IDENTIFICAÇÃO DOS AGENTES CAUSADORES DE MASTITE EM UMA PROPRIEDADE FAMILIAR ESPECIALIZADA EM PRODUÇÃO DE LEITE

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(1)IDENTIFICAÇÃO DOS AGENTES CAUSADORES DE MASTITE EM UMA PROPRIEDADE FAMILIAR ESPECIALIZADA EM PRODUÇÃO DE LEITE. Andressa Käfer 1 Arthur Fernandes Bettencourt 2 Fernanda Dias da Rosa 3 Natalie Pontes Scherer 4 Anelise Afonso Martins 5 Luciane Rumpel Segabinazzi 6. Resumo: O leite pode ser considerado um dos alimentos mais completos utilizados na alimentação humana. Composto por proteínas, carboidratos, lipídios e vitaminas também pode ser destacado como uma excelente fonte de cálcio disponível ao organismo. Um dos principais fatores que podem causar alterações na composição físico-química do leite é a mastite, doença caracterizada por uma inflamação na glândula mamária causada por patógenos contagiosos e/ou patógenos ambientais, apresentando um grande impacto econômico no setor leiteiro. A doença pode ser apresentada na forma clínica e na forma subclínica, ambas apresentam prejuízos elevados ao produtor. Assim, a presente pesquisa teve como objetivo identificar os principais agentes causadores da mastite em uma propriedade familiar, especializada em produção de leite, do município de Salvador do Sul - RS. Foram coletadas amostras de 15 vacas lactantes que compõem um rebanho de 20 animais criados em sistema do tipo freestall com área de descanso composta por camas de terra compactada e serragem que são limpas duas vezes por dia. Após o leite ser colhido diretamente em um recipiente esterilizado os mesmos foram identificados, refrigerados e encaminhados ao Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal do Pampa, campus Dom Pedrito - RS, onde foram realizados os testes bacteriológicos para a contagem de mesófilos aeróbios através da contagem padrão em placa (CPP), determinação de coliformes totais e fecais pela técnica de tubos múltiplos (NMP) e posterior identificação bacteriana. Ao coletar as amostras não foram identificados sinais de mastite clínica, porém, houve crescimento bacteriano na contagem padrão em placa (CPP) em 73% das amostras, demonstrando a presença de mastite subclínica. Enquanto isso, os coliformes totais foram verificados em 66% e em 33% das amostras foi observado crescimento de coliformes termotolerantes. Pode- se confirmar que a quantidade bacteriana encontrada nas amostras estava em conformidade com a legislação vigente. Durante o período de pesquisa foi realizado o diagnóstico etiológico dos agentes crescidos onde os principais microrganismos identificados foram: Staphylococcus spp. (60%), Streptococcus spp. (40%), Proteus spp. (60%), Serratia spp. (33%) nas 15 amostras. Foi observado que o leite in natura provenientes da propriedade analisada estava dentro dos parâmetros de qualidade exigidos quanto à presença de mesofilos aeróbios e coliformes totais, não sendo encontrados coliformes termotolerantes nas amostras. O acompanhamento da propriedade deve continuar para a identificação dos prováveis causadores da contaminação dentro do sistema de ordenha.. Palavras-chave: Agricultura Familiar. Bovinocultura de Leite. Mastite. Qualidade..

(2) Modalidade de Participação: Iniciação Científica. IDENTIFICAÇÃO DOS AGENTES CAUSADORES DE MASTITE EM UMA PROPRIEDADE FAMILIAR ESPECIALIZADA EM PRODUÇÃO DE LEITE 1 Aluno de graduação. andressak.zootecnia@gmail.com. Autor principal 2 Graduando do curso de Zootecnia da Unipampa. arthurfbettencourt@gmail.com. Co-autor 3 Graduanda do Curso de Zootecnia da Unipampa. nandadiasdarosa@gmail.com. Co-autor 4 Graduanda do Curso de Zootecnia da Unipama. nataliepscherer@gmail.com. Co-autor 5 Técnico Administrativo em Educação. anelisemartins@hotmail.com. Orientador 6 Docente do Curso de Zootecnia da Unipampa. lucianesegabinazzi@unipampa.edu.br. Co-orientador. Anais do 10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE.

