Facultad de Medicina
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología
TESIS DOCTORAL
Caracterización de la proteína PSTPIP1 implicada
en el síndrome PAPA
Presentada por Tamara Marcos de Mena para optar al grado
de doctor por la Universidad de Valladolid
Dirigida por:
Dr. Andrés Alonso García
Dra. Yolanda Bayón Prieto
Abreviatura Definición
ADN
Ácido desoxirribonucleico
ADPAdenosín difosfato
AIM2
Interferon-inducible protein AIM2
ALPS
Autoimmune lymphoproliferative syndrome
AN
Amplitud numérica
AR
Artritis reumatoide
ASC
Apoptosis-associated speck-like protein
ATP
Adenosín trifosfato
BARBin, Amphiphysin, Rvs
BB
Dominio B-box
BCA
Ácido bicinconínico
BCRB cell receptor
BSA
Albúmina de suero bovino
bZIPBasic leucine zipper domain
CAPS
Cryopyrin-associated periodic syndrome
CARD
Caspase-recruitment domain
CC
Dominio coiled-coil
CDCluster of diferentiation
CD2BP1
CD2 binding protein 1
cDNA
ADN complementario
CIP4
Cdc42 interacting protein 4
CMLChronic myelogenous leukemia
CO2
Dióxido de carbono
COS-1
Chlorocebus sabaeus, SV40 transformed
CRMO
Chronic recurrent multifocal osteomyelitis
Csk
C-src tyrosine kinase
CTH
C-terminal homology
DAMPs
Damage-associated molecular patterns
DAPI
4',6-diamino-2-fenilindol
DDDeath domain fold
DMEM
Dulbecco's modified eagle medium
DMSO
Dimetilsulfóxido
DTT
Ditiotreitol
ECL
Enhanced chemiluminescence
EDTA
Etilendiamonotetraacetato de sodio
EGTAÁcido N,N,N´-tetraacético
ERK
Extracelular-signal regulated kinase
F-BAR
EFC extended-FCH
FBP17
Formin binding protein 17
FBSi
Suero fetal bovino inactivado
FMFFamilial Mediterranean Fever
Abreviatura Definición
GFP
Green fluorescent protein
GST
Glutation S Transferasa
HA
Hemaglutinina
HBSS
Solución salina balanceada de Hanks
HEK-293Human embrionic kidney 293 cells
HEPES
Ácido 4- (2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico
HRPHorseradish peroxidase
IFN-α
Interferon alfa
IL-18
Interleuquina-18
IL-1β
Interleuquina-1 beta
IP
Inmunoprecipitados
JK
Células Jurkat
Jnk
c-Jun N-terminal kinases
LB
Medio LB (Luria-Bertani)
Lck
Proteína tirosina quinasa específica de linfocitos
LPSLipopolisacárido
LRR
Leucine-rich repeat
Lyp
Lymphoid tyrosine phosphatase
MEFVMediterranean fever
MWS
Síndrome Muckle-Well
NACHT
Nucleotide-binding, and oligomerization domain
NBD
Nucleotide-binding domain
NES
Secuencia de exportación nuclear
NFκB
Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B
cells
NLR
Nucleotide-binding oligomerization domain and leucine-
rich repeat domain
NLRC4NLR family CARD domain-containing protein 4
NLRP3
NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3
NLS
Secuencia de localización nuclear
NOD
Nucleotide-binding oligomerization domain
OFPOrange fluorescent protein
PAMPs
Pathogen-associated molecular patterns
PAPA
Pyogenic sterile arthritis, pyoderma gangrenosum and acne
PBLs
Linfocitos de sangre periférica
PBSTampón fosfato salino
PFA
Paraformaldehído
PRR
Pattern recognition receptors
PSTPIP1
Proline-serine-threonine-phosphatase-interacting protein 1
PSTPIP2
Proline-serine-threonine-phosphatase-interacting protein 2
