Estudio de factores biológicos implicados en el pronóstico del cáncer de mama mediante meta-análisis de datos publicados.

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(1)Universidad de Castilla - La Mancha Departamento de Ciencias Médicas. ESTUDIO DE FACTORES BIOLÓGICOS IMPLICADOS EN EL PRONÓSTICO DEL CÁNCER DE MAMA MEDIANTE META-ANÁLISIS DE DATOS PUBLICADOS. TESIS DOCTORAL Laura Díez González 2015.

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(3) UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA Facultad de Medicina de Albacete Departamento de Ciencias Médicas.. MEMORIA DE TESIS DOCTORAL. “ESTUDIO DE FACTORES BIOLÓGICOS IMPLICADOS EN EL. PRONÓSTICO DEL CÁNCER DE MAMA MEDIANTE META-ANÁLISIS DE DATOS PUBLICADOS”. Trabajo presentado por Laura Díez González. Directores de Tesis: Dr. Alberto Ocaña Dr. Joaquín Jordán Bueso. Albacete, 5 de Junio de 2015.

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(5) Joaquín Jordán Bueso, Profesor titular de Universidad del Área de Conocimiento de Farmacología del Departamento de Ciencias Médicas de la Universidad de Castilla-La Mancha, y Alberto Ocaña, Director de investigación de la GAI.. CERTIFICAN:. Que la presente Tesis Doctoral titulada “Estudio de factores biológicos implicados en pronóstico. del cáncer de mama mediante meta-análisis de datos publicados” constituye el trabajo de investigación realizado bajo nuestra dirección en el grupo de Investigación Traslacional del Cáncer del Hospital Universitario de Albacete y del grupo de Farmacología de la Facultad de Medicina de Albacete por Dña. Laura Díez Gónzález. Esta Tesis Doctoral reúne la calidad y el rigor científico necesarios para ser defendida en la Universidad de Castilla-La Mancha.. Y para que conste a todos los efectos firmamos el presente en Albacete a 1 Abril de 2015.. Fdo.: Dr. Alberto Ocaña. Fdo.: Dr. Joaquín Jordán Bueso. Director de Tesis. Director de Tesis.

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(7) El trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral ha dado lugar a las siguientes publicaciónes: Prognostic relevance of receptor tyrosine kinase expression in breast cancer: A metaanalysis.Templeton AJ1, Diez-Gonzalez L1, Ace O, Vera-Badillo F, Seruga B, Jordán J, Amir E, Pandiella A, Ocaña A. Cancer Treat Rev. 2014 Oct;40(9):1048-1055. (1ambos autores contribuyen igual).. Activation of the PI3K/mTOR/AKT pathway and survival in solid tumors: systematic review and meta-analysis. Ocana A, Vera-Badillo F, Al-Mubarak M, Templeton AJ, Corrales-Sanchez V, Diez-Gonzalez L, Cuenca-Lopez MD, Seruga B, Pandiella A, Amir E. PLoS One. 2014 Apr 28;9(4):e95219.. Tumor Infiltrating Lymphocytes in Breast Cancer: Ready for Prime Time?. Ocana A,DiezGónzález L,Adrover E, Fernández-Aramburo A, Pandiella A andAmir E. Journal of Clinical Oncology, Vol 32, 2014..

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(9) "Si he llegado a ver más lejos, ha sido porque me he subido a hombros de gigantes". Isaac Newton.

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(11) AGRADECIMIENTOS. Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que con su colaboración han contribuido a la realidad de este trabajo:. A Alberto Ocaña por ofrecerme este desafío y su confianza para llevarlo a cabo, por descubrirme un nuevo horizonte profesional y brindarme su dilatada y valiosa experiencia en el campo de la Oncología.. A Joaquín Jordán, por las atenciones, esfuerzo, apoyo y ayuda en la dirección de esta tesis, sin la cual no hubiera podido realizarse.. A Fernando Andrés Pretel por explicarme con paciencia los conceptos estadísticos de este trabajo y asesorarme con la maquetación.. A Gemma, Vero, Mª José y Lolín por aportarme todo lo que necesité y hacerme sentir parte del equipo.. A todos los que desde la distancia han contribuido, a través del desarrollo y publicación de los artículos que han servido de base a esta tesis.. A Charo, por su protección y cariño, haces mis días más fáciles, gracias.. Y por último, aunque en primer lugar, a mi familia y sobretodo a mi hermano y mis padres, quienes siempre han confiando en mí, apoyándome incondicionalmente..

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(13) ACRÓNIMOS ADN. Ácido Desoxirribonucleico. ARN. Ácido Ribonucleico. ASCO. Sociedad Americana de Oncología Clínica.. OMS OR OSNA. American Society of Clinical Oncology. BCSS. Supervivencia específica para el cáncer de mama. CK. CMF. DSB DFS. EGFR. Reparación por Escisión de Bases Base Excision Repair. Citoqueratina. Ciclofosfamida, Metrotrexato y Fluoracilo Roturas de doble cadena Double Strand Breaks Supervivencia libre de enfermedad Disease free survival Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico. Odd ratio Amplificación de ácido nucleico en un solo paso One Step Nucleid Acid Amplification. PAI-1. Breast cancer specific survival. BER. Organización Mundial de la Salud. PCR. PRISMA. QUORUM. Inhibidor del Activador delPlasminógeno 1 Reacción en cadena de la polimerasa Polymerase chain reaction Guía de comprobación de revisiones sistemáticas y meta-análisis Preferred Reporting Items for Systematic reviews and Meta-Analyses Calidad de la presentación de los meta-análisis Quality Of Reporting Of Metaanalysis. RE. Receptor de estrógeno. RH. Receptor hormonal. RH. Recombinación homóloga. Epidermal Growth Factor Receptor. FDA. Administración de alimentos y medicamentos. RNH. Recombinación no homóloga. Food and Drug Administration. FGFR. Receptor del Factor de Crecimiento de Fibroblastos. RP. Receptor de progesterona. RR. Riesgo Relativo. Fibroblast Growth Factor Receptor. FISH. Hibridación in situ mediante fluorescencia. Fluorescence In Situ Hybridization.

(14) HER2. IARC. IGFR. Receptor 2 del Factor de Crecimiento Epidérmico Humano Human epidermal growth factor receptor 2 Agencia internacional para la investigación del cáncer. International Agency for Research on Cancer Receptor del factor de crecimiento similar a la insulina. RS. Recurrence Score. SR. Supervivencia Relativa. SBR. Insulin-like growth factor receptor. IHC. Inmunhistoquímica. ILV. Invasión linfática y vascular. SG. IMC. Índice de Masa Corporal. STL. MMR. Apareamientos incorrectos Mismatch. SEER. TIL. Red Oncológica Nacional Integral.. NCCN. NER. NPI. National Comprehensive Cancer Network Reparación por escisión de nucleótidos Nucleotide Excision Repair. Índice Pronóstico de Nottingham. uPA. uPAR. VEGFR. Escala hisotólgica de Scarff-BloomRichardson Programa de Vigilancia, Epidemiología y Resultados finales. Surveillance, Epidemiology and End Results Supervivencia global Overal survival Síntesis de translesión Translesion synthesis Infiltración linfocítica tumoral Tumor lymphocytic infiltration Uroquinasa Activadora del Plasminógeno Receptor de la Uroquinasa Activadora del Plasminógeno Receptor del factor de crecimiento vascular endotelial. VascularEndothelial Growth Factor Receptor.

(15) ÍNDICE I.. INTRODUCCIÓN. 1. 1. Epidemiología. 3. 2. Factores pronóstico en el cáncer de mama. 4. 2.1. Factores pronóstico clásicos. 5. 2.1.1. Estado de los ganglios axilares. 5. 2.1.2. Tamaño tumoral. 7. 2.1.3.Tipo histológico. 8. 2.1.4. Grado histológico. 8. 2.1.5. Invasión linfática y vascular. 9. 2.1.6. Edad. 9. 2.2. Nuevas recomendaciones. 10. 2.2.1. Receptores hormonales (RH). 10. 2.2.2. HER2. 11. 2.2.3. Activadores e inhibidores del plasminógeno. 15. 2.2.4. Perfil genético. 15. 2.2.5. Otros biomarcadores. 17. 3. Clasificación molecular del cáncer de mama. 19. 4. Biología molecular del cáncer de mama. 22. 4.1. Receptores tirosina quinasa. 27. 4.2. Vía PI3K/Akt/mTOR. 32. 4.3. Infiltración linfocitaria tumoral (TIL). 34. 5. Estado actual del problema. 36. 6. Meta-análisis. 38. 6.1. Formulación de la pregunta. 42. 6.2. Criterios de selección del estudio. 43. 6.3. Búsqueda bibliográfica. 43. 6.4. Selección de estudios primarios. 43. 6.5. Evaluación de la calidad de los estudios. 44. 6.6. Combinación de los resultados. 44. 6.7. Interpretación de los resultados. 45.

