Nuevos enfoques en el uso de entomopatógenos en Colombia
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(2) ICA - División de Sanidad Vegetal. nes en el área de los entomopatógenos como una de las alternativas para. el manejo de insectos plagas agrícolas, pecuarias yen salud humana. La identificación correcta de los microorganismos involucrados en. el control de insectos debe ser prioritaria para el estudio de la morfolo. gía, taxonomía, características bioquímicas y moleculares de los entomopatógenos; así se seleccionarán los que presenten mayores posi bilidades de uso como bioinsecticidas en el manejo integrado de los insectos plagas.. La metodología de reconocimiento basada en realización de frotis de la hemoliosfa y cortes de tejidos de insectos enfermos, con coloraciones diferenciales para observar en microscopía óptica, bajo el lente de inmersión (90 X 10), aunque constituye una primera aproxima ción sobre la clase del virus, puede conducir a un diagnóstico errado. Lastécnicas basadas en el uso del microscopio electrónico y las caracte. rísticas bioquímicas y moleculares, se ha desarrollado principalmente con virus y bacterias.. Esta conferencia versará sobre la aplicación de algunas de estas. tecnologías para la caracterización biomolecular de virus y bacterias entomopatógenas. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VIRUS ENTOMOPATÓGENOS Los virus causales de enfermedades en insectos, son organismos auxi. liares del control biológico. Por la abundancia de especies registradas. en la mayoría de plagas de importancia económica, su gran capacidad de dispersión y de sobrevivencia en las distintas generaciones de las plagas, así como también en los agroecosistemas en que se encuentren los virus entomopatógenos, se deberán implementar en planes de mane jo integrado de plagas.. Euprosterna eleasa Dyar y Automeris sp. (Lep: Limacodidae y Saturnidae respectivamente), comedores de follaje de palma africana, causan daños de importancia económica al cultivo, cuando se desequili bran sus poblaciones.. Continuamente se registran epizootias espontáneas ocasionadas por estos virus, las cuales controlan cerca de 90% de estas plagas. 102.
(3) Bases tecnológicas del MIP. El virus de la poliedrosis nu clear de E. eleasa (VPNEe) y el de la granulosis de A. sp (VGAsp), registrados en estas plagas, perte necen a la familia Baculoviriade, (Rodríguez 1.992a). Los estudios efectuados con. estos virus se basaron en investiga ciones realizadas en el laboratorio. Fig.42 Virus de la poliedrosis nuclear en larvas. de Euprosterna elaeasa Dyar. de virología del Instituto Armand Frappier, de Laval, Quebec (Cana dá), sobre el virus de la poliedrosis nuclear del taladrador de las yemas del pino Choristoneurafumiferana Clem. (VPNMCF) Virus de la poliedrosis nuclear múltiple de CH. fumiferana (Nadeau, 1991) y para el virus citoplasmático del mismo insecto (VG Cf)** (Rodríguez 1,992b).. El VPNEe forma cuerpos de inclusión de forma poliédrica de 500. a 1.500 nm, compuestos esencialmente por una proteína llamada poliedrina. En el interior de los poliedros se encuentran uno o más viriones o nucleocápsidos en forma de varilla, encerrados dentro de una envoltura, constituida por hidratos de carbono. Los viriones contienen el material genético ADN en doble cadena en hélice. Los virus de granulosis también presentan cuerpos de inclusión de forma ovolocilíndrica de 300 a 500 nm de largo por 150 a 300 nm de ancho; están formados por la proteína llamada granulina; contienen ge neralmente un virión al interior del granulo, aunque en trabajos recien tes (1991) se han encontrado dos viriones por envoltura; al igual que el VPN, el ácido nucleico está constituido por ADN. Estos virus fueron identificados en microscopía electrónica, por la técnica de purificación en gradiente de sacarosa y el corte de partículas virales con cubrimiento en vestopal, fijación en glutaraldehido al 2,5% y ácido ósmico, seguido de deshidratación en acetona.. Se usaron métodos bioquímicos de purificación, digestión de los vi rus mediante enzimas de restricción (Eco rl)* extracción y precipitación del ADN viral. El aislamiento y purificación de fragmentos de ADN (Aci-. * Virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Ch.fumiferana. ** Virus granulado de Ch.fumiferana.. 103.
