PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 21
Número de solicitud:200302572 51 Int. Cl.: C12Q 1/68(2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 22 Fecha de presentación:04.11.2003 43 Fecha de publicación de la solicitud:01.04.2007Fecha de la concesión:22.02.2008
45
Fecha de anuncio de la concesión:16.03.200845
Fecha de publicación del folleto de la patente:16.03.2008
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Titular/es:Consejo Superior de Investigaciones Científicas c/ Serrano, 117
28006 Madrid, ES
72
Inventor/es:Fernández García, María y Álvarez González, Miguel Ángel74
Agente:No consta54
Título:Detección de bacterias del ácido láctico productoras de tiramina mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus aplicaciones.57
Resumen:Detección de bacterias del ácido láctico productoras de tiramina mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus aplicaciones.
La presente invención describe un procedimiento de con-trol de la presencia de la aminas biógenas en alimentos y bebidas mediante la identificación de bacterias del ácido láctico potencialmente productoras de tiramina median-te la amplificación por PCR del gen tdcA basado en el uso de una pareja de oligonucleótidos cebadores especí-ficos del gen tcdA deLactococcus lactisIPLA 10000 y ba-jo unas condiciones adecuadas de amplificación del frag-mento flanqueado por dichos cebadores. De utilidad en el ámbito de la seguridad alimentaria, preferentemente en el sector de lácteos o en el vinícola, tanto para asegurar la caracterización de las cepas usadas como cultivo inicia-dor como para controlar los procesos de fermentación y de alimentos ya elaborados. Las ventajas son, además de la especificidad y la sencillez, la altísima sensibilidad y la rapidez.
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5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 DESCRIPCIÓN
Detección de bacterias del ácido láctico productoras de tiramina mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus aplicaciones.
Sector de la técnica
Industria alimentaría. Seguridad alimentaría. Diagnostico por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El método desarrollado puede ser aplicado en cualquiera de los pasos del proceso de fermentación de alimen-tos y bebidas en los que participen bacterias del ácido láctico (BAL) como cultivos iniciadores o como microbiota secundaria como por ejemplo en el sector de productos lácteos o el sector vinícola.
Estado de la técnica
Las BAL son esenciales en la Industria Alimentaría como iniciadores de la fermentación, sin embargo, la actividad metabólica de algunas cepas puede dar lugar a la formación de unas sustancias tóxicas conocidas como aminas bió-genas (AB). Estos compuestos nitrogenados de bajo peso molecular se forman por descarboxilación de determinados aminoácidos (M. H. Silla Santos. 1996. Biogenic amines: their importance in foods Int. J. Food Microbiol. 29: 213-231). La ingestión de alimentos con niveles altos de AB puede ocasionar graves trastornos, llegando incluso a com-prometer la vida del consumidor, especialmente en aquellas personas con deficiencias en la actividad amino-oxidasa intestinal, enzima responsable de su destoxificación (S. Bodmer, C. Imark y M. Kneubühl. 1999. Biogenic amines in foods: histamine and food processing. Inflamm. Res. 48: 296-300). Además, las AB son precursoras de las nitrosa-minas, de conocido efecto cancerígeno (B. ten Brink, C. Daminkm H.M.L.J. Joosten y J.H.J. Huis in’t Veld. 1990. Occurrence and formation of biologically active amines in foods. Int. J. Food. Microbiol. 11: 73-84). Por todo ello, las autoridades alimentarías recomiendan evitar la presencia de AB en alimentos y bebidas. En general, las AB que aparecen con mayor frecuencia y en mayor concentración en alimentos fermentados son la tiramina y la histamina, producidas por descarboxilación enzimática de los aminoácidos tirosina e histidina respectivamente (B. ten Brink, C. Daminkm H.M.L.J. Joosten y J.H.J. Huis in’t Veld. 1990. Occurrence and formation of biologically active amines in foods. Int. J. Food. Microbiol. 11: 73-84).
La mayoría de los quesos que consumimos se elaboran a partir de leches pasteurizadas que se inoculan con cultivos iniciadores industriales. Las cepas que forman parte de estos cultivos deben de cumplir una serie de características como capacidad acidificante, resistencia a bacteriófagos, producción de aroma y sabor entre otras. Además, con el fin de garantizar las cualidades sanitarias del producto final se debería de evitar la inclusión de aquellas cepas cuya actividad metabólica pueda dar lugar a la formación de AB.
