Digestión gastrointestinal de proteínas alimentarias y mecanismos de acción de péptidos con efecto sobre la salud digestiva

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS

Departamento de Química Física Aplicada

DIGESTIÓN GASTROINTESTINAL DE PROTEÍNAS ALIMENTARIAS Y MECANISMOS DE ACCIÓN DE PÉPTIDOS CON EFECTO SOBRE LA SALUD DIGESTIVA

GASTROINTESTINAL DIGESTION OF FOOD PROTEINS AND MECHANISMS OF ACTION OF PEPTIDES ON

DIGESTIVE HEALTH

SAMUEL FERNÁNDEZ TOMÉ

INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS DE LA ALIMENTACIÓN (CSIC-UAM)

Madrid 2016

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS

Departamento de Química Física Aplicada

DIGESTIÓN GASTROINTESTINAL DE PROTEÍNAS ALIMENTARIAS Y MECANISMOS DE ACCIÓN DE PÉPTIDOS CON EFECTO SOBRE LA SALUD DIGESTIVA

Memoria presentada por:

Samuel Fernández Tomé

Para optar al grado de

DOCTOR EN BIOLOGÍA Y CIENCIAS DE LA ALIMENTACIÓN CON MENCIÓN DE “DOCTORADO INTERNACIONAL”

Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación

Trabajo realizado bajo la dirección de:

Dra. Isidra Recio Sánchez

Dra. Blanca Hernández Ledesma

ISIDRA RECIO SÁNCHEZ, PROFESORA DE INVESTIGACIÓN DEL CSIC, Y BLANCA HERNÁNDEZ LEDESMA, CONTRATADA RAMÓN Y CAJAL DEL CSIC, DEL INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS DE LA ALIMENTACIÓN

INFORMAN:

Que el presente trabajo titulado “DIGESTIÓN GASTROINTESTINAL DE PROTEÍNAS ALIMENTARIAS Y MECANISMOS DE ACCIÓN DE PÉPTIDOS CON EFECTO SOBRE LA SALUD DIGESTIVA [GASTROINTESTINAL DIGESTION OF FOOD PROTEINS AND MECHANISMS OF ACTION OF PEPTIDES ON DIGESTIVE HEALTH]”, que constituye la Memoria que presenta el Licenciado en Veterinaria SAMUEL FERNÁNDEZ TOMÉ para optar al grado de Doctor con Mención de Doctorado Internacional, se ha realizado bajo su dirección en el Departamento de Bioactividad y Análisis de los Alimentos del Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CSIC-UAM).

Y para que conste, firmamos el presente informe en Madrid a 5 de Octubre de 2016.

Fdo. Isidra Recio Sánchez Fdo. Blanca Hernández Ledesma

Al echar la vista atrás y recordar todo lo vivido durante esta etapa, resulta bastante difícil poder plasmar en tan solo unas líneas el agradecimiento debido a todas las personas e instituciones que han facilitado la realización de esta Tesis. En primer lugar, me gustaría mostrar un agradecimiento muy especial a mis directoras, las Dras. Isidra Recio Sánchez y Blanca Hernández Ledesma, por confiar en mí y darme la oportunidad de realizar este trabajo, por todo el tiempo, asesoramiento científico, paciencia y consejos dedicados que han hecho posible el buen fin de cada uno de los resultados recogidos en la siguiente memoria. Gracias por haber dejado huella tanto a nivel profesional como personal, por transmitirme orientación ante cada duda y dejarme aprender de vuestra capacidad de trabajo y experiencia.

Gracias al Ministerio de Economía y Competitividad por la concesión de una beca pre- doctoral asociada al proyecto AGL2011-24643. Al proyecto COST Action INFOGEST FA1005 por financiar mi asistencia a “2^nd PhD Training School”. Un agradecimiento personal dirigido a mi grupo de investigación, Bioactividad y Alergenicidad de Proteínas y Péptidos Alimentarios (BIOPEP), por todos los momentos compartidos con ellos. Mi reconocimiento a la Dra. Rosina López-Fandiño por su excelente trabajo como jefa de grupo y amabilidad. Un agradecimiento especial a la Dra. Lourdes Amigo, por su magnífica ayuda y consejo, aportando una actitud tan necesaria llena de entusiasmo, que me ha acompañado desde el inicio. También agradecer a las Dras. Beatriz Miralles, por todo el tiempo y atención dedicada, Elena Molina, por su carisma y labor organizativa, Marta Miguel y Josefina Belloque, por su simpatía. Me gustaría agradecer al Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL), bajo la dirección de la Dra.

Mª Victoria Moreno Arribas, por la acogida y todos los recursos humanos y técnicos facilitados.

Gracias a todo el personal del centro por su gran labor de asistencia diaria. A las Dras. Nieves Corzo, jefa del Departamento de Bioactividad y Análisis de los Alimentos, y Susana Santoyo, por aceptar la tutoría de este trabajo.

La realización de esta Tesis me ha permitido colaborar con varias instituciones a las que me gustaría mostrar mi más sincero agradecimiento por la cálida acogida, disponibilidad y ayuda brindada. Quiero agradecer a los Dres. Luis Goya y Sonia Ramos por sus enseñanzas transmitidas, cercanía y simpatía constantes durante mi estancia en el Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN), también a los Dres. María Ángeles Martín, Isabel Cordero y José Manuel Silván y a todos los integrantes del grupo Metabolismo y Bioactividad de Fitoquímicos por la agradable etapa vivida allí. Gracias a los Dres. Rocío Girón y Carlos Goicoechea y a todo su grupo de investigación, con mención especial a Guadalupe Pablo, por toda su ayuda, gentileza y disposición durante mi paso por la Universidad Rey Juan Carlos.

Igualmente agradecer los momentos transcurridos en el Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Universitario La Paz (IdiPAZ) junto a las Dras. María Tabernero y Carlota Largo, y en la Estación Experimental del Zaidín (EEZ) con los Dres. Alfonso Clemente y Cristina Delgado. I would like to truly thank to Dr. Hang Xiao for allowing me to perform a PhD internship at the

University of Massachusetts in Amherst (USA) and to his entire lab, especially Fei (Jason) Xu, Xiaokun Cai, and Minqi Wang, as well as to the “big international family” I met there.

