RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS EN CAVIDAD ORAL DE NIÑOS CON EDADES ENTRE TRES Y CINCO AÑOS
ANDREA DUEÑAS SIERRA ANA SOFIA SANTANA VARGAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA Bogotá D. C.
2001
RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS EN CAVIDAD ORAL DE NIÑOS CON EDADES ENTRE TRES Y CINCO AÑOS
ANDREA DUEÑAS SIERRA ANA SOFIA SANTANA VARGAS
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar el título de BACTERIÓLOGA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA Bogotá D. C.
2001
RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS EN CAVIDAD ORAL DE NIÑOS CON EDADES ENTRE TRES Y CINCO AÑOS
ANDREA DUEÑAS SIERRA ANA SOFIA SANTANA VARGAS
___________________ ___________________
Dr. Fredy Gamboa Dra. Margarita Chaves
DIRECTOR CODIRECTORA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA Bogotá D. C.
2001
RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS EN CAVIDAD ORAL DE NIÑOS CON EDADES ENTRE TRES Y CINCO AÑOS
ANDREA DUEÑAS SIERRA ANA SOFIA SANTANA VARGAS
____________________ ____________________
JURADO JURADO
Dra. Nelly Susana Rueda. Dr. Didier Fernández.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA Bogotá D. C.
2001
RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS EN CAVIDAD ORAL DE NIÑOS CON EDADES ENTRE TRES Y CINCO AÑOS
ANDREA DUEÑAS SIERRA ANA SOFIA SANTANA VARGAS
_________________________ __________________________
Dr. Carlos Corredor Dra. Aura Rosa Manascero
DECANO FACULTAD DE CIENCIAS DIRECTORA CARRERA DE BACTERIOLOGÍA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA Bogotá D. C.
2001
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución número 13 de julio de 1946: “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado”.
DEDICATORIA
• A Dios porque es nuestra esperanza, principio y fin, nos guío con su sabiduría en el momento preciso para lograr culminar una etapa importante en nuestras vidas. “Guíame, Señor, con tu sabiduría, ilumíname con tu luz, fortaléceme con tu poder. Aquí estoy, Señor, para hacer tu voluntad”.
• A nuestros Padres por su amor, su inmenso apoyo, dedicación y sacrificio; por enseñarnos a trabajar con constancia y aprender a tomar los obstáculos como retos a lo largo de nuestra carrera. Gracias por ser la clave en este triunfo que es también es de ustedes. Los amamos.
• Este triunfo se lo dedico a mi hija Salomé quien fue testigo de mis sacrificios, derrotas y satisfacciones. Salomé, tú que eres el futuro de mi vida, mi profesión es tu profesión. Le pido al Todo Poderoso que me de licencia de disfrutar lo aprendido para satisfacción de mis padres que fueron los baluartes de mi éxito . A Roberto que de una u otra forma estuvo conmigo siempre.
AGRADECIMIENTOS
• Al Dr. Fredy Gamboa, Director del área de microbiología del Centro de Investigaciones Odontológicas, docente del departamento de Microbiología, por su orientación, confianza y apoyo, y quien nos dio la oportunidad de realizar éste trabajo, superando todas las dificultades presentadas. Gracias por creer en nosotras y ayudarnos en los momentos en que sentimos decaer.
• A la Dra. Margarita Cháves . Por su colaboración, interés y esfuerzo en la realización de la parte práctica de este trabajo.
• A cada una de las personas del Centro de Investigaciones Odontológicas por su constante colaboración, re speto y amabilidad con la que estaremos eternamente agradecidas.
• A nuestras amigas, quienes nos acompañaron en cada etapa de nuestra carrera y fueron un apoyo incondicional, en especial a Sandra Yunez , quien siempre estuvo ahí, compartiendo los triunfos, sin abandonarnos en los tropiezos.
TABLA DE CONTENIDO
Pgs.
RESUMEN 16
INTRODUCCIÓN 18
1. JUSTIFICACIÓN 21
2. MARCO TEÓRICO 23
2.1. Los ecosistemas primarios orales 23
2.1.1. Mucosa 24
2.1.2. Dorso de la lengua 24
2.1.3. Superficies dentales 24
2.1.4. Surco gingival 24
2.1.5. Saliva 24
2.1.6. Líquido gingival 26
2.2. Ecología microbiana oral 26
2.2.1. Flora microbiana oral 27
2.2.1.1. Staphylococcus spp 29
2.2.1.2. Streptococcus spp 29
2.2.1.3. Veillonella spp 32
2.2.1.4. Actinomyces spp 33
2.2.1.5. Prevotella spp 36
2.2.1.6. Fusobacterium nucleatum 37
2.2.1.7. Leptotrichia spp 38
2.2.1.8.Capnocytophaga spp 39
2.2.1.9.Clostridium spp 40
2.2.1.10 Eubacterium spp 42
2.2.1.11.Selenomonas spp 43
2.2.1.12.Peptostreptococcus spp 44
3. OBJETIVOS 47
3.1. Objetivo General 47
3.2. Objetivos específicos 47
4. MATERIALES Y MÉTODOS 48
4.1. Tipo de estudio 48
4.2. Población 48
4.3. Lugar 49
4.4. Criterio de inclusión 49
4.5. Criterio de exclusión 49
4.6. Variables de estudio 49
4.7. Recolección de la información y análisis 49
4.8. Toma y procesamiento de la muestra 50
5. RESULTADOS 54
6. DISCUSIONES 62
CONCLUSIONES 66
BIBLIOGRAFÍA 67
ANEXOS 74
LISTA DE TABLAS
Tabla Nº 1. Pruebas bioquímicas para la identificación de microorganismos presentes en cavidad oral.
Tabla Nº 2. Reconocimiento de microorganismos en las treinta muestras estudiadas.
Tabla Nº 3. Frecuencia de microorganismos aislados en saliva de treinta niños con edades entre tres y cinco años.
Tabla Nº 4. Distribución de microorganismos aislados en saliva por edad.
Tabla Nº 5. Distribuc ión de microorganismos aislados en saliva por sexo.
LISTA DE ANEXOS
Anexo Nº 1. Formato de recolección de datos y autorización.
Anexo Nº 2. Odontograma.
Anexo Nº 3. Caldo de tioglicolato.
Anexo Nº 4. Agar sangre con vitamina k y hemina.
Anexo Nº 5. Agar sangre con fenil-etil-alcohol.
Anexo Nº 6. Agar sangre gentamicina vancomicina.
Anexo Nº 7. Coloración de Gram Anexo Nº 8. Catalasa.
Anexo Nº 9. Coagulasa.
Anexo Nº 10. Oxidasa.
Anexo Nº 11. SIM.
Anexo Nº 12. Hidrólisis de esculina.
Anexo Nº 13. Reducción de nitratos.
Anexo Nº 14. Fermentación de azúcares.
LISTA DE GRÁFICAS
Gráfica Nº 1. Frecuencia de microorganismos aislados en saliva de treinta niños con edades entre tres y cinco años.
Gráfica Nº 2. Frecuencia de microorganismos aislados en cavidad oral de niños con tres años de edad.
Gráfica Nº 3. Frecuencia de microorganismos aislados en cavidad oral de niños con cuatro años de edad.
Gráfica Nº 4. Frecuencia de microorganismos aislados en cavidad oral de niños con cinco años de edad.
Gráfica Nº 5. Frecuencia de microorganismos aislados en cavidad oral de niños de sexo femenino.
Gráfica Nº 6. Frecuencia de microorganismos aislados en cavidad oral de niños de sexo masculino.
FOTOGRAFÍAS
Fotografía Nº 1. Aislamiento de Peptostreptococcus spp. en agar sangre con vitamina k y hemina.
Fotografía Nº 2. Streptococcus spp. Coloración de Gram. Aumento 100X.