Los métodos actuales de detección de AB en alimentos son métodos cromatográficos (M.T. Veciana-Nogues, T. Hernández-Javer, A. Marine-Font y M.C. Vidal-Carou. 1995. Liquid chromatographic method for determination of biogenic amines in fish and fish products JAOAC Int. 78: 1045-1050) que detectan la presencia de estos compuestos al final del proceso productivo y por lo tanto no se puede evitar la pérdida del producto final con el consiguiente perjuicio económico. También se puede comprobar si las cepas utilizadas como cultivos iniciadores producen AB en el laboratorio. En la actualidad se usan dos tipos de métodos: cuantitativos y/o cualitativos. Los métodos cualitativos se basan en el crecimiento de los microorganismos en medios diferenciales, con un indicador de pH y en presencia del aminoácido que actúa como sustrato de la reacción (S. Bover-Cid y W.H. Holzapfel. 1999. Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol. 53: 33-41). La dificultad para el crecimiento en estos medios de algunas cepas de BAL productoras de aminas y los largos períodos de incubación necesarios (72 horas) ha conducido a la búsqueda de nuevas técnicas alternativas. Los métodos cuantitativos se basan en técnicas cromatográficas (I. Krause, A. Bockhardt, H. Neckerman, T. Henle y H. Klostermeyer. 1995. J. of Chro-matography 715: 67-79), en este caso hay que tener en cuenta que la producción de estos compuestos está inducida por determinadas condiciones ambientales, como por ejemplo la presencia del aminoácido sustrato o la acidez del
medio (N. Connil, Y. L. Breton, X. Dousset, Y. Auffray, A. Rincé y H. Prévost. Identification of theEnterococcus
faecalistyrosine decarboxylase operon involved in tyramine production. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68: 3537-3544). Esto indica que un resultado negativo en el momento de realizar el análisis no puede garantizar la seguridad de la cepa ensayada, ya que en condiciones distintas si podría producir AB que se acumularían en el alimento o bebida correspondiente. En el caso de la producción de histamina, se ha descrito un método de PCR que detecta la presencia del gen de la histidina descarboxilasa (C. Le Jeune, A. Lonvaud-Funel, B. ten Brink, H. Hofstra y J.M.B.M. van der Vossen. 1995. Development of a detection system for histidine decarboxylating lactic acid bacteria based on DNA probes, PCR and activity test.. J. Appl. Bacteriol. 78: 316-326) y por lo tanto permite identificar cepas potencialmente productoras de histamina, pero no existe ninguna alternativa en el caso de la tiramina que es la AB predominante en productos lácteos fermentados (A.R. Roig-Sagués, A.P. Molina y M.M. Hernández-Herrero. 2002. Histamine and tyramine forming microorganisms in spanish traditional cheeses. Eur. Food Res. Technol. 215: 96-100).
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Uno de los criterios de selección de los microorganismos que forman parte de los cultivos iniciadores de alimentos y bebidas fermentadas es su inocuidad, de forma que esté garantizada la calidad sanitaria del producto final. Esta necesidad, en combinación con la demanda de métodos cada vez más rápidos y sensibles que puedan ser fácilmente aplicados en cualquier punto de la cadena alimentaria hace de la reacción de PCR un método atractivo para la detección de cepas productoras de tiramina.
Descripción de la invención Descripción breve
Un objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de control de la presencia de aminas biógenas en alimentos y bebidas mediante la identificación de bacterias del ácido láctico potencialmente productoras de tiramina
mediante la amplificación del gentdcA por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basado en el
uso de una pareja de oligonucleótidos cebadores específicos del gen tcdAdeL. lactisIPLA10000, que permitan la
amplificación específica del gentdcA de distintas especies, bajo unas condiciones adecuadas. La utilidad radica en
permitir tomar decisiones en el ámbito de la seguridad alimentaria, preferentemente en el sector de los productos lácteos o en el sector vinícola, tanto para asegurar la caracterización de las cepas que pueden formar parte de un cultivo iniciador como para controlar los procesos de fermentación una vez iniciados y a alimentos ya elaborados.
Un objeto particular de la presente invención lo constituye entre otros la siguiente pareja de oligonucleótidos, los oligonucleótidos tdcA1 y tdcA2
5’-AACTATCGTATGGATATCAACG-3’ (oligo tdcA1, SEQ ID NO3)
5’-TAGTCAACCATATTGAAATCTGG-3’ (oligo tdcA2, SEQ ID NO4)
La invención comprende también un kit identificación de bacterias del ácido láctico potencialmente productoras
de tiramina por diagnóstico por PCR del gentdcAque contenga la pareja de oligonucleótidos cebadores de la presente
invención.