(16) II.. HIPÓTESIS. 49. III.. OBJETIVOS. 53. IV.. MATERIAL Y MÉTODOS. 57. 1. Papel pronóstico de los receptores tirosina quinasa en el cáncer de mama. 59. 1.1. Fuente de datos y búsqueda. 59. 1.2. Selección de estudios y extracción de datos. 59. 1.3. Síntesis de datos y análisis estadístico. 60. 2. Activación de la vía PI3K/mTOR/AKT y su relación con la supervivencia en tumores sólidos: revisión sistemática y meta-análisis 61 2.1. Identificación y selección de estudios. 61. 2.2. Extracción de datos. 61. 2.3. Síntesis de datos. 62. 2.4. Análisis estadístico. 62. 3. El papel de la infiltración linfocítica tumoral (TIL) en el cáncer de mama. V.. 64. 3.1. Fuente de datos y búsqueda. 64. 3.2. Selección de estudios y extracción de datos. 64. 3.3. Síntesis de datos y análisis estadístico. 64. RESULTADOS. 67. 1. Papel pronóstico de los receptores tirosina quinasa en el cáncer de mama. 69. 1.1. Descripción de estudios. 69. 1.2. Evaluación y expresión de RTKs. 69. 1.3. Asociación de RTKs y resultados. 70. 1.4. Resultados por análisis de RTKs. 71. 1.5. Análisis de sensibilidad para triples negativo y tumores de alto grado. 71. 2. Activación de la vía PI3K/mTOR/AKT y su relación con la supervivencia en tumores sólidos: revisión sistemática y meta-análisis 72 2.1. Análisis de activación de la vía y supervivencia por tipo de tumor. 72. 2.2. Análisis de activación de la vía y supervivencia por tipo de alteración. 72. 3. El papel de la infiltración linfocitaria tumoral (TIL) en el cáncer de mama. 73. 3.1. Asociación de TIL y resultados. 73. 3.2. Resultados por localización de TIL. 73. 3.3. Resultados en cáncer de mama triple negativo. 73.

(17) VI.. DISCUSIÓN. 75. 1. Papel pronóstico de los receptores tirosina quinasa en el cáncer de mama. 77. 2. Activación de la vía PI3K/mTOR/AKT y su relación con la supervivencia en tumores sólidos: revisión sistemática y meta-análisis 81 3. El papel de la infiltración linfocitaria tumoral (TIL) en el cáncer de mama VII. CONCLUSIONES 1. Papel pronóstico de los receptores tirosina quinasa en el cáncer de mama. 84 87 89. 2. Activación de la vía PI3K/mTOR/AKT y su relación con la supervivencia en tumores sólidos: revisión sistemática y meta-análisis 90 3. El papel de la infiltración linfocitaria tumoral (TIL) en el cáncer de mama VIII. BIBLIOGRAFÍA IX.. ANEXO. 91 93 105.

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(19) I. INTRODUCCIÓN.

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(21) Laura Díez. I. Introducción. 1. Epidemiología. El cáncer de mama es el segundo cáncer más común en el mundo y la neoplasia maligna más frecuente en la mujer. La incidencia del cáncer de mama aumentó de manera progresiva en los años 90, para los carcinomas in situ y los estadios iniciales, debido a la implantación de la mamografía como método de cribado (Siegel et al., 2013). A partir de 2003, la incidencia comenzó a disminuir, debido en parte al menor uso de la terapia hormonal sustitutiva en la postmenopausia tras publicarse en 2002, en el informe Women’s Health Initiative report, su relación con un mayor riesgo de cáncer de mama (Rossouw et al., 2002). Desde el 2008 hasta nuestros días se ha observado un incremento de la incidencia del 20%, a pesar de los avances diagnósticos y terapéuticos, representando el cáncer de mama un importante problema de salud pública, tanto por su incidencia como por su mortalidad. Según datos aportados por GLOBOCAN, a nivel mundial, 1,67 millones de nuevos casos de cáncer de mama en la mujer fueron diagnosticados en 2012, representado el 25% de todos los cánceres. En nuestro país se han diagnosticado 25.215 nuevos casos de cáncer de mama en 2012, lo que supone un 29% de todos los casos de cáncer en la mujer, de las cuales 6.075 fallecieron por esta causa (15,5% del total de muertes). Los programas de screening junto con los avances diagnósticos y las terapias adyuvantes han contribuido a un incremento anual en la supervivencia del 1,4%, con una supervivencia global a los 5 años del 83%. Se estima que el riesgo de una mujer de padecer cáncer de mama a lo largo su vida es de 1 por 8 mujeres (Domenech et al., 2009). Según previsiones de GLOBOCAN, la incidencia y mortalidad para el cáncer de mama en España ascenderá a 26.282 y 6.381 en el 2015, y a 28.010 y 6.856 casos en 2020.. !3.

(22) I. Introducción. Laura Díez. Mama Páncreas. Colorectal Estómago. Útero LNH. Incidencia. Pulmón Melanoma. Ovario Otros. Mortalidad. Fig. 1: Incidencia y mortalidad del cáncer de mama en mujeres en España. GLOBOCAN 2012 (IARC).. 2. Factores pronóstico en el cáncer de mama El empleo de terapias sistémicas adjuvantes ha permitido reducir los índices de mortalidad por cáncer de mama, sin embargo, estos tratamientos no son válidos para todas las pacientes, incrementando su toxicidad sin mejorar su supervivencia, en algunos casos. Los factores pronósticos y predictivos permiten el manejo individualizado de las pacientes con cáncer de mama, seleccionando a aquellas que presentan mayor riesgo de recurrencia y mejor respuesta al tratamiento adjuvante, evitando así su administración en las pacientes en las que no reporte ningún beneficio y sí una toxicidad substancial (Early Breast Cancer Trialists' Collaborative et al., 2012). Los factores pronóstico clásicos en el cáncer de mama son: • Número de ganglios afectados. • Tamaño del tumor. • Grado histológico. • Tipo histológico. • Invasión linfática y vascular. !4.

(23) Laura Díez. I. Introducción. • Edad. • Proliferación medida por Ki67.. En 2007, la Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO) publicó una Guía Clínica de Factores Pronóstico del cáncer de mama, estableciendo una serie de recomendaciones en cuanto a su empleo en la práctica clínica (Harris et al., 2007): • Receptores hormonales (RE y RP). • HER2. • Activadores del sistema uroquinasa-plasminógeno. • Perfiles multigénicos.. 2.1. Factores pronóstico clásicos 2.1.1. Estado de los ganglios axilares Actualmente el factor pronóstico más importante en el cáncer de mama es la afectación ganglionar. El número de ganglios afectos está en relación directa con una menor supervivencia global y una reducción del intervalo libre de enfermedad, aportando información sobre la necesidad de tratamiento quimioterápico adyuvante. De ahí su importancia tanto a nivel pronóstico como terapéutico (Fisher et al., 1983). En el estudio publicado por Soerjomataram et al. en el que se realiza una revisión sistemática de los factores pronósticos implicados en el cáncer de mama a largo plazo, se objetivó una supervivencia a los 5 años del 83% en pacientes con ganglios negativos y del 28% en pacientes con más de 10 ganglios afectos (Soerjomataram et al., 2008). Estos datos demuestran que el riesgo de recurrencia en pacientes con ganglios positivos es lo suficientemente elevado como para justificar la terapia sistémica adyuvante.. !5.

(24) I. Introducción. Laura Díez. Supervivencia Acumulada (%). Ganglios: +10. Ganglios: 4-9. Ganglios: 1-3. Ganglios: 0. 100 75 50 25 0. 0. 5. 10. 15. 20. Años después del diagnóstico. Fig. 2. Supervivencia acumulada tras diagnóstico de cáncer de mama ajustada al estado ganglionar (Soerjomataram et al., 2008).. La biopsia del ganglio centinela (GC) o primer ganglio de drenaje del área tumoral permite la estadificación axilar, seleccionando a las pacientes susceptibles de cirugía axilar conservadora. Se evita así la linfadenectomía en el caso de no existir afectación ganglionar, reduciendo sus posibles efectos secundarios tales como linfedema, seroma, trombosis de la vena axilar, afectación sensitiva y motora, y disfunción del hombro. La técnica convencional mediante el estudio anatomopatológico del ganglio detecta únicamente metástasis de más de 2 mm. Si el estudio intraoperatorio es negativo, éste debe completarse a posteriori mediante la sección del tejido restante y el empleo de marcadores inmunohistoquímicos para la detección de micrometástasis. Esto implica un segundo tiempo quirúrgico en el caso de falsos negativos. La técnica molecular One Step Nucleid Acid Amplification (OSNA) realiza en un sólo tiempo el análisis completo del ganglio linfático mediante la cuantificación de la expresión de ARNm de CK 19, en aproximadamente 30 minutos. Elimina así la posibilidad de falsos negativos en el estudio intraoperatorio, convirtiéndose en una técnica de alta sensibilidad y especificidad que suprime la variabilidad interobservacional de la técnica histopatológica (Ceberio Ganzarain et al., 2013). Según las últimas recomendaciones de la guía ASCO (Lyman et al., 2014) respecto al papel de la linfadenectomía y la realización de biopsia del ganglio centinela en el cáncer de mama, la linfadenectomía no se recomienda en mujeres sin metástasis en !6.

