Actividad antifúngica del extracto alcohólico y aceite esencial de plantago major (llantén) frente a cándida albicans

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UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES

UNIANDES

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

PROGRAMA DE MAESTRÍA EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE MAGISTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA

TEMA:

ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO ALCOHÓLICO Y ACEITE ESENCIAL DE Plantago major (LLANTÉN) FRENTE A Candida albicans.

AUTORA: BQF. CARGUA QUISHPI RUTH ELIZABETH

ASESORES: ING. OÑA CISNEROS FABIAN DAVID, MSC PHD(C)

DR. VITERI RODRIGUEZ JUAN ALBERTO, MSC

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APROBACIÓN DE LOS ASESORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN

CERTIFICACIÓN:

Quienes suscriben, legalmente CERTIFICAN QUE: El presente Trabajo de Titulación realizado por la señora BQF. Cargua Quishpi Ruth Elizabeth, Maestrante del Programa de Maestría de Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, con el tema “ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO ALCOHÒLICO Y ACEITE ESENCIAL DE Plantago major (LLANTÉN) FRENTE A Candida albicans.”, ha sido prolijamente revisado, y cumple con todos los requisitos establecidos en la normativa pertinente de la Universidad Regional Autónoma de los Andes -UNIANDES-, por lo que apruebe su presentación.

Ambato, mayo 2018

______________________________

Ing. Oña Cisneros Fabián David, MSc PhD(C)

ASESOR

_____________________________

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DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD

Yo, Cargua Quishpi Ruth Elizabeth maestrante del Programa de Maestría de Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, declaro que todos los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, previo a la obtención del Grado Académico de MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA, son absolutamente originales, auténticos y personales; a excepción de las citas, por lo que son de mi exclusiva responsabilidad.

Ambato, mayo 2018

_____________________________ BQF. Cargua Quishpi Ruth Elizabeth C.I. 0603610544

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DERECHOS DE LA AUTORA

Yo, Cargua Quishpi Ruth Elizabeth declaro que conozco y acepto la disposición constante en el literal d) del Art. 85 del Estatuto de la Universidad Regional Autónoma de los Andes, que en su parte pertinente dice: El patrimonio de la UNIANDES está constituido por…”La propiedad intelectual

sobre las Investigaciones, trabajos científicos o técnicos, proyectos profesionales y consultoría que se realicen en la Universidad o por cuenta de ella...”

Ambato, mayo 2018

_____________________________ BQF. Cargua Quishpi Ruth Elizabeth C.I.0603610544

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RESUMEN

Las propiedades demostradas por especies del género Plantaginaceae se deben a su composición química, basada principalmente en flavonoides, taninos, un glucosido iridoide denominado aucubina y otro llamado catapol. Este género ha sido objeto de numerosos estudios fitoquímicos y de actividad biológica. El presente trabajo evaluó la actividad antimicrobiana in vitro del extracto etanólico y aceite esencial de Plantago major sobre cepas de Candida albicans mediante la técnica de difusión de disco en agar. Se evaluaron cuatro concentraciones del extracto etanólico al 25%, 50%, 75% y 100%, alcohol absoluto como blanco y ketoconazol como antifúngico, el aceite esencial de

Plantago major no pudo ser obtenida a partir de la metodología empleada en el presente estudio. Se realizó la lectura de los halos de inhibición a las 24 horas de incubada la muestra. Como resultado se encontró que los extractos etanólicos de Plantago major presentaron actividad antimicrobiana contra

Candida albicans (100% HI promedio= 18.0 mm; 75%, HI promedio= 14.33 mm; ketoconazol HI promedio= 13.0 mm) y los extractos etanólicos al 25%, 50% y alcohol absoluto no poseen actividad antimicrobiana. Se estableció que la actividad antifúngico aumenta de forma proporcional a la concentración del extracto. En conclusión, existe un efecto bactericida mostrado por el extracto bruto etanólico de Plantago major sobre Candida albican. Estudios posteriores son necesarios para elucidar su efecto in vivo y evaluar su toxicidad.

Palabras claves: Actividad antifúngica, extracto alcohólico, aceite esencial de

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ABSTRACT

The properties demonstrated by species of the genus Plantaginaceae are due to the chemical composition based mainly on flavonoids, tannins, an iridoid glycoside called aucubin, and another called catapol. This genre has been the subject of numerous phytochemical and biological activity studies. The present work evaluated the in vitro antimicrobial activity of the ethanolic extract and essential oil of Plantago major on strains of Candida albicans through the disk diffusion technique in agar. Four concentrations of ethanolic extract were evaluated at 25%, 50%, 75%, and 100%, absolute alcohol as target and ketoconazole as antifungal, the essential oil of Plantago major could not be obtained from the methodology used in the present study. The inhibition halos were read 24 hours after the sample was incubated. As a result, it was found that the ethanolic extracts of Plantago major showed microbial activity against

Candida albicans (100% mean HI = 18.0 mm, 75% average HI = 14.33 mm, average ketoconazole HI = 13.0 mm) and 25% ethanolic extracts 50 %, and absolute alcohol have no microbial activity. It was established that the antifungal activity increases proportionally to the concentration of the extract. In conclusion, there is a bactericidal effect shown by the crude ethanol extract of

Plantago major on Candida albicans. Further studies are necessary to elucidate its effect in vivo and evaluate its toxicity.

Key words: Antifungal activity, alcoholic extract, essential oil of Plantago major