(3) IDENTIFICAÇÃO DOS AGENTES CAUSADORES DE MASTITE EM UMA PROPRIEDADE FAMILIAR ESPECIALIZADA EM PRODUÇÃO DE LEITE 1 INTRODUÇÃO O leite é um dos alimentos mais completos utilizados na alimentação humana, assumindo importante papel na composição da dieta por se tratar de um alimento rico em cálcio, proteínas, lipídios, glicídios, minerais e vitaminas (TRONCO, 2003; PEDRAS, 2007). De acordo com Müller (2002), uma das causas que mais interferem na composição das características físico-químicas do leite é a mastite, que pode ser considerada como uma das mais importantes doenças que acometem o setor leiteiro devido ao seu impacto econômico negativo, ocasionando queda na produção leiteira, descarte de animais infectados e até mesmo à contaminação do leite com agentes patogênicos. A mastite é determinada como uma inflamação da glândula mamária (PRESTES et al., 2003). Em geral, as bactérias que predispõe esta inflamação podem ser divididas em dois grupos, com base na sua origem: patógenos contagiosos e patógenos ambientais. Os patógenos contagiosos são adaptados a sobreviver na parte interna da glândula mamaria. Ao passo que os patógenos ambientais são referidos como invasores oportunistas do úbere, mas não adaptados a sobreviver no interior da glândula (WATTS, 1988). A doença pode ser apresentada sob duas formas, sendo elas a clínica e a subclínica. A mastite clínica que pode levar a perdas elevadas com o descarte do leite contaminado além do surgimento de edemas no úbere, aumento da temperatura corporal e alterações na composição do leite, como a formação de grumos. Conforme Vianni e Lazaro (2003) nos casos clínicos da mastite, devido ao elevado grau de apresentação da enfermidade que acomete os animais, podem levar a enormes prejuízos, tais como: despesas com medicamentos, descarte antecipado das matrizes lactantes, diminuição na produção, descarte de leite, até mesmo podendo levar o animal a óbito. Já a mastite subclínica é um quadro onde existe uma maior dificuldade no diagnóstico dos animais infectados, pois se manifesta de forma mais silenciosa, apresentando poucos sinais clínicos, mas, com uma taxa de contagem de células somáticas (CCS) bastante elevada, podendo demorar a ser detectada pelo produtor (COSER et al., 2012). A mastite pode ser causada por diferentes tipos de microrganismos. Entre os principais causadores podemos citar Staphylococcus aureus, Streptococcu sagalactiae,Corynebacteruim bovis, Streptococcus uberis, Escherichia coli, Streptococcusdys galactiae, Enterobacter spp, Serratia spp entre outros (LANGONI, et al., 2011). Com isso, o leite oriundo de animais com mastite tende a apresentar alterações em sua estrutura química que levarão a mudanças tanto em suas características nutricionais quanto às organolépticas (LOPES et al., 2012). Nesse sentido, a presente pesquisa teve como objetivo identificar os principais agentes causadores de mastite em uma propriedade familiar, especializada em produção de leite, do município de Salvador do Sul - RS. 2 METODOLOGIA O estudo foi realizado em uma propriedade familiar produtora de leite pertencente ao município de Salvador do Sul, situada no Vale do Caí- RS. O plantel de bovinos leiteiros da propriedade era composto por 20 vacas Holandesas, dentre estas, 15 lactantes de primeiras e múltiplas crias, em diferentes estágios da lactação, com produção de leite diária variando entre 17 e 50 litros vaca/dia. O sistema de ordenha da propriedade familiar analisada era canalizado, onde o leite é depositado diretamente no resfriador. Eram realizadas duas ordenhas diárias, com intervalo de Anais do10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampaœ Santana do Livramento, 6 a 8 de novembro de 2018.

