COMPOSICIONAL DE MATERIAL LIGNOCELULÓSICO BASADO EN UN ESTUDIO NIR USANDO PLS
Proyecto de Grado Por
JUAN MANUEL RIVERA ARAGON
Presentado a la Oficina de Estudios de Pregrado de la Universidad de los Andes
En cumplimiento parcial de los requisitos para el título de
INGENIERO QUÍMICO
Asesor:
ROCÍO SIERRA RAMÍREZ, M.Sc, Ph.D
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA BOGOTA D.C
2012
ESTUDIO NIR USANDO PLS Proyecto de Grado
Por
JUAN MANUEL RIVERA ARAGON
____________________________________________ ROCÍO SIERRA RAMÍREZ, M.Sc., Ph.D
Asesor
_____________________________________________ WATSON VARGAS, M.Sc., Ph.D
Jurado
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA BOGOTA
ABSTRACT
Desarrollo de un método rápido para el análisis composicional de material lignocelulósico basado en un estudio NIR usando PLS
Juan Manuel Rivera Aragon, Universidad de los Andes, Colombia. Advisor: Rocío Sierra Ramírez, M.Sc., Ph.D.
This study develops a method to establish lignin concentration in pulverized samples of biomass using Near InfraRed(NIR) spectroscopy based on the Partial Least squares method (PLS). To achieve this, 73 samples of pulverized lignocelluloses (particle size <0.152 mm)in a wide spectrum of lignin concentrationwere obtained by compositional changes in two types of sugar cane done by pretreatments with sodium hydroxide(NaOH 1 and 2% w/w) in temperatures between 50 y 100°C for different periods of time (15 to 120 min).Then, lignin concentrations between 0.3 and 40% (w/w) were determined in the samples applying traditional hydrolysis methods to the 72 samples, and spectra of each sample were obtained using the NIR equipment to build a calibration curve that allows the prediction of lignin in samples of unknown composition. Finally the calibration curve was proved to be valid experimentally obtaining errors below 3%.
RESUMEN
Desarrollo de un método rápido para el análisis composicional de material lignocelulósico basado en un estudio NIR usando PLS
Juan Manuel Rivera Aragon, Universidad de los Andes, Colombia. Advisor: Rocío Sierra Ramírez, M.Sc., Ph.D.
En el presente estudio se desarrolla un método analítico rápido que busca establecer una curva de calibraciónque sirva para estimar concentraciones de lignina en muestras pulverizadas de biomasa, utilizando un equipo de espectroscopia de Infrarrojo cercano (NIR por sus siglas en inglés) usando el método de mínimos cuadrados parciales (PLS por sus siglas en inglés). Para esto 73 muestras de lignocelulosa pulverizada (tamaño de partícula < 0.152 mm) en un rango de concentraciones de lignina entre 0.3 y 40 %. Para obtener estas muestras, se usaron dos tipos distintos de caña de azúcar (joven y madura), que fueron sometidos areacciones en medio alcalino (NaOH al 1 y 2% w/w), denominadas “pretratamientos”, los cuales se desarrollaron en condiciones diversas de temperatura (entre 50 y 100°C) y tiempo (entre 15 y 120 minutos) con lo cual los contenidos de lignina se variaron de manera importante. El contenido de lignina de la caña modificada se determinó usando un método primario consistente en una hidrólisis ácida en dos etapas (concentrada y diluida). De las 73 muestrasobtenidas, 25 fueron incluidas en la curva de calibración, que se calculó usando dos software: VISION y Unscramble X. La validación de la misma, resultó en errores estadísticos menores al 3%, lo cual es un resultado satisfactorio para los alcances de este proyecto.
CONTENIDO
Pagina
ABSTRACT ... iii
RESUMEN ... iv
CONTENIDO ... v
LISTA DE FIGURAS ... vii
LISTA DE TABLAS ... ix
I INTRODUCCION Y ESTADO DEL ARTE ... 1
II OBJETIVOS ... 9
2.1. Objetivo general ... 9
2.2. Objetivos Específicos ... 9
III METODOLOGIA ... 10
3.1 Molienda y Tamizado de Caña de azúcar...……….……… 10
3.2.Pretratamientoy secado de muestras ... 10
3.3. Determinación de espectrogramas……….……. 11
3.4. Método de referencia primario………. 11
IV RESULTADOS Y ANALISIS………. 13
4.1 Análisis estadístico del modelo desarrollado con espectrofotometría NIR……… 13
V CONCLUSIONES ... 35
VI RECOMENDACIONES Y TRABAJO A FUTURO ... 37
REFERENCIAS ... . 38
APENDICE ... 40
APENDICE A. Concentración de lignina de las muestras analizada-………. 40
APENDICE B. Datos para el cálculo de coeficientes estadísticos………. 42
APENDICE C. Datos para el calculo de lignina por muestra…...………. 43
APENDICE D . Fotos de muestras sometidas a hidrólisis……….. 45
APENDICE E. Metodologia del proyecto……….. ……….. 46
LISTA DE FIGURAS
FIGURA Pág.
1. Molecula de lignina. ... 6
2. Metodologia Hidrolisis ... 12
3. Espectro obtenido muestra No. 61 ... 14
4. Espectro obtenido muestra No 61 y 10 ... 15
5. Espectros obtenidos muestra No 7 ... 15
6. Espectros obtenidos de 4 muestras diferentes ... 16
7. Espectros de muestras escogidas para curva de calibración ... 19
8. Filtro de segunda derivada ... 20
9. Espectros de muestras escogidas con filtro de segunda derivada ... 20
10. PLS en el software VISION ... 22
11. “Cross Validation” (Validación Cruzada). ... 23
12. Resultados estadísticos de las pruebas de validación cruzada en VISION. 24 13. Quantitative Analisis en VISION ... 25
14. Curva de Validacion ... 25
15. Pre procesamiento de muestras en Unscrambler X ... 29
16. Espectros en Unscrambler sin Filtro ... 29
17. Organización de datos en Unscrambler ... 30
18. PLS en el software Unscrambler ... 31
20. Grafica de Scores ... 32
21. Grafica Predicho vs Calculado (Calibración y Validación) ... 33
22. Grafica Predicho vs Calculado (Calibración) ... 33
LISTA DE TABLAS
TABLA Pág. 1. Concentración de lignina de las muestras de la curva de calibración ... 12 2. Muestras preparadas ... 18 3. Coeficientes estadísticos ... 25
I. INTRODUCCION Y ESTADO DEL ARTE
Debido a los problemas ambientales que afronta el planeta hace varios años y debido al creciente precio de los combustibles fósiles, se ha vuelto indispensable producir un tipo de combustible que no afecte el medio ambiente, que sea más económico y a base de una materia prima asequible.