(25) Laura Díez. I. Introducción. ganglios centinela. En mujeres con uno o dos ganglios centinela metastásicos que van a ser tratadas con cirugía conservadora y RT a volumen mamario, no debe realizarse disección ganglionar (en la mayoría de los casos). Se recomienda linfadenectomía en mujeres con cáncer de mama temprano y metástasis en ganglios centinela que serán tratadas con mastectomía. Estas tres recomendaciones se realizaron en base a ensayos clínicos randomizados.. 2.1.2. Tamaño tumoral El tamaño tumoral es tras la afectación ganglionar axilar, el factor pronóstico más importante, estando en relación con el riesgo de recidiva, de metástasis ganglionares y con la tasa de supervivencia. Las tasas de supervivencia de cáncer de mama a 5 años ascienden a 91% para tumores menores de 2 cm, descendiendo a 80% para tumores de 2 a 5 cm y a 63% para tumores mayores de 5 cm. (Carter et al., 1989).. Supervivencia Acumulada (%). Otros. > 5 cm. 2-5 cm. < 2 cm. 100 75 50 25 0. 0. 5. 10. 15. 20. Años después del diagnóstico. !. Fig. 3. Supervivencia acumulada tras diagnóstico de cáncer de mama según tamaño tumoral (Soerjomataram et al., 2008).. El diámetro tumoral y el estado de los ganglios linfáticos son factores pronósticos independientes, pese a lo cual, su coexistencia potencia una peor supervivencia. Así, los tumores pequeños tienen peor pronóstico en presencia de ganglios patológicos, en comparación con aquellos que no tienen afectación ganglionar. Carter et al (Carter et al., 1989) describen una supervivencia relativa a los 5 años para tumores inferiores a 0,5 cm. !7.

(26) I. Introducción. Laura Díez. del 99,2% sin afectación ganglionar, frente al 59% en el caso de más de 3 ganglios metastásicos.. TAMAÑO (cm). N-. N 1-3. N >3. < 0,5. 99,2. 95,3. 59. 0,5 - 0,9. 98,3. 94. 54,2. 1 - 1,9. 85,8. 86,6. 67,2. 2 - 2,9. 92,3. 83,4. 63,4. 3 - 3,9. 86,2. 79. 56,9. 4 - 4,9. 84,6. 69,8. 52,6. >5. 82,2. 73. 45,5. Tabla 1. Supervivencia relativa (%) a 5 años ajustada por tamaño tumoral y estado ganglionar (Carter et al., 1989).. 2.1.3.Tipo histológico El tipo histológico más común es el carcinoma ductal infiltrante y representa más del 70% de todos los casos de cáncer de mama, seguido del carcinoma lobulillar infiltrante, con una frecuencia del 10% (C. I. Li et al., 2005). Se han descrito otros tipos de cáncer de mama invasivo: tubular, medular, papilar, coloide y adenoquístico, asociados con un mejor pronóstico. Por contra, los inflamatorios y carcinosarcomas, confieren un peor pronóstico.. 2.1.4. Grado histológico La determinación del grado histológico debe ser reproducible y estandarizada para evitar la subjetividad entre los patólogos. Con este fin se establecen escalas como la de Scarff-Bloom-Richardson (SBR), posteriormente modificada por Elston-Ellis, basada en la formación tubular, el pleomorfismo nuclear y actividad mitótica. Según estos parámetros se distinguen tres grados: • Grado I: bien diferenciado. • Grado II: moderadamente diferenciado. • Grado III: pobremente diferenciado.. !8.

(27) Laura Díez. I. Introducción. El grado histológico es un factor pronóstico de metástasis a distancia y supervivencia global independiente de otros factores pronósticos, como el tamaño tumoral o el status de los ganglios axilares, mostrando una peor supervivencia en pacientes con tumores poco diferenciados (D'Eredita et al., 2001). G III. G II. GI. Supervivencia Acumulada (%). 100 75 50 25 0. 0. 24. 48. 72. 96. 120. 144. 168. 192. Tiempo (meses) !. Fig. 4: Supervivencia acumulada según grado histológico.. Otros índices empleados como marcadores pronóstico son el Grado Nuclear de Fisher y el Índice Pronóstico de Nottingham (NPI). En este último, además del grado histológico se tiene en cuenta el tamaño tumoral y la afectación ganglionar.. 2.1.5. Invasión linfática y vascular La presencia de invasión linfovascular parece ser un indicador de mal pronóstico, en relación con la recurrencia local y metástasis a distancia, así como indicador de una mayor probabilidad de fracaso terapéutico y por tanto, menor supervivencia (Pinder et al., 1994).. 2.1.6. Edad La edad es un factor independiente de mal pronóstico. Las mujeres menores de 35 años presentan un menor índice de supervivencia global y de intervalo libre de enfermedad. Fredholm et al (Fredholm et al., 2009) publicaron una supervivencia relativa a los 5 años del 74,7% para mujeres entre 20-34 años frente al 87,8% observado en. !9.

(28) I. Introducción. Laura Díez. pacientes entre 50-69 años. La menor edad se asocia a una biología tumoral más agresiva, con una mayor afectación ganglionar, mayor tamaño tumoral, grado III histológico y receptores hormonales negativos.. 2.2. Nuevas recomendaciones 2.2.1. Receptores hormonales (RH) La presencia de receptores de estrógeno (RE) y progesterona (RP) está asociada a un mejor pronóstico y tiene además un papel fundamental como factor predictivo de respuesta a la terapia hormonal. Permiten la identificación de las pacientes que se beneficiarán del tratamiento hormonal, tanto en tumores primarios como en recidivas locales y metástasis, mejorando así su pronóstico y supervivencia. ESTADIO AL. N. DIAGNÓSTICO. SUPERVIVENCIA ESPECÍFICA (%) ER +. ER +. ER -. ER -. PR +. PR -. PR +. PR -. 5 años. 98. 97. 96. 93. 10 años. 95. 93. 93. 90. 5 años. 91. 85. 82. 76. 10 años. 81. 74. 73. 70. 5 años. 72. 61. 52. 45. 10 años. 54. 44. 40. 37. 5 años. 33. 20. 14. 15. 10 años. 17. 8. 4. 11. 5 años. 91. 86. 82. 75. 10 años. 83. 76. 72. 69. Estadio I. Estadio II. Estadio III. Estadio IV. Sin estadiaje. 68283. 58784. 10548. 5518. 12787. Tabla 2: Supervivencia específica a 5 y 10 años según estado hormonal. SEER. (Grann et al., 2005).. !10.

(29) Laura Díez. I. Introducción. El principal valor de los receptores hormonales es su carácter predictivo de respuesta a la terapia hormonal. En el meta-análisis publicado por Davies C et al. (Davies et al., 2013) sobre el papel de los RH en la eficacia del tamoxifeno como tratamiento adyuvante en el cáncer de mama, se demostró que en las pacientes con RE positivo, el tamoxifeno reduce el riesgo de recidiva en un 39% y de muerte en un 30%, independientemente del estado del RP, la edad, la afectación ganglionar o el uso de quimioterapia sistémica. Por el contrario, el tamoxifeno no tiene impacto en las tasas de recurrencia ni mortalidad de las pacientes con RE negativo (Early Breast Cancer Trialists' Collaborative et al., 2011). La expresión de los RP contribuye a la evolución del cáncer de mama de manera independiente a los RE. Algunos estudios sugieren que las pacientes con cáncer de mama RE positivo pero RP negativo tienen un peor pronóstico que aquellas con RE positivo y RP positivo (Thakkar et al., 2011). El estudio de los receptores hormonales en la práctica clínica ha sido recomendado por la Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO), tanto en mujeres premenopáusicas como en postmenopáusicas, indicando la necesidad de aumentar el tiempo de tratamiento con tamoxifeno o inhibidores de la amoratasa a 10 años. Por tanto, en mujeres pre o perimenopáusicas que hayan recibido 5 años de tratamiento adyuvante con tamoxifeno, éste debería ampliarse a 10 años de duración total. En el caso de mujeres posmenopáusicas que hayan recibido 5 años de tratamiento adyuvante con tamoxifeno, debe ofrecerse la opción de continuar con tamoxifeno o cambiar a un inhibidor de la aromatasa hasta completar los 10 años en total de tratamiento endocrino adyuvante (Burstein et al., 2014).. 2.2.2. HER2 El gen HER2 (neu o c-erbB-2) es un protooncogén localizado en el brazo largo del cromosoma 17 que codifica para la proteína HER2. Se trata de un receptor transmembrana con actividad tirosina quinasa, perteneciente a la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Su activación inicia una cascada de señales intracelulares que participan en el control sobre el crecimiento y diferenciación celular. El 15-30% de los cánceres de mama tienen amplificado y sobreexpresado el protooncogen HER2, asociándose a un peor pronóstico (Chia et al., 2008). !11.