(4) aproximadamente 12h.Os animais são criados em sistema do tipo freestall, com área de descanso composta por cama de terra compactada e serragem. A limpeza das camas é realizada duas vezes ao dia, sendo retirado o esterco e áreas demasiadamente molhadas por urina e reposta serragem seca. No restante da instalação são removidos os dejetos uma vez por PrV SRLV R SLVR p FRPSRVWR SRU ³ULSDV´ de concreto que tem afastamentos entre elas onde os resíduos caem diretamente na esterqueira, não contendo um excesso de fezes e urina. A água utilizada para a limpeza dos equipamentos, sistema de ordenha e instalações é oriunda de poço artesiano. A mesma água também é fornecida aos animais Para a avaliação microbiológica do leite foram coletadas amostras individuais das 15 fêmeas em lactação nos meses de agosto e setembro de 2017. A coleta do leite foi realizada após a devida higienização dos tetos dos animais, com solução comercial para a realização do pré-dipping e utilização de papel toalha descartável para a secagem dos mesmos. Os três primeiros jatos de cada teto foram descartados e, posteriormente, o leite dos quartos mamários foi colhido em vidraria devidamente esterilizada. Cada amostra recebeu uma identificação individual com os dados da fêmea em questão. As amostras foram refrigeradas e encaminhadas ao Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal do Pampa, Campus Dom Pedrito ± RS. Foram realizados os testes bacteriológicos para a contagem de mesófilos aeróbios através da contagem padrão em placa (CPP), determinação de coliformes totais e fecais pela técnica de tubos múltiplos (NMP) e posterior identificação bacteriana. Para a contagem de microrganismos mesófilos aeróbios (CPP) nas amostras de leite foram feitas diluições seriadas de até 10-3 em tubos contendo solução salina peptonada (0,1%), em seguida uma alíquota de 1ml de cada diluição foi semeada em placa de petri contendo meio ágar para a contagem padrão (PCA) e posta para incubação à 37ºC por 48 horas. Para o cálculo de CPP foi usado o contador de colônias digital nas placas que comportavam mais de 25 colônias, posteriormente efetuadas as médias aritméticas das colônias e multiplicando pelo inverso da diluição, ocasionado no número de unidades formadoras de colônia (UFC) por ml de leite. A determinação dos coliformes totais e termotolerantes (NMP) das amostras também foram submetidas a técnica de fermentação em tubos múltiplos, a qual determina o número mais provável (NMP) de coliformes totais e termotolerantes, utilizando-se séries de três tubos por diluição. Alíquotas de 1ml das amostras nas diluições de 10-1, 10-2 e 10-3 foram transferidas para tubos comportando Caldo Lauril Sulfato de Sódio (CLS) e Caldo Lactosado Verde Brilhante (CLVB). Para o apontamento de coliformes termotolerantes a 45ºC foi empregado o Caldo Escherichia coli (EC). Alíquotas de 1ml de cada diluição foram transferidas para séries de três tubos comportando CLS com tubos Durham invertidos no seu interior, subsequentemente incubados a 36ºC ao longo de 48 horas. Os tubos que contiveram turbidez e formação de gás foram realizados a remoção de uma alçada da solução e esta mesma amostra foi semeada em tubos contendo 10 ml de CLVB e EC, em tubos de Durham invertidos, na mesma forma citada anteriormente. Os tubos que receberam o caldo verde brilhante foram incubados a 36ºC por 48 horas, enquanto os de EC por 48 horas em uma temperatura de 45ºC em banho maria. A formação de gás nos tubos de CLVB sinalizou a presença de coliformes totais, resultado expresso em NMP por ml de leite. Na contagem de E. coli, os tubos de EC com presença de gás no seu interior foram examinados sob luz ultravioleta em uma cabine escura, para positivo de E.coli apresentavam fluorescência. Estes foram replicados em placas de petri acomodandoo em Ágar Eosina Azul de Metileno (BEM) e foram incubadas a 36ºC por 48 horas. As colônias crescidas que apresentaram coloração enegrecida com ou sem brilho metálico, são suspeitas de E.coli e foram identificadas por provas bioquímicas. Para a identificação bacteriana, as colônias crescidas nas placas incluindo o meio de cultura para a contagem padrão foram submetidas à determinação morfológica. Nas colônias Anais do10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampaœ Santana do Livramento, 6 a 8 de novembro de 2018.

