AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS NSLAB EN QUESO ARTESANAL Y SUERO FERMENTO

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(1)AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS NSLAB EN QUESO ARTESANAL Y SUERO FERMENTO. Laura Celano 1 Esteban Carbajal 2. Resumo: RESUMEN Objetivo: Aislar, identificar y caracterizar microorganismos NSLAB en queso artesanal y su suero fermento. Los microorganismos NSLAB son un grupo de microorganismos adyacentes a la maduración del queso que aportan aroma y sabor característicos a los productos lácteos. Poseen un gran capacidad para resistir las condiciones finales de maduración, interviniendo en este proceso y participando en la maduración tardía de quesos con recuentos que van desde 104-106. Los aislamientos fueron obtenidos de un queso durante el primer mes de maduración y de su suero fermento de elaboración, fabricados ambos a partir de leche cruda. El procedimiento fue el siguiente: • Muestreos cada 10 días en diluciones sobre medios MRS y M17 e incubación a 18°C en microaerofilia. • Obtención de cultivos puros para identificación filogenética mediante 16S • Determinación de la actividad lipolítica (agar tributirina) y proteolítica (agar leche) • Determinación de velocidad de acidez y crecimiento mediante pH y D.O (600 nm) para cepas de L. casei, L. paracasei y L. plantarum. Resultados y Discusión: Los aislamientos obtenidos a partir de suero fermento fueron mayores durante los primeros 10 días, mientras en queso se obtuvo mayor número de aislamientos hacia los 20-30 días. La proporción de microorganismos aislados a partir del queso y suero fueron similares, obteniéndose pocos aislamientos en el primer día de muestreo, compensados hacia el día 10, para luego aumentar en el caso del queso (20-30 días). En el queso predominaron los aislamientos de bacterias, mientras que en el suero predominaron las levaduras. Según árbol filogenético obtenido para las bacterias, existe cercanía entre las cepas del género Lactobacillus,. En el caso de las levaduras, se observan similitudes entre cepas del género Kluyveromyces y Pichia. Dentro de los aislamientos obtenidos durante la maduración, se destaca Kluyveromyces lactis, que impone su mayoría numérica y distribución a lo largo del muestreo, y Lactobacillus casei, cuya presencia es mayoritaria dentro de las bacterias.Las principales especies encontradas fueron K. lactis, P. kudriavzevii y L. casei. La mayoría de las cepas de K. lactis mostraron actividad lipolítica, que también se observó en cepas de Enterococcus y Staphylococcus aisladas. Las especies de K. lactis y K. marxianus fueron las únicas reportadas tanto en suero como en queso.Las curva de acidez y crecimiento mostraron una intersección de las 2 variables de 11 h. para L. casei, 12 h. horas para L. paracasei, y 13 h. para L. plantarum. El género mayoritario fue Kluyveromices (38 %), seguido por Lactobacillus (26%).Dentro de las levaduras se destacan K. lactis y K. marxianus por su presencia y distribución a lo largo del tiempo y por matriz. Dentro de las bacterias predominan las.

(2) especies L. casei y L. paracasei, de interés por su aislamiento a partir del queso. Conclusiones: Los microorganismos NSLAB forman parte del proceso de maduración a lo largo del primer mes de maduración. Se observó que la lipólisis es efectuada mayormente por especies de levaduras. Existe un potencial biotecnológico de estudio sobre las especies identificadas durante el primer mes de maduración del queso.. Palavras-chave: NSLAB, suero fermento, queseria artesanal. Modalidade de Participação: Pesquisador. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS NSLAB EN QUESO ARTESANAL Y SUERO FERMENTO 1 Docente. laura.celano@utec.edu.uy. Autor principal 2 Aluno de graduação. esteban.carbajal@utec.edu.uy. Apresentador. Anais do 9º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampa | Santana do Livramento, 21 a 23 de novembro de 2017.

(3) AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS NSLAB EN QUESO ARTESANAL Y SUERO FERMENTO INTRODUCCIÓN Existen algunas variedades de quesos artesanales que son elaborados a partir de leche cruda y utilizando suero fermento. Dentro de los microorganismos deseables en el proceso de maduración se han caracterizado una gran cantidad de bacterias acido lácticas relevantes en las etapas iniciales. Sin embargo, también se encuentran presentes otros microorganismo que no contribuyen a la formación de ácido láctico, pero que son de interés para el desarrollo de características deseadas en el producto final. A estos microorganismos se los denomina NSLAB (del inglés non starter lactic acid bacteria). En el presente trabajo se buscó aislar microorganismos NSLAB (non starter lactic acid bacteria) en un queso semiduro artesanal y su suero fermento natural de elaboración en la región de Colonia. A los aislamientos se los identificó mediante caracterización filogenética y fenotípicamente de acuerdo a su actividad proteolítica y lipolítica. METODOLOGÍA · Muestras: Las muestras fueron obtenidas a partir de queso y de sueros fermento. El queso fue elaborado en forma artesanal a partir de leche cruda en un establecimiento en la zona de Colonia. El mismo fue producido con suerofermento natural con un procedimiento de elaboración del tipo de pasta cocida, con prensado manual, salado por inmersión y madurado en cámaras frescas.El suerofermento natural fue elaborado en el mismo establecimiento y mantenido mediante repiques semanales. · Obtención de aislamientos: Se obtuvieron muestras de suero y queso cada 10 días durante los primeros 30 días. Se realizaron diluciones seriadas en agua de peptona (10%) y se sembraron en superficie tanto en agar MRS como en agar M17 con adición de 4.5 % de lactosa. Las placas se incubaron en anaerobiosis a 18 °C durante 72 h. Se realizaron repiques sucesivos en MRS y M17 caldo, hasta su purificación. Los aislamientos de bacterias se seleccionaron de acuerdo a la tinción de gram, · Caracterización fenotípica: La actividad proteolítica se identificó mediante colonias típicas en agar PCA + leche, y la actividad lipolítica mediante la identificación de colonias típicas en agar PCA+ tributirina. · Caracterización genotípica: A partir de aislamientos puros, se aisló el ADN utilizando un Kit ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep. La identificación se realizó mediante PCR por amplificación del fragmento 16S. La secuenciación.

