar el grado de conservación evolutiva que tienen estas células es vital para establecer generalidades y su significado en el desarrollo embrionario de mamíferos. Sin embargo, es importante recordar que la pluripotencia in vivo no es un estado estable en la naturaleza, y por lo tanto, no se aplica el concepto de auto-renovación, por lo que las conclusiones que se tomen de los experimentos in vitro puede exhibir cierto grado de disparidad. Sin lugar a duda, este es un tema de investigación candente, del cual seguramente surgirá información altamente relevante en el futuro cercano.
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Mantenimiento y diferenciación de CMP en cultivo celular
En 1981 se derivaron por primera vez CME a partir del MCI de blastocistos de ratón al día 3.5 del desarrollo, y fueron mantenidas en cultivo sobre fibroblastos (feeder layer), sin tener información sobre los factores que secretaban estas células y las mantenían en estado indiferenciado [40], [41]. Luego, se descubrió que la citoquina LIF (leukemia inhibitory factor) podía reemplazar a la feeder layer, manteniendo las CME en presencia de este compuesto y medio de cultivo conteniendo suero fetal bovino (SFB) en placas pre-tratadas con gelatina [42], [43]. LIF mantiene el estado indiferenciado en parte al inactivar a la enzima GSK3 (glycogen synthase kinase-3), la cual normalmente reprime la expresión de los factores de transcripción Nanog y c-Myc, necesarios para el mantenimiento del estado indiferenciado.
Por otra parte, se encontró que el SFB contenía otra molécula clave para el mantenimiento de la pluripotencia, el BMP4 (bone morphogenic protein 4). Este factor inhibe la vía de ERK, la cual se activa autócrinamente por FGF-4 e induce la diferenciación hacia linajes neurales [20].
La condición SFB/LIF logró simplificar la metodología para el cultivo de CME y, aún más importante, mantuvo la pluripotencia de las células. Sin embargo, las células en estos cultivos son una población heterogénea en términos de expresión de ciertos genes de pluripotencia como Nanog, Stella, Rex1, Esrrb y Klf4 [13], [44].
Distintas investigaciones sobre el efecto de suprimir genética o químicamente la señalización de FGF/ERK llevó al descubrimiento de que el bloqueo directo de esta vía combinado con la inhibición parcial de GSK3 permite la propagación de CME en ausencia de BMP4 e incluso LIF [45], [46]. La versión ahora ampliamente adoptada de este sistema, denominada 2i, comprende dos inhibidores selectivos de moléculas pequeñas dirigidos contra MEK (PD0325901) y GSK3 (CHIR99021), bloqueando ambas vías de señalización (Figura 1.6). Las CME cultivadas en 2i son en gran medida homogéneas en términos de expresión génica y morfología [47], [48], especialmente si también se incluye LIF en el medio de cultivo [49]. De esta manera, las CMP cultivadas en estas condiciones permanecen en un estado ground state de pluripotencia, y representan la inmortalización in vitro del epiblasto naïve del embrión de ratón [2], [50].
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Figura 1.6.- Mantenimiento de la pluripotencia en estado ground state en cultivo celular. Vías de señalización extrínsicas que refuerzan o antagonizan el estado de pluripotencia naïve. Esquema simplificado de varias cascadas de señalización que modulan la auto-renovación y pluripotencia. Las flechas indican activación, y las flechas de punta roma, inhibición o bloqueo en la actividad del efector blanco. Las líneas continuas indican un efecto directo o descripto, y las líneas punteadas un efecto indirecto o inferido. La vía de BMP4 está activa en presencia de SFB y actúa mediante los factores SMAD induciendo los genes Id. La señalización por LIF afecta muchas vías, una de ellas involucra la activación de JAK y fosforilación de STAT3, que induce la expresión de FT en el núcleo. La vía canónica de señalización por WNT bloquea la actividad de la GSK3, llevando a la estabilidad de β-catenina, que en respuesta anula la represión dada por TCF3. CHIR imita la acción de la señalización por WNT ya que inhibe a GSK3. A través de la señalización por FGF se activa la vía de MAPK, que lleva a la fosforilación de MEF, que a su vez fosforila y activa a ERK. La activación de ERK promueve la transición a un estado de pluripotencia primed, que es bloqueado por la acción del inhibidor farmacológico de MEK, PD.