(5) individuais foi feito a semeadura em meios específicos, tais como: Agar sangue desfibrinado de ovino 5%, MacConkey, Brain Heart Infusion (BHI) e Muller Hinton a36ºC por 48 horas, assim foi observado às características de colônia, pigmentação e hemólise. Já para as provas de morfotintoriais foram utilizados a coloração de gram e as bactérias foram divididas em grupos de gram positivas e gram negativas. Em seguida as mesmas foram inoculadas em meios para identificação de gêneros em meios como específicos 36ºC por 48 horas. Foram realizadas novas provas bioquímicas como fermentação de carboidratos, redução de nitrato, oxidase, catalase e coagulase, e ainda por meios de SIM para o teste de motilidade, Citrato de Simons. 3 RESULTADOS e DISCUSSÃO Ao coletar as amostras de leite dos animais não foram observados sinais clínicos indicativos de mastite clínica, que segundo Prestes et al. (2003) é marcada por processos inflamatórios severos, resultando em mudanças na aparência do leite e alterações visíveis na glândula mamaria. Com intuito de aprimorar o leite produzido no Brasil em 2011, entrou em vigor a instrução normativa IN 62, onde foi extinguindo a classe de leite tipo C, além de diminuir os valores para a contagem padrão em placa e contagem de células somáticas para as regiões Sul e Centro Oeste, em julho de 2011, onde o CPP máxima era de 7,5x105 (UFC/ml) e para CCS (CS/ml) máxima de 7,5x105. Todavia, a IN passou por atualização e, a partir de julho de 2017 todas as regiões do país passaram a atender os seguintes valores: CPP máximo de 1x105 (UFC/ml) já as CCS de no máximo de 4x105(CS/ml) no leite produzido (BRASIL, 2011). A partir das amostras analisadas foi possível observar que em 73% (11/15) houve crescimento bacteriano na contagem padrão em placa (CPP) de mesofilos aeróbios, enquanto que os coliformes totais foram verificados em 66% (10/15) e em 33% (5/15) das amostras foi observado crescimento de coliformes termotolerantes. A quantidade bacteriana encontrada nas amostras estava em conformidade com a legislação vigente, uma vez que, variaram entre amostras sem crescimento bacteriano e no máximo 1,5x103 para mesofilos aeróbios, 4,3x102 para coliformes totais e 2,8x102 para bactérias termotolerantes, demonstrando a qualidade do leite (Tabela 1). Tabela 1 - Valores médios das contagens de aeróbios mesofilos, coliformes totais e coliformes termotolerantesde amostras de leite dos 15 animais analisados. Amostras 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15. CPP (UFC/ml) 1x102 SC SC SC 1X102 1X102 1,5X103 1,3X102 SC 1,4X102 1,8X102 2X102 1,1X103 1,7X102 1,3X102. CT (NMP/ml) 3,8X102 <0,3 <0,3 <0,3 0,36 <0,3 4,3 X102 2,3X102 <0,3 1,1X10 2,7X102 2,1X10 4,3X102 2,9X10 1,1X102. CTT (NMP/ml) 2X102 <0,3 <0,3 <0,3 <0,3 <0,3 2.8X102 < 0,3 <0,3 <0,3 1X10 <0,3 1,9X102 1,7X10 <0,3. SC ± Sem crescimento bacteriano; < 3.0 = Ausente; CPP ± Contagem padrão em placa de mesofilos aeróbios; CT ± coliformes totais; CTT ± coliformes termotolerantes; UFC ± unidades formadoras de colônia; NMP ± número mais provável. Fonte: o autor (2018). Anais do10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampaœ Santana do Livramento, 6 a 8 de novembro de 2018.

(6) A contaminação do leite por bactérias do grupo coliformes é uma indicação de ausência de higiene e sanitização da sala de ordenha, pelos ordenhadores e dos animais, confirmando a necessidade de modificar e reeducar os procedimentos utilizados nas propriedades leiteiras (SILVA et al., 2010). Uma vez que coliformes totais são indicativos de contaminação do ambiente, a presença dos coliformes termotolerantes no leite especialmente a Escherichia coli indica contaminações de origem fecal (FRANCO; LANDGRAF, 2008). No entanto, todas as amostras analisadas foram negativas ao teste com o caldo EC, constatando que não ocorreu o crescimento de E. coli. Foi observado que 73% das amostras apresentaram crescimento bacteriano demonstrando a presença de mastite subclínica, uma vez que, os animais não demonstravam qualquer sinal clínico. Segundo Langoni (2013) deve-se considerar a mastite como uma doença multifatorial e os elementos da tríade epidemiológica: agente ± hospedeiro ± meio ambiente está interligado de forma clara e direta, e cada um deles apresentam características próprias e variadas. A principal maneira de prevenir a disseminação da mastite é a identificação, separação e o tratamento dos animais doentes. Durante o período de pesquisa foi realizado o diagnóstico etiológico dos agentes crescidos onde os principais microrganismos identificados foram: Staphylococcus spp. (60%), Streptococcus spp. (40%), Proteus spp. (60%), Serratia spp. (33%) nas 15 amostras. Estes resultados estão de acordo com outros autores que identificaram estes mesmos microrganismos como principais causadores de mastite clínica e subclínica (LANGONI, et. al., 2011). 