Fotografía Nº 3. Eubacterium spp. Coloración de Gram. Aumento 100X.
Fotografía Nº 4. Cultivo de Prevotella spp. en agar sangre con vitamina k y hemina.
Fotografía Nº 5. Cultivo de Streptococcus mutans en agar mitis salivarius.
Fotografía Nº 6. Cultivo de Staphylococcus spp. en agar sangre con vitamina k y hemina.
Fotografía Nº 7. Peptostreptococcus prevotti. Coloración de Gram. Aumento 100X.
Fotografía Nº 8. Actinomyces odontolyticus. Coloración de Gram. Aumento 100X.
Fotografía Nº 9. Leptotrichia spp. Coloración de Gram. Aumento 100X Fotografía Nº 10. Streptococcus spp. Coloración de Gram. Aumento 100X.
Fotografía Nº 11. Actinomyces israelii. Coloración de Gram. Aumento 100X.
Fotografía Nº 12. Streptococcus mutans. Coloración de Gram. Aumento 100X.
RESUMEN
La comunidad microbiana oral esta compuesta por diferentes bacterias tanto anaerobias facultativas como anaerobias obligadas, que tienen la habilidad de colonizar y sobrevivir en este microambiente, el cual presenta cambios notables durante la niñez temprana, donde se dan las bases para futuras colonizaciones.
El objetivo del presente estudio fue determinar la composición microbiana de la cavidad oral de treinta niños residentes en Bogotá. D. C. con edades entre los tres y cinco años. Las muestras de saliva no estimulada se recolectaron el caldo de tioglicolato y se agitaron en vortex por treinta segundos. Se sembraron 100 ul de cada una de las muestras por duplicado en tres medios enriquecidos y selectivos agar sangre vitamina k y hemina, agar sangre gentamicina vancomicina y agar sangre fenil-etil- alcohol, sometiendo las cajas a distintas atmósferas, para el aislamiento de los diferentes microorganismos. Las cepas fueron conservadas en leche descremada para su posterior identificación con pruebas bioquímicas.
Entre los microorganismos anaerobios facultativos, el más frecuente fue el Streptococcus mutans , el cual presentó un porcentaje de 53.3 % y se presentó con una frecuencia más notoria en niños que en niñas; seguido por el Actinomyces odontolyticus con un 40.0 % que tuvo un porcentaje igual en las tres edades a estudio.
Por otra parte, las bacterias anaerobias obligadas tuvieron un alto porcentaje en base a los cocos grampositivos (Peptococcus spp, Peptostreptococcus spp, P. anaerobius, P.
micros y P. prevotti). Los niños con edad de cinco años presentaron una frecuencia alta con respecto a las demás edades.
Fusobacterium nucleatum, Lactobacillus spp., y Veillonella spp. se aislaron ocasionalmente en niños de tres años de edad y su porcentaje aumento con la edad.
La Prevotella spp. se encontró más en niños de tres años que en las demás edades.
Nuestro estudio demostró la variada colonización oral y el incremento de las especies anaeróbicas obligadas frente a las anaeróbicas facultativas (57.2 % vs 42.8 %).
Esperamos que el presente trabajo de las bases para posteriores estudios acerca de la ecología microbiana oral en Colombia.
INTRODUCCION
La cavidad oral normalmente soporta una de las poblaciones microbianas más concentradas y variadas de cualquier parte del orga nismo, con focos principales en el dorso de la lengua, alrededor del surco gingival y en la superficie de los dientes, particularmente la placa bacteriana (31).
Durante la niñez las poblaciones bacterianas aumentan y las proporciones de microorganismos cultivables predominantes en la zona del surco gingival en los niños preescolares se asemeja a la de los adultos (9).
Las especies anaeróbicas constituyen una parte significante de la comunidad bacteriana de la boca; también son comunes organismos aerobios como el grupo viridans de los estreptococos. El tiempo de colonización y las especies involucradas en la colonización primaria de los niños es de gran importancia, ya que ésta da las bases para la formación de nuevas colonizaciones. Por consiguiente el desarrollo y estabilidad de microflora oral aeróbica y anaerobia con la edad es aún inadecuadamente comprendido.
En la cavidad oral encontramos una gran variedad de microorganismos:
Las Veillonellas spp, unas de las bacterias más numerosas de la cavidad oral (29).
Son cocos gramnegativos, anaerobios estrictos, no móviles, y no esporulados. No pueden fermentar hidratos de carbono debido a que carecen de enzimas como la glucoquinasa y fructoquinasa (9). Los Peptostreptococcus spp, son cocos grampositivos de tamaño y figura variables, que se encuentran en la piel y comúnmente en la flora de la cavidad oral y mucosas; proliferan sólo bajo condiciones anaerobicas o microaerófilicas y de modo variable producen hemolisinas(35).
En cuanto a los bacilos gramnegativos, la Prevotella spp, es un bacilo gramnegativo no formador de esporas , inmóvil y se puede presentar en forma de bacilos delgados o cocobacilos. Se asocia frecuentemente con otros microorganismos anaerobios que son parte de la flora normal, en particula r Peptostreptococcus. Las Porphyromonas spp, son bacilos o cocobacilos gramnegativos e inmóviles, no formadores de esporas que son parte de la flora normal bucal y se presentan también en otros sitios anatómicos. Pueden cultivarse especies de Porphyromonas a partir de infecciones gingivales y periapicales de los dientes (35). Los Fusobacterium spp, son bacilos gramnegativos, pleomórficos, que adoptan tanto un aspecto fusiforme, como redondeado y fino con extremos romos, a veces con coloración bipolar. Son inmóviles y generalmente no fermentadores, aunque en ocasiones pueden serlo débilmente. Su hábitat primario es el surco gingival (9). La Leptotrichia spp, es un bacilo recto o curvado móvil con extremos afilados o redondeados y que se asocia en parejas, cadenas o empalizadas. En cultivos jóvenes de unas 6 horas aparece como grampositivo, sin embargo, después de 24 horas de incubación se observa como gramnegativo pero con gránulos de color violeta (9). Las especies de Selenomonas están constituidas por bacilos gramnegativos curvados, y poseen un haz de flagelos que parten del ángulo interno de la curva.
La Capnocytophaga spp, es un bacilo gramnegativo fusiforme, son anaerobios pero pueden adaptarse y desarrollarse en una atmósfera aerobia con un 5-10% de CO2.
El nicho ecológico primario parece ser la cavidad oral, en concreto el surco gingival (31). Además entre los bacilos grampositivos se encuentran los Lactobacillus spp, es uno de los géneros más implicados en la caries (1). Son bacilos grampositivos, no móviles exceptuando raras cepas; no esporulantes, a veces pleomorfos que generalmente se dividen sólo en un plano sin ramificarse (31).
Las especies de Actinomyces son bacilos grampositivos, no esporulados e inmóviles con diversas morfologías como son: rectos, curvos, filamentosos,
cocobacilares o con ramificaciones. Son aislados normalmente de la cavidad oral (4).
Los Eubacterium spp, formado por bacilos grampositivos, a veces móviles, son pleomórficos, se encuentran en infecciones mixtas, acompañado de la flora bucofaríngea (9).
Las especies de Clostridium, son bacilos grampositivos, grandes móviles. La mayoría de ellos forman esporas cuya posición dentro de la célula vegetativa es útil en la identificación. Son gérmenes oportunistas que producen exotoxinas proteicas importantes en la patogénesis (35).
Teniendo en cuenta estos microorganismos como flora nativa en la cavidad oral, este estudio tuvo como objetivo determinar la composición microbiana de la cavidad oral de los niños con edades entre los tres y cinco años, se espera poder aislarlos e identificarlos para tratar de determinar la frecuencia de estos, en niños en edad preescolar.