(30) I. Introducción. Laura Díez. La Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO) recomienda que el estado de HER2 (HER2 negativo o positivo) sea determinado en todos los cánceres invasivos (estadios precoces o recurrencias) sobre la base de uno o más tests (inmunohistoquímicaIHQ o hibridación in situ-ISH) de HER2 (positivo, equívoco o negativo). Se define como HER2 positivo cuando haya evidencia de sobreexpresión de proteína (examinando el área del tumor mediante inmunohistoquímica y tenga >10% de células neoplásicas contiguas y homogéneas) o amplificación del gen (número de copias de HER2 o proporción HER2/ CEP17 por hibridación in situ contando al menos 20 células dentro del área). Si los resultados son equívocos (no concluyentes) debe hacerse otro test alternativo (inmunohistoquímica o ISH). Se debe repetir el test si los resultados son discordantes con los hallazgos histológicos. Los laboratorios deben demostrar alta concordancia con un test validado de HER2 y debe ser hecho en laboratorios acreditados por la CAP (Colegio Americano de Patólogos) u otra entidad acreditadora que demuestre altos estándares de calidad (Wolff et al., 2013). Posteriormente se ha publicado una actualización sobre el estudio de HER2 (Rakha et al., 2014). Esta actualización contiene recomendaciones más detalladas sobre puntos clave relacionados con la metodología de la prueba HER2, sus algoritmos y la. Puntuación: 0/1+ Sin tinción en membrana o tinción incompleta en <10% de las células tumorales (0+) o débil tinción incompleta de membrana en >10% de las células tumorales (1+). NEGATIVO Puntuación: 2+ Leve-moderada tinción completa de membrana en >10% de las células tumorales o intensa tinción completa de membrana en ≤10% de las células tumorales.. NO CONCLUYENTE. Puntuación: 3+ Intensa y uniforme tinción completa de membrana en >10% de las células tumorales. POSITIVO. Test alternativo: FISH o bright field ISH. IHQ- Ca.mama primario invasivo o recurrencial. interpretación de los resultados. HER2/CEP17 <2 y número de copias de HER2 por núcleo <4. NEGATIVO HER2/CEP17 <2 y número de copias de HER2 por núcleo 4-6 o HER/CEP17=1,80-1,99. NO CONCLUYENTE. HER2/CEP17 ≥2 o número de copias de HER2 por núcleo ≥6. POSITIVO. Fig. 5. Algoritmo del empleo del test HER2 (Rakha et al., 2015).. !12. Contar más células o revaluar nueva muestra..

(31) Laura Díez. I. Introducción. La guía ASCO establece también un serie de recomendaciones en función de la sobreexpresión o amplificación de HER2:. • El tratamiento anti-HER2 se recomienda para pacientes con cáncer de mama avanzado HER2 positivo, con excepción de aquellas con insuficiencia cardíaca congestiva o con una fracción de eyección ventricular izquierda significativamente comprometida, siendo necesario en estos casos hacer una evaluación individual de cada paciente. Se recomienda la combinación de trastuzumab, pertuzumab y taxanos para el tratamiento de primera línea y trastuzumab emtansine (T-DM1) como tratamiento de segunda línea. En el marco de la tercera línea, los clínicos deben ofrecer otras combinaciones de terapia contra HER2 o T-DM1 (si previamente no se ha administrado) y pueden ofrecer pertuzumab, si la paciente previamente no lo ha recibido. La duración óptima de la quimioterapia debe ser de al menos 4 a 6 meses o hasta conseguir una respuesta máxima, dependiendo de la toxicidad y en ausencia de progresión. El tratamiento anti-HER2 puede continuarse hasta que haya progresión o toxicidad inaceptable. Para pacientes con HER2 positivo y receptores hormonales positivos, los médicos pueden recomendar como tratamiento de primera línea, hormonoterapia más terapia anti-HER2 u hormonoterapia sola en casos seleccionados (Giordano et al., 2014).. • Las pacientes con cáncer de mama avanzado HER2 positivo y metástasis cerebrales deben recibir tratamiento local adecuado y terapia sistémica, si está indicada. Los tratamientos locales incluyen cirugía, radioterapia total de todo el área cerebral y radiocirugía estereotáxica. Los tratamientos van a depender de factores tales como el pronóstico del paciente, la presencia de síntomas, la resecabilidad, el número y tamaño de las metástasis, el tratamiento previo y si las metástasis son difusas. Otras opciones incluyen la terapia sistémica, cuidados médicos de apoyo, la inclusión en ensayos clínicos o cuidados paliativos. No debe realizarse la resonancia magnética (RMN) como cribado en ausencia de síntomas, debiendo existir un mínimo de sospecha, teniendo presente la alta incidencia de metástasis cerebrales entre las pacientes con cáncer de mama avanzado HER2 positivo (Ramakrishna et al., 2014). !13.

(32) I. Introducción. Laura Díez. • En el caso de mujeres con cáncer de mama HER2 negativo (o desconocido), la hormonoterapia es preferible a la quimioterapia como tratamiento de primera línea para las pacientes con cáncer de mama metastásico RE positivo, a menos que esta última sea necesaria (ej. enfermedad con alto potencial de mortalidad). Es preferible un único fármaco que la quimioterapia de combinación y en la duración del tratamiento deben tenerse en cuenta los posibles efectos adversos (Ocana et al., 2006). No existe un único tratamiento óptimo de primera línea ni de líneas posteriores, éste vendrá determinado por múltiples factores como la terapia previa, la toxicidad, el estado funcional, las comorbilidades y las preferencias de la paciente. El papel del bevacizumab sigue siendo controvertido aunque hasta el momento no se ha demostrado el beneficio de otras terapias en el cáncer de mama HER2 negativo (Partridge et al., 2014) (Ocana,Amir, et al., 2011).. La evaluación del estado de HER2 también ha sido objeto de numerosos estudios para determinar su aplicación en otros campos: • Factor pronóstico en pacientes no tratadas, asociándose en general a un peor pronóstico. • Predictivo de resistencia a la terapia hormonal. Existen interacciones complejas entre las vías HER2 y RE, en base a lo cual, algunos estudios han demostrado que en las pacientes con cáncer de mama RE positivo y que conjuntamente presenten HER2 positivo, existe una mayor resistencia al tamoxifeno que en las pacientes HER2 negativo. • Predictivo de resistencia a ciertos quimioterápicos como ciclofosfamida, metrotrexato y fluoracilo (CMF), y beneficio con antraciclina. Se asume que las pacientes con sobreexpresión y/o amplificación de HER2 obtienen mejores resultados con la administración de antraciclinas, como quimioterapia adjuvante, y peores con CMF.. Sin embargo, ninguna de éstas últimas aplicaciones ha sido recomendada por la guía clínica de ASCO .. !14.

(33) Laura Díez. I. Introducción. 2.2.3. Activadores e inhibidores del plasminógeno La uroquinasa activadora del plasminógeno (uPA) es una serina proteasa con un papel importante en la capacidad invasiva y metastásica del cáncer. Al unirse a su receptor (uPAR) transforma el plasminógeno en plasmina, mediando en la degradación de la matriz extracelular durante la invasión de células tumorales. Los altos niveles de uPA, así como el inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-1), se han asociado con una menor supervivencia en las mujeres con cáncer de mama. Según las recomendaciones de la guía ASCO, los bajos niveles de ambos marcadores están asociados con un riesgo lo suficientemente bajo de recurrencia, especialmente en mujeres con cáncer de mama RH positivo tratadas con hormonoterapia, que la quimioterapia adyuvante no aporta un gran beneficio. Sin embargo, este beneficio sí es objetivable en las mujeres con mayor riesgo, las cuales presentan niveles elevados de uPA y PAI-1 (Harris et al., 2007).. 2.2.4. Perfil genético La heterogeneidad celular y molecular del cáncer de mama, así como el importante número de genes implicados en el crecimiento, diferenciación y muerte celular ponen de manifiesto la importancia de los perfiles genéticos. El estudio de expresión génica permite la medición simultánea de miles de genes en la célula cancerígena. Actualmente existen varios perfiles de expresión genética en base a microarrays de ADN, siendo los dos primeros los más empleados: • Oncotype DX®. • MammaPrint®. • PAM 50®. • Theros® (Avaria H/I Test). • MapQuant Dx® Genomic.. ONCOTYPE DX Permite un análisis tanto pronóstico como predictivo en mujeres con cáncer de mama RE positivo y sin afectación ganglionar. Identifica a aquellas pacientes que van a !15.