Modificado de Hackett et. al [51].
Como mencionamos anteriormente, la pluripotencia es la capacidad de generar células de las tres capas embrionarias: endodermo, mesodermo y ectodermo. Para evaluar la pluripotencia in vitro, suele utilizarse un protocolo de diferenciación de CMP no dirigido que se basa en la formación de cuerpos embrioides (Hanging drop) [52]. También es posible realizar una diferenciación no dirigida sacando directamente del medio de cultivo a LIF y 2i.
La ausencia de estas moléculas es suficiente para que las CMP salgan del estado de
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pluripotencia naÏve [33]. Estos protocolos de diferenciación no dirigidos permiten obtener una mezcla de células diferenciadas representantes de los tres linajes, por lo que puede evaluarse su presencia mediante análisis de expresión de marcadores moleculares específicos. Por otro lado, los ensayos in vivo utilizados para evaluar pluripotencia consisten en la formación de teratomas y de animales quimera [53].
La capacidad de las CMP de diferenciarse hacia todos los tipos celulares genera una gran promesa en la clínica para la regeneración de tejidos [54]. En los últimos años se ha publicado un gran número de investigaciones en las que se desarrollaron condiciones de cultivo y protocolos adecuados para diferenciar CME a un amplio espectro de linajes [55].
Además, el estudio de estas diferenciaciones permitió la generación de modelos in vitro de desarrollo embrionario, así como modelos de enfermedades y modelos para ensayo de diversos fármacos. Los protocolos de diferenciación dirigida se basan en distintas maneras de cultivar las células, generalmente mediante medios definidos que contienen factores específicos que promueven la diferenciación hacia cada linaje. La eficiencia de diferenciación no suele ser total, y es necesario continuar investigando los mecanismos moleculares que gobiernan cada diferenciación dirigida para optimizar estos protocolos.
Factores de transcripción fundamentales de CMP
Las vías de señalización descriptas previamente interactúan de manera concertada para mantener el programa de expresión génica característico de las CMP, mediante la activación de efectores que preservan el estado indiferenciado e inhiben la expresión de genes que promueven la diferenciación. Los efectores responsables de coordinar los programas transcripcionales son los FT de pluripotencia, siendo Oct4, Sox2 y Nanog los más relevantes [56], [57].
La proteina Oct4 (Octamer transcription factor 4) es el FT esencial en el mantenimiento del estado pluripotente [58]. Se expresa desde las primeras células del embrión humano, de ratón y de otros mamíferos. En ratón, su expresión se restringe desde el estadío de dos células hasta el MCI y el epiblasto, mientras que en humanos se expresa en el blastocisto y en el TE. Cambios en los niveles de expresión de Oct4, tanto su aumento como
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su disminución, producen una diferenciación de las CME generando células con marcadores de endodermo y TE, respectivamente. Esto demuestra el delicado y complejo balance que se requiere en la regulación de sus niveles para mantener el estado pluripotente [59].
Asimismo, Oct4 forma complejos multiméricos con distintos FT, que activan o reprimen la expresión de sus genes blanco. Uno de los FT mejor caracterizado con el que interactúa es Sox2 (Sex determining Region Y-box 2). Este factor también es expresado por células del MCI durante el desarrollo y su expresión persiste en el endodermo extraembrionario y en progenitores neurales [60]. En CME, su sobre-expresión induce la diferenciación hacia células del tejido neural, mientras que su disminución desencadena la diferenciación a TE. Sox2 forma heterodímeros con Oct4, y esta interacción favorece la estabilización de este último factor [61].
Recientemente, se demostró que pequeños cambios en los niveles de Oct4 y Sox2 afectan el destino celular, específicamente si ocurren durante la fase G1 del ciclo celular [62].