Una mención especial va dirigida a todos mis compañeros del CIAL. Quiero empezar con un reconocimiento muy personal hacia el Dr. Daniel Martínez Maqueda, de quien aprendí tanto, por su ejemplar guía, disponibilidad y simpatía constantes. Un agradecimiento destacado y, tan extenso como todas las vivencias, risas y anécdotas compartidas desde que comenzamos juntos este camino, a Laura Perezábad, Alba Pablos y Daniel Lozano, por haber hecho único cada día. A Tomás Herrero, por ser uno de esos compañeros de trabajo y amigos que uno tiene la suerte de encontrarse en la vida. No me olvido de todos aquellos que me acogieron tan bien, Sara Benedé, Marta Garcés, Almudena García, Sara Junco, Mónica Ullate, Beatriz Fernández, Nuria Martínez, Isabel Herranz, Alberto Fernández, Iván López, Constanza Talavera, Alberto Valdés… y especialmente Elvia Cruz y Laura Sánchez, por su cercanía y consejos. Gracias a los que han ido llegando aportando tanto, Silvia Moreno, Diego Morales, Rubén Vilcacundo, Mónica Martínez, Leticia Pérez, Sara Lara, Juancar Ramos, Nuria Lara, Helena Rodríguez, Marta Santos, y con una mención especial a Javier Sanchón e Irene Pastor, por su ayuda y apoyo en esta etapa final. A todos los que han hecho su paso por el laboratorio, Fernanda, Aurora, Blanca, Sebnem, David, Xiaojuan, Susana, Miriam, Roberto, Estefanía, Irati, Ángela, Isabel, Amandine, Pablo, Fátima, Cindy, Diego, Sonia, Rubén, Leire, Javier… así como a mis compañeros de la sala postdoctoral, que me han alentado durante estos largos últimos pasos. Gracias a todos por vuestro apoyo y ayuda, pero, sobre todo, por cada uno de los momentos vividos que han hecho de estos años una aventura inolvidable.

Muchas gracias a mis amigos de siempre, Andy, Bea, Carmen, David, Isa, Joaquín, Laura, Lore, María, Martas, Patri, Paula, Ra, Samuel, Sergio, Sesa, Varo, Vila y “agregados”

por sacar siempre lo mejor de mí y seguir acumulando tantísimas vivencias juntos, sin las que hubiera sido mucho más complicado llegar a este punto.

Un profundo agradecimiento a toda mi familia, a mis padres por los esfuerzos hechos que me han dado el soporte por el que hoy puedo estar aquí. A mi madre y hermana por toda su comprensión, apoyo y ánimo. Con un afecto muy personal, a mis abuelos Cecilia Romo y Nicomedes Fernández por haberme transmitido muchísimo más de lo que ellos se pueden imaginar. Un agradecimiento “diferente” para “Ron”, gracias por todo lo que me acompañaste con cada gesto y paseo y, aunque no sea igual, seguir conmigo. Por último, “no quiero irme sin decirte una cosa”, el agradecimiento más especial es para ti, Patricia, por haberte cruzado en mi camino, por iluminarlo, por solo sonreír y hacerme tan feliz... gracias por todo.

Vale la pena luchar por lo que vale la pena tener.

Samuel

“Las que conducen y arrastran al mundo no son las máquinas, si no las ideas”

Victor Hugo

ABSTRACT / RESUMEN

3

LISTA DE ABREVIATURAS

11

OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

13

1. INTRODUCCIÓN

21

1.1. Composición proteica de la soja y la leche 24

1.2. Digestión y biodisponibilidad de proteínas de soja y lácteas 26

1.2.1. Proteínas de soja. Péptido lunasina 29

1.2.2. Proteínas lácteas 30

1.3. Péptidos alimentarios con efectos biológicos relacionados con

35

1.3.1. Actividad opioide. Efectos sobre la producción de mucinas

37

1.3.2. Actividad antioxidante 44

1.3.3. Actividad antiproliferativa 51

2. RESULTS / RESULTADOS

61

2.1. Publicación I: The protective role of the Bowman-Birk protease

65

2.2. Publicación II: Transepithelial transport of lunasin and derived

77

2.3. Publicación III: Bioactive peptide lunasin targets colorectal

89

2.4. Publicación IV: In vitro chemo-protective effect of bioactive

113

2.5. Publicación V: Novel peptides derived from α

125

2.6. Publicación VI: Short communication: Effect of a casein

143

2.7. Publicación VII: Comparison of the standardised in vitro

159

3. DISCUSIÓN

185

3.1. Digestión, biodisponibilidad y mecanismos quimiopreventivos

188

3.2. Efectos de péptidos lácteos sobre la mucosa intestinal. Estudio

201

4. CONCLUSIONS / CONCLUSIONES

209

5. BIBLIOGRAFÍA

215

6. ANNEXES / ANEXOS

229

ABSTRACT

In this Thesis several aspects related to the physiological effect of bioactive peptides on the digestive tract have been studied by a double approach. It has been investigated not only the modifications that food proteins and peptides undergo during the gastrointestinal digestion, but also the mechanisms of action involved in the biological function that bioactive peptides might exert due to their contact with digestive cells and receptors. Peptide lunasin, casein and whey proteins, and milk peptides were analyzed.

Initially, the behavior of peptide lunasin under digestive conditions simulating the transit through the gastrointestinal tract in the absence or presence of soybean Bowman-Birk isoinhibitor 1 (IBB1), in both active and inactive states, was evaluated.

IBB1 isoinhibitor exerted a protective effect on lunasin degradation during digestion.

Protection against the action of pepsin was due to the presence of IBB1 and its higher size in comparison with that of peptide lunasin, independently of activity. However, an IBB1 dose-dependent protective effect was found at intestinal level, related to its inhibitory activity of pancreatic enzymes trypsin and chymotrypsin. The peptide profiles of gastric and gastrointestinal digests were characterized. It was demonstrated the notable resistance during the digestive process of some domains of peptide lunasin, especially regions

SKWQHQQDSC

,

RKQLQGVN

,

LTPCEKHIME

and

29

KIQGRGDDDDDDDDD

. The transepithelial transport of these four fragments and the precursor lunasin was evaluated using Caco-2 cell monolayers. While some regions of these peptides were susceptible to epithelial brush-border peptidases, a marked resistance was found for others, particularly for fragments

SKWQHQQDSC

and

KIQGRGDDDDDDDDD

. The transepithelial transport of lunasin and fragment

11

RKQLQGVN

was mediated through diffusion via the paracellular pathway.

Additionally, lunasin, as well as its gastrointestinal digests in presence/absence of

IBB1, and some lunasin-derived fragments identified in these digests were evaluated

4 Abstract

for their effect against the viability of gastric cancer AGS and colorectal cancer HT-29 and Caco-2 cells. It is highlighted that the fragment

SKWQHQQDSC

was the main responsible for the demonstrated inhibitory effect of lunasin on cellular viability, particularly in HT-29 cells. The chemopreventive mechanisms of action of lunasin against the proliferation of bulk colorectal cancer HCT-116 cells and the expansion of their tumorsphere-derived cancer stem-like subpopulation were evaluated. Peptide lunasin inhibited the viability of bulk tumor cells, as well as the tumorsphere-forming capacity of HCT-116 cells. The inhibitory activity was mediated by inducing apoptosis and arresting cell cycle at G1 phase. These effects were associated to a stimulatory effect on molecular marker caspase-3 linked to a cleavage on PARP signal, and a modest activation of p21 protein expression. Upon chemical-induced oxidative stress, lunasin-treated liver HepG2 cells showed an increased cellular viability. This protective effect was mediated through raising intracellular glutathione levels, and decreasing oxygen reactive species production and glutathione peroxidase and catalase activities.

In addition, lunasin protected proteins from oxidative damage and inhibited caspase-3 mediated apoptosis.