(4) ICA - División de Sanidad Vegetal. do nucleico), separados por electroforesis en gel de agarosa, es una de las técnicas utilizadas en investigación sobre ácidos nucleicos. Esta técnica permite la separación de las moléculas de ADN, según tamaño, número de pares de basesque contiene cadavirus (Condición indispensable en la clasificación), forma y distribución (ADN en simple o en doble línea, circular, helicoide), y concentración de las proteínas virales. Mediante esta metodología se conocen además la cartografía física y el análisis de los genomas virales y se facilita un rápido y certero diagnóstico de las infecciones, mediante las enzimas de restricción. Escherichia coli Rl. Por otra parte, se puede llegar a determinar el lazo de parentesco entre el virus de insectos (Rodríguez y otros 1982).. CLONAJE DEL ADN VIRAL La obtención de cantidades importantes de ADN de los dos virus VPNEe. y VGAsp se hizo por inserción del ADN de cada virus, (purificado), en un vector de clonaje; es decir, una molécula de ADN (plásmido bacterial que es capaz de replicarse de manera autónoma en otro compatible). SONDAS MOLECULARES. Se establecieron sondas moleculares para cada virus en estudio; las son das son secuencias de ADN en simple línea, las cuales bajo condiciones precisas de hibridación son capaces de encontrar sus secuencias com plementarias y de hibridarse formando un dúplex estable. Las sondas son específicas para un mismo virus o para otros baculoviridae de insec tos plagas, lo cual es importante si se tiene en cuenta que una misma población insectil u otras plagas del cultivo pueden estar afectadas por diferentes virus.. APLICACIONES DE LA HIBRIDACIÓN MOLECULAR. Las sondas moleculares sirven para la detección de los virus en los in sectos que se encuentran atacando el cultivo; permiten evaluar en forma rápida la dinámica de la infección en la población del insecto plaga; se. requiere la purificacióny el corte de la ADN viral, mediante las enzimas de restricción. Por otra parte, se puede llegar a determinar el lazo de 104.
(5) Bases tecnológicas del MIP. parentesco entre los diferentes virus que afectan los insectos y pueden usarse a gran escala para obtener datos precisos sobre el desarrollo de. infecciones inducidas en los insectos que afectan los cultivos. Cono. ciendo de antemano este factor, medido por el porcentaje de infección del virus en los insectos, se prevee el posterior desarrollo de una epizootia y se podrá preservar al cultivo de aplicaciones de insecticidas posible mente innecesarias. Todo esto redundaría en beneficios para el agricul tor, el restablecimiento de la fauna benéfica, la reducciónde la contami. nación del cultivo, del ambiente y de los productos agrícolas por la au sencia de insecticidas químicos. Uno de los aspectos negativos en los cuales se basan las críticasseve. ras al uso de patógenos para el control de insectos plagas, es su baja efecti vidad en el campo, por la falta de métodos de diagnóstico preciso; algunos insectos mueren por un patógeno y sedeshidratan inmediatamente, o no es posible encontrar el microorganismo con los métodos simples de observa ción al microscopio óptico. Mediante el uso de sondas moleculares se ob. tienen porcentajes altamente significativos del efecto de virus, bacterias u hongos en los insectos; por otra parte, también se puede determinar la ac ción de los entomopatógenos en insectos vivos que todavía no muestran efectos de la infección por nn patógeno. Lo anterior permite determinar, mediante evaluaciones suscesivas de la población insectil en los cultivos. con la debida anticipación los entomopatógenos presentes en la plaga, su acción en la misma o en otras generaciones de una plaga y se evitan posi bles confusiones en la clasificación de los microorganismos. La metodología utilizada se puede adaptar para cualquier clase de virus entomopatógenos.. BACILLUS THURINGIENSIS. El B. thuringiensis Berliner (Eubacteriales: Bacillaceae), incluye bacte rias esporuladas en forma de bacilos móviles, característicos de la fami. lia. Presenta formas vegetativas gran positivas; la fase de reproducción se caracteriza por la presencia de una espora o forma de resistencia y un. cristal parasporal, el cual se sitúa en la parte del bacilo cerca a la espora. El cristal es de naturaleza proteica ysu estructura es la de un polipéptido,. con cadenas constituidas por varios polímeros; secreta una endotoxina que actúa sobre el intestino de las larvas afectadas.. La muerte del insecto ocurre por intoxicación, luego de la ingestión delB. thuringiensis, bajoel efecto de la endotoxina. Esta se activa cuando 105.