1. JUSTIFICACIÓN
Este estudio tuvo como justificación la necesidad de conocer la ecología microbiana oral predominante en la cavidad oral de los niños, y establecer cuántas clases de microorganismos hay, y cuales son los más relevantes.
Como en Colombia no existe investigación alguna sobre este tema, esperamos que esta información de las bases para posteriores trabajos en donde se establezcan comportamientos, frecuencia y manejos posibles de estos microorganismos, y que haya una planificación de posibles reglas y tratamientos para la prevención de la colonización por la flora patógena periodontal.
Este trabajo de investigación hace parte del programa de Microbiología Oral
“Aislamiento, identificación, caracterización y preservación de microorganismos de cavidad oral en niños de diferentes edades que viven en el altiplano cundiboyacense” y que conforma la línea de investigación “Ecología microbiana oral”. Este programa, dirigido y coordinado por el Dr. Fredy Gamboa, cuenta con el aval académico y financiero de la Facultad de Odontología de la Pontificia Universidad Javeriana. Este trabajo, estudio piloto, al permitir conocer la flora microbiana existente y predominante enestos niños con edades entre tres y cinco años, será de gran ayuda en los diferentes programas de prevención que tengan como fin hacer un control biológico o inmunológico por medio de vacunas. Al
conocerse la frecuencia de aparición de estos microorganismos en
la cavidad oral de estos niños, deberá hacerse en un futuro próximo otros estudios con el fin de obtener información sobre otras colonizaciones y estabilidad de estas cepas en la población estudiada. La detección del tiempo justo para la colonización y la permanencia estable de las bacterias será de hecho muy útil para diseñar estrategias para la prevención de enfermedades buco-dentales. También se tiene planteado en el futuro hacer estudio de DNA con el fin de tipificar estos microorganismos.
2. MARCO TEORICO
La cavidad oral formada por un conjunto de estructuras suaves (membranas mucosas) y duras (los dientes), con numerosos organismos asociados a ellos, constituye un ecosistema dinámico el cual soporta cerca de 250 especies bacterianas diferentes. Cuando este sistema ecológico se encuentra en equilibrio se denomina eubiosis y, en cambio, cuando estas relaciones se han alterado, pasará a llamarse disbiosis, que correspondería a la boca enferma(31, 35).
Millones de microorganismos pueden vivir en la cavidad oral distribuidos, en distintas proporciones, según la zona estudiada. Estos nichos ecológicos o ecosistemas primarios poseen diferentes características que permitirán el desarrollo de una u otras especies microbianas. Algunas áreas o zonas tienen diferencias en cuanto a tensión de oxígeno, cantidad y tipo de nutrientes. La cavidad oral es un ambiente que favorece la ubicación y el crecimiento de una gran variedad de microorganismos (35).
2.1. Los ecosistemas primarios orales.
Entre los ecosistemas orales primarios encontramos:
2.1.1. Mucosa. Recubre labios, paladar, mejillas y encías. Está formada por un epitelio escamoso estratificado con algunas variaciones histológicas según su localización. La persistencia de algunos microorganismos y la eliminación de ellos sirve para dos propósitos: primero asegura la continuidad de la flora resistente y el segundo es una forma de protecció n, ya que la descamación elimina a un número considerable de bacterias.
2.1.2. Dorso de la lengua. Su característica especial es la de ser un órgano musculoso y queratinizado. Sus dos tercios anteriores están cubiertos de papilas y el tercio posterior con numerosas glándulas, mucosas y folículos linfoides.
2.1.3. Superficies dentales. Constituidas por la corona a nivel supragingival, y el cemento radicular, de localización subgingival.
2.1.4. Surco gingival. Es un espacio delimitado por la corona y el cemento, el epitelio sulcular bucal y el epitelio de unión. En él se origina el líquido gingival de gran importancia en la génesis de los procesos periodontales.
2.1.5. Saliva. La saliva baña abundantemente todas las superficies orales, a excepción del surco gingival. Su concentración de nutrientes es muy baja, de tal forma que para que las bacterias crezcan y se multipliquen en un medio inerte como en la superficie dentaria, donde la saliva es la principal fuente de nutrientes, deben adaptarse a dichas condiciones. La saliva proviene de las glándulas denominadas mayores (parótidas,
submaxilares y sublinguales) y de las menores, distribuidas ampliamente por toda la boca excepto en las encías y la región anterior del paladar duro. La composición salival varía considerablemente entre los individuos, e inclusive en un mismo sujeto.
Existe un flujo continuo de salida sin estimulación externa (saliva en reposo), y otra distinta bajo diversas circunstancias como la proximidad de la ingesta alimentaria, la presencia de alimentos en la boca y la masticación (saliva estimulada). Tampoco será igual la saliva tal cual sale de las glándulas (saliva glandular), con la que se mezcla procedente de todas ellas, en la cavidad bucal con células, líquido gingival y microorganis mos (saliva mixta). Así pues, la composición de la saliva esta relacionada con el flujo y su carácter glandular o mixto pero además se verá influenciada por múltiples factores: alimentación, higiene bucal, enfermedades glandulares, deshidratación y otros.
La saliva contiene pequeñas cantidades de carbohidratos libres, especialmente glucosa, y los pocos que se detectan proceden de la dieta y de la degradación de glucoproteínas salivales. Existen en la saliva aminoácidos libres en muy pequeña cantidad, mientras que las proteínas y glucoproteínas, se encuentran en grandes cantidades en la saliva mixta y glandular al ser degradadas por enzimas bacterianas a péptidos y aminoácidos. Estos componentes podrán ser utilizados por aquellas especies a las que les resulta imprescindibles.
La saliva también se detectan iones como sodio, potasio, sulfato, amóniaco y otros.
Algunas bacterias con requerimientos nutricionales simples son capaces de crecer y multiplicarse con pequeños aportes de fuentes carbonatadas, amóniaco e iones inorgánicos esenciales. El valor nutricional de la saliva es escaso por lo que se podrá
comprender la importancia de otras fuentes, en especial interbacterianas. La microflora salivalia no proviene exclusivamente de los tejidos blandos sino que viene a ser una población de bacterias que han sido eliminadas tanto de los dientes como de los tejidos blandos.
2.1.6. Líquido gingival . El origen del líquido gingival son los capilares sanguíneos próximos al epitelio de unión. Para algunos, su salida estaría relacionada de forma secundaria a la influencia inducida por la acumulación bacteriana de la placa, ya sea supra o subgingival. Para otros se trataría en realidad de un fenómeno fisiológico continuo.
Numerosos elementos se encuentran en el líquido gingival. Aunque solo pequeñas cantidades son secretadas normalmente en la cavidad oral, la presencia en la misma de albúmina cuyo origen es el surco gingival explica que dicho paso se produce.(9,31,35)
2.2. Ecología microbiana oral.
La cavidad bucal es un ecosistema abierto y dinámico, expuesto a numerosos factores que condicionan las características y composición microbiana de los diferentes nichos ecológicos. La población de los mismos nichos presentan diferencias cualitativas y cuantitativas de unos con respecto a otros, entre individuos, e incluso un mismo sujeto en idéntico nicho ecológico en momentos distintos del día. Este hecho en parte es debido a 1. factores del propio hospedador (higiene oral, hábitos dietéticos,
dientes con mayores o menores irregularidades en las superficies oclusales, flujo salival o fuerza de la masticación); 2. a la naturaleza de los propios microorganismos ( Ejemplo: en que unos tengan gran capacidad de adherirse a superficies duras y el que otras carezcan de la misma o que esta sea menor); y 3. a factores físico químicos (disponibilidad de nutrientes y pH).
