Practica2BioquimicaII

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Instituto Tecnológico de Tijuana

Bioquímica II

SERIE: IBQ4A

Laboratorio de Microbiología

Practica 2.- Técnicas de separación de biomoleculas:

cromatografía en capa fina

ANGUIANO MARTINEZ CAROLINA 10211500

FALCON GUTIERREZ MARIANA I. 10211507

VALENZUELA HERNANDEZ GUADALUPE 10211554

PROFRA. Dra. María del Socorro Heredia Ruiz

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Resumen:

En esta práctica se tienen una amplia variedad de aminoácidos, los cuales se colocaran en una prueba cualitativa llamada cromatografía en capa fina. Esta prueba tiene 2 fases: la primera es la fase estacionaria y la segunda es la fase móvil.

En la fase estacionaria se preparan los aminoácidos con una marca que diferencie a cada uno ya que estarán uno a lado del otro. Encima de la marca se colocará una gota pequeña del aminoácido.

Ahora se procede a comenzar con la fase móvil, en la cual se mojará un poco la parte inferior de la capa de celulosa con la fase móvil. Después de esto con un cordón asimilando a un tendedero se dejara colgando la capa de celulosa, entonces la fase móvil subirá hasta que llegue a una línea que antes se ha trazado.

Después se deja secar, o bien con la ayuda de una secadora de cabello se trata de quitar la humedad y el olor al solvente. Entonces, una vez seca la capa de celulosa se procede a atomizar con ninhidrina dicha capa, para después colocarla en una plancha o estufa cuidando que no se queme o se tueste.

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Índice

Pag.

Introducción………4

Antecedentes………6

Metodología……….7

Resultados………..12

Cuestionario………13

Conclusiones………...15

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1. Introducción:

Cromatografía en capa fina

En la cromatografía en capa fina, CCF o TLC se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partículas finas y distribuirse uniformemente en forma de láminas. Esto incluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc.) y orgánicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc.). La utilización de soportes hidrófobos facilita la separación de compuestos no polares (lípidos, por ejemplo). En la CCF, la fase estacionaria es una lámina de 0,25-0,50 mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o plástico. Aunque muchas casas comerciales suministran placas ya preparadas, éstas pueden hacerse en el laboratorio con aparatos especiales que permiten extender sobre la placa de vidrio o plástico la “papilla” formada por la suspensión del material en un disolvente adecuado (generalmente agua). La placa ha de dejarse secar antes de su utilización.

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que el solvente haya alcanzado un punto próximo al otro extremo de la placa, ésta se saca del tanque y se seca. Las manchas correspondientes a cada compuesto, si no son visibles, se pueden revelar mediante técnicas analíticas concretas. Se determina la posición de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente, calculándose el correspondiente valor de Rf. La detección de los compuestos una vez realizada la cromatografía se puede llevar a cabo en base a sus propiedades espectroscópicas, fluorimétricas, haciéndolos reaccionar con reactivos específicos, radioisotópicamente, etc. La identificación de tales compuestos se suele realizar comparando sus Rf con los de compuestos de referencia (patrones) de naturaleza química conocida. Alternativamente, los diferentes compuestos, una vez localizada su posición por un método no destructivo, pueden eluirse de la placa raspando las zonas correspondientes y extrayendo el polvo obtenido con un solvente adecuado. Uno de los factores más críticos en este tipo de cromatografías es la elección de la fase móvil, que, básicamente, suele estar formada por una mezcla de un solvente orgánico con agua y algunas sustancias adicionales tales cómo ácidos, bases, agentes acomplejantes, etc., cuya finalidad es aumentar o disminuir la solubilidad de algunos compuestos. Además de en una sola dirección, la CCF puede también realizarse bidimensionalmente. En este caso sólo se aplica una única muestra, que se dispone en uno de los vértices de la placa y se eluye dos veces, normalmente con solventes diferentes, y en direcciones perpendiculares. La CCF presenta una serie de ventajas respecto a cromatografías alternativas, como es la de papel, tales como las siguientes:

 Una mayor resolución, obteniéndose por lo general manchas más pequeñas.

 Una mayor velocidad de separación.

 Pueden utilizarse un gran número de materiales como soportes y disolventes.

 Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su recuperación es muy simple.