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ÍNDICE GENERAL

PORTADA

APROBACIÓN DE LOS ASESORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD

DERECHOS DE AUTOR RESUMEN

ABSTRACT

INTRODUCCIÓN ... 1

ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN ... 1

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ... 3

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ... 4

DELIMITACIÓN DEL PROBLEMA ... 4

OBJETO DE INVESTIGACIÓN ... 4

CAMPO DE ACCIÓN ... 5

IDENTIFICACIÓN DE LA LÍNEA DE INVESTIGACIÓN ... 5

OBJETIVO GENERAL ... 5

IDEA A DEFENDER ... 5

APORTE TEÓRICO, SIGNIFICACIÓN PRÁCTICA Y NOVEDAD CIENTÍFICA ... 5

CAPÍTULO I: MARCO TEÓRICO ... 8

MEDICINA TRADICIONAL ... 8

1.1 USO DE LAS PLANTAS MEDICINALES ... 8

1.2 ESTUDIOS ETNOBOTÁNICOS Y ETNOFARMACOLÓGICOS ... 9

1.3 PLANTAGO MAJOR (PLANTA DE LLANTÉN) ... 9

1.4 1.4.1 Características ... 9

1.4.2 Actividad Biológica ... 11

1.4.3 Actividad Antimicrobiana ... 11

OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ... 12

1.5 1.5.1 Extracción de Principios Activos... 12

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1.5.2.1 Maceración ... 13

1.5.2.2 Percolación o lixiviación ... 13

1.5.2.3 Método de obtención de aceites esenciales ... 14

1.5.2.4 Método destilación por arrastre con vapor ... 14

1.5.2.5 Caracterización Fitoquímica ... 14

MICROORGANISMO DE IMPORTANCIA CLÍNICA ... 16

1.6 1.6.1 Candida albicans ... 16

1.6.1.1 Características generales ... 16

1.6.1.2 Patogenicidad ... 16

1.6.1.3 Actividad Antimicrobiana y Resistencia ... 17

CAPITULO II. MARCO METODOLÓGICO ... 19

DESCRIPCIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO ... 19

2.1 TRABAJO DE CAMPO ... 19

2.2 ANÁLISIS DE DATOS ETNOBOTÁNICOS ... 20

2.3 2.3.1 Nivel de uso significativo ... 20

2.3.2 Calculo de valor de uso ... 21

OBTENCIÓN DE PRINCIPIOS ACTIVOS ... 21

2.4 2.4.1 Recolección de la materia prima ... 21

2.4.2 Acondicionamiento ... 21

2.4.3 Método por Maceración ... 21

2.4.4 Arrastre por vapor ... 22

2.4.5 Caracterización Fitoquímica ... 22

2.4.5.1 Ensayo de Dragendorff (Alcaloides) ... 22

2.4.5.2 Ensayo de Baljet (Cumarinas) ... 22

2.4.5.3 Ensayo de Borntrager (Quinonas) ... 23

2.4.5.4 Ensayo de Liebermann-Burchard (triterpenos y/o esteroides) .. 23

2.4.5.5 Ensayo de la espuma (Saponinas) ... 23

2.4.5.6 Ensayo del cloruro férrico (Fenólicos y/o Taninos) ... 23

2.4.5.7 Ensayo de Shinoda (Flavonoides) ... 24

2.4.5.8 Ensayo de Sudan (Compuestos Grasos) ... 24

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA ... 24

2.5 2.5.1 Preparación Agar dextrosa Sabouraud ... 24

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2.5.3 Preparación del inóculo ... 25 2.5.4 Inoculación de las placas ... 25 2.5.5 Preparación de los discos de papel filtro (extractos alcohólicos) ... 25 2.5.6 Lecturas e interpretación de resultados ... 26

CAPITULO III: RESULTADOS DE LA INVESTIGACIÓN ... 27 ESTUDIO ETNOFARMACOLÓGICO ... 27 3.1

CAPITULO IV: DISCUSIÓN ... 34 CONCLUSIONES ... 37 RECOMENDACIONES ... 38 REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍA

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INTRODUCCIÓN

Antecedentes de la investigación

El uso de plantas medicinales tiene su origen en las antiguas civilizaciones antes de J. C, para curar patologías que afectan la salud. Hoy por hoy, esta alternativa medica experimenta un auge cada vez más creciente; sin embargo, estas no son absolutamente nuevas, casi en su totalidad son los resultados de técnicas y procedimientos usados tradicionalmente (1). Por tal motivo, en la actualidad, existen avances en el campo de la investigación de medicina ancestral para encontrar nuevos principios activos en platas que fueron usadas como medicina en la antigüedad, pero de forma empírica. Por lo tanto, surge iniciativas científicas de establecer un tratamiento fitoterapéutico que involucre: la selección, dosificación, vía de administración y recomendaciones para el paciente acerca de la alternativa natural (2-3).

Según la Organización Mundial de la Salud OMS, el 80% de la población mundial, utilizan las plantas como principal remedio medicinal y más del 25% de los fármacos existentes se obtiene de extractos vegetales, o bien se han sintetizado a partir de sustancias encontradas en la investigación fitoquímica (4). Ante este panorama, en Europa y Estados unidos más del 90% de la población utilizan las plantas medicinales, como una alternativa terapéutica para sus dolencias (5).

En Ecuador las plantas usadas por poblaciones indígenas han sido estudiadas

in vitro para buscar actividades antifúngicas, antibacteriales, antiinflamatorias y antivirales con un solo objetivo de ampliar el uso de la medicina ancestral, como terapia única o combinada con otros medicamentos (6).

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que afecta los tejidos que rodean y sostienen a los dientes, finalizando su etapa con la perdida de los dientes (7-8).

Plantago major (llantén), originaria de Europa y Asia. Es una herbácea perenne, de raíces blancas de tamaño uniforme, tallos subterráneos no ramificados y hojas ovaladas de color verde claro; poseen aproximadamente 50 cm de longitud y un ancho de 20 cm en plantas adultas, rica en principios activos. Puede ser cultivada en climas templados y fríos. Popularmente se la conoce como: llantén mayor, llantén común o llantén grande (9).

Desde la década de los 60s, Plantago major ha sido usada para tratar afecciones cutáneas, patologías asociadas al sistema digestivo, patologías ligadas a vías respiratorias y patologías de la cavidad bucal, especialmente en zonas rurales como medicina alternativa (10).

Investigaciones realizadas sobres Plantago major han revelado la presencia de flavonoides, taninos, alcaloides, terpenoides, fenólicos derivados de ácido, glucósidos iridoides, ácidos grasos, polisacáridos y vitaminas, que son principios activos con potencial efecto terapéutico. En consecuencia, han encontrado que Plantago major promueve la cicatrización de heridas, tiene propiedades antiulcerantes, antidiabéticas, antidiarreicas, antiinflamatorias, antinociceptivas, antibacterianas, antifúngicas, antivirales, antioxidantes, anticancerígenas y su consumo disminuye la fatiga. Es importante resaltar que el compuesto de mayor relevancia es un glucósido denominado aucubigemina, derivado de la aucubina y se cree que es responsable de la actividad antibacteriana de la planta.Tanto las hojas como las flores y el tallo poseen el glucósido aucubina (11).

En el año 2000, realizaron un estudio clínico comparativo, para evaluar el tratamiento de la enfermedad gingival usando como principio activo el llantén, llegando a la conclusión de que sí existe respuesta favorable en la enfermedad gingival (11).

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Plantago major tiene efectos contra Streptococcus pneumoniae sistémico serotipo 6B (11).

Otro estudio, realizado por Velasco-Lezama, R, et al, demostraron que la actividad antibacteriana y antifúngica delas hojas y semillas de Plantago major, en fracción de metanol, cloroformo y los extractos de hexano, en diferentes concentraciones, fueron positivos contra Escherichia coli, Bacillus subtilis y cultivos de Candida albicans (12).

Sharifa AA, et al, realizaron un estudio para evaluar la actividad bacteriana de

Plantago major con los tallos, hojas y raíces, con extracto acuoso, metanol y etanol, frente a Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Candida tropicalis y Escherichia coli, donde observaron que, tiene actividad bacteriana contra Gram positivos y Gram negativas a concentraciones de 100-200 mg/mL, y ausencia de actividad contra levaduras (13-14).

Planteamiento del problema

La enfermedad periodontal es una de las enfermedades bucales con mayor frecuencia en el ser humano, constituye la segunda patología más padecida por el hombre después de la caries dental, y afecta a más del 75% de población en todo el mundo (15).

La Candida albicans es una variedad de hongo muy frecuente y que se vuelve patogénico por una serie de factores predisponentes y tiene comportamiento aerobio. El 23% de pacientes portadores de prótesis dentales tienen Cándida albicans; por lo general es saprófito inofensivo, habita normalmente en la boca, en el tubo intestinal y la vagina de las mujeres (16).

La candidiasis se presenta en pacientes geriátricos, inmunodeprimidos o por factores locales como mala higiene, mal estado protésico, traumatismos físico químicos, se presenta como manchas blancas que pueden ser desprendidas quedando una superficie sangrante o rojiza (17).

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alimentarse, impidiendo la correcta ingesta de alimento, lo que podría ser fatal en pacientes que necesitan una ingesta hipercalórica como es el caso de pacientes con VIH (18).