En la cavidad bucal, como en la mayoría de las áreas corporales, puede encontrarse una microbiota residente o bien transitoria. Incluso se puede hablar de una cierta especificidad que no es ni mucho menos completa. Así por ejemplo el S. mutans y el S. sanguis se aíslan preferiblemente de superficies duras como la corona dental, mientras que el S. salivarius se detecta sobre todo a nivel del dorso de la lengua.
En cuanto a la heterogenicidad encontramos diferentes especies que pueden aislarse en distintos ecosistemas, de tal forma que se ha llegado a señalar que todos los microorganismos conocidos, que se relacionan de alguna manera con el hombre, se han aislado de la cavidad oral humana bien como transitorios o transeúntes o bien como residentes o autóctonos (31,36).
2.2.1. Flora microbiana oral.
Debido al fácil acceso de los microorganismos a la cavidad bucal se comprende que la cantidad de los mismos sea muy elevada, encontrándose además muy concentrados en un espacio relativamente muy pequeño.
La microbiota oral es muy compleja, se han llegado a aislar hasta doscientas especies distintas en una misma cavidad oral en el transcurso del tiempo; la mayor parte
tendría la característica de ser transitoria, de forma que como residente sólo quedarían unas veinte aproximadamente. Los microorganismos que se hallan en la saliva proceden del desprendimiento que se produce en otras áreas bucales, especialmente del dorso de la lengua.
El ser humano es desdentado en el nacimiento y tiene una flora característica en este estado. La erupción de los primeros dientes es de gran influencia en el ambiente oral, por proporcionar nichos indicados para la colonización bacteriana(19). Cuando se completa la dentición primaria las condiciones son relativamente estables, hasta que comienzan a erupcionar los dientes permanentes. Durante el periodo de dentición mixta, las condiciones varían al tiempo que se pierden algunos dientes y erupcionan los otros nuevos produciendo condiciones ambientales variadas que pueden afectar la flora oral. Una vez que está presente la dentición permanente las condiciones se vuelven algo más estables. La cavidad oral normalmente soporta una de las poblaciones microbianas más concentradas y variadas del organismo, con focos principales en el dorso de la lengua, alrededor del surco gingival y en la superficie de los dientes, particularmente la placa bacteriana coronaria.
La concentración microbiana alrededor del surco gingival y en la placa dental se aproxima a 200.000.000 millones de células por gramo de muestra. Esta es la densidad del sedimento empaquetado por fuerzas centrífugas en un caldo de cultivo o de una colonia bacteriana en un medio sólido(9).
2.2.1.1. Staphylococcus spp.
Los Staphylococcus son bacterias esféricas grampositivas, anaerobias facultativas.
Rara vez forman cadenas, no son móviles y no forman esporos. Las colonias que forman estos microorganismos presentan diferentes tipos como: mucoide, lisa y áspera. Crecen bien en la mayoría de medios; el agar sangre es altamente útil en el diagnóstico de las diferentes cepas. Fermentan una amplia gama de hidratos de carbono. Los datos indican que se pueden encontrar alrededor del surco gingival en un 2 % y cerca del 6.5 % en el dorso de la lengua (29,10,35).
2.2.1.2. Streptococcus spp.
Los Streptococcus son un grupo de bacterias grampositivas esféricas u ovoideas, generalmente no móviles, no esporulantes, morfológicamente pueden aparecer en forma aislada, en pares, en cadenas cortas y en cadenas largas cuando se siembra en medios adecuados. La célula promedia 1um y tiene menos de 2 um de diámetro.Los Streptococcus facultativamente anaerobios fermentan los hidratos de carbono, particularmente la glucosa. Crece bien en infusión de carne. Por su acción hemolítica sobre la sangre en un medio de agar los Streptococcus pueden clasificarse en:
• Streptococcus alfa hemolíticos: que provocan una zona interna de color verdoso y una externa de hemólisis completa. Tales Streptococcus son
también denominados grupo viridans, que significa verde. El Streptococcus salivarius es el estreptococo alfa hemolítico más común.
• Streptococcus beta hemolíticos producen una zona clara de hemólisis
completa alrededor de la colonia. El estreptococo beta hemolítico más común es el Streptococcus pyogenes.
• Streptococcus gamma hemolíticos no producen hemólisis dentro del medio o
sobre él. El Streptococcus faecalis es el más representativo de este grupo(9).
Los Streptococcus orales más abundantes son aquellos que se consideran del grupo viridans. Históricamente, éstos microorganismos han sido agrupados y clasificados por una diversidad de características y criterios. No obstante estudios recientes han delineado mejor los Streptococcus viridans; sobre la base de las características fisiológicas y bioquímicas, pueden ser divididos en varias especies.
Las pruebas que se han utilizado para caracterizar los estreptococos incluyen algunos ensayos bioquímicos comúnmente usados, análisis de pared celular y clasificación serológica. Esta última incluye fermentación, crecimiento bajo condiciones desfavorables, tales como distintas temperaturas, pH. Además, el Streptococcus sanguis, el Streptococcus salivarius y el Streptococcus mutans forman colonias distintas en agar mitis salivarius , medio que inhibe a la mayoría de bacterias, exceptuando los Streptococcus por su contenido de azul tripano, cristal violeta y telurito. También contiene un 5 % de sacarosa como sustrato para el desarrollo de las colonias características.
El Streptococcus sanguis constituye aproximadamente la mitad del recuento de los estreptococos facultativos en la placa dental, la que parece que es su hábitat principal. Los S. sanguis aislados de la placa dental se distinguen en el agar mitis salivarius, incubando aeróbicamente, como pequeñas colonias mucoides (0.5 a 0.9 mm de diámetro) que deforman el agar circundante y tienen una consistencia y adherencia tan firme que pueden ser retirados sólo con dificultad.
El Streptococcus mutans fue aislado por primera vez, de placas de caries, por el Dr. Clark en 1924. La bacteria fue descrita como formas cocoides, pequeñas , pleomórficas. Estos microorganismos no hidrolizan almidón y fermentan inulina, la rafinosa, el manitol y el sorbitol. En los cultivos en agar mitis salivarius estos microorganismos son fácilmente diferenciados por sus colonias altas, convexas a pulvinadas, celestes, mucoides, de 0.5 a 1 mm de diámetro, que son opacas . Las proporciones de S. mutans en la placa bacteriana de los dientes humanos se ha logrado correlacionar con la actividad de caries, y que el microorganismo puede aislarse de lesiones cariosas.
El S. mutans es una especie nativa en los seres humanos. Su hábitat normal es la superficie de los dientes , a menudo es un microorganismo dominante en la placa y puede ser prevaleciente en puntos y fisuras (1,9,17,35).
2.2.1.3. Veillonella spp.
Morfológicamente las especies de Veillonella son cocos gramnegativos pequeños que tienden a resistir la decoloración, con un diámetro que varía de 0.3-0.5 um, usualmente se agrupan en masas o pares, no son móviles, no son esporulados, son estrictamente anaerobios, oxidasa y catalasa negativos aunque algunas cepas descomponen el peróxido por una pseudocatalasa. Estos microorganismos requieren complejos sustratos nutricionales, producen gran cantidad de gas, son inactivos frente a los hidratos de carbono por carecer de enzimas tanto de glucoquinasa como de fructoquinasa. Pero evidentemente sintetizan otras enzimas del sistema glucoril, por lo que requieren para su crecimiento de metabolitos intermedios como lactato, piruvato, malato, fumarato u oxalacetato; además se comportan como capnofílicos siendo el anhídrido carbónico indispensable para su crecimiento. No licuan la gelatina, no producen indol pero reducen los nitratos a nitritos.
