HISTORIA
Hace ahora poco más de 50 años, Maurice Wilkins, James Watson y Francis Crick dedujeron la estructura tridimensional del DNA. Lo que les llevó a obtener, en el año 1962, el pre-mio Nobel de Medicina y Fisiología. Este brillante trabajo ha sido uno de los más transcendentes en la Historia de la Ciencia ya que permitió enten-der el funcionamiento de los compo-nentes clave de la vida, los genes, a escala molecular. El descubrimiento dio lugar al que, posiblemente, fuera el desarrollo más rápido y espectacu-lar de una nueva rama del saber, que hoy conocemos como Biología Molecular.
La Biología Molecular se dedica al estudio de la formación, estructura y función de las macromoléculas esen-ciales para la vida, centrándose prin-cipalmente en el DNA y en su papel en la multiplicación celular y la trans-misión de la información genética. Fue el propio Francis Crick el primero que empleó el término de Biología Molecular para referirse a su ocupa-ción, cansado de explicar, habitual-mente sin mucho éxito, que era una mezcla de cristalógrafo, biofísico, bio-químico y genético.
E
Ell D
DN
NA
A
De forma simplificada, podríamos decir que el DNA es el plano de un arquitecto, con la información nece-saria para construir todos los com-ponentes de una célula, que sería la casa. El DNA es una molécula muy larga formada por dos hebras que se enrollan una sobre otra adqui-riendo una estructura de doble héli-ce. Cada hebra está constituida por cuatro tipos distintos de subunida-des moleculares o nucleótidos: ade-nina, guaade-nina, timina y citosina, y que para abreviar designamos con sus iniciales A, G, T y C. El genoma de cualquier ser vivo, desde el
microorganismo más pequeño al hombre, está escrito con estas cua-tro letras. Lo que cambia de unos organismos a otros es la secuencia en que se encuentran dichas letras. Los nucleótidos de una cadena son complementarios a los de la otra de forma que la A siempre se empareja con la T y la G con la C. Esto impli-ca que la información genétiimpli-ca es redundante y que cada una de las hebras puede actuar como un molde de la otra permitiendo a la célula duplicar su material genético. Esta duplicación, que se conoce como replicación del DNA, va a ser lleva-da a cabo por la acción de un enzi-ma, denominado DNA polimerasa, que se va a encargar de copiar fiel-mente cada una de las cadenas del DNA una vez separadas. De esta forma, se obtienen dos copias exac-tas a la de partida, garantizándose así la transmisión fiel del mensaje genético a las células hijas.
L
Lo
os
s g
ge
en
ne
es
s
Los nucleótidos del DNA se agru-pan en unidades funcionales que denominamos genes, de forma que cada gen define una proteína y éste es el nexo de unión entre el DNA, la molécula informativa y las proteínas, las moléculas que sustentan la estructura de las células y que llevan a cabo el metabolismo. De manera similar a los genes, las proteínas están constituidas por una sucesión lineal de unidades moleculares que en este caso son los aminoácidos. Unas proteínas se diferencian de otras en la secuencia de aminoáci-dos, la cual determina la forma y la función de la proteína. Pues bien, la secuencia de aminoácidos viene defi-nida por la secuencia de nucleótidos del gen que la codifica.
Todas las proteínas de una célula están representadas en su genoma, pero no todas las proteínas se están sintetizando constantemente. Los genes poseen interruptores, que
lla-APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA
MOLECULAR EN TECNOLOGÍA
DE ALIMENTOS
La Biología Molecular nos ofrece, en la actualidad, una serie de técnicas con impor-tantes aplicaciones en muy distintos campos. En este artículo se muestran algunos ejemplos de la utilización que se puede hacer de estas poderosas herramientas en el ámbito de la Tecnología de los Alimentos. Una parte impor-tante del trabajo de nuestro grupo se centra en el desarrollo de vectores de clonación de grado alimentario que puedan ser empleados en bac-terias del ácido láctico (BAL) utilizadas como fermentos. Estos vectores están siendo usados para la clonación y expresión de genes que codifican antígenos, con el fin de utilizar BAL vivas como vehículos de vacunación oral. Por otro lado, la actividad metabólica de algunas cepas de BAL puede dar lugar a la formación de aminas biógenas (AB). Estos compuestos pue-den provocar problemas toxicológicos graves, por lo que se ha procedido a la mutación pre-cisa de los genes responsables de su síntesis en BAL asiladas de quesos, sin afectar sus pro-piedades tecnológicas. De esta forma se obtie-nen fermentos más saludables, incapaces de producir AB. Paralelamente, se han desarrolla-do procedimientos de PCR que permiten com-probar que las cepas seleccionadas para usar como fermentos sean incapaces de sintetizar AB. Este método también permite detectar bacterias productoras de AB en alimentos, aunque estén en muy baja concentración.