Se ha propuesto que este efecto puede estar relacionado con que ambos FT tienen actividad de “FT pioneros”, es decir que tienen la capacidad de acceder a sus sitios blanco en el ADN en regiones de cromatina compacta y aumentar su grado accesibilidad [63]. En este sentido, se encontró que con altos niveles de Oct4 se aumenta la accesibilidad a la cromatina, particularmente en enhancers asociados a genes de diferenciación. Esto sugiere que las pequeñas fluctuaciones en los niveles de estos FT pioneros pueden impactar en las decisiones del destino celular mediante el control en la accesibilidad a los elementos regulatorios de genes asociados a diferenciación. Asimismo, estos FT actuarían reabriendo la cromatina en regiones compactas inmediatamente luego de la división celular [62], de manera consistente con su requerimiento, específicamente en la transición entre mitosis y G1 [64].
Respecto a la actividad como FT pioneros, recientemente se logró mapear de manera precisa el sitio en el que se une Oct4 al nucleosoma, y se encontró que la histona linker H1 compite con este FT por la unión a la cromatina [65]. Finalmente, destacamos que la actividad más relevante de los FT pioneros es que inician interacciones cooperativas con otras proteínas reguladoras conduciendo a cambios en la estructura local de la cromatina. Es decir, su actividad no está limitada a un aumento en la accesibilidad, sino que pueden además inducir otros cambios como compactarla y reprimir la expresión génica [66]. Como veremos más
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adelante, la regulación de la dinámica de la cromatina es clave en el control de la expresión génica en general, y particularmente en CMP, es fundamental en la definición del destino celular.
Otro FT fundamental del estado indiferenciado es Nanog, que fue descubierto por los grupos de Austin Smith y Shinya Yamanaka en dos estudios publicados simultáneamente en 2003 [67], [68]. Ambos grupos identificaron este FT como el responsable de la pluripotencia en el MCI y en las CME, ya que puede mantener la autorrenovación de las CME de una manera independiente de LIF. Asimismo, en embriones carentes de Nanog, el MCI no genera células del epiblasto. Estos trabajos fundadores revelaron que Nanog juega un papel clave como regulador maestro que define la identidad y la pluripotencia de las CME. Junto con Oct4 y Sox2, Nanog define la red transcripcional que controla la formación y el mantenimiento del MCI durante el desarrollo embrionario, y en conjunto mantienen la autorrenovación de las CME, como describiremos a continuación [69]–[72].
El desarrollo de métodos que permiten un análisis a escala global (genome-wide o high-throughput) de la distribución de los FT a lo largo de todo el genoma ha permitido conocer diversos genes blanco de estos factores. Estos trabajos revelaron que Oct4, Sox2 y Nanog comparten un gran número de genes blanco, co-ocupando sitios de unión en sus regiones promotoras. Además, estos FT se unen a sus propios promotores auto-regulando su expresión mediante un feedback positivo [73]–[77]. Aproximadamente la mitad de los genes blanco de Oct4 son compartidos con Sox2. Asimismo, el 70% de los genes blanco compartidos con Oct4 y Sox2 también están asociados con Nanog (Figura 1.7a). De esta manera, está fuertemente establecido que los tres FT Oct4, Sox2 y Nanog forman el núcleo de una red regulatoria de la transcripción en CMP que mantiene la estabilidad de estas células, induciendo genes necesarios para el mantenimiento de la pluripotencia y reprimiendo genes de diferenciación (Figura 1.7b).
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Figura 1.7.- (a) Número de regiones promotoras de genes a los que son reclutados Oct4, Sox2 y Nanog.
Las intersecciones de los diagramas representan los loci que son ocupados por dos o por los tres FT simultáneamente. Modificado de Li et. al [78]. (b) Los FT Oct4, Sox2 y Nanog inducen la expresión de genes relevantes para el mantenimiento de la pluripotencia y reprimen genes relacionados con diferenciación celular. Modificado de Macarthur et. al [79].