Macroscopicamente estos microorganismos generan colonias blancas grisáceas, circulares de bordes irregulares, convexas y adheridas al medio que se caracterizan por medir de 1 a 2mm. Crecen en tween 80 (1%), pero son inhibidos por la bilis (10%). Algunos componentes inorgánicos como colorantes e indicadores son reducidos, pero son inactivas en cloruro de trifeniltetrazolio. Su temperatura óptima de crecimiento es de 30-37ºC y requiere un pH entre 6.5-8.0 . Al añadir al medio de cultivo vancomicina o kanamicina se selecciona el medio para inhibir la mayoría de la flora polimicrobiana (29, 14, 16).
Estos microorganismos forman parte de la microflora normal de la cavidad oral, vagina y tracto gastrointestinal de los seres humanos. El Dr. Rogosa dividió en dos este género con las especies V. parvula y V. alcalescens; la diferenciación de estas especies se ha hecho en base al requerimiento de putrescina y/o cadaverina agregada al medio de cultivo para el crecimiento de la V. alcalescens, y la habilidad de descomposición del peróxido de hidrógeno por la V. alcalescens . Estas especies a su vez han sido divididas en base a reacciones serológicas con test de aglutinación, asociadas a endotóxinas de polisácaridos .(31, 35)
Las especies de este género han sido aisladas de diferentes sitios de la boca, especialmente de placa bacteriana y saliva. Otro aspecto importante lo constituye el hecho de encontrarse asociadas a patologías como estomatitis, sinusitis, periodontitis e inclusive con abscesos cerebrales, lo que no descarta la posibilidad de que se encuentre relacionada con procesos infecciosos del tracto gastrointestinal y de vagina.
Cuando la Veillonella es aislada de especimenes clínicos, usualmente se desarrollan en asociación con organismos aeróbicos y anaeróbicos. La Veillonella es activa participante de la placa dental humana, utiliza la acidez que dejan los productos finales de otras bacterias como: Streptococcus mutans, Actinomyces naeslundii y Actinomyces viscosus.
2.2.1.4. Actinomyces spp.
Son bacilos rectos, grampositivos, filamentos delgados o ligeramente curvos, aunque varían considerablemente en forma y tamaño, miden de 0.2 a 1.0 um de diámetro.
Se asocian frecuentemente en pares, cadenas cortas, se distribuyen formando letras como la y, v, t y empalizadas.
No son móviles, no son formadores de esporas, son facultativos o anaerobios estrictos. El dióxido de carbono es requerido en altas concentraciones para su crecimiento. Sin embargo, algunas especies se desarrollan mejor en una atmósfera anaeróbica como ocurre en el caso del A. israelii. Poseen características similares a los hongos. Son delicados filamentos (pueden llamarse hifas o micelios) y filamentos aéreos los cuales pueden formar ramas, y algunas veces presentan pigmentos(10,13,41).
Varias especies producen microcolonias filamentosas características, que están compuestas de ramificaciones, filamentos septados o no septados con o sin signos de fragmentación central.
Las microcolonias de determinadas especies son predominantemente o exclusivamente no filamentosas y consisten principalmente en bacilos ramificados y difteroides (29,31).
Su hábitat principal en el hombre es la cavidad oral, las criptas amigdalares y el tracto genital femenino, otras localizaciones menos frecuentes son: la región torácica, gastrointestinal, cerebro, renal y ósea. Se aísla también en conjuntivitis y otras infecciones oculares, en cervicitis y endometritis en mujeres que utilizan dispositivos intrauterinos.
En la cavidad oral, el papel ecológico es importante aunque su significación patógena real es controvertida ya que la distribución de las diferentes especies es
muy heterogénea. Debido a que a menudo proliferan con lentitud, pueden requerir incubación prolongada antes de su identificación(17, 31).
Los Actinomyces son considerados como uno de los principales colonizadores de la superficie de los dientes y son muy importantes en la placa dental que se asocia con el mantenimiento de la salud periodontal (19).
La recuperación de Actinomyces orales se observa en agar sangre con antibiótico en anaerobiosis en donde se inhibe la flora gram- negativa.(13).
Crecen en agar sangre BHI, caldo de tioglicolato, se han descrito medios de cultivo selectivos especialmente para A. naeslundii, A. viscosus, y A. odontolyticus. Entre ellos se destacan el denominado GMC en cuya composición se incluye agar gelatina , metronidazol y sulfato de cadmio, y el medio CFAT constituido a base de TSA, que es sangre de carnero, sulfato de cadmio, fluoruro sódico, acriflavina neutra , telurito potásico y fucsina básica. Estos medios tienen el inconveniente, por una parte de no permitir el crecimiento de todas las cepas y por otra parte el hecho de que su poder selectivo no es alto en productos con gran diversidad y carga bacteriana.
Estos microorganismos forman parte de la microbiota normal del suelo, el hombre y los animales, originando ocasionalmente diversos procesos infecciosos(31).
Las colonias maduras (7 a 14 días) miden ent re 0.5 – 5.0 mm de diámetro, algunas son rugosas, secas, quebradizas y adherentes en cuanto a su textura; lisas, blandas o con aspecto mucoide, o muestran varios grados de transición entre sus formas. Las colonias son blancas, blancas grisáceas o blancas cremosas, pero el A. odontolyticus desarrolla un pigmento rojo cuando crece en agar sangre y puede producir una zona
de color verdoso alrededor de las colonias que se asemeja a los Streptococos beta hemolíticos. Algunas cepas de A. odontolyticus pueden crecer en forma aeróbica en agar sangre. El crecimiento en medios líquidos es generalmente turbio y parejo, pero en algunas ocasiones puede ser floculento. El hábitat normal de este microorganismo es la cavidad oral del hombre, se le puede aislar de caries dentarias profundas.y A.
denticolens forma colonias rosadas cuando crece anaeróbicamente en agar sangre. La temperatura óptima de crecimiento es de 35 a 37ºC . Los carbohidratos son fermentados con la producción final de ácido pero no de gas (29).
El A. israelii, produce un crecimiento escaso o nulo aeróbicamente. La fuente infección generalmente es endógena, ya que el hábitat normal del microorganismo es la cavidad oral (9).
2.2.1.5. Prevotella spp.
Son bacilos gramnegativos, pleomórficos, inmóviles, sensib les a la bilis al 20% y moderadamente fermentativos. Tienen fimbrias que intervienen en la adhesión y coagregación bacteriana y residuos proteicos superficiales como receptores de otras adhesinas (19). Las colonias en agar sangre son circulares, convexas, pequeñas, lisas, traslúcidas y opacas, grisáceas o de pigmento marrón o negro. Se distingue principalmente por su requerimiento de hemina(comúnmente provista por la sangre) y la producción de un derivado de la hematina de color verde amarillento a negro, si se suministra un exceso de hemina. La pigmentación de sus colonias comienza
aproximadamente al tercer día, pero se vuelven negras del 7 al 14 día. Su hábitat primario es la cavidad oral, en el surco gingival (9).
La Prevotella melaninogenica también representa especies de fácil colonización y un frecuente incremento durante los primeros años de vida, mientras que la Prevotella intermedia es un grupo de organismos que coloniza tardíamente (24).
2.2.1.6. Fusobacterium nucleatum.
Es un bacilo gramnegativo, no formador de esporas, inmóvil y anaerobio obligado.
No todas las especies de este género tienen forma fusiforme.
El Fusobacterium nucleatum mide de 0.4 a 0.7 por 3 a 10um y no posee pilis o flagelos. La superficie de las colonias en agar sangre es de 1 a 2mm de diámetro, con aspecto circular o ligeramente irregulares, convexas, traslúcidas, frecuentemente con apariencias de manchas cuando se observan con luz traslúcida. Usualmente no es hemolítico.
Este bacilo crece mejor en medios que contengan peptona (alrededor del 1%) y extracto de levadura (0.5 – 1.0%), crece más rápido usualmente a 37ºC y con un pH de 7.0.
Las especies descritas no fermentan arabinosa, manitol, ribosa, sorbitol, reduce los nitratos, y el H2S es positivo (9,24,35).