(6) ICA - División de Sanidad Vegetal. el pH del tubo digestivo del insecto es superior a 8, 9 (Burges y Hussey, 1971) yestá provisto de enzimas proteolíticas capaces de liberar las fraccio nes tóxicas del cristal. Se ha podido constatar que casi todos los lepidópteros. poseen esta característica. La espora y la endotoxina son necesarias para matar los insectos: si se someten éstos a tratamiento con el producto bajo. forma de espora o cristal solos, pueden morir pero se necesitan dosis más altas que cuando están presentes las dos estructuras en la formulación. En las especies sensibles, la intoxicación se manifiesta porque los insectos afectados dejan de consumir el vegetal una hora después de la ingestión del cristal; esto podría explicarse por un bloqueo ejercido en las transmisiones nerviosas, lo cual disminuye significativamente los. daños producidos por los insectos en las plantas (Martouret, 1978). Ocurre luego la parálisis del tubo digestivo y se presentan lesiones intestinales diferentes según el tipo de B. thuringiensis, debido ala toxina del cristal que baja el pH de lahemolinfa (Burges y Hussey, 1971). La parálisis del insecto ocurre antes de la muerte del mismo: sin embargo, la tasa de mortalidad está en relación directa con laconcentra ción del material activo; el insecto muere generalmente.. Los cristales tienen formas diferentes: bipiramidales, romboides o. cuboidales; son agregados de proteínas, identificadas como Cry; recien temente se ha demostrado que la toxina actúa sobre los bordes de las vesículas de la membrana del intestino medio del insecto (Pietrantonio y otros, 1993).. AISLAMIENTO YCARACTERIZACIÓN DE GENES DE B. thuringiensis La colección y caracterización de los aislamientos de B. thuringiensis son fundamentales para encontrar nuevas deltaendotoxinas que ofrez. can alternativas para elcontrol de insectos plagas en agricultura, veteri naria y salud humana.. La técnica de Elisa es usada para identificar el tipo de proteínas. delta endotoxinas producidas por las diferentes cepas patrones de B.. thuringiensis, mediante los anticuerpos que reconocen el tipo de toxina del cristal.. Lahibridación tipo southern blot con sondas específicas de diferentes. genes Cry, es otra metodología para la caracterización de B. thuringiensis. 106.