RESUMEN
Autores
Mª Cruz Martín, María
Fernández, Ana G. Binetti,
Beatriz del Río, Alfonso H.
Magadán, Víctor Ladero,
Daniel M. Linares y Miguel
A. Álvarez
Instituto de Productos Lácteos de Asturias CSIC
mamos promotores, que permiten la síntesis de la proteína que codifican solamente cuando ésta es necesaria para la célula. Los promotores son pequeñas secuencias de DNA que preceden al gen que regulan.
LA BIOLOGÍA
MOLECULAR Y LOS
ALIMENTOS
La alteración de la dotación genéti-ca de los organismos que son la base de nuestra dieta se remonta a 12.000 años antes de Cristo, cuando en algún lugar del Próximo Oriente nació la agricultura. En cuanto el hombre empezó a plantar semillas comenzó una selección de éstas, plantando aquéllas que mejoraban la producción y así, de una manera empírica, se ini-ció la manipulaini-ción del acerbo genéti-co de los vegetales utilizados en nuestra alimentación. Un proceso similar ocurrió con el desarrollo poste-rior de la ganadería. Esta manipula-ción genética, realizada de forma for-tuita, dio paso, con el desarrollo de la Biología Molecular, a precisas herra-mientas moleculares que permiten una manipulación dirigida mucho más rápida y eficaz de los organismos que constituyen los alimentos que consu-mimos. Al igual que los ordenadores modernos permiten editar textos con gran facilidad, introduciendo o elimi-nando palabras, así como buscar rápidamente una palabra determina-da en enormes bases de determina-datos, la Biología Molecular permite introducir (clonación), eliminar (mutación) y bus-car (PCR) genes. A continuación veremos un ejemplo de cada una de estas técnicas aplicadas a las bacte-rias del ácido láctico.
L
La
as
s b
ba
ac
ctte
erriia
as
s d
de
ell á
ác
ciid
do
o llá
ác
cttiic
co
o ((B
BA
AL
L))
La mayoría de los fermentos utiliza-dos en la industria láctea están cons-tituidos por un tipo de bacterias que son las bacterias del ácido láctico. Estas bacterias gram positivas se caracterizan, como su nombre indica, porque producen lactato como princi-pal producto de la fermentación de
azúcares. El metabolismo de dichas bacterias va a permitir una mejor con-servación de los productos finales y la aparición de aromas, sabores y textu-ras diferentes a los de la materia prima de partida. Las BAL también juegan un papel importante en otras fermentaciones alimentarias cuya materia prima puede ser carne, pes-cado o vegetales. Hay que destacar, además, que estas bacterias tienen importantes propiedades probióticas que son beneficiosas para la salud del consumidor.