En el mundo se producen 200 billones de toneladas de biomasa lignocelulósica al año(asocaña), lo cual la hace la materia prima renovable más abundante del planeta. Este recuso puede ser transformado biológica o termoquímicamente en combustible y se ha convertido en una de las soluciones más prometedoras para la crisis ambiental actual. Además, considerando que según Asocaña, en Colombia se producen más de 3500 toneladas de caña al año, Colombia se convierte en uno de los países donde más atención se le presta a esta alternativa (asocaña).
Sin embargo, uno de los factores que más afecta el proceso biológico de producción de biocombustible a partir de la biomasa es el contenido de lignina. La lignina es el constituyente intercelular de las células fibrosas de los vegetales que dan rigidez al tallo de las plantas, por lo que es el segundo elemento en importancia en su composición (Palermo). La caña de azúcar contiene un alto nivel de hidratos de carbono estructurales y específicamente cuenta con un contenido de lignina de aproximadamente 20% (Producción Animal, 2009). Dicho compuesto bloquea el acceso de enzimas a la
fracción de carbohidratos de la biomasa, es decir que inhibe la digestibilidad de estas, por lo que es necesario someter la caña a pretratamientos químicos como el pre tratamiento alcalino con hidróxido de sodio, con el fin de alterar o remover la lignina. Es indispensable contar con datos acerca del pretratamiento para obtener modelos cinéticos que permitan la optimización, control y diseño de esta etapa, que es una de las más costosas en el proceso de producción de biocombustibles (Sierra 2011).
Pretratamientos de la Caña de azúcar
El pretratamiento realizado a la caña para su proceso de producción de combustible se realiza de diversas maneras químicamente logrando degradar los carbohidratos y aumentando el nivel de la digestibilidad de la celulosa y la hemicelulosa de manera que se logre la exitosa fermentación de la caña para la producción de alcoholes.
Dentro de los variados pretratamientos que se pueden realizar, existe el alcalino. Este es bastante llamativo por ser económico y efectivo donde una solución de cal y peróxido de hidrogeno solubilizan los compuestos no deseados de la caña (Sierra, 2011). También hay dos tratamientos altamente utilizados los cuales consisten en una hidrólisis enzimática, y un tratamiento con amoniaco acuoso. Mediante la hidrólisis enzimática se cambia la estructura de la biomasa a tratar mediante enzimas altamente selectivas, sin embargo este proceso requiere de un tratamiento acido anterior el cual, aunque es bastante efectivo, es altamente corrosivo (Domínguez, 2012). Por el otro lado, la caña
suele tratarse con amoniaco líquido buscando principalmente la degradación de la lignina en su estructura.
Aunque es relativamente fácil obtener muestras pretratadas, es complicado establecer los efectos del pretratamiento debido a lo tedioso y largo de los protocolos de análisis composicional. Más aún, para poder modelar esta etapa apropiadamente, es indispensable realizar un gran número de corridas experimentales de muestras que luego deben ser analizadas. Tradicionalmente, el análisis composicional de lignocelulosa (pretratada o no), se logra a través de su fraccionamiento en una hidrólisis ácida que se lleva a cabo en dos etapas: concentrada y diluida. Como resultado de este proceso la lignina queda condensada en la fase sólida y puede cuantificarse gravimétricamente, mientras que los carbohidratos quedan solubles en la fase líquida y se cuantifican midiendo su concentración. Este protocolo normalmente toma entre 5 y 8 horas para ser completado y requiere uso intensivo del ácido.
Por lo anterior, es indispensable la búsqueda de un método alterno para el análisis composicional de material lignocelulósico de una forma más rápida y eficaz. Entre varias alternativas existentes, hay una posibilidad de hacer el análisis con el método de espectroscopia de Infrarrojo Cercano (NIR por sus siglas en inglés), usando el método de los mínimos cuadrados parciales (PLS por sus siglas en inglés).
Después de haber descubierto la región del infrarrojo cercano estudiando la luz solar en 1800, se descubrió como ciertos elementos como el plomo eran sensibles para la luz en esta región. Así, la técnica de la espectrometría conto con un detector sensible que facilito la fabricación de espectofotometros específicos para esta región del espectro electromagnético(cañas, 2009)..
Ya en 1954 se comenzaron a presentar espectros de compuestos orgánicos en la segunda mitad del intervalo asignando bandas a grupos funcionales específicos. De esta forma en los Estados Unidos se impulsa el uso de la espectroscopia NIR en ciertas investigaciones logrando convertirla en una técnica llamativa para varios sectores (cañas, 2009).
El análisis de la caña de azúcar ha pasado por varios métodos a través de los años. El primer método reportado para la medición de la densidad del jugo de caña se logro con el hidrómetro brix, pasando luego a la polarimetría donde se logra encontrar el porcentaje de sacarosa. Finalmente, no fue sino hasta 1998 cuando ingenieros azucareros de la Florida desarrollaron la ecuación que predijo valores para el análisis del jugo de caña(cañas, 2009)..
En la actualidad, la aplicación de la espectrometría NIR permite el ahorro de tiempo y químicos para determinar la calidad de la caña de azúcar mediante la determinación de
sólidos y sacarosa presentes en el jugo de caña. Sin embargo la mayoría de estudios y aplicaciones de la técnica se hace en fases liquidas.