(7) Bases tecnológicas del MIP. El PCR es una tecnología rápi da de identificación genética de microorganismos por la reacción en. cadena delapolimerasa; utiliza unpar de oligonucleótidos específicos para ciertos genes Cry, para amplificar un fragmento de estos genes, de un ta maño característico (Kronstad y Whiley, 1.986; Bourque y otros, 1993; Fig 43. Bacillus thuringiensis. Berliner, Cerón y otros, 1994; Chack y otros, (Frotis bacterial teñido con azul de metileno 1994; Gleave y otros, 1993; Citados y fuschina), aislado delarvas deSpodoptera por Bravo, 1955).. sp. Obsérvense bacilos alargados, bacilos. Otros estudios muestran que hay. con esporas y cristales en los extremos, esporas y cristales libres.. una correlación entre la actividad bio. lógica de latoxina Cry y lahabilidad para encontrar las microvellosidades. de la membrana del intestino medio. La toxina del cristal (Cry) requiere de un receptor molecular específico de las microvellosidades del intestino, que le permite insertarse en la membrana de éste, formando un poro (Pietrantonio yotros, 1993), con laconsecuente destrucción de lapared celular; las bacte. rias de la flora intestinal comienzan a reproducirse anormalmente, lo cual causa septicemia y mal olor de los insectos muertos.. PCR : REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. Es una técnica bioquímica que produce millones de copias de una se. cuencia relativamente corta de ADN (de 100 a 300 nucleótidos). Los productos de un ciclo de amplificación sirven como substrato para el siguiente.. La secuencia que se amplifica se incrementa en forma exponencial (School, 1995).. Se usa para sintetizar las moléculas del ADN, para clonar molécu. las de ARNm (Ácido ribonucleico mensajero) en el genoma de los vi. rus, bacterias u hongos.. La enzima polimerasa puede sintetizar ADN, si se encuentra en presencia de una secuencia de ADN preexistente. Esta última tecnolo. gía se usa ampliamente en la caracterización de virus, bacterias y otros microorganismos. 107.
(8) ICA - Dvisión de Sanidad Vegetal. En Colombia existen varias entidades que desarrollan investiga. ción con B. thuringiensis. Se ha creado una Red Internacional de Bacillus thuringiensis, la cual agrupa a los investigadores que desarrollan traba jos en este campo.. Actualmente, el Centro de Investigaciones Biológicas (CIB) de Medellín, el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional en. Bogotá y la Corporación de Investigación Agropecuaria, Corpoica, han estandarizado técnicas de identificación molecular de colecciones de B.. thuringiensis, basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR ), usando primers generales yespecíficos para diferenciar los grupos de CRY (Marino y otros, 1995).. Por otra parte, se han caracterizado cepas de B. Thuringiensis y B.. Sphaericus tóxicas para los mosquitos Culexquinquefasciatus yAnopheles albimanus, vectores de malaria (Andrade y otros, 1995).. En el CIB de Medellín (Colombia) se llevan a cabo investigacio nes sobre la caracterización bioquímica, inmunológica y toxicológica de aislamientos de B. Thuringiensis, tóxicos para mosquitos. La. subespecie Medellín presenta alta toxicidad para Culex quinquefascialus con proteínas Cry entre 90 a 100 KDA, de mayor potencialidad que la subespecies israeliensis y morrisoni (Díaz y otros, 1995 ). EXPOSICIÓN DE GENES DE B. thuringiensis TÓXICAS PARA MOSQUITOS EN OTROS MICROORGANISMOS. Delecluse, 1995, ha probado que el B. thuringiensis subespecie israeliensis. es tóxico para dípteros; sin embargo, esta bacteria presenta poca persis tencia en el medio acuático en que viven las larvas de mosquitos y su actividad se reduce con los rayos ultravioleta.. Para obviar este problema, la investigación propone transferir la toxina Cry del B. thuringiensis contra mosquitos dentro de diferentes microorganismos de cyanobacterias y B. sphaericus.. Orduz y otros, en 1995, introdujeron genes de la toxina binaria de B. sphaericus clonadas en un vector, en la bacteria nativa acuática B. thuringiensis subespecie israeliensis CIB 300501b y probaron que la 108.