Obstáculos en la obtención de CMP de diversas especies animales
La obtención de líneas estables de CMP de algunas especies de mamífero sigue siendo un gran desafío en el área de la biología del desarrollo. Estas células atraen gran interés por parte de la comunidad científica, y de la sociedad en general, debido a su potencial biomédico y biotecnológico.
Históricamente, el modelo de ratón ha servido como referencia para elucidar los mecanismos que regulan el desarrollo embrionario temprano [40], [41]. Sin embargo, la evidencia brindada por diversos estudios en otras especies de mamífero ha demostrado que existen diferencias cruciales en el control de estos procesos. Por muchos años se intentó establecer sin éxito CME humanas utilizando las condiciones de derivación funcionales para las células de ratón. Finalmente, fueron derivadas a partir de blastocistos provenientes de fertilización in vitro cedidos mediante consentimiento [80]. Si bien en la actualidad se ha
(a) (b)
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logrado obtener CME humanas en estado naÏve mediante modificación de las condiciones de cultivo [81], [82], inicialmente fueron caracterizadas con un perfil molecular correspondiente al estado de pluripotencia primed [83], revelando una mayor similitud con las EpiSCs de ratón que con las CME de esta especie [84].
Este hecho puso en evidencia la existencia de diferentes estados de pluripotencia, como los descriptos anteriormente [85]. Desde ese entonces, ha cambiado la perspectiva acerca del desarrollo embrionario entre las especies de mamífero, logrando mejorar las estrategias para la derivación de CME. Como sucedió con las CME humanas, a pesar de los años de investigación y los numerosos descubrimientos tecnológicos aplicados a los distintos protocolos, la derivación de CME estables y bona fide de animales de granja, como el bovino y el porcino, no ha resultado exitosa [86]–[88], a excepción de unos pocos reportes muy recientes que muestran un panorama más alentador [89]–[91]. Algunas de las deficiencias demostradas a lo largo de todos los trabajos, incluyen la falta de contribución de las células obtenidas a la formación de animales quimera y teratomas, la senescencia prematura en cultivo y/o la poca capacidad de diferenciación y transmisión a la línea germinal [92]. Todos estos reportes destacan la necesidad de ajustar tanto las condiciones de cultivo como el momento preciso de la etapa embrionaria para aislar CME y lograr capturar in vitro células en estado de pluripotencia naïve. Para este fin, resulta crucial la comprensión de los procesos que conducen a la segregación de los linajes en el embrión para proporcionar un entorno molecular orientado a estas especies que favorezca la autorrenovación y la pluripotencia. Más adelante, también discutiremos la problemática actual que se presenta en la obtención de CMPI para estas especies de mamífero.
1.3. Cromatina y compartimentalización del núcleo
La complejidad presentada en los animales multicelulares se adjudica a su capacidad de producir y mantener una gran variedad de tipos celulares que comparten el mismo material genético. Esta organización intrincada requiere de una regulación estricta de la expresión génica para dirigir con especificidad el compromiso celular a los distintos linajes durante el desarrollo del embrión. Los programas transcripcionales, la regulación epigenética,
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y las vías de señalización, cooperan dentro del contexto genómico de la cromatina controlando el destino celular.
La cromatina es el complejo macromolecular núcleo-proteico mediante el cual se empaqueta y condensa el ADN, ordenándose en el espacio nuclear y regulando su actividad.
En cuanto a su organización, la unidad fundamental son los nucleosomas, compuestos por dos copias de las cuatro proteínas histonas clásicas, H2A, H2B, H3 y H4, rodeadas por 146 pares de bases de ADN. La regulación epigenética de la expresión génica es transversal a un gran número de niveles, que incluyen la metilación del ADN, las modificaciones post- traduccionales de las histonas, el empaquetamiento y re-arreglo de los nucleosomas, las estructuras de cromatina de alto orden y la interacción dinámica entre la cromatina y la lámina nuclear [93], [94] (Figura 1.8).