La espectrometría de infrarrojos NIR utiliza la región infrarroja del espectro electromagnético y está basado en el hecho que los enlaces químicos de las sustancias tienen frecuencias de vibración únicas debido los niveles de energía de cada molécula. De esta forma, cuando una molécula recibe luz esta es absorbida o no dependiendo de la energía de cada vibración; durante esta oscilación los rayos generan un cambio en el momento dipolar de la molécula para que aparezca en el espectro infrarrojo (Espectrometría).
La espectrometría de infrarrojos NIR también es utilizada con frecuencia en estudios de química orgánica para hacer un riguroso análisis composicional de compuestos conformados por enlaces covalentes. En la actualidad es una herramienta de alta importancia en medidas de alimentos y se aplica para inspección de calidad dado que tiene gran ventaja sobre métodos analíticos físicos y/o químicos. En especial se utiliza NIR ya que cuenta con bandas de absorción que usualmente corresponden a 3 enlaces químicos en específico, el C-O, C-H y N-H, dos de los cuales conforman la molécula de lignina. Otros enlaces también se evidencian en algunas bandas pero suelen ser muy débiles para considerarse en el análisis composicional (Wang, L., Liu, H. 2012).
Figura 1. Molecula de lignina (Palermo, P)
Regresión de mínimos cuadrados parciales PLS.
La regresión de mínimos cuadrados parciales PLS es un algoritmo iterativo que extrae características latentes de un espacio dimensional alto y combina características del Análisis de Componentes Principales y Análisis de Regresión Múltiple (Saigo, H., Kramer, N). La regresión PLS es utilizada en la ciencia y usualmente en quimiometria para el cálculo de concentraciones y otras propiedades de compuestos, ya que depende de cálculos matriciales elementales. A diferencia de la regresión de Componentes Principales(PCR) utiliza datos X como matriz predictora (matriz nxp de variables predictoras) y una matriz Y de variables respuesta (matriz nxp de variables dependientes) (José Vega).
Considerando un planteamiento general del procedimiento PLS se establece como se modela la relación entre los 2 bloques de variables X y Y mediante vectores latentes que
maximizan la covarianza entre los dos conjuntos de variables (Kramer). De esta manera se pueden observar n datos de cada bloque de variables y el método PLS descompone la matriz (n x N) de variables X y la matriz (n x M) de variables Y en la forma:
(1) (2)
Donde:
• T y U son matrices (n x p) de los p vectores latentes para cada variable. • P y Q matrices (N x p)/(M x p) de CARGAS para cada variable.
• E y F matrices (n x N)/(n x M) de residuos para cada variable.
El método clásico PLS basado en el algoritmo NIPALS (por sus siglas en ingles) calculas vectores peso w y c tal que:
(3)
Donde cov(t, u) = tTes la covarianza entre los vectores latentes t y u. El algoritmo comienza con una inicialización aleatoria del espacio del vector latente uy repite 6 pasos de iteración hasta que el resultado converge (Kramer). Aplicado al caso de predicción de lignina a partir de los espectros NIR se puede aplicar la la ley de Beerpara obtener la relación entre la absorbancia A, la longitud de onda λ, el grosor de la celda d y el coeficiente de absorción molar ε (Otto, 1999):
E + TP = X T +
=UQ F
Y T
(4)
Entonces, asumiendo las absorbancias a una longitud de onda i son como la suma de las absorbancias de cada uno de los m componentes individuales se obtiene:
(5) (6) Donde:
• a representa cada espectro y es un vector (p x 1) • K matriz (p x m) de absortividades molares • c vector de concentraciones (m x 1).
c ε A = d
=
j ki1c1+ki2c2+...+kimcm
A
c k
II. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Desarrollar un método para el análisis composicional de material lignocelulósico basado en análisis de NIR usando PLS que sea aplicable de manera económica, rápida y eficiente a un gran número de muestras.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obtener 72muestras de lignocelulosa pulverizada en un amplio espectro de concentraciones de lignina y carbohidratos a través de cambios composicionales de dos tipos distintos de caña de azúcar, logrados a través de pretratamientos con hidróxido de sodio.
Determinar los contenidos de lignina en las 72 muestras a través de los métodos de hidrólisis tradicionales y obtener espectros mediante el equipo NIR para construir una curva de calibración que permita predecir la concentración de lignina de muestras de composición desconocida.
III. METODOLOGIA
3.1 Molienda y Tamizado de Caña de azúcar
Para el proyecto se contó con 2 tipos de caña de azúcar (joven de aproximadamente 6 meses y madura de 12 meses). El primer paso fue secar los palos de caña en un horno a una temperatura que no superara los 35ºC. Posteriormente se molió la caña en una licuadora por 4 min aproximadamente para luego pasar el material a una moledora de café. Se realizó este procedimiento hasta obtener 1 kg de material de cada tipo de caña. Finalmente se molió cada muestra de caña en un molino industrial para luego ser tamizada;el proceso de molienda fue repetido hasta obteneraproximadamente 650 g de cada caña con el tamaño de partícula apropiado (+100 Thylermesh que equivale a un tamaño de partícula<0.152 mm).
3.2. Pretratamientoy secado de muestras
El material se separóen 36 grupos de muestras por tipo de caña (madura y joven) obteniendo 72 muestras en total (Ver fotos en el Anexo 1). Se tomaron subgrupos de 6 muestras de cada caña (muestras de 10 a 12 g), para ser sometidos a una temperatura y tiempo diferente en frascos schottde 250 ml con10 ml de hidróxido de sodio por gramo de biomasa. El hidróxido de sodio utilizado se preparo a dos concentraciones: una concentración de 1% (w/w) se usopara una caña y 2% (w/w) para la otra. Las temperaturas a usar fueron: 50, 60, 70, 80, 90 y 100°C y los tiempos de pretratamiento
fueron: 15, 30, 45, 60, 75, y 90 min.Fue necesario el uso de gafas y guantes para la manipulación de los químicos ya que el hidróxido de sodio puede ser irritante para la piel mucosa y ojos. Finalmente las muestras se secaron en un horno a una temperatura máxima de 35°C, se pulverizaron de nuevo y se rotularon con números del 1 al 72.