CLONACIÓN DE GENES
V
Ve
ec
ctto
orre
es
s d
de
e g
grra
ad
do
o a
alliim
me
en
ntta
arriio
o
La Biología Molecular nos permite cortar el DNA de un genoma donante mediante unos precisos bisturís mole-culares que se denominan enzimas de restricción, tomar el fragmento de DNA que contenga el gen deseado, pegarlo con otro enzima, la DNA liga-sa, a una molécula de DNA transpor-tadora, que llamamos vector y que será finalmente introducido en la bac-teria receptora, confiriéndole una nueva propiedad (Figura 1). Es impor-tante resaltar que para poder utilizar estos vectores en microorganismos que vayan a intervenir en la fermenta-ción de alimentos, cuyo destino final sea el consumo humano o animal, tie-nen que ser de grado alimentario. Los sistemas de clonación de grado ali-mentario más utilizados se basan en vectores replicativos en los que todo el DNA procede de BAL. Estos vecto-res pvecto-resentan numerosas dificultades, tanto para su manipulación en el labo-ratorio, puesto que no se pueden utili-zar herramientas genéticas derivadas de E. coli (organismo fácilmente manejable y de uso común en los laboratorios de investigación), ni pue-den contener genes de selección que codifiquen resistencia a antibióticos; como para su aplicación en la indus-tria, puesto que es necesaria una pre-sión selectiva para evitar que el vector se pierda. En este sentido, en nuestro grupo hemos desarrollado un sistema de grado alimentario que permite la clonación y estabilización de genes
SEGURIDAD ALIMENTARIA
Molecular Biology offers at the present time a series of techniques with important applica-tions in very different fields. Some examples of the uses that these powerful tools have in Food Technology are shown. An important part of the work of our group is focused in the development of food grade cloning vectors for lactic acid bacteria (LAB) used like starters. One application is the cloning and expression of antigen genes with the purpose of using living LAB like oral vaccination vehicles. On the other hand, the metabolic activity of some BAL strains can produce biogenic amines (BA). These compounds can cause serious toxicolo-gical problems. For this reason, the BA synthe-sis genes have been precisely mutated in dairy LAB producing strains, without affecting their technological properties. Thus, more healthful starters, unable to produce BA, were obtained. In parallel, PCR procedures to check if selected LAB starter strains are incapable to synthesize BA have been developed. This method allows also to detect BA producing bacteria in foods, even if they are in very low concentration.
SUMMARY
en BAL mediante el empleo de dos vectores, uno “integrativo” que porta el gen a clonar y que es capaz de integrarse en el genoma de la bacte-ria receptora sin afectar su eficacia biológica y sin necesidad de presión selectiva. Y un vector “depurativo” que permite eliminar, tras la integra-ción, todo el DNA del vector integrati-vo a excepción del gen o los genes
que pretendamos expresar (Martín y cols., 2000). Este sistema permite la introducción de nuevas característi-cas en las bacterias receptoras. A modo de ejemplo, veremos como se pueden convertir las BAL en sofistica-dos vehículos de vacunación oral.
D
De
es
sa
arrrro
ollllo
o d
de
e v
va
ac
cu
un
na
as
s o
orra
alle
es
s
Debido al aumento alarmante de cepas resistentes a los antibióticos conocidos y a la aparición de nuevas enfermedades víricas, la comunidad científica ha vuelto la vista a las vacu-nas como un medio eficaz para hacer frente a las infecciones. Además de las características tradicionales de toda buena vacuna (seguridad, efecti-vidad y capacidad de inducir inmuni-dad en las primeras etapas de la vida), las leyes de mercado y la nece-sidad de vacunaciones masivas en el tercer mundo imponen en la actuali-dad que las vacunas posean nuevas propiedades: deberían ser baratas, de administración oral e independientes de la cadena de frío. Debido a esto, se ha comenzado a trabajar en la
posibilidad de utilizar bacterias recombinantes vivas como vehículos para la presentación de antígenos en las mucosas. En este contexto, las BAL presentan una serie de caracte-rísticas que las revelan como las mejores candidatas, ya que son bac-terias GRAS (General Regarded as
Safe; Reconocidas como seguras),
capaces de colonizar la superficie de las mucosas, pueden ser manipula-das genéticamente, pueden expresar antígenos heterólogos y presentan coadyuvancia intrínseca.
E
Ex
xp
prre
es
siió
ón
n d
de
ell g
ge
en
n q
qu
ue
e c
co
od
diiffiic
ca
a lla
a
p
prro
otte
eíín
na
a m
ma
ay
yo
orriitta
arriia
a d
de
e lla
a c
cá
áp
ps
siid
da
a
d
de
ell v
viirru
us
s N
No
orrw
wa
allk
k
El sistema integrativo de grado ali-mentario previamente descrito está siendo utilizado para expresar en
Lactobacillus casei el gen que
codifi-ca la proteína VP60, que es el compo-nente mayoritario de la cápsida del virus de Norwalk (Martín y cols., 2004). Este virus perteneciente a la familia Caliciviridae ha sido descrito en países de todo el mundo como el
Fig. 2: Producción de la amina biógena
tirami-na por descarboxilación enzimática del amino-ácido tirosina.