Muchos han sido los factores que han contribuido al incremento de cepas multirresistentes a antibióticos, entre ellos su uso inadecuado e indiscriminado de los fármacos, transformándose en un serio problema clínico, es entonces necesaria la planificación de modalidades alternativas que permitan curar las infecciones en la medicina moderna (18-19).

Considerando todo aquello, se intenta sugerir una oferta oportuna sobre el uso idóneo del llantén como alternativas farmacológicas que no tengan efectos secundarios y con menores costos, que se convierta en una herramienta valiosa como método complementario en el tratamiento de la enfermedad periodontal.

El Objetivo de este estudio es demostrar efectividad del extracto alcohólico y aceites esenciales del llantén sobre la Candida albicans, hongo que se encuentra presente en la cavidad oral y que al asumir patogenicidad provoca la candidiasis cuyas manifestaciones son las aftas.

Formulación del problema

¿Presenta actividad antifúngica el extracto y el aceite de Plantago major frente a Candida albicans?

Delimitación del problema

Lugar: Escuela Superior Politécnica de Chimborazo

Tiempo: tres meses de noviembre del 2017 a enero del 2018. Objeto de investigación

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Campo de acción

Actividad antifúngica del extracto y aceite de Plantago mejor (Llantén) frente a

Candida albicans.

Identificación de la línea de investigación

Estudios microbiológicos. Objetivo general

Evaluar la actividad antifúngica “in vitro” del extracto alcohólico y del aceite

esencial de Plantago major (Llantén) frente a Candida albicans. Objetivos específicos

 Extraer el extracto alcohólico de Plantago major.

 Obtener el aceite esencial de Plantago major.

 Determinar mediante el tamizaje fitoquímico los metabolitos que se encuentran en el extracto alcohólico de Plantago major.

 Comprobar la efectividad antifúngica entre el extracto alcohólico y el aceite esencial frente a Candida albicans.

Idea a defender

El extracto alcohólico y aceite esencial de Plantago major presentan actividad antifúngica frente a Candida albicans.

Aporte teórico, significación práctica y novedad científica

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en el organismo; los cuales en muchos casos han reemplazado a los Productos Farmacéuticos superando su eficacia.

En el caso de microorganismos, se ha evidenciado un pronunciado desarrollo de varias cepas con resistencia antimicrobiana a la gran mayoría de antibióticos existentes en la actualidad, lo que ha incrementado la mortalidad de la población por falta de nuevas alternativas farmacoterapéuticas para el tratamiento de las patologías causadas por dichos microorganismos. Los tratamientos habituales se vuelven ineficaces y las infecciones persisten y pueden transmitirse a otras personas generando mayor incremento de patologías en la población, lo que incrementa el gasto público para solucionar dichos problemas de salud a nivel global.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) elaboró un catastro de las plantas que aparecen indicadas en la farmacopea de 73 países donde el llantén se encuentra en nueve de ellas, lo que ha provocado que sean una de las especies más estudiadas, tanto desde el punto de vista bioquímico como farmacológico; gran interés está dado también por sus cualidades medicinales, dentro de las cuales se ha señalado hasta un efecto anticancerígeno.

Partiendo de todo lo anterior, es que se anhela trabajar con otro tipo de terapia complementaria, donde se pretende utilizar plantas naturales como alternativa y que sean de gran utilidad tanto en el sector rural como urbano, de bajo costo y simple accesibilidad; convirtiéndose en una promoción de estilos de vida saludables a fin de mejorar las condiciones de salud; demostrando en ésta ocasión mediante un estudio in vitro el efecto inhibitorio del extracto y aceite esencial del llantén ( Plantago major ); acotamiento importante para tratar la Candidiasis, actuando sobre su hongo, Candida albicans; microorganismo que afecta gravemente a pacientes geriátricos, inmunodeprimidos o por factores locales como mala higiene, mal estado protésico o traumatismos físico químicos.

Esta investigación basada en la actividad antifúngica del llantén frente a

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alternativa farmacológica que no tiene efectos secundarios y con menores costos, que se convierta en una herramienta valiosa como método complementario en el tratamiento de la enfermedad periodontal.

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CAPÍTULO I: MARCO TEÓRICO

Medicina Tradicional 1.1

Desde tiempos prehistóricos hasta comienzos del siglo XIX las plantas medicinales se utilizaron por ensayos error; aquellos extractos que brindaban curar enfermedades. Esta práctica médica se perfeccionaba de generación en generación por lo cual se denominó medicina tradicional (20).

El reconocimiento del uso y valor de la medicina tradicional a nivel mundial se incrementan día a día, por un lado, debido a que 80% de la población mundial y 60% de la población ecuatoriana, recurren a la medicina tradicional y a las plantas medicinales para atender sus necesidades de asistencia médica (21). Es así que la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha reconocido la importancia de la medicina tradicional en el control de la salud y ha generado un programa orientado a la promoción de la medicina tradicional en los países de desarrollo (22).

Uso de las plantas medicinales 1.2

Según estimaciones de la Organización Mundial de la Salud, más del 80% de la población mundial, especialmente en los países en desarrollo, utiliza tratamientos tradicionales a base de plantas medicinales para sus necesidades de atención primaria de salud y que gran parte de los tratamientos tradicionales implica el uso de extractos de plantas o sus principios activos (23-24).

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Estudios Etnobotánicos y Etnofarmacológicos 1.3

La investigación etnobotánica puede ayudar a evitar la pérdida de dicho conocimiento y proteger, simultáneamente, la biodiversidad de las plantas medicinales. La naturaleza interdisciplinaria de la etnobotánica permite una amplia variedad de enfoques y aplicaciones. Sin embargo, hasta el presente ha existido poco intercambio de teorías y métodos entre disciplinas relacionadas, lo que ha favorecido el predominio de trabajos descriptivos, que se limitan a compilar listas de plantas útiles (26).

Por otra parte, en pocos casos son reconocidos los derechos de propiedad intelectual que tienen las comunidades locales sobre el conocimiento tradicional. Para superar esta situación, los enfoques actuales de la etnobotánica enfatizan el desarrollo de proyectos interdisciplinarios de gran alcance, que comiencen con la documentación del conocimiento tradicional, reconozcan los derechos de propiedad intelectual y culminen con estrategias para retribuir a las comunidades por los beneficios obtenidos en la investigación (26).

La industria farmacéutica se ha basado en estudios Etnofarmacologícos para la extracción y elaboración de fármacos modernos. Ejemplo de esto es la aspirina, una de las medicinas más comunes es producida por la corteza del

Salix alba; vinblastina y vincristina, son dos importantes alcaloides para tratar ciertos tipos de cáncer los cuales se extraen de Catharanthus roseus (27-28).

Plantago major (Planta de Llantén) 1.4

1.4.1 Características

El llantén es una herbácea perenne, de raíces blancas de tamaño uniforme, tallos subterráneos no ramificados y hojas ovaladas de color verde claro. Popularmente se la conoce como: llantén mayor, llantén común o llantén grande (28).

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medicinales; que han contribuido notablemente en el avance de modernas terapias (29-30).

En tal sentido, a partir de la década de los 60, a nivel mundial empezaron a utilizarse plantas medicinales como el “colirio” y el Plantago major, empleadas en zonas rurales, para afecciones cutáneas y del aparato digestivo y para inflamaciones poco agudas de la garganta o de la cavidad bucal (31-32).