(9) Bases tecnológicas del MIP. bacteria recombinante esmás eficaz que lanativa no recombinante con tra larvas de anophelinos vectores de enfermedades en humanos.. PLANTAS TRANSGÉNICAS. Las nuevas tendencias de la investigación con B. thuringiensis se basan en la obtención de plantas transgénicas en las cuales se transfieren los. genes Cry del B. thuringiensis contra un insecto plaga que las ataque. CONCLUSIONES. Los virus entomopatógenos ylas bacterias entomopatógenas son excelen tes auxiliares del control biológico de insectos plagas; las epizootias cau sadas por estos organismos reducen significativamente las poblaciones insectiles. Poseen alta capacidad de dispersión yde adaptabilidad de hués ped, y a lasdiferentes condiciones ambientales. Su estudio se debe incre. mentar con el fin de obtener los resultados que permitan incluirlos en planes de manejo integrado de insectos plagas en la agricultura. Por los estudios de reconocimiento e identificación bioquímica y molecular de virus, bacterias yotros organismos entomopatógenos efec tuados hasta ahora, se ha confirmado la existencia de abundantes recur sos genéticos para control de plagas; posiblemente se encuentran en el. país especies por describir ycon un grado de patogenicidad mayor que el de las conocidas actualmente.. Las tecnologías de recombinación de genes permiten mejorar, in crementar y seleccionar los entomopatógenos con alto grado de toxici dad para la misma u otra especie de insecto a controlar.. Con metodologías específicas de caracterización de microorganismos causales de enfermedades de insectos se puede evaluar su acción en insec tos que atacan los cultivos agrícolas y conocer la dinámica de la infección.. Si un patógeno está actuando en la población insectil, se prevé que cuando ésta se incrementatambién hay aumento de la acción de los entomopatógenos en dicha población. En esta forma se evitarán aplicaciones innecesarias de. insecticidas químicos para una plaga. Lo anterior redunda en beneficio para el agricultor, el restablecimiento de poblaciones de insectos auxiliares, la reducción de residuos químicos en los productos agrícolas y la alta tenden cia a la recuperación del equilibrio ambiental. 109.
(10) ICA - División de Sanidad Vegetal. La obtención de plantas transgénicas, con genes tóxicos de entomo. patógenos introducidos en éstas, contribuirán a la disminución de po. blaciones de insectos plagas susceptibles, lo cualreducirá igualmente el uso de insecticidas. Sin embargo, serán necesarios estudios avanzados. sobre la estabilidad de genes introducidos, con el fin de evitar la posible resistencia de los insectos a dichos genes. Cuando se manipulan orga. nismos vivos, las investigaciones deben ir avanzando progresivamente para resolver los problemas en la medidas en que se presenten.. BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA. Bravo, A. 1955. Aislamiento y caracterización de cepas de Bacillus thuringiensis. Curso taller internacional: aisla miento, caracterización y producción deB. thuringiensis.. Santafé de Bogotá. Colombia, 22 de agosto al 1 de sep tiembre de 1955. Memorias. Pag. 6.. Burgess, H. D.; Hussey, N. H.; 1981. Microbial control of insectandmites. Londres. Academic Press. Inc. 681 p.. Díaz, T.; Restrepo, N.¡ Orduz, S.; Rojas, W. 1991. Distribu ción y aislamiento de B. thuringiensis en Colombia. So ciedad Colombiana de Entomología, Socolen. Santafé de Bogotá XVIII. p 78.. ; Tamayo, M.; Orduz, S. 1955. Caracterización bioquímica, inmunológicay toxicológica de lasproteínas del cristal de B. thuringiensis subespecie Medellín. So ciedad Colombiana de Entomología, Socolen. Santafé. de Bogotá (Colombia) julio 26 al 28 de 1995 XXII Con greso. Resúmenes, p 9.. Delecluse A. 1.995. Expressión of Bacillus thuringiensis. mosquitoscidal genes in ryanobacteria and other. alternative host. Curso internacional de B. thuringiensis.. Aislamiento, caracterización y producción. Red Nacio naldeBacillus thuringiensis Santafé deBogotá (Colom. bia) 22 de agosto al 1de septiembre de 1955. Memorias, p. 13. 110.
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