Descripción detallada
La presente invención se basa en la identificación de bacterias BAL productoras de tiramina que puede ser
realiza-da de forma rápirealiza-da y sensible por PCR mediante oligonucleótidos cebadores específicos del gentdcA, que codifica la
tirosina descarboxilasa, enzima que cataliza la síntesis de tiramina a partir de tirosina. Estos oligonucleótidos
cebado-res se diseñaron a partir de la secuencia de nucleótidos del gentdcAdeL. lactisIPLA10000. La comparación de las
secuencias de nucleótidos del gentdcAentre las formas conocidas hasta la fecha y la descrita en la presente invención
ha permitido la identificación de regiones altamente conservadas entre los distintos géneros. Estas secuencias son por tanto buenas candidatas para el diseño y la definición de oligonucleótidos cebadores para su uso en reacciones de PCR
que permita amplificar un fragmento interno identificativo del gentdcAy por tanto la determinación de la existencia
de bacterias BAL productoras de tiramina en los cultivos en los que se toma la muestra.
Las ventajas más importantes del procedimiento que se propone, son, además de la especificidad y la sencillez, la altísima sensibilidad y la rapidez. Partiendo de una colonia aislada o de material genético obtenido a partir de células crecidas en cualquier medio de cultivo se puede conocer, en menos de 4 horas, si esa cepa es potencialmente productora de tiramina o si existieron cepas productoras de tiramina. Igualmente, pueden analizarse alimentos ya elaborados, por ejemplo productos lácteos como el queso entre otros, vinos, cervezas, etc, y determinar la existencia de trazas previas o presentes de cepas productoras de tiramina.
Así, un objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de amplificación del gentdcApor la técnica
de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en adelante procedimiento de la presente invención, basado en el uso
de una pareja de oligonucleótidos cebadores específicos del gentcdAdeL. LactisIPLA10000.
Hasta el momento, en bacterias Gram positivas, sólo se conoce la secuencia completa del gen de la tirosina
des-carboxilasa (tdcA) deEnterococcus. faecalisJH2-2 (N. Connil, Y. L. Breton, X. Dousset, Y. Auffray, A. Rincé y H.
Prévost. 2002. Identification of theEnterococcus faecalistyrosine decarboxylase operon involved in tyramine
pro-duction. Appl. Environ. Microbiol. 68: 3537-3544) y parcialmente la secuencia del gentdcAdeLactobacillus brevis
IOEB 9809 (P. Lucas y A. Lonvaud-Funel. 2002. Purification and partial gene sequence of the tyrosine decarboxylase ofLactobacillus brevisIOEB 9809. FEMS Microbiol. Lett. 211: 85-89) En el géneroLactococcus, el fermento más utilizado en la producción de queso, aunque se han identificado algunas cepas productoras de tiramina, no se disponía de datos genéticos. Utilizando como cebadores los oligonucleótidos degenerados descritos en la literatura (P. Lucas y A. Lonvaud-Funel. 2002. FEMS Microbiol. Lett. 211:85-89), se amplificó mediante PCR un fragmento interno del
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gen (Figura 1, SEQ ID NO1) y su correspondiente secuencia aminoacídica (SEQ ID NO2). Por tanto el gentdcAdeL.
lactisIPLA10000 identificada en la SEQ ID NO1 (en concreto la región CDS entre los nucleótidos 269 y 2137) y no descrito anteriormente forma parte de esta invención y por tanto la secuencia de nucleótidos codificante del mismo.
El diseño de los cebadores adecuados que permitan la amplificación específica del fragmento de DNA deseado, ha
requerido la comparación de las secuencias nucleotídicas del gentdcA, procedentes de distintas especies bacterianas.
Esta comparación nos permitió identificar las zonas conservadas que serán comunes para los distintos microorganis-mos. En concreto, la comparación de las secuencias nucleotídicas de la tirosina descarboxilasa de los tres géneros nos permitió identificar regiones comunes a todos ellos y con un tamaño adecuado (Figura 2, zonas sombreadas) para diseñar oligonucleótidos con el objeto de amplificar de forma específica formas homologas de este gen. Otro objeto de
la presente invención lo constituye la propia pareja de nucleótidos específicos del gentdcAdeL. LactisIPLA10000,
en adelante pareja de oligonucleótidos cebadores de la presente invención, que permiten la amplificación específica
por PCR del gentdcAde distintas especies.