El llantén es una planta con grandes propiedades medicinales, de ella se utiliza tanto la hoja como las semillas. Históricamente el llantén se ha utilizó de forma común por sus propiedades antiinflamatoria, antibacteriana, astringente y antihemorrágica; también como cicatrizante de heridas, tanto interna como externa. El compuesto de mayor relevancia es la aucubigemina (derivado de la aucubina) y se cree que es el responsable de la actividad antibacteriana de la planta (28).

El hábitat del vegetal es espontáneamente en zonas templadas y frías de la región centro y sur de Ecuador, localizado en Carchi, Chimborazo, Cotopaxi, Imbabura, Pichincha, y Tungurahua, por ser una planta de fácil localización, no se cultiva, se considera una maleza (28).

Partiendo de todos los estudios anteriormente expuestos, se ha observado que el llantén posee gran actividad antimicrobiana; estudios científicos realizado por Velasco-Lezama et al (2008), demostraron que la actividad antifúngica de

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1.4.2 Actividad Biológica

Plantago major ha demostrado contener varias clases de compuestos biológicamente activos; flavonoides, alcaloides, glucósido iridoide (aucubina), ácidos grasos, vitaminas, fenólicos compuestos (ácido cafeico) y terpenoides. Las actividades biológicas y propiedades medicinales de Plantago major

dependen principalmente de las actividades de los componentes químicos activos. Esta planta se ha utilizado desde épocas muy antiguas para cicatrización de heridas, tiene propiedades antiulcerantes, antidiabéticas, antidiarreica, antiinflamatorias, anticoncentivas, antibacterianas, antifúngicas, antivirales, antioxidantes, anticancerígenas y su consumo disminuye la fatiga. Los principales glucósidos iridoides presentes en Plantago major son aucubin, que Long et al. aisló de las hojas (45-46), y se cree que es el responsable de la actividad antibacteriana de la planta (31).

1.4.3 Actividad Antimicrobiana

Partiendo de varios estudios se ha descubierto que Plantago major posee propiedades, bactericidas y fungicidas. Además, varios trabajos han informado sobre la actividad antibacteriana del extracto de Plantago major contra una amplia gama de organismos que comprenden microorganismos grampositivos y gramnegativos, levaduras y hongos. En estos estudios se encontró que el extracto de Plantago major es efectivo contra Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Candida tropicalis y Escherichia coli (33).

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La decocción de la hoja de Plantago major demostró inhibición de los microorganismos Escherichia coli y Staphylococcus aureus aislados de conjuntivitis humana. Varios estudios en animales de extractos acuosos de Plantago major demostraron la acción hipotensora arterial del mismo (33).

Obtención de extractos 1.5

1.5.1 Extracción de Principios Activos

Para lograr una concentración adecuada de los principios activos contenidos en las plantas y que su acción sea más efectiva es necesario realizar diversos procedimientos mediante los cuales sean extraídos aquellos, con solventes adecuados que se seleccionan de acuerdo a la solubilidad y la estabilidad que posean las sustancias beneficiosas (36).

Los extractos son preparaciones todavía más concentrados que las tinturas. Se basan en el principio de que las sustancias como el agua o el alcohol pueden disolver las sustancias curativas de las plantas, así tenemos que hay extractos hidroalcohólicos y extractos puramente acuosos. Los extractos hidroalcohólicos tienen la ventaja que se les puede calcular en dosis exactas. Así, 1 mL de extracto fluido representa un gramo de la droga en polvo (36).

Se puede elevar la concentración de principios activos procedentes de una tintura, cocimiento o jugo de las plantas por medio de la evaporación del disolvente, sea alcohol o sea agua (19).

Mediante calor y evaporación con baño María se logra que el extracto tome diferentes consistencias, pueden quedar blandos como la miel, secos como polvo y líquidos o fluidos (36).

1.5.2 Métodos de obtención de extractos

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material vegetal seco y pulverizado para que se logre mayor permeabilidad del solvente y por lo tanto se genere un mayor rendimiento en la extracción. La polaridad de los compuestos a extraer es un factor determinante en el tipo de solvente que se debe emplear. La extracción con etanol es muy común ya que con este se extraen sustancias de todas las polaridades, además este es un solvente estable (poco reactivo) y económico, también se puede evaporar fácilmente (34).

Los métodos de extracción permiten obtener los productos en formas farmacéuticas adecuadas para su administración oral o externa de acuerdo al lugar de acción que se recomiende.

1.5.2.1 Maceración

El principio de la maceración consiste en la obtención de extractos, gracias al duradero tiempo de contacto que el solvente debe tener con el material vegetal, que debe estar pulverizado o molido para lograr una mayor superficie de contacto con el solvente, este proceso es realizado a temperatura ambiente. Es conveniente realizar agitaciones frecuentes para la homogenización del procedimiento y así tratar de influenciar el rendimiento de la extracción, el poder de extracción del solvente va disminuyendo a medida que pasa el tiempo de contacto con el material vegetal; para la realización de este tipo de extractos es conveniente la protección del recipiente de extracción de la luz solar, ya que esta puede llegar a descomponer sustancias fotolábiles. Después de la realización del extracto por medio de un filtrado es necesario lavar el material vegetal restante con más solvente para la obtención del extracto total (34). 1.5.2.2 Percolación o lixiviación

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1.5.2.3 Método de obtención de aceites esenciales

Los aceites esenciales son productos volátiles de naturaleza compleja, elaborados por ciertos vegetales a los que confieren un aroma agradable. Oficinalmente, se denominan aceites esenciales los productos que se pueden obtener por arrastre con corriente de vapor de agua. Los aceites esenciales son generalmente líquidos a temperatura ambiente, aunque algunos solidifican a baja temperatura. Algunos aceites esenciales son inflamables. Poseen índices de refracción elevados y presentan actividad óptica (desvían el plano de la luz polarizada, tienen poder rotatorio) (25-37).

1.5.2.4 Método destilación por arrastre con vapor

Es una técnica usada para separar sustancias orgánicas insolubles en agua y ligeramente volátiles, de otras no volátiles que se encuentran en la mezcla, como resinas o sales inorgánicas, u otros compuestos orgánicos no arrastrables (37). En las investigaciones revisadas no se reporta que Plantago major presenta aceite esencial.

1.5.2.5 Caracterización Fitoquímica

El tamizaje fitoquímico permite contrastar cualitativamente los componentes que se encuentran presentes en la planta. Para dicha información existen distintos métodos que se emplea para realizar la técnica de tamizaje fitoquímico Tabla Nº 1 (36-39).

Tabla 1. Técnica para el tamizaje fitoquímico

Ensayo Metabolito Procedimiento Resultado

Dragendorff

Alcaloides.

Si la alícuota del extracto está disuelta en un solvente orgánico, éste debe evaporarse, en un baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de ácido clorhídrico al 1 % en agua. Si el extracto es acuoso, a la alícuota se le añade 1 gota de ácido clorhídrico concentrado. Con la solución acuosa ácida se realiza el ensayo, añadiendo 3 gotas del reactivo.

Si hay opalescencia se considera (+) turbidez definida

(++), precipitado (+++).

Wagner y Mayer Se parte de igual manera en los casos anteriores de la solución acida, añadiendo 2 ó 3 gotas del reactivo.