agente causal de numerosos brotes de gastroenteritis (Buesa y cols., 2002; Lopman y cols., 2002; White y cols., 2002). Disponemos en nuestro laboratorio de herramientas genéticas que nos permiten la construcción de BAL capaces de producir la proteína VP60 intra- o extra-celularmente e, incluso, anclada establemente a la pared celular (Figura 1). Se ha com-probado que la proteína VP60 produ-cida por Lb. casei es antigénica, lo que abre esperanzadoras perspecti-vas para el desarrollo de vacunas ora-les frente a estos virus entéricos.
MUTACIÓN DE GENES
Además de añadir un gen, también podemos eliminarlo. Para ello nos aprovechamos de un proceso, la
recombinación homóloga, que se da frecuentemente en las bacterias. Este proceso permite el intercambio de información entre DNAs de secuencia similar y es una fuente de variabilidad genética, básica para la evolución de las especies. Principalmente, esta técnica consiste en mutar el gen diana “in vitro” para, posteriormente, introducirlo en la cepa en la que pre-tendemos silenciarlo. Mediante el pro-ceso de recombinación homóloga se puede conseguir el intercambio del gen original presente en el genoma por el gen mutado.
M
Mu
utta
ac
ciió
ón
n d
de
e g
ge
en
ne
es
s rre
es
sp
po
on
ns
sa
ab
blle
es
s d
de
e lla
a
s
síín
ntte
es
siis
s d
de
e A
Am
miin
na
as
s B
Biió
óg
ge
en
na
as
s ((A
AB
B))
Como vimos, las BAL juegan un papel muy importante en la industria alimentaria como iniciadores de la fer-mentación. Sin embargo, la actividad
metabólica de algunas cepas puede dar lugar a la formación de productos alterantes como las aminas biógenas. Las AB se forman por descarboxila-ción de algunos aminoácidos (Figura 2) debida a la actividad enzimática de las bacterias que forman parte del cul-tivo iniciador, de la microbiota secun-daria o de bacterias contaminantes. Cabe destacar, que la capacidad de producir AB es una característica que depende de cepas y no de especies. Estos compuestos, pueden provocar problemas toxicológicos graves, especialmente en personas que care-cen de actividad amino-oxidasa intes-tinal, encargada de su eliminación. Por otra parte las AB son precursoras de las nitrosaminas de conocido efec-to cancerígeno (Silla-Sanefec-tos, 1996).
La AB más frecuentemente encon-trada en productos lácteos fermenta-dos es la tiramina y se forma por des-carboxilación del aminoácido tirosina presente en la leche, en una reacción catalizada por el enzima tirosina des-carboxilasa (TDC) (Figura 2). Basándonos en el uso de medios dife-renciales, que permiten identificar cepas productoras de tiramina, se encontraron cepas aisladas de que-sos capaces de producir tiramina y se identificaron los genes responsables de su síntesis (Fernández y cols., 2004). En este caso, el objetivo no es introducir un gen nuevo, como se vio en el apartado anterior, sino inactivar o mutar los genes responsables de la producción de tiramina y que, por tanto, son peligrosos para la salud del consumidor. De esta forma, se obtie-nen cepas que permiten la fabricación de un producto con las mismas pro-piedades organolépticas que el inicial, pero seguro para el consumidor.
DETECCIÓN DE GENES:
LA PCR
El conocimiento del DNA nos permi-te no solo modificarlo, sino también detectarlo aunque esté presente en muy pequeña cantidad. Esto es de gran utilidad en tecnología de alimen-tos para desarrollar métodos de detección de patógenos, analizar fraudes alimentarios, etc. Existe una
SEGURIDAD ALIMENTARIA
Fig. 4: Detección por PCR de bacterias productoras de tiramina. Fig. 3: PCR, la herramienta maravillosa.