In the context of gastrointestinal mucus strengthening by food protein

compounds, novel peptides derived from α

-casein

YFYPEL

and

YFYPEL

and, to a lower extent,

YFY

and

AYFYPEL

were found, for the first time, to

exert an opioid agonist activity. By molecular dynamics simulations of peptides binding

with the µ-opioid receptor, it was proved that the carboxi-terminal proline residue from

peptide

YFYP

affected to its interaction with opioid receptor and activity. On

intestinal goblet cells, it was demonstrated that peptide

YFYPEL

was the minimum

fragment able to stimulate expression of MUC5AC, the main secreted mucin gene in

HT29-MTX cells. Later on, the protective effect of a peptic casein hydrolyzate

containing these opioid peptides was studied in the rat intestinal mucus layer. This

hydrolyzate stimulated the gene expression of mucins Muc2 and Muc3 in ileum and

colon, and the fecal mucin secretion after its oral administration during two and eight weeks, enhancing in vivo the intestinal mucus barrier.

Finally, protein degradation and peptide formation in digests obtained after in

this purpose, the peptide profile of jejunal digests of 5 human volunteers was characterized and compared with peptides generated during in vitro gastrointestinal digestion of milk proteins following a standardized and internationally harmonized static digestion protocol. Whereas protein degradation through the gastrointestinal tract was observed, some protein domains showed resistance against the action of digestive enzymes. In vivo and in vitro protein degradation and digests peptidome were similar.

Spearman correlation coefficients between in vivo and in vitro digests were within the range of that obtained between the different human volunteers of the study. Therefore, this in vitro method represented a suitable model to physiologically simulate the gastrointestinal digestion, at least in the case of milk proteins.

Altogether, these results demonstrated the key role that digestive tract can play

on the bioactivity of ingested compounds. Moreover, the results have allowed

increasing the knowledge on the mechanisms of action involved in the beneficial

effects of peptide lunasin, milk proteins, and derived peptides on digestive health.

RESUMEN

En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el estudio de varios aspectos relacionados con el efecto fisiológico de los péptidos bioactivos sobre el tracto digestivo con un doble enfoque. Por un lado, se han estudiado las modificaciones que sufren las proteínas alimentarias durante la digestión gastrointestinal y, por otro, se han evaluado los mecanismos de acción implicados en la funcionalidad biológica que los péptidos bioactivos pueden ejercer en contacto con las células y los receptores del tracto digestivo. Como sustratos se estudiaron el péptido lunasina, las caseínas y proteínas de suero y distintos péptidos lácteos.

Inicialmente, se estudió el comportamiento del péptido lunasina en condiciones de digestión que simulan el tránsito a través del tracto gastrointestinal, en ausencia o presencia de la isoforma 1 del inhibidor de proteasas Bowman-Birk (IBB1) derivado de la soja, tanto en su estado activo como inactivo. El isoinhibidor ejerció un efecto protector frente a la degradación del péptido lunasina durante la digestión. La presencia del IBB1 y su mayor tamaño con respecto al péptido lunasina, independientemente de su actividad, fueron responsables del efecto protector ejercido a nivel gástrico. Sin embargo, a nivel intestinal, la protección fue dependiente de la dosis de IBB1, relacionado con su actividad inhibitoria de las enzimas pancreáticas tripsina y quimiotripsina. Se caracterizó el perfil peptídico de los digeridos gástricos y gastrointestinales y se identificaron ciertos dominios del péptido lunasina con marcada resistencia durante el proceso digestivo, concretamente las regiones

1

SKWQHQQDSC

,

RKQLQGVN

,

LTPCEKHIME

y

KIQGRGDDDDDDDDD

. Asimismo, se evaluó el transporte transepitelial del péptido lunasina y de los cuatro fragmentos mencionados, empleando el modelo de células Caco-2 en monocapa.

Aunque algunas regiones de estos péptidos fueron susceptibles a la acción de las

enzimas del epitelio intestinal, se encontró una notable resistencia en otras zonas,

especialmente los fragmentos

SKWQHQQDSC

y

KIQGRGDDDDDDDDD

. El

8 Resumen

transporte del péptido lunasina y del fragmento

RKQLQGVN

a través de la monocapa celular estuvo mediado por un mecanismo de difusión por la vía paracelular. Paralelamente, se ensayó el efecto del péptido lunasina, de los digeridos gastrointestinales obtenidos a partir de las mezclas con/sin IBB1 y de algunos de los fragmentos identificados en dichos digeridos sobre la viabilidad de células de cáncer gástrico AGS y colorrectal HT-29 y Caco-2. Se pudo concluir que el fragmento

1

SKWQHQQDSC

es el principal responsable de la actividad inhibitoria del péptido lunasina sobre la viabilidad celular, especialmente en células HT-29. Se profundizó en los mecanismos de actividad quimiopreventiva del péptido lunasina frente a la proliferación de células nativas de cáncer colorrectal HCT-116 y la expansión de su subpoblación de células madre tumorales. El péptido lunasina inhibió la viabilidad de las células nativas tumorales así como la capacidad de formación de esferas tumorales de las células madre. La actividad inhibitoria estuvo mediada por un efecto inductor de la apoptosis celular y un bloqueo del progreso del ciclo celular en la fase G1. Estos eventos se asociaron a un aumento en la expresión proteica del biomarcador caspasa-3, con la consiguiente disminución de la señal PARP, y un moderado incremento de la expresión de la proteína p21. Frente al estrés oxidativo inducido químicamente en células hepáticas HepG2, las células tratadas con el péptido lunasina mostraron un incremento en la viabilidad. Este efecto estuvo mediado por un aumento del contenido intracelular de glutatión, una disminución en la generación de especies reactivas de oxígeno y de la actividad de las enzimas glutatión peroxidasa y catalasa, así como una recuperación frente al daño oxidativo a proteínas provocado por el agente químico y un bloqueo de la activación pro-apoptótica por caspasa-3.

En el contexto del fortalecimiento del mucus gastrointestinal mediante

compuestos alimentarios de naturaleza proteica, se describió por primera vez la

actividad agonista opioide de los péptidos lácteos derivados de la α

-caseína

144

YFYPEL

e

YFYPE

y, aunque con menor potencia, de los péptidos

YFY

y

143

AYFYPEL

. Mediante una modelización de la interacción molecular entre los péptidos y el receptor opioide tipo µ, se observó que la presencia de prolina en el extremo carboxi-terminal del péptido

YFYP

influía negativamente en su interacción con el receptor y actividad opioide. Adicionalmente, se demostró que el péptido

YFYPEL

constituye la mínima secuencia con capacidad estimulante de la expresión del gen MUC5AC, que codifica para la principal mucina en las células caliciformes intestinales HT29-MTX. Posteriormente, se estudió el efecto protector de un hidrolizado de caseínas con pepsina que contiene estos péptidos lácteos opioides, sobre la barrera mucosa del intestino de ratas. El hidrolizado aumentó la expresión génica de las mucinas Muc2 y Muc3 en íleon y colon, así como la secreción fecal de mucinas tras dos y ocho semanas de tratamiento, fortaleciendo in vivo la capa mucosa intestinal.