2.2.1.7.Leptotrichia spp.
Es uno de los microorganismos más grandes encontrados en la cavidad bucal.
Requiere ambiente de anaerobiosis para el aislamiento inicial, pero crece en subcultivos con ambiente de microaerofilia o tensión de oxígeno reducida. El microorganismo es un filamento recto o ligeramente curvo que varía entre 3 y 40um de longitud por 1um de grueso. En general es plano en un extremo y redondeado en el otro. Frecuentemente se asocia en pares, cadenas, empalizadas, cuerpos cocoides o filamentos septados, son generalmente inmóviles. Las células jóvenes de leptotrichia se tiñen de grampositivo, pero las que tienen ocho horas o más se tiñen como gramnegativas, pero con gránulos de color violeta distribuidos a lo largo del bacilo.
La temperatura óptima es de 35 a 37ºC, no crece a temperaturas menores de 25ºC. El buen crecimiento ocurre a un pH de 7.0 a 7.4.
Metaboliza carbohidratos con la formación de ácido, más no hay producción de gas.
Es catalasa negativo, indol negativo, no reduce nitrato. Estos microorganismos se encuentran en el material de la placa dentaria y también en los surcos gingivales, sobre todo en los detritos. En estudios bacteriológicos se muestra que las formas cocoides se multiplican por fisión. Esas formas complejas se encuentran en áreas en torno a los dientes y se encuentran salvo de ser eliminadas por el cepillado de los dientes y por el efecto limpiador de los movimientos de la lengua y los carrillos.
La bacteria habita en las bolsas periodontales profundas(31, 35).
Los medios de cultivo emp leados para el crecimiento de este microorganismo contienen peptonas, extracto de levadura y glúcidos fermentables. El crecimiento se
estimula con suero. En medios sólidos, pueden observarse dos tipos de colonias lisa e incoloras: unas con superficie cerebriforme y otras con relieve filamentoso. Las colonias de Leptotrichia crecen anaerobicamente en agar sangre o en medios con extracto de levadura y triptona.
La Leptotrichia crece bien en medios comunes semilíquidos, en medios líquidos que contengan agentes reductores. La atmósfera anaeróbica con 5 a 10 % de CO2 es esencial para el aislamiento de Leptotrichia y para el buen crecimiento en medio sólido. Después de dos días de incubación las colonias son pequeñas, incoloras con un diámetro de 2 a3mm; convexas y con una superficie arrugada que se asemeja al cerebro humano. Las colonias algunas veces poseen filamentos puntuados. Las colonias son no hemolíticas y no adherentes al medio (28).
2.2.1.8.Capnocytophaga spp.
Son bacilos gramnegativos, fusiformes y anaerobios facultativos. Móviles por desplazamiento pero no se ha demostrado la presencia de flagelos. Requieren de una temperatura óptima de 35 a 37ºC .
Las células pueden ser únicas, pequeñas después de 18 a 24 horas de incubación, y tienen un diámetro de 3-5 mm a los 3-4 días de incubación; son ligeramente convexas con un borde plano irregular formando spreading (película) y con depresiones o agujeros en el agar; otras colonias pueden ser circulares o pequeñas.
La pigmentación de las colonias en la superficie del agar varía de blanco - gris a rosado y amarillo- naranja. La especie Capnocytophaga fue encontrada como parte de
la microbiota normal del humanos. El nicho ecológico primario es el surco gingival.
Es recuperada de lesiones periodontales(31,24).
No crece en agar Mac Conkey pero si lo hace en Thayer- Martín y agar chocolate.
Las placas son incubadas 3 – 5 días a 35 – 37 ºC en anaerobiosis. Por lo común no se descubre su movilidad en agar sangre, aunque en dicho medio más o menos la mitad de las cepas muestran un crecimiento que se aleja ligeramente de la línea de picadura después de 2 a 7 días de incubación(9).
Produce alfa hemólisis o hemólisis parcial, cuando la bacteria se retira por raspadura de la superficie del agar, la masa celular tiene un color amarillo (31).
La Capnocytophaga como otros géneros de bacterias orales, tiene la capacidad de agregarse especialmente con el Actinomyces israelii. La coagregación, es una asociación por el reconocimiento célula – célula, formando micro y macrocolonias en la superficie del cemento dental. El Actinomyces israelii, tiene la habilidad de reconocer la superficie de la Capnocytophaga formando coagregados en la superficie dental; esto juega un papel muy importante y explica el establecimiento de éstas dos células en el mismo nicho ecológico, además contribuye al entendimiento de la ecología oral(10).
2.2.1.9.Clostridium spp.
Son bacilos grampositivos, esporulados y anaerobios estrictos, si bien algunas cepas son microaerofilicos. Los esporos redondos u ovales suelen deformar el soma
bacteriano y se sitúa en posición central, terminal o subterminal. La mayor parte de las especies son móviles, merced a flagelos perítricos. Entre las de importancia médica la única inmóvil es C. perfringes , que es además también la única dotada de cápsula.
Los clostridios forman parte de la flora del hombre y los animales y se encuentran ampliamente distribuidos en el suelo, a causa de la alta resistencia a los agentes externos que le proporcionan los esporos. En el hombre su hábitat normal es el tubo gastrointestinal y el aparato genital femenino aunque también se pueden aislar dela boca y piel.
La amplia distribución de los Clostridium en la naturaleza provoca que con elevada frecuencia contaminen heridas. Pero al carecer de poder invasivo, los casos de infecciones clínicas son escasos. Estas infecciones están condicionadas por circunstancias favorecedoras exógenas y por el huésped. El origen de los cuadros clínicos producidos en la mayoría de las ocasiones es endógeno pero tienen o pueden tener un origen exógeno: tétanos, botulismo, gangrena gaseosa, celulitis clostridiana, toxiinfección alimentaria por C. perfringes, y enteritis necrotizante (9,31).
Las especies más importantes de interés clínico, ejercen su acción patógena mediante toxinas elaboradas por ellas que en algunos casos tienen un elevado poder tóxico.
En general las toxinas son sustancias proteícas solubles y termolábiles; unas son difusibles y se producen y se liberan durante el crecimiento bacteriano, en tanto que otras se originan por lisis celular. Algunas se sintetizan como prototoxinas o toxinas progenitoras y necesitan para actuar ser activadas por enzimas proteolíticas exógenas o de la propia bacteria. Por sus propiedades proteolíticas y sacarolíticas los
Clostridium se dividen en cuatro grupos: C. neurotóxicos (tetani y botulinum); C.
histotóxicos ( perfringes, septicum ); C. enterotóxicos ( perfringes ); C. piógenes (producen cuadros purulentos)
Los Clostridium solamente crecen en condiciones de anaerobiosis las cuales pueden lograrse por cualquiera de los métodos siguientes:
• Se colocan placas de agar o tubos de cultivo en un recipiente hermético del
cual se extrae el aire y se reemplaza por nitrógeno con 19% de CO2 o puede extraerse el oxígeno por otros métodos (gaspack).
• Medios líquidos en tubo de ensayo llenos hasta cierta altura y conteniendo ya
sea tejidos animales (carne picada) o bien 0.1 % de agar o un agente reductor como el tioglicolato, tales tubos pueden ser manejados como tejidos aerobios, y el crecimiento se presentara desde el fondo del tubo hasta cerca de 15mm de la superficie expuesta al aire.
Algunos microorganismos producen colonias grandes, elevadas, con bordes enteros (por ejemplo C. perfringes) otros producen colonias más pequeñas cuyos bordes se extienden en formas de red de finos filamentos (C. tetani). Muchos clostridios producen una zona de hemólisis en agar sangre (28).
