PRACTICA N° 3
EXTRACCIÓN DE LA CASEINA Y DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELECTRICO
PRESENTADO POR:
GUILLERMO LEÓN ESCOBAR JOSÉ DANIEL GUARNIZO JIMÉNEZ
JAROL ANDRÉS LOZANO NIÑO EDWAR ERNESTO ORTÍZ BARRERO CARLOS EDUARDO VARGAS VELASQUEZ
Informe de laboratorio
PRESENTADO A:
DIEGO FERNANDO RAMOS
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FACULTAD DE INGENIERÍA AGRONÓMICA PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
LÁCTEOS IBAGUÉ-TOLIMA
2014
A. AISLAMIENTO DE LA CASEÍNA CONSIDERACIONES
La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida.
METODOLOGÍA
Al calentar la leche a una temperatura de 38°C se agrega
una solución de ácido acético al 1 N, esto se hace ya que la propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita, después de precipitada la caseína, se filtra el suero y grasa dejando solo la materia solida precipitada en el papel filtro, a esta se le agrega etanol con el objetivo de aumentar la consistencia de la caseína.
Una vez filtrada la caseína sólida, secada y agrupada formando una masa manejable, esta fue pesada, dando un peso de aproximadamente 260mg de caseína sólida, usada para preparar una solución posterior de caseína.
B. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE CASEINA CONSIDERACIONES
La caseína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lisina estarían protonados (-NH3 +). De igual forma si la caseína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).
METODOLOGÍA
Una vez obtenido el Precipitado blanco o caseína se procede a hacerle su preparación para la identificación cualitativa del punto isoeléctrico, punto en el cual se encuentra un equilibrio de
cargas positivas y negativas; para esto se usan 250mg de la caseína obtenida de los anteriores filtrados y se depositan en un vaso de precipitado junto con 20 ml de agua destilada y 5 ml de NaOH; esta solución se agito para logar una efectiva disolución. De ahí se le adicionaron 5ml de ácido acético al 1N junto con otros 20ml de agua destilada.
RESULTADOS
Se obtuvo una solución transparente que facilitó el no repetir el proceso de filtrado. Desde la química, éste ensayo se basa en la característica de las proteínas como la caseína de adquirir cargas totales en función del pH del medio en que se encuentren y de los aminoácidos que la componen.
C. DETERMINACIÓN DE PI DE LA CASEÍNA RESULTADOS
En 10 tubos de ensayo se adicionan los siguientes reactivos, según la siguiente tabla:
TABLA DE DISOLUCIONES
TUBO Acetato
0.1N Acético
0.1N Acético 0.01 N
pH resultante (aprox.)
1 0,5 9,5 -- 3,2
2 1 9 -- 3,6
3 1,5 8,5 -- 3,8
4 2 8 -- 4
5 3 7 -- 4,2
6 4 6 -- 4,5
7 6 4 -- 4,7
8 8 2 -- 5,1
9 6 -- 4 5,5
10 8 -- 2 6,1
Tabla 1. Disoluciones de Ácidos y pH teóricos.
Los valores de pH experimentales obtenidos fueron los siguientes:
TUBO Ph
4 3,72
5 4,1
6 4,29
7 4,52
8 5
9 5,67
10 6,17
Tabla 2. pH obtenido en cada tubo de ensayo.
NOTA: La prueba se inició desde el tubo número 4, por lo tanto se utilizaron 7 tubos de ensayo.
Figura1. Tubos de ensayo con las disoluciones de ácidos, ascendente desde el número 4 de izquierda a derecha.
Luego de realizar las respectivas disoluciones, se agregó 1 ml de disolución de caseína a cada tubo de ensayo, se agitaron y luego de 3 minutos, se observaron los resultados, en la siguiente imagen se puede observar cada tubo de ensayo después de trascurridos los 3 minutos.
Figura 2. Tubos de ensayo con la caseína y las respectivas disoluciones, orden ascendente desde el número 4 de izquierda a derecha.
ANÁLISIS DE RESULTADOS.
En los tubos 4,5 y 6 con pH 3.72, 4.1, 4.29 se puede observar una turbiedad lo que determina que hay presencia de exceso de iones hidrógeno, por lo tanto las proteínas están cargadas positivamente y se repelen, siendo hidrófobas e insolubles generando una coagulación.
En el tubo número 7 la caseína, se encuentra en punto Isoeléctrico, con un pH de 4,5 en este caso, las cargas se encuentran neutras, se mantiene estable y con las moléculas de caseína agrupadas por consiguiente, ya en los tubos número 8,9 y 10 se observa que hay un cambio en la solución y presenta un color más transparente que se puede ver a primera vista, con pH de 5, 5.67 y 6.17 respectivamente, el cambio se debe a que las cargas de la proteína cambian y comienzan a tomar carga negativa ya que la solución cada vez es más alcalina, dado este cambio la hidratación que tiene por el cambio de pH, hace que se disminuya el tamaño de la partícula y le confiera la capacidad hidrófila que tiene la caseína cuando se entra en la leche con pH normal de 6,6.
CONCLUSIONES
Al agregar NaOH el Na+ neutraliza las micelas de caseína, mientras que el ácido precipita a Caseinato sódico parcialmente disociado en iones, se da micelas de tamaño pequeño pero molecularmente estables (Tetrapak, 1996). Además, el uso de un ácido débil y una base conjugada se transforman en un estabilizante de pH algo más bajo a 7, que permitió mejor disolución de la caseína en agua con pH neutro.
Posteriormente, al preparar las disoluciones con soluciones de acetato al 0.1 N y ácido acético al 0.01 N, y 0.1 N, el punto isoeléctrico de la caseína se da a un pH cercano a 4.5, valor teórico no lejano al experimental (pH marcado en 4.52) en el cual sus grupos terminales Carboxilo y Amino se encuentran neutralizados con carga neta 0.
REFERENCIAS
Cano, H., Méndez, S., & Cruz, J. (2013). Manual prácticas de laboratorio de bioquímica.
Bucaramanga: Universidad Industrial de Santander.
Tetrapak. (1996). Manual de Industrias Lácteas. Madrid.