Finalmente, se comparó la degradación proteica y el proteoma obtenido tras la digestión gastrointestinal in vivo/in vitro de caseínas y proteínas de suero lácteo. Para ello, se caracterizó el perfil peptídico de los digeridos obtenidos a partir del yeyuno humano en 5 voluntarios y se comparó con los péptidos liberados a partir de las proteínas lácteas tras ser sometidas a un protocolo estático de simulación de la digestión gastrointestinal recientemente consensuado a nivel internacional. Se puso de manifiesto la degradación que sufren las proteínas a su paso por el tracto gastrointestinal, mientras que algunos dominios mostraron resistencia al proceso digestivo. La degradación proteica y el peptidoma de los digeridos obtenidos in vivo e

de correlación de Spearman entre los digeridos in vivo e in vitro fueron del mismo

orden a los encontrados al evaluar la variabilidad inter-individual entre los voluntarios

del estudio. Por ello, el método empleado de simulación de la digestión gastrointestinal

10 Resumen

in vitro, supuso una buena aproximación a la situación fisiológica, al menos en el caso

de la digestión de las proteínas lácteas.

En conclusión, se ha demostrado el papel determinante que desempeña el

tracto digestivo sobre los compuestos bioactivos ingeridos y se ha avanzado en el

conocimiento de los mecanismos involucrados en los efectos beneficiosos del péptido

lunasina, de proteínas lácteas y de péptidos derivados sobre la salud digestiva.

LISTA DE ABREVIATURAS

α-La: α-lactoalbúmina β-Lg: β-lactoglobulina

BBI: inhibidor de proteasas Bowman-Birk

BBIC: concentrado de inhibidor de proteasas Bowman-Birk CAT: catalasa

CM: casomorfina

CMP: caseinomacropéptido CN: caseína

CPPs: caseinofosfopéptidos

ECA: enzima convertidora de angiotensina

EFSA: Agencia Europea de Seguridad Alimentaria

FDA: Agencia Estadounidense de Alimentos y Medicamentos GPx: glutatión peroxidasa

GSH: glutatión reducido H

O

: peróxido de hidrógeno

HPLC-MS/MS: cromatografía de líquidos de alta eficacia acoplada a espectrometría de masas en tándem

IBB1: isoinhibidor-1 de Bowman-Birk KTI: inhibidor de tripsina Kunitz LF: lactoferrina

LPS: lipopolisacárido

Mucn: gen correspondiente a la mucina de rata número “n”

MUCn: gen correspondiente a la mucina humana número “n”

qRT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa ROS: especies reactivas de oxígeno

SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida SOD: superóxido dismutasa

t-BOOH: tert-butil hidroperóxido

OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

El tracto digestivo constituye la mayor superficie de intercambio entre el medio externo y el organismo. Se encuentra continuamente en contacto con los digeridos de los alimentos y con numerosos compuestos que pueden provocar desequilibrios oxidativos y alteraciones proliferativas en sus poblaciones celulares. Además, expresa una gran cantidad de receptores, p.e. receptores opioides, y desempeña un papel decisivo en las modificaciones de los componentes ingeridos. Por tanto, el tracto digestivo es considerado como una de las principales dianas de los compuestos con actividad biológica y es determinante en su posible relevancia fisiológica.

Durante la digestión gastrointestinal se producen una gran cantidad de péptidos por hidrólisis de las proteínas alimentarias, los cuáles podrían desempeñar distintos efectos regulatorios sobre las funciones digestivas. Así, en el estudio de los efectos biológicos de los péptidos alimentarios, resulta esencial conocer cómo se digieren las proteínas alimentarias, identificar la forma activa en el organismo y evaluar los mecanismos de acción implicados en dichos efectos. Esta información es fundamental para establecer la relación entre el compuesto y la funcionalidad biológica. De este modo, estos estudios se presentan como una interesante estrategia para la mejora de la salud digestiva y la prevención de las enfermedades relacionadas.

Objetivo general

El principal objetivo de esta Tesis Doctoral es la “evaluación de los procesos

relacionados con la digestión y la biodisponibilidad de diferentes péptidos de origen

alimentario implicados en la salud digestiva, así como el estudio de sus propiedades

beneficiosas, a través de su efecto opioide y modulador de la expresión de mucinas

intestinales, y de su capacidad protectora frente a procesos de estrés oxidativo y de

proliferación celular anormal”. Para cumplir este objetivo se plantearon los siguientes

16 Objetivos y plan de trabajo

Objetivo 1

Estudio del comportamiento del péptido lunasina frente a la simulación in vitro de la digestión y la absorción gastrointestinal. Efectos sobre la viabilidad de células tumorales del tracto digestivo.

1.1. Evaluación del efecto protector del isoinhibidor-1 de Bowman-Birk (IBB1)

en la digestión in vitro del péptido lunasina. Estudio de la actividad de los digeridos gastrointestinales sobre la viabilidad de células de cáncer colorrectal.

1.2. Evaluación del transporte transepitelial del péptido lunasina y de péptidos

liberados a partir de su digestión gastrointestinal. Estudio de la actividad de los péptidos sobre la viabilidad de células de cáncer gástrico y colorrectal.

Lunasina:IBB1 (p:p) 1:0

1:1 1:2 1:2 IBB1 inactivo

Simulación digestión in vitro

Gástrica Gastrointestinal

Cuantificación lunasina Perfil peptídico

Efecto

antiproliferativo HPLC-MS/MS

20 25 30 35 40 45 50 55 60

0 500 1000 1500 2000 2500

Time (min)

Intensity(mAU)

A

(m/z) 0 2 4 6

800100012001400160018002000

Intensity(x105 )

+4 1258.0

+5 1006.7

+3 1677.2

Células tumorales

HT-29 Caco-2

Lunasina (1-43)

20 25 30 35 40 45 50 55 60

0 500 1000 1500 2000 2500

Time (min)

Intensity(mAU)

A

(m/z) 0 2 4 6

800100012001400160018002000

Intensity(x105 )

+4 1258.0

+5

1006.7 1677.2+3

Lunasina (1-43), f(1-10), f(11-18), f(19-28), f(29-43)

Lunasina (1-43), f(1-10), f(11-18), f(17-28), f(19-28), f(29-41), f(29-43), f(34-43) Monocapa células

Caco-2

HPLC-MS/MS

Resistencia peptidasas epiteliales Absorción intestinal

Mecanismo de transporte

Células tumorales

AGS HT-29 Caco-2

Efecto antiproliferativo

Estabilidad lunasina en cultivo

HPLC-MS/MS

Objetivo 2

Estudio de los mecanismos celulares protectores del péptido lunasina responsables de su actividad quimiopreventiva.

2.1. Efecto del péptido lunasina sobre la proliferación de células de cáncer

colorrectal. Evaluación de los mecanismos preventivos en células nativas y células madre tumorales.

2.2. Evaluación de los mecanismos de defensa antioxidante ejercidos por el

péptido lunasina en células hepáticas.