(34) I. Introducción. Laura Díez. tener una mejor respuesta al tratamiento con tamoxifeno sin necesitar quimioterapia adjuvante y aporta información sobre el riesgo de recurrencia en pacientes tratadas con tamoxifeno que se beneficiarán de tratamiento quimioterápico adjuvante (CMF). Se basa en el estudio de 21 genes relacionados con la recidiva a partir de la extracción de ADN de la muestra tumoral. En base al análisis de la expresión de estos 21 genes, se asigna una puntuación de recurrencia al cáncer de mama (recurrence score-RS) que va del 0 al 100, estratificando a las pacientes según su riesgo de recidiva en : • Riesgo bajo (RS < 18). • Riesgo medio (RS18 - 30). • Riesgo alto (RS ≥ 30).. Las pacientes con riesgo bajo presentan un escaso beneficio con el empleo de quimioterapia adyuvante, tanto para el control local como para la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global, no justificando los riesgos de sus efectos secundarios. Este beneficio es estadísticamente significativo en pacientes con alto riesgo. En pacientes con riesgo intermedio, el beneficio de la quimioterapia frente a los riesgos de los efectos adversos no ha sido comprobado. Respecto al índice de recurrencia a distancia a los 10 años del tratamiento con tamoxifeno en pacientes de bajo, medio y alto riesgo, se obtuvieron tasas del 6,8%, 14,3% y 30,5% respectivamente, con independencia del tamaño tumoral y la edad (Gruvberger et al., 2001).. MAMMAPRINT La prueba MammaPrint está aprobada por la FDA (Food and Drug Administration). Permite la identificación mediante técnicas de microarrays de 70 genes a partir de muestras de tejido de cáncer de mama en estadios I y II, clasificando a las pacientes en buen y mal pronóstico según el riesgo. Un resultado de buen pronóstico en la prueba está asociado a una menor tasa de recurrencia en el transcurso de los 10 años posteriores al diagnóstico. Un mal pronóstico, según la expresión génica, está en relación con un mayor riesgo de metástasis a distancia. La probabilidad de permanecer libre de metástasis a distancia y la supervivencia global tras 10 años de diagnóstico de la enfermedad en las. !16.

(35) Laura Díez. I. Introducción. pacientes de bajo y de alto riesgo es del 85,2% y del 94,5% frente al 50,6% y 54,6%, respectivamente (West et al., 2001).. Test genético MammaPrint comercializado ®. Oncotype DX® PAM 50®. Avaria H/I test®. MapQuantDx. Laboratorio. Genomic Health Arup Laboratories. Biotheranostics. Ipsogen. Tipo de ensayo 70 genes. 21 genes. 50 genes. Ratio de 2 genes HOXB13/ILI7R. Grado Genético. Tejido. Fresco o congelado. Fijado formol, con parafina. Fijado formol, con parafina. Fijado formol, con parafina. Fresco o congelado. Técnica. DNA microarrays. Q-RT-PCR. Q-RT-PCR. Q-RT-PCR. DNA Microarrays. Indicación. Ayudar en el pronóstico, pacientes < 61 años, estadio I-II, ganglios negativos, tamaño <5cm. Predecir el riesgo de recurrencia en pacientes con RE positivos, ganglios negativos, tratados con tamoxifeno, para identificar pacientes de bajo riesgo de recurrencia que pueden no necesitar quimioterapia adyuvante. Clasifica a las pacientes N+ y N- en bajo y alto riesgo de recidiva. La ventaja es que discrimina a las paciente de alto riesgo en Luminal B, HER2 y basallike, las cuales el enfoque sistémico y respuesta es diferente. Clasificar los pacientes RE positivo en bajo y alto riesgo de recurrencia. Predecir buena y mala respuesta a la hormonoterapia. En tumores invasivos, RE +, grado II, reclasificarlos en grado I y en grado III. Evidencia. III. II. II. III. III. FDA. Si. NO. NO. NO. NO. Europa y USA. Europa y USA. USA. USA. Europa. Disponible. Agendia. Tabla 3. Tests Genéticos Comercializados (Isern J, 2012).. 2.2.5. Otros biomarcadores En base a la revisión realizada en 2007 por ASCO sobre el empleo de marcadores tumorales en el cáncer de mama, existen diversos biomarcadores que no han demostrado suficiente evidencia científica como para incluirlos en la práctica clínica. Estos son: ADN/ploidía por citometría de flujo, p53, catepsina D, la ciclina E y proteómica, ciertos ensayos de expresión génica, detección de micrometástasis de médula ósea y de células tumorales circulantes (Harris et al., 2007). !17.

(36) I. Introducción. Laura Díez. Tabla 4. Revisión de las recomendaciones sobre el empleo de marcadores tumorales en el cáncer de mama. ASCO 2007 (Harris et al., 2007). !18.

(37) Laura Díez. I. Introducción. 3. Clasificación molecular del cáncer de mama Se identifican cuatro subtipos principales de cáncer de mama en función de los perfiles moleculares, lo que permite establecer diferencias respecto al pronóstico y tratamiento: • Luminal A (>40%): es el subtipo más frecuente. Presenta un patrón inmunofenotípico similar al componente epitelial luminal de la glándula mamaria. Se caracteriza por una alta expresión de genes relacionados con receptores hormonales y citoqueratinas luminales 8/18, así como por una baja expresión de genes de proliferación celular, con un valor de Ki 67 menor del 14%. Menos de un 20% presentan mutaciones en p53 y son mayoritariamente de bajo grado. Es el subgrupo de mejor pronóstico, con una alta respuesta a la hormonoterapia y escaso beneficio con la quimioterapia (Sotiriou et al., 2003). • Luminal B (20%): presenta menores niveles de receptores de progesterona y mayores niveles de genes de proliferación que el subtipo previo. Aunque tiene buen pronóstico, éste es peor que el Luminal A. Los pacientes con este tipo molecular pueden beneficiarse de quimioterapia junto con hormonoterapia, fundamentalmente con inhibidores de la aromatasa (Brenton et al., 2005). • HER2 sobre-expresado (10-15%): se caracteriza por una alta expresión de genes relacionados con la amplificación de HER2 y ausencia de receptores hormonales. Presenta mal pronóstico y un alto grado histológico. Muestra una mayor respuesta a la quimioterapia basada en antraciclinas y taxanos que los subtipos luminales (45% de respuesta completa a quimioterapia basada en paclitaxel seguida de 5-fluoracilo, doxorrubicina y ciclosfosfamida, frente al 6% de respuesta en los subtipos luminales). Son tumores resistentes a la terapia hormonal, debido a la ausencia de receptores hormonales, siendo su tratamiento específico terapias dirigidas contra la proteína HER2 (Rouzier et al., 2005). • Basal (15-20%): Es un subgrupo muy heterogéneo, con un patrón de expresión semejante al de las células epiteliales basales o mioepiteliales del tejido mamario. Se caracteriza por la ausencia de expresión de receptores hormonales y HER2. Expresa citoqueratinas basales (CK 5/6 y 17) y se asocia a una alta expresión de genes de. !19.

(38) I. Introducción. Laura Díez. proliferación celular y del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Presenta un alto porcentaje de mutaciones p53 y son tumores de alto grado, por lo que se relacionan con un comportamiento más agresivo y un peor pronóstico. Este subtipo tumoral no es susceptible a tratamientos hormonales y anti-HER2, aunque presenta una alta sensibilidad a la quimioterapia (Carey et al., 2007). Se ha asociado con mutaciones en el gen BRCA1. El 80% de mujeres con mutación BRCA1 en la línea germinal que desarrollan cáncer de mama, presentan un subtipo basal aunque la mayoría de los subtipos basales son esporádicos (Ribeiro-Silva et al., 2005). Los tumores Triple Negativo se definen inmunohistoquímicamente por la ausencia de expresión de receptores hormonales y HER2 (RE-, PR-, HER2-). Aunque la mayoría de los triple negativos se corresponden con el subtipo basal y viceversa, no todos los triple negativos son basales.. Figura 6. Microarrays de expresión génica (Sorlie et al., 2001).. !20.