Esta regulación requiere la participación de diversos protagonistas, entre ellos, muchas enzimas modificadoras de histonas diferentes, incluidas las writers que generan las modificaciones, las erasers que las eliminan, mientras que las readers reconocen las marcas distribuidas a través del genoma e interactúan con proteínas catalíticas [95]. Una función de las modificaciones de las histonas es coordinar la relación entre los remodeladores de cromatina y la maquinaria transcripcional para la regulación de la expresión génica. Estas marcas funcionan en conjunto con las variantes de las histonas, el remodelado de la cromatina, la metilación del ADN y las chaperonas de histonas, contribuyendo al establecimiento y mantenimiento fiel de la cromatina.
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Figura 1.8.- Organización jerárquica de la cromatina en un núcleo en interfase. Diversos factores colaboran en la condensación de la cromatina a cada nivel. El conjunto de nucleosomas se pliega en estructuras de alto orden, donde participan ARNs non coding estructurales. A la derecha se observa un esquema de un nucleosoma, comprendido por la hebra de ADN envuelta alrededor de un octámero de histonas. El módulo básico del nucleosoma puede variar dinámicamente según las modificaciones del ADN, las chaperonas, los tipos de histonas, y modificaciones post-traduccionales (MPT) en las colas de histonas. Modificado de Yaday et. al [93].
En los últimos años, numerosos trabajos revelaron una interacción compleja y dinámica entre distintas vías epigenéticas y el mantenimiento del estado indiferenciado y la diferenciación de CME. Estos estudios mostraron dos principios generales en la epigenética de estas células. Por un lado, la existencia de factores específicos que mantienen a la cromatina en un estado abierto y accesible para la activación transcripcional y, por otro, reguladores que contribuyen al silenciamiento de genes específicos de linaje hasta el desencadenamiento de la diferenciación celular [96]–[98]. En esta sección introduciremos los principales mecanismos epigenéticos mediante los cuales se regula el mantenimiento del estado indiferenciado y la diferenciación de CME hacia distintos linajes celulares.
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Estructura y organización de la cromatina
La organización de la cromatina dentro del espacio nuclear es un factor determinante en la regulación génica. Los niveles jerárquicos mediante los cuales se organiza la arquitectura genómica controlan la transcripción, modulando la accesibilidad y proximidad de los genes y elementos regulatorios. Por muchos años, la atención fue puesta en el estudio de la expresión génica y las proteínas asociadas a este proceso. Sin embargo, en las últimas dos décadas, se ha logrado un giro en este enfoque que logró una nueva perspectiva respecto a la importancia que tiene la cromatina, contemplando su organización y su dinámica, como pilares fundamentales en la regulación de la expresión génica.
Analizando la organización del genoma a nivel global, los cromosomas en el núcleo de células en interfase no se encuentran entremezclados al azar entre sí, sino que se disponen en estructuras discretas denominadas territorios cromosómicos (Figura 1.9a). Los mismos presentan posiciones preferenciales dentro del núcleo que dependen de cada tipo celular, y que están conservadas entre distintas especies [99]. Por otra parte, se postula que los territorios cromosómicos están rodeados por regiones nucleares denominadas compartimentos inter-cromosómicos, en donde se ubicarían las fábricas de ARN, estructuras multi-enzimáticas de ARN polimerasas donde tiene lugar la transcripción génica [100].
Mediante el estudio de la arquitectura tridimensional del genoma utilizando nuevas tecnologías [101], se han logrado identificar grandes regiones genómicas que interactúan específicamente con la membrana nuclear interna [102] o con el nucleolo [103], y son denominadas regiones asociadas a la lámina nuclear (LADs, del inglés, lamin-associated domains) y regiones asociadas al nucleolo (NADs, del inglés, nucleolus-associated domains), respectivamente (Figura 1.9b). Este tipo de organización está relacionada con la represión transcripcional, y es variable entre distintos tipos celulares, pero notablemente conservada entre especies.