Entre las distintas posibilidades de parejas de oligonucleótidos y como una realización particular de la presente invención se han diseñado los oligonucleótidos cuya secuencia se muestra a continuación:
5’-AACTATCGTATGGATATCAACG-3’ (oligo tdcA1, SEQ ID NO3)
5’-TAGTCAACCATATTGAAATCTGG-3’ (oligo tdcA2, SEQ ID NO4)
que bajo unas condiciones adecuadas de amplificación del fragmento de doble cadena flanqueado por dichos oli-gonucleótidos, como por ejemplo, las siguientes:
3 un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos.
3 30 ciclos:
• Desnaturalización a 94ºC (30 segundos)
• Anillamiento a 40ºC (1 minuto)
• Extensión a 72ºC (1 minuto)
3 Incubación a 72ºC durante 7 minutos para permitir la finalización de todas las cadenas iniciadas
previa-mente.
Hay que señalar que las condiciones de la reacción PCR descritas anteriormente pueden adaptarse fácilmente por un experto medio de la técnica de la presente invención dependiendo del termociclador, pudiéndose modificar las condiciones de desnaturalización, la temperatura de anillamiento, la temperatura de extensión, la polimerasa así como
la secuencia de los cebadores, etc, de tal forma que estos procedimientos de amplificación del gentdcA por (PCR)
forman parte de la presente invención.
Otro objeto de la presente invención lo constituye un kit de diagnóstico por PCR del gentdcAque contenga la
pareja de oligonucleótidos cebadores de la presente invención.
Descripción de las figuras
Figura 1.-Secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica deducida del gen tdcA de L. lactis IPLA 10000. La
secuencia sombreada en gris corresponde al fragmento inicialmente clonado. La secuencia señalada en verde son los oligonucleótidos diseñados.
Figura 2.-Comparación de las secuencias nucleotídicas del gen tirosina descarboxilasa de L. lactis IPLA 10000,
Enterococcus. faecalis (número de acceso en GeneBank AF354231), Lactobacillus. brevis (número de acceso en Ge-neBank AF446085). En rojo se indican los nucleótidos idénticos en los tres géneros.
Figura 3.-Comparación de las secuencias aminoacídicas de la tirosina descarboxilasa en bacterias del ácido
láctico. En rojo se indican los aminoácidos idénticos y en azul los aminoácidos del mismo grupo.
Figura 4.-Crecimiento de cepas productoras y no productoras de tiramina en un medio con tirosina. Dos de las
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Ejemplos de realización de la invención
Ejemplo 1
Identificación directa de cepas productoras de tiramina usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de placa
Se utilizaron 184 cepas de BAL de la colección del Instituto de Productos Lácteos de Asturias (CSIC) que habían sido aisladas a partir de distintos tipos de quesos. Las cepas se sembraron en medio diferencial con tirosina como aminoácido sustrato. A partir de las 21 cepas que dieron positivo en este medio se realizó la reacción de PCR.
En este caso, la reacción de PCR se realizó directamente a partir de la placa. La colonia se resuspendió en 25µl de
agua MilliQ, a esta suspensión, se añadieron los oligonucleótidos (1µl de una solución 10µM), los deoxinucleótidos
(1µl de una solución 10 mM) el tampón de la reacción (5µl de una solución 10 veces concentrada suministrada por el
proveedor del enzima) y el enzima (1µde una solución 1 U/µl) se añadieron 16µl de agua MilliQ con el fin de realizar
la reacción en un volumen total de 50µl. Las reacciones de amplificación se realizaron en un termociclador iCyclerTM
Thermal Cylcer (Bio-Rad). Las reacciones de amplificación contenían 50 ng de DNA cromosómico, 0.5µM de cada
cebador, los cuatro deoxinucleótidos (0.2 mM), 1 U de Taq Polymerasa (Amersham) y 5µl del tampón suministrado
con el enzima en 50µl totales de reacción.
Las condiciones de la reacción son las siguientes:
3 un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos.
3 30 ciclos:
• Desnaturalización a 94ºC (30 segundos)
• Anillamiento a 40ºC (1 minuto)
• Extensión a 72ºC (1 minuto).
3 Incubación a 72ºC durante 7 minutos para permitir la finalización de todas las cadenas iniciadas
previa-mente.
Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 0.8% en tampón Tris-Borato EDTA (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis. 1982. En Molecular cloning. A laboratory manual. 2ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York). Después de la electroforesis los geles fueron teñidos con bromuro de etidio (1µg/ml) y visualizados con
luz ultravioleta (300 nm). Como patrón de peso molecular se utilizó DNA del fagoλdigerido conPstI.
De las 21 cepas positivas analizadas, la PCR dio lugar a la banda del tamaño esperado en 18 de ellas (Figura 5). Mediante técnicas cromatográficas se comprobó que las 18 eran capaces de producir tiramina. En las tres restantes no se produjo ningún tipo de amplificación por PCR, pero se pudo comprobar mediante cromatografía que eran incapaces de producir tiramina, siendo por tanto falsos positivos. También se comprobó, que a partir de las colonias negativas en el medio diferencial, ni se produce amplificación por PCR, ni se detecta producción de tiramina por cromatografía.
Como conclusión, podemos asegurar que todas las cepas que resultaron positivas mediante el método de PCR aquí descrito, producen tiramina, mientras que en ninguna de las cepas negativas se pudo detectar su producción.
Ejemplo 2
Identificación de cepas productoras de tiramina a partir de material genético procedente de cultivo de bacterias, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Se utilizaron 18 cepas distintas, pertenecientes a los génerosLactobacillus(4 cepas), Lactococcus(7 cepas) y
Enterococcus (7 cepas), que habían sido previamente identificadas como cepas productoras de tiramina mediante su capacidad de hidrolizar tirosina en placa (Se muestra un ejemplo de dos cepas productoras en la Figura 4) y se valoró la formación de tiramina mediante análisis cromatográfico. Se obtuvo DNA cromosómico de todas ellas por procedimientos estándares. A continuación se realizó la reacción de PCR siguiendo exactamente las condiciones descritas en el ejemplo anterior. El producto de PCR se visualizó en un gel de agarosa.
En todos los casos se amplificó un único fragmento de DNA del tamaño esperado (Figura 5). Se comprobó si los oligonucleótidos y las condiciones de la reacción de PCR diseñados permitían la amplificación del fragmento interno
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Identificación de cepas productoras de tiramina a partir de alimentos, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Muestras de leche se inocularon con la cepa productoraL. lactisIPLA 10000.A distintos tiempos, y durante 24
horas, se sacaron muestras de 1µl que se utilizaron directamente para la reacción de PCR. Esta se realizó siguiendo
las condiciones descritas en los ejemplos anteriores con la salvedad de que se aumentó el número de ciclos a 35. El producto de PCR se visualizó en un gel de agarosa Se comprobó que se obtenía una única banda del tamaño esperado, a partir de la primera hora de cultivo y se mantenía en todas las muestras a lo largo del tiempo de muestreo, tanto en la leche como en la cuajada. Este resultado permite comprobar la sensibilidad y la rapidez del método ya que no es necesario el aislamiento del material genético y se puede detectar rápidamente la cepa productora.
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de detección de bacterias del ácido láctico productoras de tiraminacaracterizadopor el uso la
técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con una pareja de oligonucleótidos cebadores específicos del
gentcdA(SEQ ID NO 1) deL. LactisIPLA10000.
2. Procedimiento de detección de bacterias del ácido láctico productoras de tiramina según la reivindicación 1
caracterizado porque la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realiza bajo unas condiciones adecuadas de amplificación del fragmento de doble cadena flanqueado por dichos oligonucleótidos, como por ejemplo, las siguientes:
3 un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos.
3 30 ciclos:
• Desnaturalización a 94ºC (30 segundos)
• Anillamiento a 40ºC (1 minuto)
• Extensión a 72ºC (1 minuto)
3 Incubación a 72ºC durante 7 minutos para permitir la finalización de todas las cadenas iniciadas
previa-mente.
3. Procedimiento de detección de bacterias del ácido láctico productoras de tiramina según las reivindicaciones 1 y 2caracterizadoporque la pareja de oligonucleótidos cebadores está constituida por los oligonucleótidos tdcA1 (SEQ ID NO3) y tdcA2 (SEQ ID NO4).
4. Procedimiento de detección de bacterias del ácido láctico productoras de tiramina según las reivindicaciones 1 a 3caracterizadoporque utiliza como material de partida un cultivo de bacterias sin mediar extracción de DNA.
