Variabilidad genética del espaciador intergénico psbA-trnH
en Amaranthus L. (Amaranthaceae)
Carlos Torres – Miño1,2, M.A. Slugina3, M. A. Filyushin4, Rafael Hernández - Maqueda1 1Universidad Técnica de Cotopaxi, 3 Universidad Estatal de Moscú, 4Centro de Bioingeniería de la
Academia de Ciencias de Rusia
Resumen
En el presente trabajo se analizó la secuencia psbA-trnH de 16 muestras de Amaranthus (A. flavus, A. aureus, A. gangeticus, A. floridanus, A. hypochondriacus A. giganteus, A. mantegazzianus, A. bouchonii, A. mangostanus, A. oleraceus, A. tricolor, A. cruentus, A. hybridus, A. caudatus) para determinar la variabilidad genética. La región estudiada se caracterizó por tener un bajo nivel de polimorfismo (2,36% de las bases nucleotídicas). Se detectó la presencia de polimorfismos de nucleótido simple (en adelante, SNPs) e indeles. La especie silvestre A. gangeticus presentó la mayor variabilidad (2 haplotipos). Se describen, por primera vez 11 haplotipos de especies silvestres y cultivadas de Amaranthus. Es necesario explorar otro tipo de marcadores moleculares (AFLP, SSR, RAPD) que podrían ser más resolutivos para resolver cuestiones taxonómicas y filogenéticas dentro del género.
Palabras clave: Amaranthus, espaciador intergénico, polimorfismo genético, cebador.
Abstract
In this study we analyzed the plastid region psbA-trnH of 16 Amaranthus (A. flavus, A. aureus, A. gangeticus, A. floridanus, A. hypochondriacus A. giganteus, A. mantegazzianus, A. bouchonii, A. mangostanus, A. oleraceus, A. tricolor, A. cruentus, A. hybridus, A. caudatus) in order to determinate genetic variability. The region studied resulted in a low polymorphism level (2,36% of the nucleotide bases). Simple Nucleoite Polymorphism (hence forth SNPs) and indels were detected. The wild species A. gangeticus showed the highest genetic variability (2 haplotypes). 11 haplotypes were described for the first time for both cultivated and wild species of Amaranthus. Other molecular markers such as AFLP, SSR, RAPD must be explored to resolve the taxonomic and phylogenetic problems within the genus.
Introducción
El género Amaranthus L. incluye alrededor de 60 especies de plantas anuales con semillas pequeñas, de un peso aproximado de 0,1-0,5 gr por cada 1000 semillas (Kononkov P.F, 2008). La mayoría de estas especies son consideradas malezas (A. retroflexus L., A. hybridus L., A. powellii S. Watt., A. spinosus L), aunque algunas especies de amaranto pueden ser utilizadas como cereales, hortalizas, forrajes, oleaginosas y decorativas. Algunas de ellas como A. blitum L.; sin. A. lividus L., A. viridis L.; sin. A. gracilis Desf. y A. tricolor L.; sin. A. gangeticus L, son muy apreciadas, especialmente en los trópicos húmedos de África y Asia, por el valor nutritivo, alto rendimiento y tolerancia a altas temperaturas. En América se consumen las semillas de amaranto de las especies A. caudatus, A. hypohondriacus y A. cruentus. (Sauer J. D., 1950).
El género Amaranthus se caracteriza por poseer una alta variabilidad genética interespecifica e intraespecifica (Mosyakin y Robertson, 1996). Esta variabilidad, así como la capacidad de formar híbridos inter- e intraespecíficos (Trucco, 2009) no permiten definir claramente los límites de las especies, por lo que la taxonomía del género Amaranthus no está resuelta (M. Costea, et al, 2006). Los resultados obtenidos en diferentes estudios a nivel molecular y bioquímico han resultado contradictorios (Xu F, Sun M, 2001; LimanskiĬ SV., De 2012), por lo que muchas cuestiones permanecen sin resolver respecto a la variabilidad genómica del género Amaranthus.
En la actualidad, para abordar este tipo de
puede ser determinada con facilidad y puede ser bastante informativo a nivel interespecífico, por lo que puede ser empleado como un código de barras genético (bar-coding) para diferenciar especies similares morfológicamente. En consecuencia, esta región ha sido ampliamente utilizada para establecer la taxonomía de familias y géneros, la determinación de relaciones filogenéticas y para la identificación de especies. (Li DZ et al, 2011). En estudios recientes (Pang et al 2012; Gere et al., 2013) se determinó el polimorfismo de esta región para 12 géneros de plantas, con una precisión taxonómica de más del 70%. Esto confirma que el polimorfismo de la secuencia del espaciador psbA-trnH es una buena herramienta para la identificación de especies y la evaluación de la variabilidad genómica.
En este trabajo se estudió la secuencia del fragmento psbA-trnH para caracterizar la variabilidad genética y evaluar su posible uso para la determinación de haplotipos en Amaranthus.
Metodología
El ADN fue extraído de los tejidos de las hojas de amaranto de 15 días, con una desproteinización adicional usando una mezcla de fenol/cloroformo.