3.3. Determinación de espectrogramas
A cada una de las muestras utilizadasen la curva de calibraciónfue necesario determinarle un espectro utilizando la pistola del equipo NIR la cual dispara rayos infrarrojos. Para la medición se lleno a tope la copa de medición del equipo con la muestra. De esta manera, se logró construir espectros de las 72 muestraspretratadas para posteriormente crear una librería en el software del equipo donde se guardaron estos. Una vez se cree la librería, se realizó un análisis cuantitativo utilizando PLS y se modificaron diferentes parámetros matemáticos a partir de los datos de referencia de la hidrólisis ácida (el método de referencia seleccionado) para obtener los datos de concentración de lignina deseados. Es de suma importancia siempre rotular las muestras de 1 a 72.
3.4. Método de referencia primario
Fue necesario determinar los contenidos de lignina y carbohidratos de las muestras que van a formar parte de la curva de calibración. La medición las concentraciones se realizó a través del fraccionamiento de la biomasa en una hidrólisis ácida que se lleva a cabo en dos etapas: c
muestra en un tubo de ensayo con 3 mL de ácido sulfúrico 72%(w/w) y se someten a un baño de maría a 30°C por una hora. Posteriormente las muestras son diluidas en un frasco de 250 mL agregándoles 54 mL de agua y son sometidas a un proceso de autoclave durante otra hora a 121°C. Finalmente se filtra cada muestra y se observa que la lignina queda condensada en la fase sólida y puede cuantificarse gravimétricamente, mientras que los carbohidratos, solubles en la fase líquida, se pueden cuantificar midiendo su concentración.
IV. RESULTADOS Y ANALISIS
4.1 Análisis Composicional de Lignina y Azucares
En la Tabla 1 se presenta la composición de las muestras de biomasa utilizadas para calcular la curva de calibración.
Tabla 1. Concentración de lignina de las muestras de la curva de calibración No. De Muestra Contenido de lignina (%) Comentario
SIN PRETRATAR (15-30)*
1 10.17 C
2 14.17 C
5 9.00 C
8 17.00 C
12 10.50 C
13 14.33 C
19 10.33 C
22 4.00 C
26 0.33 C
30 7.00 C
34 12.33 C
36 5.33 C
39 15.00 C
42 18.67 C
45 21.83 C
54 19.33 C
55 11.67 C
58 14.50 C
60 9.00 C
61 7.00 C
62 15.17 C
63 3.33 C
65 10.33 C
* Resultado obtenido de revisión de literatura (Sierra, 2008)
En las 73 muestras analizadas (Anexo 1) se observa que el contenido de lignina varía desde 0.3% a 40% y que, a diferencia de ciertas muestras, los contenidos de lignina difieren, lo cual evidencia el éxito del pre tratamiento realizado con hidróxido de sodio. Por otro lado, en algunos casos resulta evidente la agresiva degradación de la lignina durante el pre tratamiento, ya que la caña de azúcar usualmente cuenta con un alto contenido de este compuesto (aproximadamente el 20% le provee su rigidez).
Conjuntamente, se logró obtener espectros con el quipo NIR de las 73 muestras de biomasa. A continuación se muestran figuras algunos de espectroselaborados por el software que utiliza el equipo de rayos infrarrojo:
Figura 3. Espectro obtenido muestra No. 61
Figura 4. Espectro obtenido muestra No 61 y 10
Para disminuir el error y corroborar que cada espectro obtenido era correcto, se tomó una réplica de cada muestra. En caso que hubiera mucha diferencia entre los resultados de la misma muestra se repetía la toma de datos.
Figura 5. Espectros obtenidos muestra No 7
En la Figura 5 se confirma que el dato tomado de la muestra 7 es correcto debido a la poca diferencia entre los espectros. Igualmente, para ver la precisión de los resultados, el software permitió agrupar varias muestras en una sola gráfica.
Figura 6. Espectros obtenidos de 4 muestras diferentes
Según las figuras 3-6 se observa que la relación entre longitud de onda y absorbancia sigue la misma tendencia en todas las muestras indicando alta precisión. Además, se evidencia la diferencia entre ellas indicando variación en la composición de las muestras como se esperaba después de hacer el pretratamiento alcalino.
En la Tabladel anexo 1se muestran los promedios de contenido de lignina después de determinar las concentraciones mediante hidrólisis acida a una replicas por muestra. Sin embargo un gran número de muestras tuvieron que ser descartadas para la construcción de la curva de calibración de lignina por diferentes factores que se indican en la columna de comentarios de la tabla.
Las muestras con el comentario “R” son aquellas cuyas replicas difieren considerablemente en su porcentaje de lignina o alguna de las réplicas se dañó en el laboratorio durante el proceso de hidrolisis de manera que no fue confiable tomarlas en cuenta para realizar la curva de calibración. En el caso de las muestras con comentario “F”, no se tomaron en cuenta para cálculos de la curva ya que son su resultado excede los límites de contenido de lignina reportados en la literatura (alrededor de 20-30%), de hecho, la muestra 49 es bagazo sin pretratar por lo que no tendría sentido que muestras pretratadas superaran el 25-30% de lignina.
Para el resto de muestras se determinó que eran resultados confiables para la realización de la curva debido a que sus réplicas presentaban resultado similar (1% a 2% de diferencia). Sin embargo era necesario que las muestras siguieran una tendencia de acuerdo sus espectros correspondientes obtenidos con el equipo NIR.
Según literatura y estudios anteriores, se ve una tendencia descendente en los espectros a medida que aumenta el contenido de lignina en la biomasa, es decir que el espectro de
una muestra con menos lignina debe verse superior al de una muestra con más lignina si se ponen en la misma gráfica (Castro 2012). Siguiendo esta idea, al analizar los espectros y su porcentaje de lignina correspondiente se tuvo que reducir la población para la realización de la curva a 24 muestras cuya tendencia concentración/espectro tuviera sentido. Una vez escogidas las muestras, un tercer proceso de hidrólisis acida se le aplicó a estas para corroborar definitivamente la concentración de lignina determinada anteriormente. De esta forma, en la Tabla 1 se evidencia con una letra “C” las muestras utilizadas para la curva de calibración y en el Anexo 1 con una letra “N” aquellas que no tenían sentido con sus espectros correspondientes.