(39) Laura Díez. I. Introducción. En la Conferencia de Sant Gallen 2013 se establecieron las recomendaciones para el tratamiento sistémico del cáncer de mama según su clasificación molecular (Goldhirsch et al., 2013).. SUBTIPO. DEFINICION CLÍNICO-PATOLOGICA. NOTAS. RE y/o PR positivo HER2 negativo Ki-67 bajo (<14%) Riesgo de recurrencia “bajo” en base a los perfiles de expresión génica (si están disponibles). - Ki-67: punto de corte variable según el. Luminal A. -. Alto Ki-67 o bajo RP diferencian subtipo Luminal A y Luminal B (HER2 negativo). Luminal B. Luminal B (HER2 negativo) - RE positivo - HER2 negativo - Y al menos uno: • Ki-67 alto (>14) • RP negativo o bajo (<20%) • Riesgo de recurrencia alto en base a los perfiles de expresión génica. -. laboratorio. Ki-67 < 14% es el nivel que mejor correlación tiene con la definición de Luminal A mediante perfil génico RP ≥ 20% es el punto de corte que mejor se corresponde con Luminal A. Luminal B (HER2 positivo) - RE positivo - HER2 sobreexpresado o amplificado - Cualquier Ki-67 - Cualquier RP. HER2 sobreexpresado. Basal-like. HER2 positivo (no luminal) - HER2 sobreexpresado o amplificado - ER y PR negativo Triple negativo (ductal) - ER y PR ausente - HER2 negativo. Triple negativo y basal-like se superponen en el 80% de los casos. Algunos casos con baja tinción para RE son incluidos en el subtipo no luminal en los análisis de expresión génica. Triple negativo también incluye algún tipo histológico especial como el carcinoma adenoide quístico. Tabla 5: Subtipos moleculares del cáncer de mama y tratamiento. Conferencia de San Gallen 2013.. !21.

(40) I. Introducción. Laura Díez. SUBTIPO. Luminal A. Luminal B (HER2 negativo). Luminal B (HER2 positivo) HER2 positivo (no luminal). Triple negativo (ductal). Tipos histológicos especiales: A. Respuesta endocrina B. Respuesta no endocrina. TIPO DE TRATAMIENTO. Hormonoterapia. NOTAS Indicaciones relativas para la asociación a citotóxicos: - 21 genes: alto RS (> 25) - 70 genes: riesgo alto - Grado 3 - Afectación de ≥ 4 ganglios Sin acuerdo respecto a si la edad (< 35 años) es una indicación para administrar citotóxicos. Hormonoterapia ± quimioterapia Quimioterapia + AntiHER2 + Hormonoterapia. Quimioterapia + AntiHER2. Sin datos que apoyen la omisión de quimioterapia en este grupo. Umbral para uso de antiHER2: pT1b o gran tumor o ganglios positivos. Quimioterapia. Hormonoterapia Quimioterapia. El carcinoma adenoide quístico no requiere adyuvancia con quimioterapia (si ganglios negativos). Tabla 6: Tratamiento del cáncer de mama según subtipos. Conferencia de San Gallen 2013.. 4. Biología molecular del cáncer de mama El cáncer mama, como el resto de neoplasias, es una enfermedad genética debida a la adquisición progresiva de una serie de cambios específicos en el material genético, lo que conduce a la pérdida de control de funciones fisiológicas tales como proliferación, migración, supervivencia, angiogénesis e invasión entre otras. La adquisición de estos cambios tiene lugar de manera progresiva, distinguiéndose tres fases: iniciación, !22.

(41) Laura Díez. I. Introducción. promoción y progresión. En base a la teoría monoclonal, el cáncer se origina a partir de una célula única, tras la suma de múltiples mutaciones. Estos cambios en el material genético, confieren a la célula capacidad proliferativa y de supervivencia, transmitiendo la mutación a sus descendientes y generando un clon homogéneo. A lo largo de este proceso se suman nuevas mutaciones que originan distintos clones celulares, responsables del alto grado de heterogeneidad de los tumores. En su fase proliferativa, las células tumorales adquieren capacidad para la invasión local y a distancia, produciendo metastásis (Robbins et al., 2012).. !. Fig. 7. Teoría monoclonal de la oncogénesis. Kumar et robbins.. Existen cuatro alteraciones moleculares implicadas en cáncer: • Prootoncogenes, regulan el crecimiento y proliferación celular. En condiciones normales, ante determinados estímulos externos como factores de crecimiento que son reconocidos por los receptores de membrana, se desencadenan cascadas de señalización intracelular que finalizan en el núcleo, donde se lleva a cabo la transcripción de genes en respuesta a los estímulos recibidos. Cualquier alteración en algunos de estos procesos conduce a un crecimiento celular anárquico.. !23.

(42) I. Introducción. Laura Díez. Los oncogenes son genes alterados, bien por mutaciones puntuales, amplificación genética o translocaciones cromosómicas. Adquieren la capacidad de activar la proliferación celular autónoma en ausencia de señales de crecimiento, siendo responsables de una división celular incontrolada (Lemmon et al., 2010). Los oncogenes pueden codificar proteínas que actúan en distintos niveles de la cascada de señalización, a nivel extracelular como factores de crecimiento, a nivel de membrana como receptores de membrana y a nivel intracelular como segundos mensajeros y factores de transcripción. • Genes supresores tumorales, encargados de limitar el crecimiento celular, bloqueando el proceso de división de las células mediante la detención del ciclo celular. Se activan en respuesta al estrés o a un daño en el material genético, con el fin de llevar a cabo la reparación del ADN o la muerte celular programada. Su mutación implica la proliferación anómala de las células tumorales. Algunos de estos genes son: BRCA1, BRCA2, p53, PTEN, ATM,… (Negrini et al., 2010) • Genes de reparación del ADN, aseguran la integridad del ADN celular mediante la reparación del ADN dañado. Tal es el caso de BRCA1 y BRCA2. • Genes de regulación de la apopotosis o muerte celular programada. Conducen a la muerte de la célula dañada siempre que la reparación del ADN no sea posible.. Hanahan y Weinberg publican (Hanahan et al., 2000) un modelo que define las seis propiedades adquiridas por la célula tumoral durante el proceso oncogénico que determinará su fenotipo maligno : • Autosuficiencia en las señales de crecimiento. • Insensibilidad a las señales inhibitorias del crecimiento. • Potencial de replicación ilimitado. • Capacidad de invasión y metástasis. • Angiogénesis mantenida. • Evasión de la apoptosis.. !24.

(43) Laura Díez. I. Introducción. Este modelo fue posteriormente actualizado (Hanahan et al., 2011), incorporando dos nuevas propiedades, la capacidad de modificar o reprogramar el metabolismo celular, incrementando su potencial proliferativo, y la capacidad de evitar al sistema inmune. Todas estas características adquiridas durante el proceso tumoral se ven favorecidas por la inestabilidad genómica, donde la elevada tasa de mutaciones aleatorias en el ADN favorece la diversidad genética y por tanto la proliferación tumoral. Otro factor favorecedor es la respuesta inflamatoria, inicialmente diseñada por el sistema inmune para hacer frente a las células tumorales, pero con un efecto paradójico. Lejos de suprimir el avance del tumor, la respuesta inflamatoria puede estimular su progresión mediante la liberación de enzimas proteolíticas y factores pro-angiogénicos, activando procesos de neovascularización, necesarios para el aporte de los nutrientes y la diseminación metastásica.. ! Fig. 8. Principales mecanismos del cáncer (Hanahan et al., 2011).. Una segunda premisa cada vez más aceptada es la importancia del microambiente tumoral, basada en el concepto de que las células cancerosas no manifiestan la enfermedad por sí solas, sino que surgen y evolucionan dentro de un ambiente, estableciendo interacciones con otras células no cancerosas. El microambiente tumoral, además de células mutadas, contiene células de inmunidad innata (macrófagos,. !25.

(44) I. Introducción. Laura Díez. neutrófilos, mastocitos, células supresoras de origen mieloide, células dendríticas y células Natural Killer-NK), células de inmunidad adaptativa (linfocitos T y B) y células del estroma (pericitos, células endoteliales, fibroblastos y células mesenquimales) (de Visser et al., 2006). Estas células comunican entre sí por contacto directo o a través de la producción de citoquinas y quimiocinas, actuando de manera autocrina y paracrina en el control del crecimiento y progresión tumoral. Mientras que algunos aspectos han sido ampliamente estudiados, en particular, la angiogénesis tumoral y el remodelado de la matriz extracelular (Dvorak, 1986), otros como la participación del sistema inmune en el crecimiento y progresión del tumor, así como en la resistencia frente a la terapia, siguen siendo actual objeto de estudio.. ! Fig. 9 Contribuciones multifactoriales de las células estromales en el cáncer (Hanahan et al., 2012).. En la presente tesis nos hemos centrado en tres mecanismos fundamentales del proceso oncogénico en el cáncer de mama:. • El papel de los RTKs en los mecanismos de mitosis tumoral. • La importancia de la vía PI3K/Akt/mTOR en la capacidad de supervivencia y proliferación de las células tumorales.. • El papel de la infiltración linfocitaria tumoral en la respuesta del tumor. Todos estos factores se han estudiado en relación al pronóstico en cáncer de mama. !26.