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redisolverse en la menor cantidad de alcohol (1mL). En estas condiciones se adiciona 1mL de reactivo.

(+++).

Borntrager Quinonas.

Si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1mL de cloroformo. Se adiciona 1mL hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amonio al 5% en agua. Se agita mezclando

las fases y se deja en reposo hasta su ulterior separación.

Si la fase acuosa alcalina se colorea de rosado o rojo.

Coloración rosada (++), coloración roja (+++).

Liebermann-Burchard Triterpenos y/o esteroides.

Se adiciona 1mL de anhídrido acético y se mezcla bien. Por la pared del tubo de ensayo se dejan resbalar 2-3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin

agitar.

1. Rosado 2. Verde intenso-visible

3. Verde oscuro-negro

Catequinas Catequinas

Tome una gota de la fracción alcohólica, con la ayuda de un capilar y aplique la solución sobre papel filtro. Sobre la mancha aplique solución de carbonato

de sodio.

Verde carmelita a la luz UV.

Fehling Azúcares Reductores.

Si la alícuota del extracto no se encuentra en agua, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el

residuo redisolverse en 1–2 mL de agua. Se adicionan 2mL del reactivo y se calienta en baño

de agua 5–10 min la mezcla.

Solución se colorea de rojo o aparece precipitado rojo.

Cloruro Férrico

Compuestos fenólicos y/o taninos.

Si el extracto es acuoso se añade acetato de sodio para neutralizar y tres gotas de una solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica a

una alícuota del extracto alcohólico se adiciona el reactivo.

Coloración rojo- vino, verde intenso, azul.

Shinoda Flavonoides.

Si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol, se diluye con 1 mL de ácido clorhídrico concentrado y

un pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción se espera 5 minutos, se añade 1 mL de alcohol amílico, se mezclan las fases

y se deja reposar hasta que se separen.

Cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intenso en

todos los casos.

Antocianidinas

Estructuras de secuencia C6-C3-C6 del grupo de los

flavonoides.

Se calientan 2 mL del extracto etanólico 10 minutos con 1 mL de HCl concentrado. Se deja enfriar y se adiciona 1mL de agua y 2 mL de alcohol amílico. Se

agita y se deja separar las dos fases.

La aparición de color rojo a marrón en la fase amílica.

Resinas Resinas. Adicione a 2mL de la solución alcohólica, 10 mL de

agua destilada. Precipitado.

Espuma Saponinas.

Si la alícuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces su volumen en agua y se agita la mezcla

fuertemente durante 5–10 min.

(25)

Microorganismo de importancia clínica 1.6

1.6.1 Candida albicans

1.6.1.1 Características generales

Candida albicans es el hongo más patogénico del género Candida, el cual está compuesto por 81 especies donde Candida albicans es el agente etiológico que con mayor frecuencia produce candídiasis. Podemos encontrarlo de forma habitual en piel, estómago, colon, boca y garganta de individuos sanos. Las especies de Candida que existen a nivel cutáneo pocas veces son patógenas; sin embargo, se han aislado en determinadas formas clínicas como endocarditis, vaginitis y onicomicosis que cuando se encuentra en la piel en condiciones favorables para su desarrollo (quemaduras, heridas, humedad etc) colonizan y se multiplican agresivamente (34).

1.6.1.2 Patogenicidad

Candida albicans es un agente colonizador habitual de la piel y mucosas humanas. En promedio, el 25-30% de los individuos son portadores de C. albicans en la cavidad oral, con mayor incidencia en los lactantes, niños pequeños y personas con SIDA. La mala higiene bucal y las dentaduras postizas aumentan la tasa de portación oral. Alrededor del 50% de las personas poseen C. albicans en su tracto gastrointestinal y alrededor del 30% de las mujeres tienen colonización vaginal en algún momento. La portación vaginal es particularmente prevalente durante el embarazo. (46) (47)

La capacidad de ciertas cepas de C. albicans de sufrir un cambio fenotípico, es decir, la formación de tipos de colonia en apariencia diferente, en particular las que muestran formación de franjas discontinuas cuando se cultivan en medios sintéticos específicos, se asocia de manera estrecha con la videncia e invasión tisular. (28)

(26)

pacientes en quienes los mecanismos de defensa normales se hallan alterados por otra enfermedad, por ejemplo, por el empleo excesivo de antibióticos o agentes inmunosupresores. También existen reportes de ciertas infecciones de la sangre como, endocarditis (en drogadictos) y meningitis ocasionada por

Candida (14).

1.6.1.3 Actividad Antimicrobiana y Resistencia

La utilización de sustancias químicas para tratar procesos infecciosos se conoce desde hace muchos años. Al empezar los primeros estudios in vitro

sobre la sensibilidad bacteriana a los antibióticos, solo se obtuvieron una apresacion cualitativa, sin ningún rigor científico, declarando al microorganismo como sensible o resistente según que su crecimiento fuera inhibido o no por unas arbitrarias concentraciones del fármaco. En la actualidad, el antibiograma es una técnica perfectamente estandarizada que permite in vitro definir claramente los conceptos de sensibilidad y resistencia, relacionados con lo que ocurre in vivo (39).

Durante varias décadas, la resistencia a los antimicrobianos (AMR) ha sido una amenaza creciente para el tratamiento efectivo de una gama cada vez mayor de infecciones causadas por bacterias, parásitos, virus y hongos. La RAM produce una reducción de la eficacia de los fármacos antibacterianos, antiparasitarios, antivirales y antimicóticos, lo que hace que el tratamiento de los pacientes sea difícil, costoso o incluso imposible. El impacto en pacientes particularmente vulnerables es más obvio, lo que resulta en una enfermedad prolongada y una mayor mortalidad. La magnitud del problema en todo el mundo y el impacto de la resistencia a los antimicrobianos en la salud humana, y en los costos para el sector de la salud y el impacto social más amplio, aún se desconocen en gran medida (39).

(27)

acelerado por la presión selectiva ejercida por el uso y el uso indebido de agentes antimicrobianos en humanos y animales. La falta actual de nuevos antimicrobianos en el horizonte para reemplazar aquellos que se vuelven inefectivos aumenta la urgencia de la necesidad de proteger la eficacia de los medicamentos existentes (39).

La OMS, en 2001 se publicó la Estrategia mundial para la contención de la resistencia a los antimicrobianos, y la AMR fue el tema central del Día Mundial de la Salud en 2011 cuando se emitió un paquete de políticas AMR de 6 puntos. La Asamblea Mundial de la Salud, a través de varias resoluciones a lo largo de los años, ha pedido una aplicación más intensa de la estrategia global, destacando la necesidad de una vigilancia reforzada de la resistencia a los antimicrobianos y una mayor capacidad de laboratorio para llevarla a cabo y una reducción en el uso inapropiado de antimicrobianos (39).

(28)

1 CAPITULO II. MARCO METODOLÓGICO

Descripción del área de estudio 2.1

La presente investigación se realizó en el área rural del sector Guayllabamba, cantón Chambo, provincia de Chimborazo-Ecuador; 1°44′00″S 78°35′00″O, altitud de 2780 m s. n. m. La temperatura promedio es de 14 °C. y su clima es apto para la agricultura. El Cantón Chambo no posee ninguna parroquia, sin embargo en su interior encontramos un territorio con características que encierran a lo rural y urbano. En su conjunto, Chambo posee una población total de 11 885. Situada a 8 km de la Ciudad de Riobamba hacia el este, se extiende en las faldas de los montes Quilimas y Cubillín de la Cordillera Oriental. Limita al norte, al oeste y al sur cantón Riobamba, al este con Morona Santiago.