Lunasina

Células tumorales HCT-116 Células nativas

Células madre

Viabilidad celular Efecto

antiproliferativo

Formación de esferas tumorales

Citometría de flujo

Western Blot

Apoptosis (PARP, caspasa-3)

Ciclo celular (p21, p27)

Lunasina

t-BOOH

Lunasina + t-BOOH

Células HepG2 Efecto

directo Inducción química de estrés oxidativo

Efecto quimiopreventivo

HPLC-MS/MS

20 25 30 35 40 45 50 55 60

0 500 1000 1500 2000 2500

Time (min)

Intensity(mAU)

A

(m/z) 0 2 4 6

800 100012001400160018002000

Intensity(x105 )

+4 1258.0

+5

1006.7 1677.2+3

Mecanismos de defensa antioxidante Estabilidad lunasina

en cultivo

Viabilidad celular Morfología

ROS, GSH, GPx, CAT Carbonilos

Caspasa-3

18 Objetivos y plan de trabajo

Objetivo 3

Estudio de los mecanismos implicados en la actividad protectora de péptidos lácteos sobre la capa mucosa del tracto intestinal.

3.1. Evaluación de la actividad opioide de péptidos lácteos con efecto en la

expresión de mucinas en células caliciformes intestinales.

3.2. Efecto modulador in vivo de un hidrolizado de caseínas lácteas sobre la

producción de mucinas en el intestino de rata.

Efecto opioide α_s1-caseína

AYFYPEL, f(143-149) YFYPEL, f(144-149) YFYPE, f(144-148)

YFYP, f(144-147) YFY, f(144-146)

Deferente de ratón Íleon de cobaya

Estabilidad péptidos

en la preparación HPLC-MS/MS

Dinámica Molecular YFYPEL vs YFYP Receptor opioide

Mucinas intestinales

Células HT29-MTX

qRT-PCR

MUC5AC Inhibidores

de proteasas

Hidrolizado de Caseínas

Mucinas

intestinales _Rata Zucker

Duodeno Yeyuno Íleon Colon

qRT-PCR Muc2, Muc3, Muc4

Lumen intestinal Heces

Fluorímetria Secreción de mucinas

Objetivo 4

Estudio comparativo de procesos de simulación in vitro de la digestión gastrointestinal de proteínas lácteas (caseínas y proteínas de suero) con digeridos intestinales obtenidos en individuos sanos.

Caseínas

Humanos in vivo (aspirado yeyuno)

Protocolo consensuado digestión in vitro Proteínas

de suero

Análisis elemental Precipitación

CPPs Degradación proteica

Perfil peptídico

Comparación in vivo / in vitro SDS-PAGE

HPLC-MS/MS

1. INTRODUCCIÓN

Un gran número de las funciones del organismo se encuentran reguladas por proteínas y péptidos endógenos que pueden actuar como hormonas, neurotransmisores o reguladores enzimáticos. Durante la digestión gastrointestinal de las proteínas alimentarias se produce una amplia variedad de péptidos. Estos péptidos exógenos pueden ser estructuralmente similares a sus homólogos endógenos, lo que les permite interaccionar con los mismos receptores y, de esta forma, ejercer una determinada actividad biológica. El tracto digestivo se encuentra expuesto de forma continua y directa a los compuestos derivados de la digestión de los alimentos.

Además, expresa en su superficie una gran diversidad de receptores, por lo que es en sí mismo una de las principales dianas de los compuestos bioactivos ingeridos. De este modo, la modulación ejercida por la dieta en las funciones fisiológicas del sistema digestivo ha sido reconocida como un elemento esencial para el mantenimiento general y la mejora de la salud (Shimizu, 2010).

En las últimas dos décadas se han descrito varios estudios acerca de las

múltiples actividades de los péptidos bioactivos. Sin embargo, los datos sobre la

influencia que tiene el tracto digestivo en la relevancia fisiológica de los péptidos, así

como los efectos biológicos ejercidos a este nivel son más reducidos. Por un lado,

resulta necesario conocer los cambios ocurridos durante la digestión de las proteínas,

a través del análisis, tanto de su degradación, como de la consecuente liberación de

secuencias peptídicas. Asimismo, se debe considerar que los péptidos bioactivos

pueden ejercer su efecto bien a través de interacciones locales con los receptores de

la superficie gastrointestinal o bien a nivel sistémico, para lo cual deben resistir el

proceso digestivo, atravesar la barrera intestinal y permanecer en estado activo

durante su metabolismo y distribución hasta el órgano diana (Foltz y col., 2010). Por

otro lado, para establecer una relación causa-efecto entre los péptidos bioactivos y la

salud, es necesario evaluar los mecanismos de acción implicados e identificar la forma

activa potencialmente responsable de los efectos biológicos observados.

24 Introducción

Por todo ello, y en el ámbito de la funcionalidad de las proteínas alimentarias, se ha despertado el interés científico sobre las interacciones entre los componentes del sistema digestivo y los péptidos derivados de los alimentos. Estos estudios pueden proporcionar información muy valiosa y de relevancia fisiológica para la promoción de la salud digestiva y la prevención de las enfermedades crónicas asociadas. Además, pueden ser de utilidad para el avance en el diseño de nuevos ingredientes alimentarios.

1.1. Composición proteica de la soja y la leche

La soja presenta un contenido en proteína variable entre el 35 y el 45%

(peso/peso). Las proteínas de almacenamiento globulinas son el componente proteico mayoritario (70-83%), principalmente formado por la β-conglicinina y la glicinina, también conocidas como globulina 7S y globulina 11S, respectivamente. Se presentan como proteínas poliméricas unidas mediante puentes disulfuro y uniones no covalentes (Hill y Breidencach, 1974). La fracción proteica de la soja, al igual que la presente en otras especies de leguminosas, está compuesta por una compleja mezcla de proteínas minoritarias y polipéptidos como lectinas, lipoxigenasas, α-amilasas, inhibidores de proteasas de las familias Bowman-Birk (BBI) y Kunitz (KTI), y péptidos bioactivos como la lunasina. Se ha descrito que la composición nutricional y proteica de la soja es variable en función de factores medioambientales, genéticos y de las condiciones de cultivo o del procesado (Zarkadas y col., 2007; Gomes y col., 2014).