Para la amplificación de la secuencia de psbA-trnH se utilizaron los cebadores prpsbA-trnH (CGCGCATGGTGGATTCACAATCC), psbA (GTTATGCATGAACGTAATGCTC) (White, 1990). Para la determinación de la secuencia de los nucleótidos se empleó el sistema de Bigdye (Applied Biosystems) en el ABI PRISM 310 (Applied Biosystems).
Para la alineación de las secuencias se utilizó el software MEGA 5.0.
Resultados y discusión
El nivel total de la variabilidad genética del fragmento analizado fue de 2,36 %, lo que indica un nivel bajo de polimorfismo entre las especies estudiadas.
En plantas vasculares, la longitud del espaciador psbA- trnH es de alrededor de 450 pb (Pang et al 2012), sin embargo en las especies estudiadas el fragmento analizado no sobrepasó los 250 pb (Figura 1). La longitud Tabla 1. Colección de especies de Amaranthus, seleccionadas para el análisis.
Muestras Origen
A. aureus L. Hungría
A. bouchonii Thell. Costea & Carretero. Gran Bretaña
A. caudatus L. var. Bulava Rusia, VNIISSOK
A. cruentus L. var. Duimovochka Rusia, VNIISSOK
A. flavus L. Gran Bretaña
A. floridanus (S. Watson) Sauer. Estados Unidos
A. gangeticus L. Bangladesh
A. giganteus L’Hér. ex Moq. Tanzania
A. gangeticus L . var. Molten fire. Bangladesh
A. hybridus L.var. Nezhenka Rusia, VNIISSOK
A. hypochondriacus L. var. Kempsay Australia
A. hypochondriacus L. var. Krepish Rusia, VNIISSOK
A. mangostanus L. Tanzania
A. mantegazzianus Pass. Argentina
A. oleraceus L. Bangladesh
A. tricolor L. var.Valentina Rusia, VNIISSOK
de la secuencia varió desde los 238 pb en (A. mantegazzianus, A. bouchonii) hasta 250 pb en (A. gangeticus). Se detectaron 7 inserciones/deleciones (codificados como indeles) que explican las diferencias de longitud en el fragmento analizado (Tabla 2).
Tabla 2. Polimorfismo de la región psbA-trnH en Amaranthus.
Longitud de la secuencia sin indeles, pb
Cantidad de sitios conservativos / (%)
Cantidad de sitios variables / (%)
Cantidad de sitio informativos en
parsimonia / %
Cantidad de sitios únicos (singleton) / %
Cantidad de indeles (inserciones/ deleciones)
AT (%)
Desde 238 hasta
250
238/250
(95,2 %) (2,4 %)6/250 (1,2 %)3 3 (1,2%) 7 68,4%
El mayor número de indeles identificados en la secuencia del espaciador psbA- trnH, se dio en la especie A. gangeticus.
Figura 2. Inserción de 10pb en la composición de la secuencia del espaciador psbA-trnH en la especie A. gangeticus.
En el estudio, además de secuencias propias para cada especie, se detectaron inserciones/ deleciones compartidas por varias especies (Figura 3).
Figura 3. Indeles en la composición del fragmento psbA-trnH comunes para varias especies
Además de estas inserciones y deleciones identificadas en el fragmento trnH-psbA, se encontraron 6 polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs) de los cuales tres son sitios informativos en parsimonia (sinapomorfías). En base a la presencia de inserciones, deleciones, y SNPs, se determinaron los haplogrupos de las especies de amaranto en análisis. Se identificaron un total de 11 haplotipos. Siete de ellos son propios para cada especie (A. flavus, A. aureus, A. gangeticus, A. giganteus, A. mantegazzianus, A. bouchonii, A. caudatus var. Bulava). Sin embargo el resto de haplotipos agrupan dos o más especies. El grupo más grande (haplotipo 4) incluye tres
Tabla 3. Haplotipos del fragmento psbA-trnH de las muestras de amaranto.
Conclusiones
La variabilidad de los nucleótidos en el fragmento analizado psbA - trnH es bastante baja, lo que indica que dicha región es conservativa en Amaranthus. Una excepción es la especie A. gangeticus con 2 haplotipos. Esta baja variabilidad de la región del ADN cloroplástico psbA - trnH, coincide con el bajo polimorfismo en isoenzimas (Jain , SK y Hauptli , H., 1980), así como en la región de los espaciadores transcritos internos ITS1 , ITS2 y el gen ribosomal 5.8S, donde también se pudo evidenciar un bajo polimorfismo en sus secuencias (Slugina, Torres Miño y Filyushin, 2014). Debido a esto se recomienda realizar estudios con otro tipo de marcadores moleculares como AFLP, SSR y RAPD que, según investigaciones previas (Limanski SV.2012, Xu F, Sun M., 2001) han mostrado un alto nivel de polimorfismo genómico con un 85-97% de variación y que, por lo tanto, podrían ayudar a clarificar las dudas taxonómicas y filogenéticas que
Literatura citada
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