Trabajo de campo 2.2

(29)

métodos de preparación, vía de administración y partes de la planta que frecuentemente usan.

Análisis de datos etnobotánicos 2.3

La información etnobotánica proporcionada por los habitantes del área de estudio, fue organizada en una base de datos empleando una hoja de cálculo de Microsoft Office Excel 2011 bajo licencia personal. Los porcentajes y frecuencias de las citaciones de las plantas medicinales asociadas a la medicina tradicional, se utilizaron para el análisis etnobotánico. Se emplearon tres índices para determinar la importancia de las diferentes especies identificadas en el área de estudio.

2.3.1 Nivel de uso significativo

Para estimar el nivel de uso significativo para cada especie y verificar su aceptación cultural, se utilizó la siguiente ecuación. Esta metodología, expresa que aquellos usos medicinales que son citados con una frecuencia superior o igual al 20%, por las personas encuestadas que usan plantas como primer recurso para un determinado problema de salud, pueden considerarse significativos desde el punto de vista de su aceptación cultural y, por tanto, se consideran para investigaciones científicas.

𝑈𝑆𝑇 = 𝑈𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑒 (𝑠)

𝑁𝑖𝑠 𝑋 100

Dónde:

Uso de especie (s) = Número de citaciones para cada especie

(30)

2.3.2 Calculo de valor de uso

Este índice expresa la importancia o valor cultural de una especie determinada para todos los informantes entrevistados. Para estimar el índice de valor de uso general de cada especie para todos los informantes (IVUs) se utilizó la formula.

𝐼𝑉𝑈𝑠 =∑ 𝑖𝑉𝑈𝑖𝑠

𝑁𝑠

Dónde: VUis= valor de uso de la especie por cada informante, y Ns= es el número de informantes para cada especie.

Obtención de principios activos 2.4

2.4.1 Recolección de la materia prima

Las hojas del Plantago major (llantén) fueron recolectadas en la provincia de Chimborazo, Cantón Riobamba, en el mes de diciembre del 2017 con el criterio que deben ser hojas ovaladas de color verde claro que se halle en perfectas condiciones y de tamaño considerable, para proceder a su respectivo análisis del vegetal.

2.4.2 Acondicionamiento

Las muestras de Plantago major (llantén) recolectadas cumplieron con los procesos de: selección, lavado y secado, tratando de mantener la genuinidad y propiedades que a ella se le atribuyen. Se seleccionaron así el llantén en mejor estado morfológico, descartando restos y material vegetal de otra procedencia. El lavado se realizó únicamente con agua potable, la cual se llevó a sequedad sobre un recipiente limpio exponiéndolas al sol por una hora, posteriormente se trocea las hojas en un recipiente limpio y se almaceno evitando contacto con la luz y humedad.

2.4.3 Método por Maceración

(31)

transfiere a un vaso de precipitación de 1000 mL todo el material líquido obtenido, filtrar el extracto, para eliminar las impurezas. El filtrado se coloca n un valón esmerilado, para iniciar el proceso de concentración en el rota vapor, posterior a este proceso se recoge el extracto etanólico concentrado en un recipiente de vidrio etiquetado.

2.4.4 Arrastre por vapor

Se tomaron 300 ml. de agua en el matraz de 500 ml con 200g de muestra vegetal fresca y se lo llevo al destilador para condensar el aceite esencial. 2.4.5 Caracterización Fitoquímica

El estudio fitoquímico tiene como finalidad aislar e identificar los diferentes tipos de compuestos presentes en la planta.

Con el extracto alcohólico de Plantago major se realizó las respectivas pruebas de coloración y precipitación.

Así el extracto alcohólico fue dividido para los ensayos de: 2.4.5.1 Ensayo de Dragendorff (Alcaloides)

Se tomó un 3 mL del extracto alcohólico, este debe evaporarse en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de ácido clorhídrico al 1 % en agua. Con la solución acuosa ácida se realizó el ensayo, añadiendo 3gotas del reactivo de Dragendorff, si hay opalescencia se considera (+), turbidez definida (++), precipitado (+++).

2.4.5.2 Ensayo de Baljet (Cumarinas)

(32)

2.4.5.3 Ensayo de Borntrager (Quinonas)

Se adiciona 1 mL de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio ó amonio al 5 % en agua. Se agita mezclando las fases y se deja en reposo hasta su ulterior separación. Si la fase acuosa alcalina (superior) se colorea de rosado o rojo, el ensayo se considera positivo. Coloración rosada (++), coloración roja (+++).

2.4.5.4 Ensayo de Liebermann-Burchard (triterpenos y/o esteroides)

Si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de cloroformo. Se adiciona 1 mL de anhídrido acético y se mezcla bien. Por la pared del tubo de ensayos se dejan resbalar 2-3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar. Un ensayo positivo se tiene por un cambio rápido de coloración:

 Rosado-azul muy rápido.

 Verde intenso-visible aunque rápido.

 Verde oscuro-negro-final de la reacción. 2.4.5.5 Ensayo de la espuma (Saponinas)

Se tomaron una alícuota del extracto alcohólico y se diluyo con 5 veces su volumen en agua y se agito la mezcla fuertemente durante 5-10 minutos.

El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie del líquido de más de 2 mm de altura y persistente por más de 2 minutos. 2.4.5.6 Ensayo del cloruro férrico (Fenólicos y/o Taninos)

A una alícuota del extracto alcohólico se le adicionan 3 gotas de una solución de tricloruro férrico al 5 % en solución salina fisiológica (cloruro de sodio al 0.9 % en agua). Un ensayo positivo puede dar la siguiente información general

(33)

 Desarrollo de una coloración verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos.

 Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalotánicos.

2.4.5.7 Ensayo de Shinoda (Flavonoides)

En una alícuota del extracto alcoholico, se diluye con 1 mL de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción se espera 5 minutos, se añade 1 mL de alcohol amílico, se mezclan las fases y se deja reposar hasta que se separen. El ensayo se considera positivo, cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intensos en todos los casos.

2.4.5.8 Ensayo de Sudan (Compuestos Grasos)

A la alícuota de la fracción en el solvente de extracción, se le añade 1 mL de una solución diluida en agua del colorante Sudan III o Sudan IV. Se calienta en baño de agua hasta evaporación del solvente.

La presencia de compuestos grasos se considera positiva si aparecen gotas o una película coloreada de rojo en el seno del líquido o en las paredes del tubo de ensayos respectivamente

Actividad antimicrobiana 2.5

2.5.1 Preparación Agar dextrosa Sabouraud

(34)

2.5.2 Método de difusión en agar

Esta prueba se basa en la inhibición del crecimiento fúngico, mediante la difusión de las sustancias activas en un medio sólido y se evidencia por la formación de halos claros alrededor de las colonias.

2.5.3 Preparación del inóculo

Las cepas fueron cultivadas en agar Sabouraud e incubadas a 37 °C durante 48 h. De cada cultivo se tomaron 5 colonias de aproximadamente 1 mm de diámetro y se re suspendieron en tubos con 5 mL de agua destilada estéril, hasta alcanzar una turbidez equivalente a la del tubo 0,5 de la escala de McFarland (106 células/mL).