También para obtener una curva más robusta, se prepararon un grupo de muestras adicionales agregándoles lignina extraída con hidrólisis de ellas mismas. Estas muestras se dispararon con a pistola del equipo NIR para obtener sus espectro y se les determino la lignina por medio del método experimental establecido, sin embargo, solo se utilizaron 3 que concordaban según la tendencia de los espectros para tener un total de 27 muestras en la curva de calibración.
Tabla 2. Muestras preparadas
No. De Muestra Contenido de lignina (%) Comentario
1* 7.33 C
2* 8 C
Figura 7. Espectros de muestras escogidas para curva de calibración
Para trabajar los espectros se contó con el software VISION del equipo NIR el cual cuenta con las herramientas necesarias para hacer el análisis estadístico. De esta manera, en primera instancia se realizó un filtro (pretratamiento matemático de segunda derivada) donde se pudo identificar las zonas de variación por componente.
Según datos reportados en la literatura se pudo establecer las zonas específicas en donde se cuantifican los grupos funcionales de la lignina según su longitud de onda como se muestra a continuación. De esta forma se pudo acotar cada espectro a una región de longitud de onda entre 1100nm y 1550nm donde se evidenciaba una mejor organización de estos para obtener un resultado de medición adecuado de la curva de calibración (el equipo trabaja un rango de 1100 nm a 2500 nm). Así, se logró una señal con menor ruido por tamaño de partícula (Brereton, 2007).
Figura 8. Filtro de segunda derivada
Figura 9. Espectros de muestras escogidas con filtro de segunda derivada 1170
C-H 2do. Sobretono (lignina)
1365 O-H 1er. Sobretono
(lignina) 1496Grupo hidroxílo fenólico (lignina)
Antes de aplicar la regresión de mínimos cuadrados parciales, fue de suma importancia pre procesar matemáticamente los espectros. Los diferentes programas que tratan estos cuentan con técnicas de pre procesamiento de manera que se pueda reducir el efecto de cambios físicos en el espectro (cambios por tamaño de partícula), separar picos que puedan causar ciertas fluctuaciones en las absorbancias estándar del espectro y reducir la complejidad de la variabilidad de los espectros. Para comenzar, aunque se realizo un proceso de tamizado y molienda para garantizar un tamaño de partícula mínimo y uniforme, se busco evitar cualquier afectación de este factor en la dispersión de la luz del equipo ya que cambios en el tamaño de partícula afectan la cantidad de luz que se absorbe por la biomasa (hay mayor dispersión y reflexión de la luz en partículas más pequeñas) (Hayes 2011).
Por ende, utilizando la herramienta “apply math” del VISION se realizo pre procesamiento de primera, segunda y tercera derivada de los espectros. En nuestro caso, el filtro de segunda derivada representa una medida de la curvatura del espectro original en cada punto. De esta manera se logra mantener la intensidad de banda y la ubicación de cada pico del espectro original de manera que se interpreta el espectro de manera visual con más facilidad que un filtro de primera derivada. Además, se reduce la superposición de las bandas de absorción lo cual puede generar ruido en el espectro, un error común al trabajar sólidos con NIR (Hayes 2011).
El filtro de tercera derivada suele ser utilizado como reemplazo a un filtro de primera derivada donde se reduce el efecto de desplazamiento de línea base del espectro y se obtienen picos correspondientes a puntos del espectro sin tratamiento con una pendiente máxima (Hayes 2011). Este pretratamiento de las muestras resulto en el rechazo de 2 de las 27 muestras por parte del software lo cual redujo la población a 25.
Una vezpre procesadas las muestras, se utilizo el código implícito en el software VISION necesario para aplicar la regresión de mínimos cuadrados parciales. De esta forma, mediante la herramienta “regressionmethod” se aplica el modelo de la regresión PLS.
Por otro lado, fue necesario someter el modelo a un proceso de validación cruzada con el cual se pueda garantizar el mejor ajuste de los datos en la regresión y donde se corrobora que el modelo no está sobre equipado de manera que se pueda aplicar con confianza a muestras desconocidas.
Figura 11. “Cross Validation” (Validación Cruzada).
Con el método de validación cruzada se seleccionan muestras nombradas “muestra de validación” y otras muestras denominadas “muestras de entrenamiento” o “muestras de calibración”. De acuerdo a esto, el software aplica el modelo de la regresión PLS y muestra los resultados estadísticos con respecto a la validación escogida.
En nuestro caso, después de varios intentos se seleccionaron 8 muestras de validación de manera que resulto un error estándar de calibración bajo, un valor de suma de cuadrados de predicción (PRESS) mínimo, un mayor número de factores de carga en la regresión y un coeficiente de correlación (R2) más cercano a 1. A continuación se muestra la figura con los resultados obtenidos.
Figura 12. Resultados estadísticos de las pruebas de validación cruzada en VISION
En la figura 12 se evidencia como se cuenta con 4 factores (Variables latentes) con los cuales garantizan una reducción del error de predicción. Ademas mediante la herramienta de analisis cuantitativo del software VISIONse obtuvo la curva de valores de lignina predecidos por el equipo NIR contra valores determinados en el laboratorio mediante hidrólisis.