2.2.1.10. Eubacterium spp.
Son bacilos grampositivos, pleomórficos, no esporulados; pueden ser móviles o inmóviles. En el curso de su metabolismo producen gran cantidad de hidrógeno,
siendo unas especies sacarolíticas y otras no, lo mismo ocurre con la producción de indol(19).
El crecimiento usualmente es más rápido a 37ºC y con un pH de 7. Crece en agar sangre suplementado con vitamina K y hemina. Las colonias tienen aspecto variable;
traslúcidas, grises, granulares con bordes continuos o irregulares.(9,35)
Todas las especies pueden aislarse a partir de placa supragingival, el surco gingival, las bolsas y abscesos periodontales, cálculo dental, lesiones cariosas de dentina e infecciones radiculares, no estando clara en ningún caso su significación patógena (31).
2.2.1.11. Selenomonas spp.
Son bacilos gramnegativos usualmente miden 0.9 – 1.1 por 3.0 – 6.0 um, están agrupados en cadenas; no son formadores de cápsula ni de esporas, son móviles con actividad de rodamiento, los flagelos son dispuestos linealmente en el centro del lado cóncavo, en el área del ángulo interno. Son estrictamente anaeróbicos; la temperatura óptima es de 35 a 40 ºC, tienen metabolismo fermentativo y son catalasa negativo.
Las células son rígidas en forma helicoidal o en media luna, están agrupados en pares o cadenas cortas (o solas) y muchas veces en masas especialmente la S. sputigena . El flagelo es de 17nm o más. Las células a veces forman una curva de “S”, pero por lo general, tienen entre dos y cinco curvas, de ahí su apariencia espiroidal (31).
La S. sputigena ha sido encontrada sólo en la cavidad bucal del hombre, especialmente en el surco gingival, esta relacionada con la etiología de la enfermedad periodontal, pero aún no esta establecida.
Las especies de Selenomonas usualmente fermentan esculina, lactosa, sucrosa (29) .
2.2.1.12.Peptostreptococcus ssp.
Son cocos grampositivos anaerobios, no esporulados. Agrupados en pares, tétradas, masas irregulares o cadenas.
Metabolizan peptonas y aminoácidos en ácido acético. Crece en agar sangre con suplementos adicionales con vitamina K y hemina.
La preparación del medio, edad y condiciones de almacenamiento del mismo son críticos para el aislamiento de los cocos grampositivos anaerobios de importancia clínica. Estos microorganismos requieren medios frescos para la recuperación óptima (29). Además de aislarse en la cavidad oral, forman parte de la microbiota normal del intestino, el tracto urogenital y la piel. Desencadenan numerosos procesos patológicos fuera del ámbito bucal, tales como abscesos pulmonares, del sistema nervioso central, abdominales, septicemias y otros (31).
Generalmente sus células son pequeñas, convexas, opacas, lisas y blancas; las colonias oscilan entre el negro carbón hasta un color traslúcido o blanco grisáceas (9).
Las bacterias anaerobias presentan numerosos aspectos biológicos en común con las aerobias y las facultativas, pero su rela ción con el oxígeno molecular es lo que las diferencia fundamentalmente.
El oxígeno resulta tóxico para las bacterias anaeróbicas por su la labilidad de determinados sistemas enzimáticos propios de estas bacterias en ambiente aerobio quizá por la producción de radicales superóxido. Por ello el desarrollo de las bacterias anaerobias en las lesiones humanas o como componentes de la flora se efectúa por una serie de circunstancias, como la falla de aporte de oxígeno a una región provocada por isquemia, presencia de bacterias de asociación que consumen el oxígeno existente.
Para trabajar con los anaerobios en el laboratorio, es preciso obtener unas condiciones de anaerobiosis que se basan en la aplicación de métodos físicos (por ejemplo: el vacío), químicos (añadiendo sustancias reductoras, como la cisteína u otras sustancias) o biológicos (como la asociación con aerobios que consumen el O2), o todos ellos. Prácticamente cualquier técnica de anaerobiosis suele incorporar dos o más tipos de métodos.
La atmófera de anaerobiosis se puede lograr por varios métodos, cuya finalidad es doble: eliminar o reducir la tensión de O2. la tecnología ha evolucionado, hasta disponer en la actualidad de unos procedimientos, cuyo rendimiento es claramente satisfactorio. Algunos son sofisticados y necesitan un equipo complejo, como es la cámara de anaerobiosis o el sistema PRAS, con medios prereducidos y esterilizados, que pueden ser muy útiles , sobre todo en el trabajo con bacterias muy oxígeno lábiles. Otros sistemas como el de la jarra de anaerobiosis son más sencillos y más
fáciles de manejar y consiguen resultados finales similares en la recuperación de anaerobios de importancia clínica (40).
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
Determinar la composición microbiana de la cavidad oral de los niños con edades entre los tres y cinco años.
3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
v Aislar e identificar las bacterias presentes en la cavidad oral de niños en edades de tres a cinco años.
v Determinar la frecuencia de aparición de cada uno de los microorganismos aislados en la cavidad oral de los niños a estudio.
4. MATERIALES Y METODOS
4.1. TIPO DE ESTUDIO
Se realizó un estudio piloto en el que se estudiaron treinta niños con edades entre tres y cinco años de un jardín pre-escolar de la ciudad de Bogotá D.C. El estudio de carácter descriptivo tuvo una duración de seis meses, comprendidos entre febrero y agosto del año 2001. Las muestras fueron procesadas en el Centro de Investigaciones Odontológicas (CIO) de la Facultad de Odontología de la Pontificia Universidad Javeriana.
4.2. POBLACIÓN
Se realizó un muestreo de treinta niños en edad pre-escolar (3-5 años) de un jardín infantil de Bogotá D.C. Con previa autorización de los padres de familia y la asesoría y supervisión de una odontóloga para valorar el estado de la cavidad oral de cada infante.
4.3. LUGAR
Las muestras se recogieron en un jardín infantil que pertenece a la zona Nº 13 de Teusaquillo en la ciudad de Bogotá D.C.
4.4. CRITERIO DE INCLUSIÓN
Los niños incluidos en el estudio fueron aquellos en edades entre tres y cinco años que estudian en un jardín infantil, con un estado de salud satisfactorio.
4.5. CRITERIO DE EXCLUSIÓN
Niños menores de tres años y mayores de seis años.
4.6. VARIABLES DE ESTUDIO
Las variables analizadas en este estudio fueron edad, sexo.
4.7. RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN Y ANÁLISIS
La recolección de la información se llevó a cabo por medio de un formato de consentimiento, elaborado por el Centro de Investigaciones Odontológicas de la Pontificia Universidad Javeriana. (ANEXO Nº 1) Y un formato de reconocimiento de la salud oral de cada niño, elaborado por la odontóloga que colaboro.(ANEXO Nº 2 ).
La información es confidencial y se guarda en la base de datos del Centro de Investigaciones Odontológicas de la Pontificia Universidad Javeriana, para
posteriores estudios, de los cuales los padres de familia y los niños ya están enterados.
Para el análisis de los datos se incluyó la determinación de indicadores epidemiológicos (proporciones), distribución de frecuencias de las diferentes variables.
4.8. TOMA Y PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
La recolección de las muestras de saliva se realizó en el Jardín infantil “ Mi Dulce Hogar” de Bogotá D.C. en dos fechas diferentes con la asesoría respectiva de una Odontóloga .
Recién obtenida la muestra (0.5 ml de saliva) fue llevada en un tubo que contenía 2 ml de tioglicolato (ANEXO Nº 3). Todas las muestras se transportaron rápidamente hasta el laboratorio de microbiología del Centro de Investigaciones Odontológicas de la Pontificia Universidad Javeriana, dentro de las cuatro primeras horas de obtenidas, y se almacenaron a –20ºC hasta el momento de su procesamiento.(FIGURA Nº 1) Antes de realizar la siembra cada una de las muestras fue agitada en vortex por 30 segundos. Se sembraron 100 microlitros en seis placas de petri con agar Sangre: 1.