(4) ·. fue realizada a través del servicio Macrogen y herramientas bioinformáticas MEGA 7.0. Determinación de las curvas de acidificación y crecimiento. La velocidad de acidificación se determinó midiendo el pH en pHmetro y las curvas de crecimiento se determinaron mediante el seguimiento de la D.O a 600 nm para una cepa de cada una de las siguientes especies aisladas: L. casei; L. paracasei; L. plantarum.. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se obtuvieron un total de 40 aislamientos, de los cuales 20 correspondieron a cepas bacterianas y los 20 restantes a levaduras. Del queso se obtuvieron 21 aislamientos, 15 de los cuales correspondieron a bacterias y 6 a levaduras. En el suero se obtuvo una relación inversa, de 19 aislamientos en total, 14 de los cuales fueron levaduras y 5 restantes bacterias.. Número de Aislamientos. Aislamientos obtenidos durante la maduración 10 Bacterias SUERO. 8 6. Levaduras SUERO. 4. Bacterias QUESO. 2. Levaduras QUESO. 0 Día 1. Día 10. Día 20. Día 30. Figura 1. Distribución de aislamiento a lo largo de la maduración en queso y suero.. Los aislamientos bacterianos que corresponden al grupo NSLAB, fueron encontrados mayoritariamente en queso, mientras que levaduras identificadas se obtuvieron tanto de suero como de queso. La presencia de las levaduras fue importante durante la maduración mediante la interacción dinámica y variable con especies NSLAB. Proporción de especies obtenidas Staphylococcus saprophyticus 6% Lactobacillus plantarum 6%. Otros 9%. Kluyveromyces lactis 29%. Lactobacillus paracasei 6% Enterococcus faecalis 9%. Kluyveromyces marxianus 9%. Lactobacillus casei 12%. Figura 2- Proporción de aislamientos obtenidos. Pichia kudriavzevii 14%.

(5) Día 1. Día 10 Actividad Lipolítica. Cepas. Día 20 Actividad Proteolítica. Kluyveromyces lactis. Enterococcus faecalis. Kluyveromyces marxianus. Lactobacillus plantarum. Debaryomyces vindobonensis. Staphylococcus saprophyticus. Saccharomyces cf. cerevisiae/paradoxus. Kluyveromyces marxianus. Pichia kudriavzevii. Kluyveromyces lactis. 5 4 3 2 1 0 Kluyveromyces lactis. Aislamientos Positivos. En la figura 2 se muestra el porcentaje de cada especie aislada. Las tres especies de las que se obtuvieron mayor cantidad de cepas fueron K. lactis, P. kudriavzevii y L. casei. Además se obtuvieron aislamientos de E. faecalis, S. saprophyticus, L. paracasei y L. plantarum. El predominio del género Kluyveromyces durante las etapas iniciales de la maduración muestra un alto grado de participación a lo largo de los primeros 30 dias. Sin embargo la mayoría de las especies del género Lactobacillus fueron aisladas del queso, en su mayoría hacia los 20-30 días.. Día 30. Figura 3- Actividad lipolítica y proteolítica de los aislamientos obtenidos. Del total de aislamientos, las especies de levaduras fueron predominantes durante todo el muestreo. Las cepas de la especie K. lactis fueron las que mostraron mayor actividad lipolítica, seguidas de K. marxianus. Las especies de E. faecalis y S. saprophyticus también mostraron actividad lipolítica. La actividad proteolítica sólo fue constatada en E. faecalis para los dos aislamientos obtenidos luego de 30 días de maduración del queso (Fig. 3).. pH L. paracasei pH L. casei C DO L. casei A. pH. pH L. Casei A pH L. plantarum DO L. Casei B. pH L. casei B DO L. paracasei DO L. casei C. D.O. (600 nm). 6.50 6.00. 1.000. 5.50 5.00 4.50 4.00. 0.100. 1. 3. 5. 7. 9. 11 13 15 TIEMPO (H). 17. 19. 21. Figura 4. Curva de acidez y crecimiento de L. casei, L. paracasei y L. plantarum. 23.

(6) La figura 4 muestra la curva de acidez en función del tiempo en horas (líneas descendentes) y la curva de crecimiento (líneas descendentes) para cepas de L. casei, L. paracasei, y L. plantarum. El experimento se realizó obteniendo muestras a partir de un cultivo en agitación continua e incubado a 30 °C. Entre especies de L. casei (líneas planas) se registró un patrón similar de intersección hacia las 11 h de incubación, mientras que L. paracasei y L. plantarum registraron 12 h y 13h (guiones y guiones con doble punto, respectivamente). CONCLUSIONES Los microorganismos NSLAB aislados forman parte del proceso de maduración del queso. La actividad lipolítica fue evidenciada en la mayoría de las especies de levaduras. Se propone la continuación de este trabajo mediante la realización de estudios adicionales para identificar potenciales de uso biotecnológico..

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