técnica destacable, denominada PCR (siglas de reacción en cadena de la polimerasa, en inglés), cuya sencillez, rapidez y sensibilidad supera con cre-ces a las técnicas empleadas hasta su descubrimiento. Fue desarrollada por el Dr. Kary B. Mullis, el cual fue galardonado con el premio Nobel de Química, en el año 1993. Básica-mente, es un método enzimático que nos permite copiar muchas veces (amplificar) un fragmento específico de DNA (Figura 3). Para ello, se
utili-zan dos pequeños fragmentos de DNA de cadena sencilla llamados oli-gonucleótidos, cebadores o primers, cuya secuencia de nucleótidos es complementaria a los extremos del fragmento de DNA que pretendemos amplificar y que, por tanto, confieren especificidad al proceso de amplifica-ción. Tras juntar la muestra con los primers y todos los componentes de la reacción, incluida una DNA polime-rasa termorresistente, el primer paso consiste en subir la temperatura para
que se separen las dos hebras del DNA diana. Después se baja la tem-peratura para que se adhieran los pri-mers en la secuencia correspondiente y permitan que la DNA polimerasa sintetice la cadena complementaria. Estos ciclos se repiten sucesivamente pudiendo obtenerse millones de copias del ADN diana a partir de una única copia inicial (Figura 3). Es importante insistir en que la amplifica-ción es específica, y exponencial, de forma que partiendo de una única copia del gen diana, en 35 ciclos obtendríamos 34.000 millones de copias iguales.
D
De
ette
ec
cc
ciió
ón
n d
de
e b
ba
ac
ctte
erriia
as
s p
prro
od
du
uc
ctto
orra
as
s
d
de
e ttiirra
am
miin
na
a
Como se ha visto en el apartado anterior, la presencia de bacterias con capacidad de producción de AB supone un problema para el consu-midor. Para intentar conseguir un método rápido y eficaz que nos per-mita detectar la presencia de estos organismos en los alimentos, se han diseñado los oligonucleótidos ceba-dores y se han optimizado las condi-ciones que permiten la amplificación específica de un fragmento interno del gen de la tirosina descarboxilasa (tdc). Este gen es un buen
candida-Fig. 6: Desarrollo de un sistema rápido de detección de fagos en leche mediante PCR. MW:
Marcador de peso molecular, 1: Control negativo, 2: _c2 (fago de la especie c2 de Lc. lactis), 3: _bIL170 (fago de la especie 936 de Lc. lactis), 4: _P335 (fago de la especie p335 de Lc. lactis), 5: _YAB (fago de Lb. bulgaricus subsp delbrueckii), 6: _OBJ (fago de St. thermophilus).
Fig. 5: Análisis de la producción de tiramina en el proceso de elaboración del queso. A) Análisis mediante HPLC del contenido (mg kg-1) en tirosina
y tiramina durante el proceso de elaboración. B) Detección por PCR de bacterias productoras de tiramina a lo largo del proceso de elaboración del queso MW: Marcador de peso molecular, a: leche cruda, b: cuajada, queso en distintas etapas de maduración (c: 3 días, d: 7 días, e: 15 días, f: 30 días, g: 60 días, h: 90 días), i: leche pasterizada, j: queso elaborado con leche pasterizada.
to ya que se encuentra muy conser-vado entre las distintas cepas pro-ductoras de tiramina (Fernández y cols., 2004). Esta técnica permite detectar, de forma específica, rápi-da, sencilla y barata, bacterias pro-ductoras de tiramina, aunque estén en muy baja concentración. Además, la reacción de PCR ha sido optimiza-da con éxito para poder detectar dichas bacterias en muestras de ali-mentos. Así, por ejemplo, se ha podido seguir su presencia en todos los pasos de elaboración (leche cruda, cuajada y distintas etapas del proceso de maduración) de quesos (Figura 5). Todas las muestras fue-ron paralelamente analizadas mediante HPLC y se pudo compro-bar que, aunque se llegaban a alcanzar concentraciones altísimas, de más de 2.000 mg kg-1 en el pro-ducto final, no se puede detectar tiramina en los pasos iniciales de la elaboración. En cambio, mediante PCR se detecta la presencia de cepas productoras en todos los pun-tos ensayados. Espun-tos resultados, junto con los de otros autores (Lonvaud-Funel, 2001), evidencian la necesidad de incluir la incapaci-dad de sintetizar AB como criterio de selección de los cultivos iniciadores. El procedimiento de PCR descrito también permite comprobar fácil-mente que las cepas seleccionadas para usar como fermentos en las industrias alimentarias, sean incapa-ces de sintetizar tiramina.