Dos cajas con agar sangre con vitamina K- hemina (ANEXO Nº 4), 2. Dos cajas con agar sangre con fenil-etil-alcohol (ANEXO Nº 6), 3. Dos cajas con agar sangre con gentamicina y vancomicina (ANEXO Nº 5). Después de la siembra cada placa fue incubada a 37ºC en diferentes ambientes atmosféricos: anaerobio y aerobio durante 48 horas. El medio anaeróbico se generó con un sobre de Gas Pack y su respectivo indicador.
Igualmente todas las muestras se sembraron en agar mitis salivarius, para saber si los niños presentan microorganismos cariogénicos.
Después del crecimiento cada colonia se resembró nuevamente en cada agar y llevada de igual forma a las diferentes atmósferas .Posteriormente cada colonia fue sometida a la tinción de Gram (ANEXO Nº 7) y a la prueba de la catalasa (ANEXO Nº 8).
Luego se mantuvo cada colonia en leche descremada para su posterior identificación con las pruebas bioquímicas estándares y el sistema Api 20A (TABLA Nº 1).
Las pruebas o ensayos bioquímicos (ANEXOS Nº 9- 14), son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar de forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente.
El sistema comercial usado en el presente estudio fue el API 20 A el cual es un sistema estandarizado para la identificación de bacterias anaeróbicas.
TABLA Nº 1 PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PRESENTES EN CAVIDAD ORAL
MICROORGANISMOS GRAM COMPORTAMIENTO FRENTE AL O2 CATALASA COAGULASA OXIDASA INDOL MOTILIDAD H2S UREASA GELATINA HID. ESCULINA RED. NO3 GLUCOSA SACAROSA MANITOL RAFINOSA MALTOSA
Veillonella spp Cocos gramnegativos AO - - - - + - - - + - - - -
Actinomyces spp Bacilos grampositivos AF - - - - - + v + + - v -
Prevotella melaninogenica Bacilos gramnegativos AO - - - v - + -
Fusobacterium nucleatum Bacilos gramnegativos AO - + + - - - - -
Porphyromona catoniae Bacilos gramnegativos AO - + v + - - -
Leptorichia spp. Bacilos grampositivos AO - - + - + + + + + +
Capnocytophaga spp. Bacilos gramnegativos AF - - - + - - - + - + v + + +
Clostridium spp. Bacilos grampositivos AO - - v - +
Eubacterium spp. Bacilos grampositivos AO - - - - - - - v -
Selenomonas spp. Bacilos gramnegativos AO - - - - + + + - + +
Peptostreptococcus spp. Cocos grampositivos AO - - - - - - - - + -
Lactobacillus spp Bacilos grampositivos AF - - + + +
Prevotella intermedia Bacilos gramnegativos AO - + - + - v -
CONVENCIONES
+ POSITIVO AF ANAEROBIO FACULTATIVO - NEGATIVO AO ANAEROBIO OBLIGADO V VARIABLE
FIGURA 1. DISEÑO EXPERIMENTAL SEGUIDO PARA EL AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE CAVIDAD ORAL
MUESTRAS
30 MUESTRAS DE SALIVA
TOMADAS A NIÑOS DE 3- 5 AÑOS
Veillonella spp.,Actinomyces spp., P.intermedia., Fusobacterium spp., Porphyromona spp., Lepto- trichia spp., Capnocytophaga spp., Clostridium AGAR SANGRE Anaerobiosis spp., Eucabterium spp.,Selenomonas spp., Con vitamina K y Hemina Lactobacillus spp.
Aerobiosis
AGAR SANGRE Anaerobiosis Gramnegativos: Prevotella spp., Fusobacterium Con Gentamicina Vancomicina spp., P. catoniae., Capnocytophaga spp Aerobiosis Selenomonas spp.Veillonella spp.
AGAR SANGRE Anaerobiosis Grampositivas: Actinomyces spp., Clostridium Con Fenil-etil alcohol spp., Leptotrichia spp., Eubacterium spp., Aerobiosis Peptostreptococcus spp.,Lactobacillus spp.
Incubación 35-37 ºC durante 48 horas
Características de crecimiento
(en medios primarios y diferentes atmósferas)
Aislamiento de colonias obtenidas en anaerobiosis y aerobiosis
AGAR SANGRE
Anaerobiosis (anaerobio estricto) Aerobiosis (aerobio)
Determinar si el microorganismo aislado es
Anaerobio estricto, microaerofílico o aerobio
Coloración de Gram
IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA
REACCIONES BIOQUÍMICAS (IDENTIFICACIÓN FINAL)
5. RESULTADOS
Entre febrero y agosto del año 2001 se realizó un estudio piloto con 30 niños en edades entre tres y cinco años con los cuales se realizó una brigada de salud oral . De estos 13 niños (43.3 %) fueron de sexo femenino y 17 (56.6%) fueron de sexo masculino. La edad promedio del grupo fue de 4.1 años.
Con el aislamiento se logró identificar y reconocer diferentes géneros de bacterias con predominio de bacterias anaerobias estrictas. En promedio se logró aislar de cada muestra 5.7 bacterias. En la tabla Nº 2 se muestra el reconocimiento de la microflora oral dividida en bacterias anaerobias facultativas y anaerobias estrictas, que se encontraron en las muestras de saliva de los 30 niños en estudio.
Tabla Nº 2 Reconocimiento de microorganismos en las 30 muestras estudiadas.
Nº Muestra
Bacterias anaerobias facultativas
Bacterias Anaerobias Estrictas
Staphylococcus spp. Streptococcus mutans Streptococcus sanguis Streptococcus salivarus Streptococcus mitis Capnocytophaga spp. Actinomyces odontolyticus Actinomyces israelí. Peptococcus spp. Peptostreptococcus spp. Peptostreptococcus anaerobius. Peptostreptococcus micros. Peptostreptococcus prevotti Fusobacterium nucleatum. Leptotrichia spp. Clostridium spp. Eubacterium spp. Selen
omonas spp. F. nucleatum Lactobacillus spp. Veillonella spp. sppsppspp.spp.Prevot Prevotella spp.
1
X X X X X X X X2 X X X X X X
3 X X X X
4 X X X X
5 X X X X X X
6 X X X X X X X X
7 X X X
8 X X X X X X X X
9 X X X X
10 X X X X X X
11 X X X X X
12 X X X
13 X X X X X
14 X X X X X
15 X X X
16 X X X X X X X X
17 X X X X X
18 X X X X X X
19 X X X X
20 X X X X X X X
21 X X X X X
22 X X X X X X X
23 X X X X
24 X X X X X X X X X X
25 X X X X X
26 X X X X X X X X X
27 X X X X X X
28 X X X
29 X X X X X X
30 X X X X X X X
Total 6 16 6 9 9 9 12 5 11 7 11 11 9 1 8 9 7 8 9 7
La tabla Nº 3 (ver gráfica Nº1) muestra la frecuencia que presentó cada microorganismo aislado en cada una de las diferentes muestras. El Streptococcus mutans fue la especie de mayor frecuencia encontrado con un porcentaje de 53.3 %, seguido por Actinomyces odontolyticus con un 40.0 %. La población a estudio presentó un 13.3 % de niños que presentaron tanto de Actinomyces odontolyticus como de Streptococcus mutans. Peptococcus spp., Peptostretococcus micros y Peptostreptococcus anaerobicus; todos con un porcentaje de 36.6 %. Teniendo en cuenta estos resultados las bacterias anaeróbicas estrictas predominan con un 57.2 % mientras que las anaerobias facultativas se aislaron en un 42.8 %.