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS Com os resultados obtidos foi observado que o leite in natura provenientes da propriedade analisada estava dentro dos parâmetros de qualidade exigidos quanto à presença de mesofilos aeróbios e coliformes totais, não sendo encontrados coliformes termotolerantes nas amostras. Mesmo dentro dos parâmetros da legislação houve o isolamento de bactérias causadoras de mastite subclínica, demonstrando a importância de ser realizado o diagnóstico bacteriológico para o controle e prevenção da enfermidade. O acompanhamento da propriedade deve continuar para a identificação dos prováveis causadores da contaminação dentro do sistema de ordenha, para isso, são necessários coletas de outros materiais como ordenhadeiras, água e resfriador para identificação da fonte de infecção dentro da propriedade. REFERÊNCIAS ANDREWS, A. H.; BLOWEY, R.W.; BOYD, H.; EDDY, R. G. Medicina bovina: doenças e criação de bovinos.2ed. São Paulo: Roca, 2008. 1080p. BRASIL. Ministério da Agricultura. Instrução Normativa n° 62, de 29 de dezembro de 2011. Regulamentos Técnicos de Produção, Identidade, Qualidade, Coleta e Transporte de Leite. Brasília; 2011. Disponível em: Acessado em 07 ago. 2018. COSER, S. M.; LOPES, M. A.; COSTA. G. M. Mastite Bovina: Controle e Prevenção.Boletim Técnico, Lavras ± MG. n. 93, p. 1-30, 2012. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo: Atheneu, 2008. Anais do10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampaœ Santana do Livramento, 6 a 8 de novembro de 2018.

(7) LANGONI, H.; PENACHIO, D. S.; CITADELLA, J. C. C.; LAURINO, F.; FACCIOLIMARTINIS, P. Y.; LUCHEIS, S. B.; MENOZZI, B. D.; SILVA, A, V. Aspectos microbiológicos e de qualidade do leite bovino. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 31, n.12, p. 1059-1065, dezembro 2011. LANGONI, H.; Qualidade do leite: utopia sem um programa sério de monitoramento da ocorrência de mastite bovina. Pesq. Vet. Bras. 33(5):620-626, maio 2013 LOPES, M.A.; DEMEU, F.A. Avaliação do impacto econômico da mastite em rebanhos bovinos leiteiros. Arq. Ins. Biol, v.79, n.4, p.477-483, 20012. MÜLLER, E. E. Qualidade do leite, células somáticas e prevenção da mastite. In: SIMPÓSIO SOBRE SUSTENTABILIDADE DA PECUÁRIA LEITEIRA NA REGIÃO SUL DO BRASIL, 2002, Maringá. Anais do II Sul-Leite. Maringá: UEM, 2002. p.206-217. PEDRAS, M. M. Avaliação de propriedades físico-químicas e funcionais de leite processado por tecnologia de homogeneização a ultra alta pressão. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária), Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, 2007. PRESTES, D. S.; FILAPPI, A.; CECIM, M. Susceptibilidade à mastite: fatores que a influenciam ± uma revisão. Revista da Faculdade de Zootecnia, Veterinária e Agronomia, v. 9, n. 1, p. 48-59, 2003. SILVA, M. A. P.; SANTOS, P. A.; SILVA, J. W.; LEÃO, K. M.; OLIVEIRA, A. N.; NICOLAU, E. S. Variação da qualidade do leite cru refrigerado em função do período do ano e do tipo de ordenha. Revista Instituto Adolfo Lutz, v. 69, n. 1, 2010 TRONCO, Vania M. Manual para Inspeção da Qualidade do Leite. 3. ed. Santa Maria, Rio Grande do Sul, 2003. VIANNI, M. C. E.; LÁZARO, N. S. Perfil de suscetibilidade a antimicrobianos em amostras de cocos Gram- -positivos, catalase negativos, isolados de mastite subclínica bubalina. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.23, n.2, p.47-51, 2003. WATTS, J. L. Etiological agents of bovine mastitis. Veterinary Microbiology, v. 16, p. 4166, 1988.. Anais do10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampaœ Santana do Livramento, 6 a 8 de novembro de 2018.

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