5. Procedimiento de detección de bacterias del ácido láctico productoras de tiramina según las reivindicaciones 1 a 3caracterizadoporque utiliza como material de partida el DNA cromosómico extraído de las bacterias.
6. Procedimiento de detección de bacterias del ácido láctico productoras de tiramina según las reivindicaciones 1 a 3caracterizadoporque utiliza como material de partida el DNA cromosómico extraído de cualquier alimento.
7. Pareja de nucleótidos cebadores específicos del gentdcAdeL. LactisIPLA10000caracterizadosporque
permi-ten la amplificación específica por PCR del gentdcAde distintas especies y la realización de un procedimiento según
las reivindicaciones 1, 2 y 3.
8. Pareja de nucleótidos cebadores específicos del gentdcAde L. LactisIPLA10000 según la reivindicación 7
caracterizadaporque está constituida por los siguientes oligonucleótidos
5’-AACTATCGTATGGATATCAACG-3’ (oligo tdcA1, SEQ ID NO3)
5’-TAGTCAACCATATTGAAATCTGG-3’ (oligo tdcA2, SEQ ID NO4)
9. Secuencia de nucleótidos codificante del gentdcAdeL. lactisIPLA10000caracterizadapor la SEQ ID NO1
indicada en la reivindicación 1 (en concreto la región CDS entre los nucleótidos 269 y 2137).
10. Kit de detección de bacterias del ácido láctico productoras de la amina biógena tiraminacaracterizadopor
realizarse por el procedimiento indicado en las reivindicaciones 1 a 6 y que contenga la pareja de oligonucleótidos cebadores según las reivindicaciones 7 y 8.
11. Uso del procedimiento según la reivindicación 1 a 6 para el control de contaminaciones de aminas biógenas en alimentos mediante la identificación de trazas de bacterias productoras de tiramina que permitan tomar decisiones en el ámbito de la seguridad alimentaria, preferentemente en el sector de los productos lácteos o vinícolas, tanto
para asegurar lacaracterizaciónde las cepas que pueden formar parte de un cultivo iniciador como para controlar
los procesos de fermentación una vez iniciados y los productos finales como alimentos ya elaborados por ejemplo productos lácteos como el queso entre otros, vinos y cervezas.
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 LISTA DE SECUENCIAS
<110>CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS
Álvarez González, Miguel Ángel Fernández García, María
<120>DETECCIÓN DE BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO PRODUCTORAS DE TIRAMINA MEDIANTE
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
<130>tcdA <160>4 <170>PatentIn version 3.1 <210>1 <211>2462 <212>DNA <213>Lactococcus lactis <220> <221>primer_bind <222>(1052)..(1073) <223> <220> <221>primer_bind <222>(1757)..(1779) <223> <220> <221>misc_feature <222>(2427)..(2427) <223>Unknow residue <220> <221>CDS <222>(269)..(2137) <223> <400>1
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 <210>2 <211>623 <212>PRT <213>Lactococcus lactis <220> <221>misc_feature <222>(2427)..(2427) <223>Unknow residue <400>2
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 <210>3 <211>22 <212>DNA <213>artificial sequence <220>
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 <210>4 <211>23 <212>DNA <213>artificial sequence <220>
<223>Oligo artificially obtained designed from gentcdAofLactococcus lactissequence
<400>4
ESPAÑA
21
Nº de solicitud:20030257222
Fecha de presentación de la solicitud:04.11.200332
Fecha de prioridad:INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA
51
Int. Cl.: C12Q 1/68(2006.01)DOCUMENTOS RELEVANTES
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X: de particular relevancia
Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría
A: refleja el estado de la técnica
O: referido a divulgación no escrita
P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud
E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
A LONVAUD-FUNEL, A. "Biogenic amines in wines: role of lactic acid 1-11 bacteria.", FEMS MICROBIOL. LETT., 2001, Vol. 199, No. 1,
páginas 9-13. Todo el documento.
A LUCAS, L. et al. "Purification and partial gene sequence of the 1-11 tyrosine decarboxylase of Lactobacillus brevis IOEB 9809.", FEMS
MICROBIOL LETT., 2002, Vol. 211, No. 1, páginas 85-89. Todo el documento.
A NOVELLA-RODRIGUEZ, S. et al. "Influence of starter and 1-11
nonstarter on the formation of biogenic amine in goat cheese during ripening.", J DAIRY SCI., 2002, Vol. 85, No. 10, páginas 2471-2478. Todo el documento.