2.5.4 Inoculación de las placas

Se tomó una cantidad de la disolución que se preparó con el inoculo de

Candida albicans y con el uso de un hisopo estéril se recubrió toda la placa para garantizar el crecimiento uniforme de las colonias.

2.5.5 Preparación de los discos de papel filtro (extractos alcohólicos)

Se utilizó discos de papel filtro con peso de 30 ± 4 mg /cm2 y con un diámetro de 6.35 mm, se pueden obtener con una perforadora de papel. Separar los discos en cuatro grupos y cargarlos de los extractos alcohólicos de Plantago mayor en las siguientes concentraciones: 25%, 50%, 75% y 100%.

Con el uso de una micropipeta se procede a colocar en cada papel filtro 20 uL de la disolución respectiva del extracto y aceite esencial.

(35)

2.5.6 Lecturas e interpretación de resultados

(36)

2 CAPITULO III: RESULTADOS DE LA INVESTIGACIÓN

Estudio etnofarmacológico 3.1

En la tabla 2 se muestran los resultados del estudio etnofarmacológico generados a partir de los datos recopilados. El valor de uso y el nivel de uso significativo han sido calculados en base a las fórmulas descritas en el capítulo II.

Tabla 2. Datos obtenidos a partir de las encuestas aplicadas a la población de estudio involucrada en la investigación. Se expresa los valores numéricos y porcentuales

Planta (Nombre común) Veces citadas por

encuestados (n=65) Valor de Uso

Nivel de uso Significativo

Manzanilla 40 7,81 61,54

Orégano 30 5,86 46,15

Menta 29 5,66 44,62

Sábila 27 5,27 41,54

Ortiga 22 4,30 33,85

Eucalipto 20 3,91 30,77

Marco 18 3,52 27,69

Paico 16 3,13 24,62

Llantén 15 2,93 23,08

Perejil 14 2,73 21,54

Alfalfa 10 1,95 15,38

Matico 10 1,95 15,38

Toronjil 10 1,95 15,38

Caballo Chupa 9 1,76 13,85

Hierba Luisa 9 1,76 13,85

Malva 9 1,76 13,85

Romero 9 1,76 13,85

Apio 8 1,56 12,31

Hierba Mora 7 1,37 10,77

Valeriana 7 1,37 10,77

(37)

Taraxaco 6 1,17 9,23

Cola de Caballo 4 0,78 6,15

Borraja 3 0,59 4,62

Casamarucha 3 0,59 4,62

Diente de León 3 0,59 4,62

Jengibre 3 0,59 4,62

Canela 2 0,39 3,08

En lo referente a la obtención del extracto alcohólico y el aceite esencial, a partir de los métodos redactados en el capítulo II, se obtuvieron los resultados que se redactan en la tabla 3. En el citado cuadro se encuentran las características organolépticas del extracto etanólico del llantén (Plantago major), siendo líquido en su aspecto, de color verdoso-claro, de olor inodoro y de sabor alcohol y musilaginoso.

Tabla 3. Determinación de las características del extracto alcohólico del llantén (Plantago major).

PARÁMETROS RESULTADOS MÉTODO

Aspecto Liquido Vista

Color Verdoso – Claro Vista

Olor Inodoro Olfato

Sabor Alcohol y Mucilaginoso Gusto

Los principios activos obtenidos a partir de Plantago major, se muestran en la tabla 4. Se expresa que a partir de la metodología empleada no se pudo obtener el aceite esencial de la especie objeto de estudio por lo que tan solo se trabajó con el extracto etanólico en lo referente a los ensayos microbiológicos

(38)

Tabla 4. Determinación del porcentaje de rendimiento del extracto concentrado y aceite esencial del llantén

Planta fresca Llantén (g) Extracto alcohólico concentrado (mL)

Porcentaje de rendimiento.

% 𝒅𝒆 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 = 𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒐 𝒄𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒅𝒐 𝒑𝒆𝒔𝒐 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 ∗ 𝟏𝟎𝟎 3000 150 5% Planta fresca Llantén (g) Aceite esencial (mL)

Porcentaje de rendimiento.

% 𝒅𝒆 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐

= 𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆 𝒂𝒄𝒆𝒊𝒕𝒆 𝒆𝒔𝒆𝒏𝒄𝒊𝒂𝒍

𝒑𝒆𝒔𝒐 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 ∗ 𝟏𝟎𝟎

200

0 0%

El porcentaje de rendimiento del extracto concentrado de Llantén (Plantago major) es de 5% lo que indica una disminución notable debido a la recuperación del solvente. El porcentaje de rendimiento es menor al 50%, esto se debe a la relación entre las hojas de Llantén con el etanol al 96% que aumenta de acuerdo al tiempo de permanencia, también es por el tiempo y la presión a la cual es sometida el extracto para ser concentrado. Es importante mencionar que el llantén no contiene aceite esencial dando un porcentaje de rendimiento de 0%.

(39)

Tabla 5. Resultados del tamizaje fitoquímico del llantén

TAMIZAJE FITOQUÍMICO DEL EXTRACTO ALCOHÓLICO DE LLANTÉN

EXTRACTO METABOLITOS ENSAYO RESULTADO

ALCOHÓLICO

Cumarinas Baljet (++)

Triterpenos Liebermann-Burchard (+++)

Saponinas Espuma (-)

Fenoles Cloruro férrico (+++)

Taninos Cloruro férrico (-)

Quinonas Borntrager (-)

Flavonoides Shinoda (+++)

Alcaloides Dragendorff (-)

Compuestos grasos Sudan (-)

(+++) Alto contenido del metabolito secundario (+) Bajo contenido del metabolito secundario (++) Contenido leve del metabolito secundario (-) Ausencia del metabolito secundario

Los resultados del tamizaje fitoquímico del extracto alcohólico de las hojas frescas de llantén presentado en la tabla 5, evidencia la presencia de: compuestos triterpenos, compuestos fenólicos y flavonoides, en contenido leve cumarinas y ausencia de saponinas, taninos, quinonas, alcaloides y compuestos grasos; esto indica que el llantén no tiene aceite esencial.

(40)

Tabla 6. Resultados de la actividad antimicrobiana del extracto alcohólico de llantén frente a Candica albiocans

HALOS DE INHIBICION

Concentración de

Dilución del Extracto.

Promedio R1

(Radio en mm)

Promedio

R2 (Radio

en mm)

Promedio

R3 (Radio en

mm)

Media de radios de

los halos de

inhibición (mm)

Blanco (Alcohol absoluto) 0 0,00

Extracto de llantén al

25% 0 0 0 0,00

Extracto de llantén al

50% 0 0 0 0,00

Extracto de llantén al

75% 14 14 15 14,33

Extracto de llantén al

100% 18 18 18 18,00

Antifúngica Ketoconazol

25ug (Control Positivo) 13 13,00

(41)
(42)

Los análisis estadísticos fueron llevados a cabo usando los datos generados a partir de los ensayos antimicrobianos in vitro. Se usó un t de student para comparar dos tratamientos y se usó un ANOVA para una comparación múltiple de todos los tratamientos. Los resultados se describen y detallan en las tablas 7 y 8.