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2. Antecedentes

Técnicas de separación de biomoléculas

Las técnicas de separación y análisis de biomoléculas más comúnmente empleadas son la cromatografía y la espectroscopia de infrarrojo. La técnica de cromatografía permite separar, identificar y cuantificar los compuestos presentes en una muestra, tal es el caso de la cromatografía en capa fina, la cromatografía de líquidos de alta resolución y la cromatografía de gases. Las técnicas cromatográficas y espectroscópicas permiten conocer la composición química de las plantas y por ende pueden ser empleadas en diversas áreas de investigación, o bien para el control de calidad ya sea en industrias farmacéuticas o de los alimentos, entre otras.

Coeficiente de reparto

La distancia recorrida por un soluto en la dirección del flujo del disolvente durante una separación cromatográfica se caracteriza mediante el término valor de Rf, que se define como sigue:

distanciarecorrida por el soluto distanciarecorrida por el disolvente

Este valor es constante para un compuesto determinado bajo condiciones estándar, y refleja estrechamente el coeficiente de distribución del compuesto.

Cromatografía en capa fina

Esta técnica es especialmente útil para la separación de muy pequeñas cantidades de material. Se trata primordialmente de una cromatografía de adsorción, aunque pueden estar implicados otros efectos de reparto. Se recubre una lámina de vidrio con una delgada capa de un absorbente.

La muestra se aplica a la placa mediante una

micropipeta o jeringuilla, en forma de una mancha situada a unos 2.5 cm de uno de los extremos y por lo menos a igual distancia del borde. El disolvente se elimina de la muestra, posiblemente, mediante el uso de un secador, lo que permite la adición de una nueva cantidad de material si ello es necesario.

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mediante una placa de vidrio y se deja durante una hora, para asegurarse de que el ambiente interior del recipiente se sature del vapor del disolvente. Una vez ha tenido lugar el equilibrio, se quita la tapadera y la placa de capa fina se sitúa verticalmente, apoyándola sobre el fondo de la cubeta, introducida en el disolvente. Se vuelve a tapar el recipiente, y entonces tiene lugar la separación de los compuestos a medida que el disolvente asciende por la placa.

La determinación de valores de Rf en sistemas de capa fina no siempre es una guía fiable de la identidad de un compuesto, puesto que estos valores pueden variar. Por lo tanto, siempre que sea posible, se deben cromatografiar compuestos conocidos junto con la muestra.

3. Metodología:

1.-Se marca la hoja con números que indiquen el aminoácido y después se procede a poner pequeñas en cada marca.

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4. Resultados

Aminoácido d Aminoácido d

1. Glutamico 5 cm 8. L-serina 4.6 cm

2. Lisina 3.4 cm 9. Fenilalanina 14 cm

3. Alanina 10 cm 10. Leucina 15.3 cm

4. Glicina 5.5 cm 11. L-ácido

aspártico

4.8 cm

5. DL - Alanina 8.3 cm 12. Asparagina 2.5 cm

6. Prolina 10.4 cm 13. Metionina 11.8 cm

7. L- cisteína 6.8 cm 14. Muestra

problema

8.1 cm

dT = 20.9 cm

Rf = d dT

1. Rf = 20.95 = .23923 2. Rf = 20.93.4 = .16267

3. Rf = 20.910 = .47846 4. Rf = 20.95.5 = .26315

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7. Rf = 6.8

20.9 = .32535 8. Rf = 4.6

20.9 = .22009

9. Rf = 20.914 = .66985 10. Rf = 15.320.9 = .73205

11 .Rf = 4.8

20.9 = .22966 12. Rf = 2.5

20.9 = .11961

13. Rf = 11.8

20.9 = .56459 Muestra problema

14. Rf = 20.98.1 = .38756

La muestra problema es DL-Alanina

Comparación Rf de aminoácidos experimentales y teóricos

Rf de aminoácidos

Aminoácido Experimental Teórico Aminoácido Experimenta l

Teórico

1. Glutamico .23923 0.30 8. L-serina .22009 0.27

2. Lisina .16267 0.14 9. Fenilalanina .66985 0.68

3. Alanina .47846 0.38 10. Leucina .73205 0.73

4. Glicina .26315 0.26 11. L-ácido

aspártico

.22966 0.24

5. DL- Alanina .39713 12.

Asparagina .11961 0.5

6. Prolina .49760 0.43 13. Metionina .56459 0.55

7. L- cisteína .32535 0.4 14. Muestra problema

5. Cuestionario

1. Que naturaleza tienen las fases estacionaria y móvil empleadas? Con una fase móvil mas polar, la separación ¿sería mejor o peor?¿por qué?