En un orden a menor escala se pueden identificar regiones de cromatina que están definidas por altos niveles de interacción, espaciadas por otras regiones que presentan menor grado de contacto [104] (Figura 1.9c). Estos dominios, conocidos normalmente como dominios asociados a la topología (TADs, del inglés, Topologically Associating Domains),
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poseen una organización estructural que se mantiene entre distintos tipos celulares [105], y está conservada parcialmente entre el genoma humano y el de ratón [106]. En los TADs se agrupan regiones de ADN que comparten un mismo entorno regulatorio y características estructurales y químicas de la cromatina. Así, se favorecen las interacciones dentro de un mismo TAD, mediante loops estabilizados por proteínas como CTCF y cohesina [106]–[109].
Mas aún, distintas zonas regulatorias que actúan como enhancers establecen contactos físicos con los promotores de los genes, formando centros activos de cromatina (ACH, del inglés, Active Chromatin Hub) [99]. Estos contactos acercan factores y cofactores que se encuentran unidos a distintas secuencias, facilitando así la formación y el correcto funcionamiento de complejos necesarios para la actividad transcripcional. De esta manera, estas estructuras moldean la conformación tridimensional del genoma en forma dinámica, pudiendo modificarse ante distintos requerimientos de actividad transcripcional y según el contexto celular.
Figura 1.9.- Resumen de los niveles de organización de la cromatina en el núcleo. (a) Los cromosomas individuales tienden a ocupar su propio territorio, que puede solaparse en el límite con otros territorios. (b) Regiones con cromatina activa (naranja) tienden a localizarse en el centro del núcleo, mientras que las regiones con cromatina inactiva (verde) tienden a localizarse cerca de la lámina nuclear o el nucleolo, en forma de LADs o NADs. Las regiones que compartan el mismo estado de la cromatina tenderán a interactuar más frecuentemente entre ellas que lo esperado por la distancia
(a) (b)
(d) (c)
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genómica que las separa. (c) Los dominios que presentan auto-interacción, o TADs, se forman cuando una región genómica presenta una interacción preferencial consigo misma que con una región vecina.
(d) Los loops se pueden formar entre regiones genómicas específicas, las llamadas ACH. Estas interacciones están mediadas por proteínas de la arquitectura nuclear, FT o reguladores de la cromatina. Modificado de Ing-Simmons et. al [110].
Tradicionalmente, la cromatina ha sido dividida en dos categorías: eu- y heterocromatina. Mientras que la eucromatina es generalmente permisiva a la activación transcripcional, la heterocromatina es distinguida dentro de la topología del genoma por la presencia de dominios altamente compactos, que incluyen zonas transcripcionalmente silenciadas. Se propone que este silenciamiento génico ocurre en parte por la habilidad de la familia de la proteína asociada a heterocromatina 1 (HP1) a expandirse a grandes regiones del genoma, compactar la cromatina y reclutar otras moléculas relevantes para el silenciamiento [111]. De este modo, se limita el acceso de los FT para interactuar con el ADN [112]. Asimismo, la heterocromatina se divide en dos grupos: la constitutiva -presente en regiones centroméricas y teloméricas con secuencias repetitivas- y la facultativa, que presenta, entre otras marcas, la marca represiva H3K9me3 y engloba genes regulados tanto espacial como temporalmente [113].
Las CME presentan una configuración inusual en la organización de la cromatina ya que es principalmente abierta y ampliamente dispersa. Ante las señales de diferenciación, ocurre una reorganización extensiva de la misma acompañada por la formación de grandes dominios compactos [114]. Del mismo modo, las proteínas arquitectónicas de la cromatina como HP1, H1 e histonas centrales, muestran una unión a la cromatina hiperdinámica y más flexible, respecto a células diferenciadas [115], [116]. Estas observaciones están íntimamente relacionadas con la idea de que una estructura abierta de la cromatina es necesaria para el mantenimiento e incluso la inducción de la pluripotencia, conservando la plasticidad sin cambios drásticos en la organización y posicionamiento de los cromosomas [117]. De hecho, las alteraciones en la expresión de las proteínas remodeladoras de la cromatina en CME resulta en la acumulación de cromatina compacta, interrupción de la auto-renovación y perdida del potencial de diferenciación [96].