Figura 13. Quantitative Analisis en VISION
Figura 14. Curva de Validacion
Por ultimo, se calcularon los coeficientes estadisticos mas relevantes en la regresion: Tabla 3. Coeficientes estadísticos
Coeficiente Valor
SSres 208.3036697
SStot 196.1622
SSregr -12.1414
MS regr -2.428284
MS res -0.758838
r2 0.83
T test (correlación) 10.36396472 Error de calibración estándar (SEC) 1.95
Error de validación estándar (SVC) 3.02 Error de predicción EP 9.92405448
BIAS -0.0008619 error de predicción estándar SEP 3.228042197
Root Mean SEC 1.396424004
Root Mean SVC 1.73781472
Root Mean Square EP 3.150246733
PRESS 155.8
Para el caluclo de los datos estadisticos se utilizaron los resultados arrojados por el programa VISION y las siguientes formulas:
(7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14)
N 1 i 2 res = (yi yˆi) SS
N 1 i 2 tot = (yi yi) SSres tot
regr =SS SS
SS 1 regr regr A SS MS 1 regr res A N SS MS 2 ) 1 ( 2 N r r t
N 1 i 2 ) ˆ ( = N y yEP i i
N 1 i ) ˆ ( = N y y(15)
En primera instancia, para confirmar que los datos estadisticos tienen sentido se comprueba que:
(16)
Obteniendo que:
En la figura 13se ven en color amarillo las muestras de validacion y en azul aquellas de calibracion, tambien se muestra como, del set predecidas por el equipo NIR, solo 2 se podrian despreciar según su ajuste al eje x=y. Otro factor que corrobora el sentido de los resultados es el hecho de que la suma de cuadrados de los residuales calculada es similar a la que arroja el programa. La suma de cuadrados de la regresión nos indica que tan alejados están los valores del laboratorio de la media de los valores predichos por el modelo y se puede decir que es un valor aceptable considerando el método de referencia primario y las posibles variaciones en los espectros al trabajar con muestras solidas. Así mismo el pequeño valor de la media de suma de cuadrados de residuales indica que la línea de regresión si se ajusta de buen modo a los datos. También es importante resaltar que el factor de correlación r2 es cercano a uno lo cual evidencia un buen ajuste de estos
N 1 i 2 1 ) ˆ ( = N BIAS y ySEP i i
2 2
2
BIAS RMSEP
SEP
92 . 9 42 . 10
y los bajos valores que toman los errores demostrando que el modelo es apropiado y confiable.
Sin embargo, aunque se podria concluir que ya se obtuvo un buen modelo de prediccion se quizo profundizar en el analisis estadistico repitiendo el mismo utilizando el programa Unscrambler X por lo siguiente:
• Realiza un preprocesamiento de los espectros de cuarta derivada lo cual hace que la locacion de mas picos se vean mas claros con minima o casi nula sobrepocision de estos. Este tratamiento es de alta utilidad para resolver bandas de absorcion muy estrechas y para evitar posibles lobulos laterales en las bandas de interes (Hayes 2011). • Cuenta con el pretratamiento de derivada de S-Golay donde se escoge un segmento de las muestras y se les ajusta un polinomio hasta de orden 12 usando minimos cuadrados el cual ajusta aun mas los datos, se logra una estimacion menos distorcionada de la derivada que las que usa el software anterior(Hayes 2011).
• Metodo de pretratamiento de SNV (por sus siglas en ingles) e cual hace una autoescala de las filas en ves de las columnas para evitar dispersion(Hayes 2011).
Figura 15. Pre procesamiento de muestras en Unscrambler X
Con esto se busca hacer un analisis estadistico diferente con una herramienta alterna para comparar los resultados de la curva y verificar una ves mas que el modelo es confiable. Para comenzar, se exportaron los datos espectrales de VISION a excel para poder ser importados por Unscrambler X. Luego, se graficaron los espectros.
Paso a seguir se hicieron sets de filas para Validacion y Calibracion (se utilizaron las mismas muestras que en VISION para cada set) y dos sets de columnas, 1 (color café) donde se asignaron los valores de lignina obtenidos en el laboradorio y otro llamado Analisis que toma los datos de los espectros dentro del rango utilizado en VISION (1100 nm – 1550 nm).
Figura 17. Organización de datos en Unscrambler
Luego mediante las herramientas de analisis del programa se aplico la regresion de minimos cuadrados parciales y al igual que en VISION se realizo una validacion cruzada.
Figura 18. PLS en el software Unscrambler
Figura 19. Validación cruzada en el software Unscrambler
Los resultados en el software son gráficos en su mayoría y primero se obtiene la grafica de Scores.
Figura 20. Grafica de Scores
La figura anterior muestra un mapa de las muestras donde se modela la varianza en X que explica la varianza en Y. Se concluye que, con el set de datos escogido, con un factor se explica alrededor del 90 por ciento de la varianza en Y mediante la varianza en X. Es decir que de las más de 500 variables utilizadas, se está utilizando una variable latente para modelar la varianza entre X y Y.
En la validación se obtuvo la grafica de valor predicho por el software y el determinado en el laboratorio y una grafica de predicción.
Figura 21. Grafica Predicho vs Calculado (Calibración y Validación)
Figura 23. Grafica de predicción
Similar al resultado de VISION en la figura 18 se ven en color rojo las muestras de validacion y en azul aquellas de calibracion con un ajuste aceptable. En la figura 19 observamos solo las muestras de calibracion y los datos estadisticos que aroja el programa de los cuales se resalta que se obtiene un coeficiente de correlacion r2 casi perfecto demostrando que con Unscrambler y su pre procesamiento se ajustan los datos casi perfectamente. Sin embargo el error de calibracion estandar es igual al obtenido en el software anterior y el BIAS es menor lo cual indica que el valor del error de prediccion disminuirá en este caso. Dicho error se refleja en la Figura 20 (obtenida en la herramienta “prediction” de Unscrambler X) donde se selecciono un grupo de muestras para ser predecidas por el modelo y se evidencia que aunque la desviacion de la mayoria de las muestras no supera las 4 unidades si hay un par de muestras con desviacion considerable.
V. CONCLUSIONES
La cuantificación de la composición de biomasa, ha sido exitosamente implementada (errores menores al 1%) utilizando métodos secundarios, entre los cuales sobresale laespectroscopía de infrarrojo (preferiblemente cercano) acoplada con métodos de Principal ComponentRegression (PCR), especialmente el método de los mínimos cuadrados parciales. Este método secundario de cuantificación es altamente deseable debido a su rapidez, efectividad y bajo costo, comparado con el método primario de cuantificación correspondiente. La limitación principal de este procedimiento es la obtención de la curva de calibración, ya que es dispendiosa. En este estudio se ha obtenido una curva de calibración para la lignina contenida en bagazo de caña y se ha hecho una intensiva validación de la misma.