D
De
ette
ec
cc
ciió
ón
n d
de
e b
ba
ac
ctte
erriió
óffa
ag
go
os
s
Los bacteriófagos, también deno-minados de forma más sencilla como fagos, son la principal causa de retraso en las fermentaciones lácticas industriales (Josephsen y Neve, 1998). Estos virus, que no suponen ningún riesgo para la salud del consumidor, están frecuente-mente presentes en la leche de par-tida, provocando la lisis de las bacte-rias que componen los iniciadores y provocando cuantiosas pérdidas económicas en este sector. En cola-boración con la compañía CAPSA, se ha desarrollado un sistema de PCR que permite detectar bacterió-fagos en leche y así, poder destinar
la leche contaminada a productos no fermentados (Figura 6). Además, se han diseñado iniciadores específi-cos para los fagos de las distintas especies de BAL utilizadas como fer-mentos, de forma que podemos determinar con mayor precisión el uso final más recomendable de la leche analizada, en función, no sólo de la carga viral, sino también del tipo de bacteria que puede infectar los fagos detectados y por tanto del problema tecnológico que puedan provocar.
Hemos mostrado unos pocos ejem-plos de las posibles aplicaciones que la Biología Molecular tiene, en la actualidad, en una parcela muy con-creta de la Tecnología de los Alimentos. Esperamos que sean sufi-cientes para vislumbrar el enorme potencial que estas nuevas técnicas tienen para la industria alimentaria, la cual no debería permanecer ajena al desarrollo espectacular que la Biología Molecular ha tenido en los últimos 50 años, ni a sus aplicaciones futuras.
1.- Buesa, J., Collado, B., Lopez-Andujar, P., Abu-Mallouh, R., Rodriguez Diaz, J., Garcia Diaz, A., Prat, J., Guix, S., Llovet, T., Prats, G. y Bosch, A. (2002). Molecular epidemio-logy of caliciviruses causing outbreaks and sporadic cases of acute gastroenteritis in Spain. J. Clin. Microbiol. 40: 2854-2859. 2.- Fernández, M., Linares, D. M. y Alvarez, M.
A. (2004). Sequencing of the tyrosine decar-boxylase cluster of Lactococcus lactis IPLA 655 and the development of a PCR method for detecting tyrosine decarboxylating lactic acid bacteria. J. Food Protect. 67: 2521-2529.
3.- Josepsen, J. y Neve, H. (1998). Bacteriophages and lactic acid bacteria. En “Lactic Acid Bacteria. Microbiology and func-tional aspects”. Salminen. S. y Wright, S. A. (Eds.). Nueva York. pp: 385-436.
4.- Lonvaud-Funel, A. (2001). Biogenic amines in wines: role of lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 199: 9-13.
5.- Lopman, B. A., Brown, D. W. y Koopmans, M. (2002). Human caliciviruses in Europe. J. Clin. Virol. 24: 137-160.
6.- Martín, M. C. , Fernández, M., Martín-Alonso, J. M., Parra, F., Boga, J. A., y Alvarez M. A. (2004). Nisin-controlled ex-pression of Norwalk virus VP60 protein in
Lactobacillus casei. FEMS Microbiol. Lett. 237: 385-391.
7.- Martín, M. C., Alonso, J. C., Suárez, J. E. y Alvarez, M. A. (2000). Generation of food-grade recombinant lactic acid bacterium strains by site-specific recombination. Appl. Environ. Microbiol. 66: 2599-2604. 8.- Silla-Santos, M. H. (1996). Biogenic amines
and their importance in food. Int. J. Food Microbiol. 29: 213-231.
9.- White, P. A., Hansman, G. S., Li, A., Dable, J., Isaacs, M., Ferson, M., McIver, C. J. y Rawlinson, W. D. (2002). Norwalk-like virus 95/96-US strain is a major cause of gastro-enteritis outbreaks in Australia. J. Med. Virol. 68: 113-118.