Tabla 7. Análisis de comparación de tratamientos mediante una prueba t student modificada (Bonferroni test for comparisons)

Prueba de comparación de Bonferroni

Intervalos de confianza al 95,00%

Significancia P Value Ajustado R

Blanco (Etanol Absoluto) vs. T1 (25%)

Blanco (Etanol Absoluto) vs. T2 (50%)

Blanco (Etanol Absoluto) vs. T3 (75%)

-14,45 to -13,13 Yes <0,0001 Blanco (Etanol Absoluto) vs. T4

(100%)

-18,36 to -17,55 Yes <0,0001 Blanco (Etanol Absoluto) vs.

Ketoconazol

-14,98 to -12,68 Yes <0,0001

R= Tratamiento de referencia

Tabla 8. Análisis de comparación de tratamientos mediante una ANOVA modificada (Tukey’s test for mutliple comparisons)

Prueba de comparación múltiple de Tukey

Intervalos de confianza al 95,00%

Significanc ia

P Value Ajustado

Blanco (Etanol Absoluto) vs. T1 (25%) -0,354 to 0,354 No >0,9999

Blanco (Etanol Absoluto) vs. T2 (50%) -0,354 to 0,354 No >0,9999

Blanco (Etanol Absoluto) vs. T3 (75%) -14,15 to -13,44 Yes <0,0001

Blanco (Etanol Absoluto) vs. T4 (100%)

-18,31 to -17,6 Yes <0,0001

Blanco (Etanol Absoluto) vs. Ketoconazol

-14,18 to -13,48 Yes <0,0001

T1 (25%) vs. T2 (50%) -0,354 to 0,354 No >0,9999

T1 (25%) vs. T3 (75%) -14,15 to -13,44 Yes <0,0001

T1 (25%) vs. T4 (100%) -18,31 to -17,6 Yes <0,0001

T1 (25%) vs. Ketoconazol -14,18 to -13,48 Yes <0,0001

T2 (50%) vs. T3 (75%) -14,15 to -13,44 Yes <0,0001

T2 (50%) vs. T4 (100%) -18,31 to -17,6 Yes <0,0001

T2 (50%) vs. Ketoconazol -14,18 to -13,48 Yes <0,0001

T3 (75%) vs. T4 (100%) -4,521 to -3,813 Yes <0,0001

T3 (75%) vs. Ketoconazol -0,3915 to 0,3165 No 0,9992

(43)

CAPITULO IV: DISCUSIÓN

Con el objetivo de cumplir con los objetivos del presente estudio, en primera instancia se verificó que la muestra vegetal recolectada fuese Plantago major, los resultados de estos análisis se muestran en el apartado de anexos. Paralelamente, se llevó a cabo un censo sobre el consumo de plantas naturales para tratar dolencias en población rural y urbana (Tabla 3). Aproximadamente el 56% del total de los encuestado reporto consumir alguna planta para tratar una determinada dolencia. Dentro de las especies vegetales, los resultados mostraron que el (61.54%) de la población encuestada consume manzanilla, seguido del orégano (46.15%), la menta (44.62%) y sábila (41.54%).

En lo referente exclusivamente a la especie vegetal objeto de estudio, los resultados mostraron que el 23.08% consumen llantén, respectivamente. Por otra parte, el 77% de la población consume las especies vegetales en forma de infusión y el 18% en forma de aceites, el restante 5% en otras en ungüentos y aplicación directa. Estos resultados hablan claramente de la importancia de las especies vegetales y el conocimiento ancestral en el tratamiento de dolencias de la población en general tal y como se ha descrito en la literatura (3, 6, 10). En lo referente a la caracterización fitoquímica, los análisis mostraron que la presencia de triterpenos, fenoles y flavonoides fue superior a los otros compuestos hallados (Tabla 5). Los hallazgos aquí reportados concuerdan con estudios previos reportados con anterioridad (31).

(44)

Estos hallazgos guardan concordancia con lo mostrado en estudios anteriores en los que se probó el efecto del extracto alcohólico de Plantago major frente a

C. albincans (12). Sobre la base del estudio se puede observar que la diferencia entre tratamientos es estadísticamente significativa (p<0.001), tal y como se muestra en la tabla 7 y 8. Es importante mencionar que no existe diferencia estadística significativa entre platos y repeticiones, lo que confiere robustez a los ensayos llevados a cabo y denotan una estandarización de protocolos.

En lo referente a la comparación de la media de los halos obtenidos aplicando alcohol absoluto versus los distintos tratamientos, se puede observar que existe diferencia entre ellos. Así, al comparar el DMSO versus el tratamiento 3, 4 del ketoconazol, se observa que son diferentes (p<0.001). Esto, supone que el efecto inhibitorio del extracto, es eficaz frente al crecimiento de C. albicans y la valida la actividad antifúngica in vitro del extracto de P. major.

Análisis posteriores fueron llevados a cabo mediante la prueba estadística de Anova, para establecer similitudes o diferencias entre todos los tratamientos. Los resultados mostraron que entre todos los tratamientos existe diferencias significativas, lo que consolida la idea de que la actividad antifúngica del extracto de P. major es directamente proporcional a su concentración, y que su actividad es independiente del medio de cultivo.

Además, con el propósito de elucidar si efectivamente el efecto de la concentración al 100% del extracto era similar al presentado por el Ketoconazol, un fármaco con demostrada capacidad bactericida, se llevó a cabo un cálculo referente al porcentaje del efecto inhibitorio del extracto.

(45)

las mujeres. (16). Los extractos de P. major se han estudiado por su efecto antimicrobiano sobre las bacterias cariogénicas en el proceso de formación de placa dental (17). Los compuestos triterpénicos activos aislados del extracto alcoholico de P. major ha sido demostrados previamente para ser un potencial agente para inhibir el crecimiento de C. albincans.

Sin embargo, en el presente estudio, se ha evaluado más profundamente el efecto del extracto al contrarrestarlo en concentraciones más altas y bajas. Es evidente, que un extracto acuoso de P. major deberá ser probado en futuros ensayos, pues es el medio de consumo altamente aceptado por comunidades rurales en relación a los datos obtenidos en el estudio etnofarmacológico. Si bien es claro, que el extracto alcohólico puede mostrar un sesgo en los resultados debido a la acción del etanol y potenciar el efecto del extracto, resulta evidente el incremento de la actividad del extracto conforme su concentración aumenta datos que valida el efecto por sí mismo del extracto, y de las moléculas inherentes a él.

(46)

CONCLUSIONES

Se demostró que el extracto alcohólico de Plantago major (Llantén) tiene efecto antifúngica “in vitro” frente a Candida albicans.

Se obtuvo concentraciones de extracto alcohólico de Plantago major al 100%, 75%, 50% y 25% y se determinó que a concentraciones 100% y 75% el extracto tiene actividad antimicrobiana, y las concentraciones al 50% y 25% presentan una actividad antimicrobiana nula.

El llantén no contiene aceite esencial por lo tanto no se puede comprobar su actividad antifúngica.

Dentro del estudio fitoquímico se detectó mediante tamizaje que el extracto alcohólico presenta sustancias de naturaleza triterpenos , compuestos fenólicos y flavonoides.

(47)

RECOMENDACIONES

Se recomienda emplear el presente estudio como base para posteriores investigaciones donde el extracto de llantén ( Plantago major ) sean aplicadas in vitro en otras bacterias patógenas, con el fin de demostrar su eficacia inhibitoria sobre ellas.

(48)

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