Uno de los puntos más importantes en la obtención de esta curva, fue la selección apropiada de muestras con composición variable y uniformemente distribuida dentro de los rangos de interés. En este estudio, la biomasa utilizada fue obtenida a través de la manipulación por medio de pretratamientos ácido y alcalino, de la composición de dos muestras de bagazo de caña de distinta variedad y estado de maduración, con lo que se obtuvo un total de 73 muestras de composición distinta. El método de cuantificación primario, fue la hidrólisis ácida de las muestras en dos etapas (concentrada y diluida) que resulta en la separación de la fracción de lignina en la fase sólida.
De las 73 muestras procesadas, 25 fueron incluidas en la curva de calibración, las demás fueron desechadas por diversos motivos. La curva fue calculada y validada usando dos softwares (VISION versión 1.0 y Unscramble X, versión 10). Los métodos de validación incluyeron el cálculo de Standard Error of Prediction (SEP), Standard Error of Cross Validation (SECV), y Standard error of Calibration(SEC). Todos estos indicadores se mantuvieron por debajo de 3.3, demostrando con ello la confiabilidad del modelo.
VI. RECOMENDACIONES Y TRABAJO A FUTURO
Para un trabajo futuro se sugiere:
Mejorar la replicabilidad del método de cuantificación primario, ya que es muy pobre
Incluir muchas más variedades de caña de diferentes estratos y métodos de manipulación de su composición
Continuar con la aplicación de más de un software para el cálculo de la curva de calibración tanto como para la validación de este
Hacer validación usando muestras muy diferentes a las utilizadas en la curva de calibración
REFERENCIAS
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Brereton, R. G. (2007). Applied Chemometrics for Scientists. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons.
APENDICE A. Concentración de lignina de las muestras analizada No. De Muestra Contenido de lignina (%) Comentario
SIN PRETRATAR (15-30)*
1 10.17 C
2 14.17 C
3 37.00 F
4 43.00 F
5 9.00 C
6 19.00 N
7 7.00 N
8 17.00 C
9 12.00 N
10 17.67 N
11 31.33 N
12 10.50 C
13 14.33 C
14 16.50 N
15 16.17 N
16 10.67 N
17 8.50 N
19 10.33 C
20 23.67 N
21 0.67 N
22 4.00 C
23 40.00 F
23 32.00
R
24 5.67
25 32.17 N
26 0.33 C
27 10.50 N
28 0.83 N
29 11.00 N
30 7.00 C
31 40.67 N
32 17.00 F
33 5.33 N
34 12.33 C
35 10.67 N
37 40.00 N
38 0.33 N
39 6.67 N
39 15.00 C
40 13.00 N
41 0.33 N
42 18.67 C
43 32.67 N
44 27.00 F
45 21.83 C
46 4.00 N
46 18.33
R
47 5.33
48 37.33 N
49 18.50 F
50 9.00 N
51 13.83 N
52 3.33 N
53 5.33 N
54 19.33 C
55 11.67 C
56 11.00 N
57 11.50 N
58 14.50 C
59 13.33 N
60 9.00 C
61 7.00 C
62 15.17 C
63 3.33 C
64 22.67 N
65 10.33 C
66 4.33 N
67 30.00 N
68 4.33 C
69 4.50 N
70 0.67 n
70 10.33
R
71 6.67
73 4.33 N
* Resultado obtenido de revisión de literatura (Sierra, 2008)
APENDICE B. Datos para el cálculo de coeficientes estadísticos
Y gorro Yi residual residual2 Yi-PROM (Ygorro - Yi)2 Ygorro-Yi Ygorro-Yi-BIAS (Ygorro-Yi-BIAS)2
8 12.9269 4.9269 24.2743436 3.57512464 24.27434361 -4.9269 -4.926038095 24.26585132
10.17 11.6786 1.5086 2.27587396 0.41280625 2.27587396 -1.5086 -1.507738095 2.273274164
9 11.0082 2.0082 4.03286724 0.00077841 4.03286724 -2.0082 -2.007338095 4.029406229
17 14.7575 -2.2425 5.02880625 13.848818 5.02880625 2.2425 2.243361905 5.032672636
10.5 11.04 0.54 0.2916 1.521E-05 0.2916 -0.54 -0.539138095 0.290669886
14.33 12.5078 -1.8222 3.32041284 2.16590089 3.32041284 1.8222 1.823061905 3.323554709
10.33 12.3287 1.9887 3.95492769 1.67081476 3.99480169 -1.9987 -1.997838095 3.991357055
4 8.8682 4.8682 23.6993712 4.69979041 23.69937124 -4.8682 -4.867338095 23.69098013
7 7.7026 0.7036 0.49505296 11.1122223 0.49364676 -0.7026 -0.701738095 0.492436354
12.33 8.1789 -4.1511 17.2316312 8.16359184 17.23163121 4.1511 4.151961905 17.23878766
5.33 4.0982 -1.2318 1.51733124 48.1344564 1.51733124 1.2318 1.232661905 1.519455371
15 9.637 -5.363 28.761769 1.95748081 28.761769 5.363 5.363861905 28.77101453
18.67 13.8455 -4.8245 23.2758003 7.89272836 23.27580025 4.8245 4.825361905 23.28411751
19 15.4648 -3.5352 12.497639 19.6133837 12.49763904 3.5352 3.536061905 12.50373379
11.67 15.088 3.4088 11.6199174 16.4178936 11.682724 -3.418 -3.417138095 11.67683276
14.5 13.4999 -1 1 6.07031044 1.00020001 1.0001 1.000961905 1.001924735
9 6.2202 -2.7798 7.72728804 23.1928928 7.72728804 2.7798 2.780661905 7.732080629
7 8.5165 1.5165 2.29977225 6.34838416 2.29977225 -1.5165 -1.515638095 2.297158836
14.97 12.7555 -2.2145 4.90401025 2.95633636 4.90401025 2.2145 2.215361905 4.907828369
10.45 13.8036 3.3536 11.246633 7.65905625 11.24663296 -3.3536 -3.352738095 11.24085274