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En paralelo a la organización tridimensional del genoma, la compartimentalización de las moléculas en el espacio nuclear promueve una mayor eficiencia de los procesos biológicos, dando como consecuencia una división de las actividades en los distintos microambientes de la célula. Estas estructuras nucleares, denominados condensados biomoleculares [118], [119], no están delimitados por membranas y pueden ser identificados microscópicamente dado que se puede distinguir la acumulación prominente de proteínas en múltiples foci distribuidos en el nucleoplasma. Varían en su tamaño y en la cantidad de cada tipo por núcleo.
Algunos ejemplos de estos condensados son los speckles, los paraspeckles, el nucleolo, los de heterocromatina, los de super-enhancers, los cuerpos de Polycomb, entre otros (Figura 1.10).
Figura 1.10.- Condensados biomoleculares del núcleo. Arriba, imágenes de inmunofluorescencia para las proteínas indicadas (en verde), y la señal del ADN marcado con Hoechst (en azul). Se indica la denominación de cada uno de los condensados y la proteína utilizada para visualizarlo. Abajo, representación de cómo se organizan los distintos tipos de condensados nucleares. La línea gris representa la fibra de cromatina, la flecha verde indica un sitio de inicio de la transcripción (en super- enhancers) y las líneas rojas representan ARN (en speckles). Modificado de Sabari et. al [118].
La función principal de estas estructuras es concentrar eficientemente un alto número de biomoléculas funcionalmente relacionadas. Esto es logrado a través de interacciones débiles, multivalentes, y dinámicas entre los componentes implicados. La mayoría interactúa con loci específicos en el ADN, lo que les confiere cierto grado de organización dentro del
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núcleo. Los condensados biomoleculares se encuentran involucrados en muchos procesos nucleares como la regulación y mantenimiento de la estructura de los cromosomas [120]–
[122], la replicación y reparación del ADN [123], [124], la transcripción [125]–[128], el procesamiento del ARN [129], [130], entre otras. Asimismo, conforman reservorios de moléculas que pueden ser modificados frente a una determinada señal afectando la respuesta de la célula.
Pese a todos los trabajos publicados bajo la temática de los condensados biomoleculares, muchos son los interrogantes relacionados con el mecanismo detrás de la compartimentalización funcional del núcleo. Asimismo, una de las hipótesis más fuertes que se evalúa es que estos compartimentos son de naturaleza líquida y se forman por separación de dos fases (LLPS, en inglés, liquid-liquid phase separation) [131]–[133]. Es importante destacar que la funcionalidad y bioquímica de ciertos condensados nucleares está aún en discusión, dada la baja cantidad de evidencia acumulada, falta de herramientas experimentales y resultados contradictorios en la literatura [134], [135].
1.4. Reprogramación celular
El estado estable de una célula diferenciada es controlado por mecanismos dinámicos susceptibles a ser perturbados. Una célula adulta puede entonces ser alterada en cuanto a su patrón de expresión génica, y como consecuencia, cambiar su destino celular. El proceso mediante el cual se obtienen células pluripotentes a partir de células terminalmente diferenciadas se denomina reprogramación celular, y su estudio comenzó hace casi 70 años.
Las primeras reprogramaciones se realizaron durante la década del 50, mediante la transferencia del núcleo de una célula somática a un oocito enucleado de Rana pipiens [136]
y de Xenopus leavis [137]. Este procedimiento es conocido como transferencia nuclear (SCNT, en inglés, Somatic Cell Nuclear Transfer), donde se produce la reprogramación del núcleo de la célula somática mediante la modificación de la expresión génica, consecuencia de modificaciones epigenéticas en el ADN y en la cromatina inducidas por los factores presentes en el citoplasma del oocito. Treinta años más tarde, se logró la reprogramación de células de mamífero, utilizando núcleos de distintos tipos de células somáticas y oocitos enucleados de