(45) Laura Díez. I. Introducción. 4.1. Receptores tirosina quinasa En el estudio del genoma humano se han identificado 520 genes que codifican para proteínas quinasa, implicadas en la transducción de señales, 90 de las cuales tienen actividad tirosina quinasa. Dentro de este grupo de proteínas quinasa, 58 son receptores tirosina quinasa (Robinson et al., 2000). Se caracterizan por ser receptores transmembrana dotados de actividad fosfo-tirosina quinasa intrínseca. Estas proteínas se sitúan en la membrana plasmática y poseen un dominio extracelular N-terminal de unión a ligandos activos y un dominio citoplasmático C-terminal donde se anclan las moléculas de señalización (Ocana,Amir, et al., 2013). La disfunción de estas proteínas se ha relacionado con el desarrollo de distintos tipos de cáncer, entre ellos el cáncer de mama. Su activación puede producir señales proliferativas vinculadas a la transformación maligna, confiriendo a las células tumorales la capacidad de proliferar sin estímulos externos, siendo, por tanto, responsables de una multiplicación incontrolada y de la invasión de otros tejidos, originando así un clon de células malignas. A esto se une el papel que en determinadas circunstancias juegan en la resistencia frente a terapias antitumorales. Se han descritos varios mecanismos asociados con su activación patológica (Cruz et al., 2007): • Cambio estructural secundario a mutaciones genéticas o truncamientos de la proteína. • Amplificación del gen que conduce a la sobreexpresión de la proteína. • Activación por ligandos. • Falta de mecanismos de regulación, como la pérdida de las fosfatasas.. !27.

(46) I. Introducción. Laura Díez. ! Fig. 10. Activación de RTKs (Ocana,Amir, et al., 2013).. En los últimos años se han realizado importantes avances en la terapia biológica del cáncer de mama, actuando sobre dianas moleculares implicadas en los mecanismos de división celular, proliferación, diferenciación y apoptosis. La identificación de los receptores tirosina quinasa activos en el cáncer de mama, constituye uno de los pilares fundamentales para el desarrollo de nuevos fármacos. Las dianas moleculares más estudiadas en el cáncer de mama son: • Receptores del factor de crecimiento epidérmico humano (erbB): Familia compuesta por cuatro miembros: HER1 (factor de crecimiento epidérmico, EGFR o HER1), HER2 (erbB2 o neu), HER3 (erbB3) y HER4 (erbB4). Su activación inicia una cascada de señalización intracelular responsable de la división celular, migración, adhesión, diferenciación y apoptosis. La activación anómala de estas proteínas puede ser debida a la unión del ligando, sobreexpresión del receptor, alteraciones estructurales del mismo o ausencia de actividad fosfatasa (Yarden, 2001). HER3 carece de dominio quinasa activo por lo que para la transmisión de las señales intracelulares necesita formar heterodímeros con otros miembros de la familia HER con actividad quinasa. Dicha heterodimerización permite la activación de las señales. !28.

(47) Laura Díez. I. Introducción. intracelulares a través de la fosforilación de proteínas citoplasmáticas, desencadenando los mecanismos de proliferación y diferenciación celular. Por tanto, HER3 juega un papel importante en la transducción de señales desde los receptores HER, así como en la resistencia a las terapias anti-HER2 (Ocana,Amir, et al., 2013), por lo que su papel como diana terapéutica en el cáncer de mama está siendo actualmente estudiado. HER2 es el receptor más ampliamente evaluado y su sobreexpresión en el 15-30 % de casos de cáncer de mama determina un subtipo tumoral, asociado a un fenotipo agresivo con menor supervivencia e intervalo libre de enfermedad. El impacto pronóstico del factor de crecimiento epidérmico humano HER2 y la eficacia de las terapias aplicadas sobre dicho receptor mediante trastuzumab (anticuerpo monoclonal) y otros fármacos como lapatinib (inhibidor de tirosina quinasa) está bien establecida, no siendo objeto de revisión en esta tesis (Slamon et al., 2001). • Receptor del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGFR- Vascular Endothelial Growth Factor Receptor): Los receptores de VEGF tienen una porción extracelular compuesta de 7 dominios similares a las inmunoglobulinas, una región transmembrana y un dominio tirosina quinasa intracelular. Su activación está implicada en el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica del cáncer de mama a través de la inducción de la angiogénesis (Weidner et al., 1991). Su sobreexpresión se relaciona con un peor pronóstico de la enfermedad (Liu et al., 2011). Según recientes estudios, VEGFR supone una importante diana terapéutica mediante el empleo del anticuerpo monoclonal bevacizumab, incrementando la tasa de respuestas completas con quimioterapia neoadjuvante, particularmente en el subtipo triple negativo (von Minckwitz et al., 2012). • Receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR- Fibroblast growth factor receptor): Esta familia está compuesta por cuatro miembros (FGFR 1-4). Consta de una región intracelular con actividad tirosina quinasa, una región transmembrana y una región extracelular, formada por tres dominios de tipo inmunoglobulina que permiten su unión con 23 ligandos diferentes. Su activación implica un aumento en la actividad !29.

(48) I. Introducción. Laura Díez. mitótica, favoreciendo los mecanismos de crecimiento y división celular, además de estimular la angiogénesis. FGFR1 es el receptor FGFR descrito con mayor frecuencia en el cáncer de mama, estando amplificado en el 10% de los casos, fundamentalmente en cáncer de mama RE positivo. Su amplificación está en relación con un peor pronóstico y una mayor resistencia al tamoxifeno (modulador selectivo de receptores estrogénicos) (Jain et al., 2012). • Receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFR- Insulin-like growth factor receptor): Existen dos tipos de receptor, IGFR1 e IGFR2, siendo el primero el que más se sobreexpresa en el cáncer de mama, en torno al 40-80% de los casos. IGFR1 está constituido por dos cadenas extracelulares alfa y dos subunidades transmembrana beta con actividad tirosina quinasa. La autofosoforilación de este receptor mediante su unión a ligando conlleva la activación de la vía PI3K, convirtiéndose en un importante modulador de la proliferación, diferenciación e invasión celular a través del control de la apoptosis (Peiro et al., 2009). Distintos estudios han descrito una mayor resistencia frente a terapias anti-HER2 en las pacientes que sobreexpresan dicho receptor (Lu et al., 2001). La activación de IGFR1 se ha asociado con un aumento en la expresión de VEGF, contribuyendo a la angiogénesis (Coskun et al., 2003).. ! Fig. 11. Representación gráfica de receptores tirosina quinasa. !30.

(49) Laura Díez. I. Introducción. DIANA TERAPEUTICA. FARMACO. HER2:HER3. Pertuzumab. HER2 and HER3. AZD8931. IGF-1R. OSI-906 (with erlotinib) AVE1642 R1507 Cixutumumab Cixutumumab/IMC-A12 AMG 479 BMS-754807 Dalotuzumab Figitumumab (CP-751871). EGFR. Erlotinib Gefitinib Canertinib Cetuximab Panitumumab. EGFR/HER2. Lapatinib Neratinib Afatinib. FGFR1/2/3. AZD4547. VEGFR2. Pazopanib/GW786034 Sorafenib Ramucirumab (IMC-1121B) Motesanib (AMG706) Cediranib (AZD2171) Cediranib (AZD2171) Sunitinib. HER 3. RO5479599 (antibody against HER3) MM-111 (antibody against HER2 and 3) MM-121 U3-1287. VEGFR and FGFR. Nintedanib (BIBF 1120) Dovitinib (TKI258). VEFFR and EGFR. Vandetanib/Zactima Vandetanib. HER 1/2. Cipatinib. Tabla 7. Fármacos en desarrollo clínico dirigidos contra RTKs en el cáncer de mama.. !31.