La fase estacionaria es la celulosa del papel y la móvil una mezcla de disolventes orgánicos y agua.

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Eluyentes (fase móvil) más polares arrastran más fácilmente a los compuestos, es decir los compuestos "corren más" en eluyentes más polares. Por el contrario, mezclas de disolventes con poca polaridad desplazan los compuestos a través de la columna con mayor lentitud.

2. Describa la reacción de ninhidrina con los aminoácidos, y los colores obtenidos. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un oxidante energético que por una desaminación oxidativa de los aminoácidos conduce a la formación del aldehído correspondiente, con liberación de amoniaco, gas carbónico y formación de la ninhidrina reducida o hidrindrantina. La molécula de hidridantina, en presencia de otra de ninhidrina, condensa a través del amoniaco produciendo una estructura denominada indanona o púrpura de Ruhemann, manifestando un color entre azul y violeta intenso, excepto para la prolina, hidroxiprolina y en menor medida para la histidina que dan un color amarillento, porque no produce un grupo amino libre. NINHIDRINA + AMINOACIDO --- HIDRINDANTINA + ALDEHIDO + CO2+ NH3

HIDRINDANTINA + NH3 + NINHIDRINA --- COMPLEJO DE COLOR VIOLETA + AGUA

3. Podrían diferenciarse, por una cromatografía de este tipo, los 20 aminoácidos proteicos?¿qué es entiende por cromatografía en placa fina bidimensional?¿para que la emplearía?

Si pueden diferenciarse los 20 aminoácidos.

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separación de la mezcla en sus componentes.; se emplea para separar mezclas complejas.

4. La detección precoz de algunas enfermedades congénitas relacionadas con el metabolismo de aminoácidos se realiza por esta técnica, empleando una muestra de sangre. El caso más importante es la fenilcetonuria. Consultar el problema metabólico que origina la enfermedad y describir que observaríamos en la cromatografía de un suero fenilcetonurico.

Algunas enfermedades metabólicas congénitas dan lugar a la eliminación anormal de algunos aminoácidos en la orina (p ej fenilcetonuria).

En la cromatografía del suero fenilcetonurico para aminoácidos en sangre, observaríamos un aumento franco en la banda correspondiente a la fenilalanina, en comparación al estándar de 4 mg/dl

6. Conclusiones:

Conclusión Falcón Gutiérrez:

En esta práctica pudimos aprender como hacer una cromatografía en capa fina, y ya que no había mucho equipo, tuvimos que hacer la práctica todos juntos.

Las intensidades y las longitudes de las manchas se pudieron deber a:

• Que algunas gotas no eran muy pequeñas y quedó muy mojado el papel. • Algunos aminoácidos eran muy pesados y al momento del arrastre no pudieron moverse mucho.

• Pudo haber mezcla de aminoácidos, nadie puede asegurar que fueran aminoácidos 100% puros.

Nuestro aminoácido problema resultó ser alanina, ya que sacamos el Rf de cada aminoácido que teníamos, resultando el Rf de la alanina con el cual encajaba muy bien.

Conclusión Valenzuela Hernández María Guadalupe:

En este experimento se observó como sucede una cromatografía en capa fina utilizando aminoácidos. En una placa fina de celulosa se añadió diferentes

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Rf de cada aminoácido. La muestra problema obtuvo un valor muy parecido al de DL- Alanina por lo tanto se concluyó que es ese aminoácido.

Conclusión Anguiano Martínez:

La técnica de cromatografía en capa fina es de las más simples para la

determinación de aminoácidos, además de que nos permitió observar la reacción producida por medio de la ninhidrina que la reacciona con el grupo α–NH2 de los aminoácidos produciendo una coloración morada; pero la prolina al no tener grupo tener NH2 libre sino nomas –NH- da un color amarillento.

Pudimos observar como a partir de la fase estacionaria que era la hoja de celulosa y la fase móvil que era el eluyente, el comportamiento de los aminoácidos y al estar investigando nos dimos cuenta que entre más arrastre tenía el aminoácido en la hoja por el eluyente significaba que era mas polar.

7. Bibliografia

1. Bryan, L., Keith, W. (1981). Principios y técnicas de bioquímica experimental. España: Omega

Páginas de internet

1. Rodriguez, M.(s.f) Introducción a las técnicas de separación y análisis de

biomoléculas.

Recuperado el 26 de septiembre del 2012, de

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