La leche tiene un contenido medio en proteína entre el 3,0 y el 3,5%

(peso/volumen), variable según algunos factores como la especie, la alimentación o el

estado de lactancia y/o salud del animal, entre otros (Dalgleish, 1993). Las proteínas

lácteas se clasifican en dos grupos: caseínas y proteínas de suero. Las caseínas se

caracterizan por precipitar en condiciones ácidas (pH 4,6 y 20 ºC), por su carácter

anfipático y por poder estar fosforiladas en los residuos de serina. Las caseínas

representan un 80% del contenido proteico total y comprenden cuatro tipos de cadenas polipeptídicas: α

-caseína (CN), α

-CN, β-CN y κ-CN, en proporción aproximada 4:1:4:1, respectivamente. Por ejemplo, en la leche de vaca, el contenido en caseínas es de 29 g/L y estas proteínas se presentan en un 37,6-39,5% (α

-CN), 7,8-12,1% (α

-CN), 33,4-44,6% (β-CN) y 9,5-19,7% (κ-CN) (Farrell y col., 2004). En la leche, las caseínas se encuentran estructuralmente en forma de micelas, formando complejos esféricos con sales inorgánicas, principalmente el fosfato cálcico. Además, pueden sufrir modificaciones por glicosilación y proteolisis, como las producidas sobre la β-CN por las propias enzimas presentes en la leche y que dan lugar a las denominadas γ-CN (Swaisgood, 1992). Las proteínas de suero lácteo permanecen solubles en condiciones ácidas (pH 4,6 y 20 ºC). Estas proteínas incluyen la β- lactoglobulina (β-Lg), la α-lactoalbúmina (α-La), la seroalbúmina bovina, las inmunoglobulinas, y otros componentes minoritarios como lactoferrina (LF), lactoperoxidasa, y algunos péptidos de bajo peso molecular que provienen de la proteolisis de las caseínas. La β-Lg es predominante en la leche bovina, mientras que está ausente en la leche humana, en la que la α-La es mayoritaria. Las proteínas de suero tienen una estructura globular en la que predominan los motivos α-hélice. Son proteínas susceptibles a la desnaturalización por calentamiento, aunque disponen de puentes disulfuro intramoleculares que aportan estabilidad a su estructura (Madureira y col., 2007).

La funcionalidad de las proteínas está influenciada por sus características

estructurales y físico-químicas. Se ha demostrado que dichas características pueden

ejercer un papel determinante en la digestión, biodisponibilidad y formación de

secuencias peptídicas de relevancia fisiológica, tanto a partir de proteínas de soja

(Carbonaro y col., 2015) como de proteínas lácteas (Dziuba y col., 2010).

26 Introducción

1.2. Digestión y biodisponibilidad de proteínas de soja y lácteas

Las acciones ejercidas por los procesos fisiológicos del sistema digestivo han sido objeto de estudio en numerosas investigaciones científicas relativas a la nutrición, farmacología, toxicología y microbiología (Sambruy y col., 2001). Los alimentos, tras ser ingeridos, van a sufrir una serie de complejas modificaciones físicas y químicas propias de la digestión que finalmente darán lugar a la liberación y absorción de los nutrientes. Las proteínas alimentarias pueden comportarse de distintas maneras durante el proceso digestivo debido a las diferencias en sus características estructurales, de conformación y tamaño, o a la presencia de inhibidores de proteasas.

Además, durante la digestión de las proteínas, se liberan una gran cantidad de péptidos que podrían tener implicaciones fisiológicas, actuando como señales regulatorias de las funciones del organismo (Sánchez-Rivera y col., 2014a), y toxicológicas, como la formación de epítopos con capacidad para inducir reacciones relacionadas con las alergias alimentarias (Jiménez-Saiz y col., 2015). Por ello, resulta fundamental conocer los cambios ocurridos en las proteínas alimentarias en relación a su degradación y a la identificación de regiones proteicas resistentes durante el proceso digestivo. Aunque los métodos de evaluación de la digestión in vivo, tanto en animales como en humanos, son los que aportan los resultados fisiológicamente más relevantes, por razones prácticas y éticas, ha sido necesario el desarrollo de modelos

diversidad de metodologías in vitro que difieren en cuanto a variables, como el número

de fases de la digestión, fluidos y enzimas empleados, pH y tiempos de incubación,

relación enzima:sustrato, adición y retirada de compuestos, mezcla del contenido y

uso de co-factores de digestión, entre otros (Hur y col., 2011; Guerra y col., 2012). En

este contexto, y en el ámbito de la Acción COST FA 1005 Infogest, recientemente se

ha publicado un protocolo en el que se establecen las condiciones estándar para la

simulación de la digestión in vitro (Minekus y col., 2014). Este método ha sido

aceptado mediante el consenso por parte de diferentes grupos de investigación internacionales, y su reproducibilidad se ha evaluado recientemente en ensayos inter- laboratorio (Egger y col., 2016). Sin embargo, es necesario correlacionar y validar los resultados de estos métodos in vitro con aquellos obtenidos in vivo, para los que todavía existen muy pocos datos.

Se ha descrito que el tracto gastrointestinal juega un papel decisivo en la relevancia fisiológica de los compuestos bioactivos derivados de los alimentos. En el estudio de los péptidos bioactivos, uno de los primeros aspectos a evaluar es su resistencia a las enzimas digestivas. Asimismo, debe considerarse su estabilidad durante el tránsito digestivo, así como su capacidad de absorción, distribución, metabolismo y excreción (Segura-Campos y col., 2011; Sánchez-Rivera y col., 2014a).

La presencia de péptidos bioactivos en el contenido intestinal no es suficiente si no se asegura su bioaccesibilidad y biodisponibilidad (Figura 1), es decir, es necesario que

Figura 1. Bioaccesibilidad y biodisponibilidad de los compuestos ingeridos (Adaptada de Guerra y col., 2012).

28 Introducción

el péptido interaccione con receptores de la superficie gastrointestinal o, si su sitio de acción implica su absorción, que atraviese la barrera intestinal y alcance el órgano diana en su forma activa (Foltz y col., 2010; Nongonierma y FitzGerald, 2016). Por ello, en los últimos años, se han empleado modelos combinados de simulación in vitro de la digestión y absorción intestinal en monocapas de células Caco-2 (Picariello y col., 2013a; 2015). Las células Caco-2 provienen de una línea de adenocarcinoma colorrectal humano. Al cultivarse en soportes adecuados y llegar a confluencia, son capaces de diferenciarse espontáneamente en una monocapa polarizada con microvellosidades, espacios intercelulares, enzimas y sistemas de transporte, presentando las características propias de las células epiteliales intestinales. Este modelo celular ha sido ampliamente utilizado para evaluar la degradación y absorción en el intestino de fármacos y otros compuestos administrados por vía oral (Hubatsch y col., 2007; Antunes y col., 2013). Además, este modelo ha permitido identificar las principales rutas implicadas en el transporte intestinal de proteínas y péptidos derivados (Segura-Campos y col. 2011), tal como se describe en la Figura 2.

Figura 2. Representación esquemática de los principales mecanismos de transporte de péptidos a través de las células del epitelio intestinal: (1) Transporte paracelular a través de las uniones intercelulares, (2) Transporte transcelular mediante difusión pasiva, (3) Transcitosis, transporte transcelular mediante vesículas, (4) Transporte transcelular mediado por transportadores específicos.

1.2.1. Proteínas de soja. Péptido lunasina

Los trabajos publicados sobre la digestión y/o biodisponibilidad de las proteínas de la soja en relación a sus efectos fisiológicos son escasos. Se ha descrito que la digestión in vitro de un aislado de proteínas de soja da lugar a la formación de péptidos antihipertensivos con capacidad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) (Lo y Li-Chan, 2005). Siguiendo una estrategia similar, se ha observado como el producto de la digestión enzimática de la proteína β-conglicinina provoca una activación del receptor de colecistoquinina tipo-1, relacionado con la sensación de saciedad (Staljanssens y col., 2012). También se ha visto que la digestión de esta proteína, y de su forma deglicosada, genera péptidos con potencial efecto protector frente a radicales libres (Amigo-Benavent y col., 2014). En este trabajo se identificaron los péptidos presentes en los digeridos gastrointestinales, algunos de los cuáles fueron además biodisponibles en la monocapa intestinal de células Caco-2.