(50) I. Introducción. Laura Díez. 4.2. Vía PI3K/Akt/mTOR La activación de los receptores tirosina quinasa requiere de su oligomerización, generalmente en respuesta a la unión con un ligando, lo que conduce a la fosforilación de los residuos de tirosina quinasa de las subunidades del receptor, convirtiéndose en puntos de unión a proteínas citoplasmáticas responsables de desencadenar una cascada de señales intracelulares (Schlessinger, 2000). Una de las vías activadas por los RTKs es la ruta fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K)/Akt/mTOR (mammalian target of rapamycin). PI3KCA codifica la subunidad catalítica p110α y junto con la subunidad reguladora p85, conforman PI3K. La vía PI3K es estimulada fisiológicamente como consecuencia de la activación de RTKs, los cuales fosforilan el sustrato del receptor de insulina (IRS) y éste a su vez, fosforila la subunidad p85 de PI3K, provocando un cambio conformacional de dicha proteína y su unión a la subunidad catalítica p110α. PI3KCA activo, fosforila el fosfatidil inositol 3, 4 difosfato (PIP2) convirtiéndolo en el segundo mensajero fosfatidil inositol 3, 4, 5 trifosfato (PIP3). PIP3 sirve como ligando, contribuyendo a reclutar Akt hacia la membrana plasmática. Una vez en la cara interna de la membrana, Akt es fosforilada por una serina/treonina quinasa dependiente de fosfatidil inositol-3 (PDK1). La fosforilación de Akt constituye el punto de arranque de diferentes vías de señalización, mTOR entre otras, responsables de los mecanismos de proliferación, angiogénesis, supervivencia, motilidad, resistencia a fármacos y diseminación metastásica.. PI3KCA Las mutaciones en este gen se localizan en dos puntos: E542K o E545K, situado en dominio helicoidal y H1047R, en el dominio de la quinasa (Samuels et al., 2004). El pronóstico de la enfermedad varía según la ubicación de la mutación. Así, mutaciones en el dominio helicoidal se asocian con una menor supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad, mientras que las mujeres con cáncer de mama con mutación en el dominio quinasa muestran una mayor supervivencia (Barbareschi et al., 2007). PI3KCA, junto con p53, es uno de los genes más frecuentemente mutados en el cáncer de mama (Bachman et al., 2004). Se han descrito cifras de mutación para PI3KCA del 35% en tumores RE positivo, 23% en HER2 positivo y 8% en tumores basales. Además de los !32.

(51) Laura Díez. I. Introducción. subtipos principales, hay un número de variantes patológicas raras como el cáncer de mama metaplásico que muestra una alta tasa de mutación en PI3KCA (47%) (Bachman et al., 2004).. PTEN Es un gen supresor tumoral (10q23) con acción antagónica a PI3K. Codifica para una proteína con actividad fostatasa con capacidad para desfosforilar PIP3, inhibiendo la activación de Akt y por tanto, regulando la señal de supervivencia celular. Su mutación o pérdida de expresión implica un hiperactivación de la vía PI3K/AKT/mTOR, con la consiguiente proliferación tumoral (Schlessinger, 2000).. !. Fig. 12. Representación esquemática de la vía PI3K/Akt/mTOR.. Teniendo en cuenta su papel pre-oncogénico, la vía PI3K/AKT/mTOR se ha convertido en objeto de interés en la identificación de posibles dianas terapéuticas así como de biomarcadores pronósticos y predictivos de respuesta. Se han definido distintas dianas terapéuticas: inhibidores PI3K puros, duales PI3K-mTOR, inhibidores de AKT e inhibidores de mTOR. A pesar de la aprobación de algunos fármacos y del desarrollo clínico de agentes dirigidos contra la ruta PI3K/AKT/mTOR, poco se sabe sobre qué pacientes tienen más probabilidades de beneficiarse con este tipo de terapias. Del mismo modo, la relación entre las alteraciones de esta vía y un fenotipo más agresivo, así como el pronóstico, no está claro.. !33.

(52) I. Introducción. Laura Díez. 4.3. Infiltración linfocitaria tumoral (TIL) Los patólogos han reconocido desde hace tiempo el papel del sistema inmune en la oncogénesis, demostrando que algunos tumores son densamente infiltrados por las células del sistema inmune innato y adaptativo (Dvorak, 1986). De hecho, esta asociación ya había sido enunciada por Virchow en el siglo XIX. Inicialmente, se pensó que su función era la erradicación de las células mutadas, sin embargo, en el año 2000 comenzó a haber indicios de que la respuesta inflamatoria tenía un efecto paradójico, pues ayudaba a las células tumorales a adquirir las propiedades que le conferían un fenotipo maligno. En la década posterior han aumentado las investigaciones sobre las interacciones en el microambiente tumoral entre las células tumorales e inflamatorias, demostrando su contribución al proceso oncogénico al favorecer la proliferación celular, la inestabilidad genómica y la diseminación metastásica (DeNardo et al., 2010). La mayoría de los tumores sólidos desencadenan una respuesta inflamatoria intrínseca que genera un microambiente favorable para la proliferación tumoral mediante la liberación de moléculas bioactivas tales como factores de crecimiento que mantienen las señales proliferativas, factores de supervivencia que evitan la muerte celular y factores angiogénicos que estimulan la neovascularización (Mantovani, 2010). En alguna fase del proceso oncogénico, disminuye el suministro vascular y por tanto el oxígeno y nutrientes, lo que ocasiona la muerte celular por necrosis, liberando mediadores proinflamatorios como IL-1 y HMGB1 (Vakkila et al., 2004). La respuesta inflamatoria subsiguiente promueve la angiogénesis y la supervivencia de las células cancerosas mediante la liberación de factores de crecimiento adicionales producidos por las células inflamatorias y las células inmunes reclutadas (Karin et al., 2006). Entre las principales células inmunes presentes en el microambiente tumoral, destacan los linfocitos, distinguiéndose varios subtipos:. • Los linfocitos T citotóxicos (CD8): producen la muerte celular mediante la liberación de IFN-gamma, ejerciendo una importante función en la respuesta antitumoral.. • Linfocitos T helper (CD4): Th1-CD4, al ser activados secretan interferón (IFN) γ, factor de necrosis tumoral (TNF) α, IL2 y IL12. Estas citoquinas favorecen el !34.

(53) Laura Díez. I. Introducción. procesamiento de antígenos y la expresión de moléculas CMH clase I y II, además de regular la actividad citotóxica de los linfocitos CD8. Las células Th1 también pueden actuar directamente sobre las células tumorales por liberación de altos niveles de IFNγ, TNFα y gránulos citolíticos. Por lo tanto, participan directa e indirectamente sobre los mecanismos antitumoles que frenan el desarrollo del cáncer. En contraste, los linfocitos Th2-CD4, expresan IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13. Alteran la repuesta inmune adaptativa inhibiendo la acción citotóxica mediada por linfocitos CD8, potencian la respuesta humoral tumoral a través de los linfocitos B e inhiben la apoptosis. En base a esto, una alto cociente Th2/Th1 se ha correlacionado con parámetros de progresión de la enfermedad, así como con un mayor tamaño tumoral y afectación ganglionar en el cáncer de mama (Chin et al., 1992). Th17CD4, son inducidos por una combinación de IL-6 y TGF-β y median sus efectos a través de la secreción de IL-17, IL-21 y IL-22. Parecen tener una función en la protección frente a patógenos extracelulares, posiblemente mediante el reclutamiento de células inflamatorias (Faghih et al., 2014).. • Linfocitos T reguladores (Treg). Expresan el fenotipo CD4+CD25+FOXP3+. Tienen capacidad para inhibir la activación y proliferación de los linfocitos CD4 y CD8. El incremento en la infiltración de linfocitos Treg se ha relacionado con un peor pronóstico en distintos tipos de cánceres, entre ellos el cáncer de mama (Demir et al., 2013).. Otras células inmunes también han sido descritas dentro del microambiente tumoral como macrófagos y células NK. El alto porcentaje de infiltración tumoral por macrófagos se ha relacionado con un peor pronóstico. Los macrófagos promueven el crecimiento del tumor mediante la secrección de factores de crecimiento, liberación de citoquinas proangiogénicas tales como VEGF, TNF-α, IL-8 y bFGF, y enzimas que estimulan los procesos metastásicos como las metaloproteinasas MMP-2, MMP-7, MMP-9 y MMP-12. Las células NK, cuya diferenciación y función está controlada por una compleja red de citocinas como IL 2, IFNγ y IL-12, potencian mecanismos citotóxicos. Tienen, por tanto, junto con los CD8 una función antitumoral (Ruffell et al., 2010).. !35.

(54) I. Introducción. Laura Díez. ! Fig. 13. Mecanismos de acción pro y antitumoral del sistema inmune (Ruffell et al., 2010).. Existen cada vez más estudios que hacen referencia a la existencia de una respuesta inmune antitumoral en algunos tipos de cáncer (Bindea et al., 2010). Por ejemplo, pacientes con cáncer de colon y ovario con un elevado infiltrado tumoral de linfocitos T citotóxicos y NK, se ha descrito que presentan un mejor pronóstico que aquellas con menores porcentajes de infiltración (Pages et al., 2010). Sin embargo, su confirmación en otros tipos de cáncer, como el cáncer de mama, es aún objeto de investigación.. 5. Estado actual del problema La alteración en la regulación de varios RTKs se ha visto vinculada a la génesis y progresión del cáncer de mama. Los mecanismos asociados a su activación patológica incluyen: cambio estructural (por mutaciones puntuales o truncamientos de proteína), amplificaciones del gen que conducen a la sobreexpresión de la proteína y activación por ligandos (Cruz et al., 2007).También la falta de mecanismos de regulación debido a la pérdida de las fosfatasas puede estar involucrada en su activación (Sun et al., 2011). Debido al papel potencial que desempeñan en la patogenia del cáncer de mama, los RTKs !36.