APENDICE C. Datos para el calculo de lignina por muestra No. De Muestra Contenido de lignina (gramos) Contenido de lignina
(gramos) PROMEDIO
1 0.033 0.028 0.0305
2 0.051 0.034 0.0425
3 0.099 0.123 0.111
4 0.124 0.134 0.129
5 0.054 0.027
6 0.055 0.059 0.057
7 0.019 0.023 0.021
8 0.057 0.045 0.051
9 0.034 0.038 0.036
10 0.05 0.056 0.053
11 0.089 0.099 0.094
12 0.035 0.028 0.0315
13 0.039 0.047 0.043
14 0.054 0.045 0.0495
15 0.043 0.054 0.0485
16 0.031 0.033 0.032
17 0.028 0.023 0.0255
19 0.034 0.028 0.031
20 0.063 0.079 0.071
21 0.002 - 0.002
22 0.008 0.016 0.012
23 0.072 0.12 0.096
24 0.014 0.02 0.017
25 0.095 0.098 0.0965
26 0.001 - 0.001
27 0.041 0.022 0.0315
28 0.002 0.003 0.0025
29 0.037 0.029 0.033
30 0.017 0.025 0.021
31 0.134 0.11 0.122
32 0.053 0.049 0.051
34 0.037 0.016 0.0265
35 0.032 0.032 0.032
36 0.012 0.016 0.014
37 0.06 0.12 0.09
39 0.045 0.02 0.0325
40 0.039 0.039 0.039
41 0.001 - 0.001
42 0.053 0.059 0.056
43 0.096 0.1 0.098
44 0.074 0.088 0.081
45 0.07 0.061 0.0655
46 0.055 0.012 0.0335
47 0.011 0.021 0.016
48 0.127 0.097 0.112
49 0.055 0.056 0.0555
50 0.027 0.027 0.027
51 0.047 0.036 0.0415
52 0.01 0.01 0.01
53 0.014 0.018 0.016
54 0.057 0.059 0.058
55 0.047 0.023 0.035
56 0.037 0.029 0.033
57 0.037 0.032 0.0345
58 0.051 0.036 0.0435
59 0.046 0.034 0.04
60 0.026 0.028 0.027
61 0.028 0.014 0.021
62 0.056 0.035 0.0455
63 0.011 0.009 0.01
64 0.068 0.068 0.068
65 0.031 0.031 0.031
66 - 0.013 0.013
67 0.08 0.1 0.09
68 0.015 0.011 0.013
69 0.016 0.011 0.0135
70 0.031 0.002 0.0165
71 0.027 0.013 0.02
72 0.017 0.005 0.011
73 0.016 0.01 0.013
APENDICE E. Metodologia del Proyecto Molienda y Tamizado de dos tipos de Caña de azúcar
Se realiza un secado exhaustivo a los palos de caña en un horno a una temperatura que no superara los 35ºC, por un tiempo mínimo de 20 minutos. Utilizando una licuadora casera, se muele la caña por 4 min aproximadamente,
luego pasar el material a una moledora de café por 2 minutos más.
Se realiza una segunda molienda de cada muestra de caña en un molino industrial.
Realizar un proceso de tamizado hasta obtener aproximadamente 650 g de cada caña con el tamaño de partícula apropiado (+100 Thylermesh que equivale a un tamaño de partícula<0.152 mm).
Pretratamiento y secado de muestras
El material se separó en 36 grupos de muestras por tipo de caña (madura y joven) obteniendo 72 muestras en total.
Se tomaron subgrupos de 6 muestras de cada caña (muestras de 10 a 12 g) en frascos schottde 250 ml .
Se agregan 10 ml de hidróxido de sodio por gramo de biomasa (Utilizar una concentración de 1% (w/w) se uso para una caña y 2% (w/w) para la otra). Someter cada grupo de 6 muestras preparada a diferentes temperaturas de: 50,
60, 70, 80, 90 y 100°C. Se retira del horno la primera muestra después de 15 min, la segunda después de 30min, la tercera después de 45min, y así cada 15
min hasta retirar las 6 muestras por temperatura. Esnecesario el uso de gafas y guantes para la manipulación de los químicos ya que el hidróxido de sodio puede ser irritante para la piel mucosa y ojos.
Por ultimo las muestras se secan en un horno a una temperatura máxima de 35°C por un día, se pulverizaron de nuevo y se rotularon con números del 1 al 72.
Determinación de espectrogramas
A cada una de las muestras de caña es necesario determinarle un espectro utilizando la pistola del equipo NIR la cual dispara rayos infrarrojos.
Se llena la copa de medición del equipo con cada muestra.
Se ingresa la punta de la pistola del equipo NIR en la copa y se toma cada medición,
Se repite cada medición.
Se crea una librería en el software del equipo donde se guardaron los espectros obtenidos.
Método de referencia primario
Se toman 0.3 g de cada muestra en un tubo de ensayo con 3 mL de ácido sulfúrico 72%(w/w) .
Se someten las muestras a un baño de maría a 30°C por una hora. Posteriormente las muestras son diluidas en un frasco de 250 mL agregándoles 54 mL de agua.
Se toman filtros circulares y se registra el dato de cada uno según la muestra. Luego se filtra cada muestra y se deja secar el filtro con la lignina durante un día a 45°C.
Una ves secado el filtro, se pesa y se calcula la cantidad de lignina gravimétricamente.
APENDICE F. Espectros de muestras de la curva de calibración Espectro Muestra No 1
Espectro Muestra No 2
Espectro Muestra No 8
Espectro Muestra No 13
Espectro Muestra No 22
Espectro Muestra No 30
Espectro Muestra No 36
Espectro Muestra No 42
Espectro Muestra No 54
Espectro Muestra No 58
Espectro Muestra No 61
Espectro Muestra No 63
Espectro Muestra No 68
Espectro Muestra No 2*