En un trabajo reciente, Capriotti y col. (2015) han caracterizado el conjunto de péptidos presentes en digeridos in vitro de las proteínas extraídas de semillas y bebidas de soja. Estos autores observaron una intensa degradación de las proteínas durante el proceso digestivo, formándose un total de 2430 secuencias de tamaño variable entre 5 y 49 aminoácidos. Además, se propuso que la longitud de algunos de los péptidos, generalmente más largos que aquellos encontrados en estudios similares con proteínas animales, se justificaba por la presencia de inhibidores de proteasas en las propias proteínas de origen vegetal (Capriotti y col., 2015).

Se ha demostrado que el péptido de 43 aminoácidos lunasina, tanto de origen

sintético como aislado de la soja, se digiere rápidamente en presencia de pepsina y

pancreatina (Park y col., 2007). Sin embargo, en este trabajo se observó que cuando

la lunasina se encuentra dentro del extracto proteico de la soja es capaz de resistir

parcialmente la acción de las enzimas gastrointestinales. Estos resultados también se

han visto en otros estudios con lunasina procedente de otras fuentes proteicas

30 Introducción

vegetales, como trigo (Jeong y col., 2007a) y Solanum nigrum L. (Jeong y col., 2007b).

Por ello, se ha sugerido que los inhibidores de proteasas presentes de forma natural en estos productos, como BBI y KTI, pueden ejercer un efecto protector sobre la digestión enzimática del péptido lunasina. En este sentido, se ha determinado la presencia de los péptidos lunasina y BBI en varios productos comerciales de soja (Hernández-Ledesma y col., 2009a). En este estudio se estableció que la relación de lunasina:BBI (peso:peso) presente en los productos se encontraba en el rango de 1:0,7 – 1:3,9, y se sugirió la influencia de esta relación sobre la resistencia del péptido lunasina frente a la digestión gastrointestinal in vitro mediante pepsina y pancreatina.

Además, se han publicado algunos estudios in vivo que confirman los hallazgos in vitro anteriormente mencionados. Hsieh y col. (2010) demostraron la biodisponibilidad de la lunasina en ratones y ratas, determinando su presencia en varios tejidos como hígado, riñón, pulmón, glándula mamaria y próstata. De forma similar, se ha determinado la presencia de este péptido en una forma intacta y bioactiva en el plasma e hígado de ratas alimentadas con dietas de soja (Jeong y col., 2007c), trigo (Jeong y col., 2007a), centeno (Jeong y col., 2009) y cebada (Jeong y col., 2010) enriquecidas en lunasina.

Asimismo, Dia y col. (2009) determinaron la presencia de este péptido en el plasma de individuos sanos tras la ingesta de soja, estimando un porcentaje de absorción (intestino-plasma) del 4,5% del total de lunasina ingerida en 50 g de proteínas de soja.

Sin embargo, y en el contexto de las modificaciones propias ejercidas durante el proceso digestivo de los péptidos bioactivos, no hay estudios que hayan evaluado en profundidad la influencia de la digestión sobre la secuencia de 43 aminoácidos del péptido lunasina ni la formación e identificación de fragmentos derivados de dicho péptido con posible actividad biológica.

1.2.2. Proteínas lácteas

La digestión de las proteínas lácteas ha sido evaluada en numerosos trabajos

mediante métodos in vitro de simulación gastrointestinal, en los que mayoritariamente

se emplea como herramienta analítica técnicas de separación e identificación por

cromatografía acopladas a espectrometría de masas (Picariello y col., 2013b; Capriotti

y col., 2016). Estos estudios se han desarrollado con una amplia variedad de objetivos

dirigidos, bien a la identificación de secuencias específicas con relevancia fisiológica, o

al análisis general de las modificaciones ocurridas en las proteínas y sus péptidos

liberados durante la digestión. Por ejemplo, se ha estudiado la formación de péptidos

antioxidantes e inhibidores de la ECA en digeridos de leche humana y fórmulas

infantiles (Hernández-Ledesma y col., 2007), de los péptidos opioides β-casomorfina

(CM)-5 y β-CM-7 tras la digestión de varios productos lácteos comerciales (De Noni y

Cattaneo, 2010) y de epítopos relacionados con la alergia a las proteínas lácteas β-Lg

(Benedé y col., 2014a) y β-CN (Benedé y col., 2014b). Oshawa y col. (2008)

observaron la resistencia de los péptidos antihipertensivos IPP y VPP, fragmentos

f(74-76) y f(84-86) de la β-CN, respectivamente, tras una simulación de la digestión

con enzimas gástricas, pancreáticas y del epitelio intestinal. Asimismo, se ha

demostrado la biodisponibilidad de estos tripéptidos y se han estudiado sus

parámetros farmacocinéticos en cerdos (van der Pijl y col., 2008) y humanos (Foltz y

col., 2007). De un modo similar, se ha evaluado la estabilidad del péptido

antihipertensivo LHLPLP, correspondiente al fragmento f(133-138) de la β-CN, durante

la digestión (Quirós y col., 2009) y la biodisponibilidad del péptido derivado HLPLP, β-

CN f(134-138), en células Caco-2 (Quirós y col., 2008) y en ratas (Sánchez-Rivera y

col., 2014b). Con un enfoque más amplio, recientemente se ha evaluado el conjunto

de péptidos generados durante la fermentación y posterior digestión gastrointestinal de

un yogur (Jin y col., 2016). También se ha comparado el perfil de péptidos formados

en los digeridos de dos matrices alimentarias lácteas distintas, queso Valdeón y leche

en polvo evaporada (Sánchez-Rivera y col., 2014c). Dupont y col. (2010) estudiaron el

comportamiento de las proteínas β-CN y β-Lg sometidas a dos protocolos de digestión

adulto o infantil. En el trabajo de Picariello y col. (2010), se demostró la influencia

32 Introducción

ejercida por las peptidasas del borde del epitelio intestinal en la digestión mediante pepsina y pancreatina de las caseínas y las proteínas de suero. Estos autores trataron así de aproximar los protocolos in vitro de digestión simulada a las condiciones propias

Hay pocos estudios que hayan evaluado la digestión gastrointestinal de las proteínas lácteas en humanos. Se ha descrito que las distintas proteínas lácteas presentan un comportamiento diferente durante la digestión gastrointestinal. Por ejemplo, se ha encontrado que un 64 y 44% de las proteínas β-Lg y α-La, respectivamente, llegan intactas a la parte superior del yeyuno (Mahé y col., 1991). En el caso de la proteína LF, Troost y col. (2001) observaron que más de un 60% no se degrada durante su digestión en el estómago. Se ha reconocido a las caseínas como proteínas de “digestión lenta” y a las proteínas de suero lácteo de “digestión rápida”, en función de la cinética de su hidrólisis y de la absorción de aminoácidos provenientes de su digestión (Boirie y col., 1997). Recientemente, se ha propuesto en un meta-análisis de estudios clínicos que estas diferencias podrían tener influencia sobre la utilización postprandial del nitrógeno proteico, la llegada de péptidos y aminoácidos al plasma sanguíneo, la secreción de hormonas y enzimas digestivas y sobre aspectos metabólicos relacionados con el apetito (Bendtsen y col., 2013). Estos autores vieron que las proteínas de suero tenían un mayor efecto sobre la saciedad a corto plazo mediante el estímulo de la secreción de hormonas incretinas (péptido 1 similar al glucagón y péptido insulinotrópico-dependiente de glucosa), mientras que relacionaron a las caseínas con efectos a largo plazo.

Como se muestra en la Tabla 1, se han descrito algunos estudios in vivo

acerca de la presencia de péptidos en el tracto gastrointestinal tras la digestión de

proteínas lácteas en humanos y animales. Sin embargo, la diversidad de estos

trabajos es bastante amplia en cuanto a la especie utilizada, el producto consumido

Especie Dieta Muestra Objetivo del estudio Referencia

Humano Leche Intestino delgado β-CMs Svedberg y col., 1985

Leche, yogur Estómago, duodeno Péptidos de caseínas Chabance y col., 1998

Yogur, caseínas, proteínas de suero Yeyuno, íleon CMP Ledoux y col., 1999

LF Estómago LF Troost y col., 2001

Caseínas, proteínas de suero Yeyuno Péptidos de caseínas y suero Boutrou y col., 2013

Mini cerdo Caseínas Intestino delgado β-CMs, CPPs Meisel y Frister, 1989

Leche desnatada Duodeno Péptidos de caseínas y suero Barbé y col., 2014

Vaca Leche desnatada, caseínas Estómago Péptidos de caseínas Yvon y Pelissier, 1987

Leche desnatada Estómago Péptidos de caseínas Scanff y col., 1992

Rata CPPs Duodeno, yeyuno, íleon CPPs Brommage y col., 1991

Caseínas, CPPs Intestino delgado, intestino grueso CPPs Kasai y col., 1995

Proteínas de suero, α-La Estómago, intestino delgado α-La, péptidos de suero Pantako y col., 2001

Dieta suplementada en Phe-CMP Estómago, intestino delgado CMP Fosset y col., 2002

LF: lactoferrina, CPPs: caseinofosfopéptidos, α-La: α-lactoalbúmina, CMP: caseinomacropéptido, β-CMs: β-casomorfinas

34 Introducción

(desde matrices lácteas a proteínas aisladas), el segmento del tracto gastrointestinal evaluado y el análisis de las muestras a estudio.

Con un enfoque particular a los trabajos publicados sobre el análisis de contenidos intestinales humanos, tras la ingesta de leche se ha detectado en el intestino delgado la presencia de los péptidos opioides β-CM-7, -6, y -4 mediante ensayos inmunológicos (Svedberg y col., 1985). Posteriormente, Chabance y col.

(1998) caracterizaron los digeridos gástricos y duodenales de humanos que tomaron leche y yogur. A nivel gástrico, en el estudio de la leche se identificaron un total de 26 péptidos derivados de la α

-CN, α

-CN, β-CN y κ-CN, mientras que del yogur se formaron 8 péptidos derivados de la α

-CN, β-CN y κ-CN. Adicionalmente, se observó la degradación de las proteínas lácteas a su paso por el intestino delgado, así como la formación de péptidos de menor tamaño, entre los que destacan algunas secuencias para las que posteriormente se ha demostrado bioactividad, como el péptido inductor de mucinas intestinales YFYPEL, α

-CN f(144-149) (Martínez-Maqueda y col., 2013a), y el péptido opioide YPVEPF, β-CN f(114-119) (Jinsmaa y Yoshikawa, 1999), ambas formadas 20 minutos tras la ingestión de leche. Además, se identificó la presencia y resistencia del caseinomacropéptido (CMP), correspondiente al fragmento f(106-169) de la κ-CN, y de varios fragmentos derivados durante el tránsito gastrointestinal. De la misma forma, Ledoux y col. (1999) confirmaron posteriormente la presencia de CMP a nivel de yeyuno e íleon. Con el avance de las técnicas analíticas de proteómica y peptidómica se ha conseguido mejorar la identificación de secuencias en muestras complejas como son los digeridos gastrointestinales. Así, en un estudio reciente realizado con muestras de aspirados de yeyuno, se han detectado y secuenciado un total de 356 y 146 péptidos tras la ingesta de caseínas y proteínas de suero, respectivamente (Boutrou y col., 2013). En el caso de las caseínas, la mayoría de los péptidos identificados pertenecían a la β-CN (61,2%) seguida de la α

-CN (24,9%).

Ciertas regiones de estas proteínas resistieron durante su tránsito digestivo hasta el

yeyuno dando origen a la mayoría de los péptidos encontrados, como son, las regiones 1-14, 57-70, 67-92, 128-140, 144-163 y el dominio C-terminal de la β-CN; y las regiones 23-33, 104-121 y 165-186 de la α

-CN. De las proteínas de suero, la β- Lg, y principalmente las regiones comprendidas entre los aminoácidos 40-58 y 122- 137, dieron lugar a la mayoría de los péptidos identificados (72,0%). Mientras que en las proteínas de suero no se observó la presencia de ningún fragmento con efecto biológico descrito, numerosos péptidos bioactivos se identificaron derivados de las caseínas, y en concreto de la β-CN, como por ejemplo el péptido con efecto inmunomodulante PGPIPN, f(63-68) (Gill y col., 2000) o los péptidos antihipertensivos EMPFPK, f(108-113) (Pihlanto y col., 1998) y LHLPLP, f(133-138) (Miguel y col., 2006). Además, se identificaron 32 y 27 precursores de los tripéptidos antihipertensivos (Nakamura y col., 1995) VPP e IPP, respectivamente, y 15 precursores que incluyen la conocida secuencia opioide YPFPGPI, f(60-66) β-CM-7.

Dada la relevancia fisiológica y la alta frecuencia de estos últimos péptidos en los digeridos, se cuantificó la presencia de β-CM-7 estimándose una concentración de 17 µM después de 2 horas tras la ingestión de caseínas, lo que sería compatible con la cantidad necesaria para ejercer su efecto fisiológico in vivo (European Food Safety Authority, EFSA, 2009; Boutrou y col., 2013).

1.3. Péptidos alimentarios con efectos biológicos relacionados con la salud digestiva

En las últimas dos décadas muchos estudios han establecido una relación

entre las proteínas alimentarias, y los péptidos incluidos en sus secuencias, y diversos

efectos beneficiosos sobre los principales sistemas del organismo, como son el

sistema cardiovascular, digestivo, endocrino, inmunológico y nervioso (Hernández-

Ledesma y col., 2014).