PTKs
Protein tyrosine kinase
Abreviatura Definición
PTP
Protein tyrosine phosphatase
PTPN22
Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 22
PV
Pervanadato sódico
PYD
Dominio PYRIN
RGB
del inglés
Red, Green, Blue
RPMI
Roswell Park Memorial Institute medium
SAA
Suero amiloide A
SDSDodecilsulfato sódico
SH3Src homology 3
SLE
Systemic lupus erythematosus
Syk
Spleen tyrosine kinase
TBS
Solución salina tamponada con tris
TCRT cell receptor
TGFβ
Transforming growth factor beta
THP1
Línea celular monocítica humana
TL
Total lysates
TLR
Toll-Like Receptor
TNFα
Factor de necrosis tumoral
UV
Ultravioleta
WASP
Wiskott-Aldrich syndrome protein
WLL
White light laser
Aminoácido Símbolo de una letra Abreviatura común
Alanina A Ala
Arginina R Arg
Asparagina N Asp
Ácido aspártico D Asp
Cisteína C Cys
Glutamina Q Gln
Ácido glutámico E Glu
Glicina G Gly Histidina H His Isoleucina I Ile Leucina L Leu Lisina K Lys Metionina M Met Fenilalanina F Phe Prolina P Pro Serina S Ser Treonina T Thr Triptófano W Trp Tirosina Y Tyr Valina V Val
Abreviaturas ... 5
Índice ... 11
Introducción ... 17
1. El inflamasoma... 19
2. Enfermedades autoinflamatorias ... 22
3. Síndrome de artritis piogénica estéril, pioderma gangrenoso y acné (PAPA) .... 23
4. PSTPIP1 ... 25
4.1. El dominio F-BAR ... 27
4.2. Relación de PSTPIP1 con el citoesqueleto ... 30
4.3. Fosforilación de PSTPIP1 por la quinasa de tirosina Abl ... 31
5. Familia de fosfatasas de tirosina PEST ... 32
5.1. Lyp ... 33
6. Pyrin ... 34
6.1. Inflamasoma de Pyrin ... 36
6.2. Fiebre Mediterránea Familiar ... 39
6.3. Interacción de Pyrin y PSTPIP1 ... 41
Objetivos ... 43 Material y Métodos ... 47 1. Materiales ... 49 1.1. Soluciones y tampones ... 49 1.2. Anticuerpos ... 50 1.3. Plásmidos ... 52 2. Métodos experimentales ... 54 2.1. Cultivos celulares... 54 2.1.1. Líneas adherentes ... 54 2.1.2. Líneas en suspensión ... 54
3. Técnicas de manipulación celular ... 54
3.1. Establecimiento de líneas estables... 54
3.2. Métodos de transfección celular ... 55
3.2.1. Transfección por fosfato cálcico ... 55
3.2.2. Transfección por electroporación ... 55
4. Técnicas moleculares ... 57
4.1. Western blot ... 57
4.3. Pull-down de proteínas ... 58
4.4. Ensayo de quinasa invitro ... 59
4.5. Valoración de proteínas ... 59
5. Otras técnicas moleculares ... 59
5.1. ADN plasmídico ... 59
5.2. Mutagénesis dirigida ... 60
6. Técnicas de Inmunocitoquímica ... 61
6.1. Tratamiento de cristales con Poly-L-Lisina ... 61
6.2. Fijación de células adherentes ... 62
6.3. Fijación de células en suspensión ... 62
6.4. Tinción de núcleos ... 62
6.5. Tinción de filamentos de actina ... 63
6.6. Inmunofluorescencia ... 63
6.7. Estimulación de células THP-1 para la formación de specks ... 64
7. Técnicas de análisis de imágenes ... 64
7.1. Microscopía de fluorescencia ... 64
7.1.1. Observación y contaje de specks ... 64
7.2. Microscopía confocal ... 65
7.2.1. Análisis de colocalización ... 65
8. Análisis estadístico ... 66
Resultados ... 67
1. Expresión y localización subcelular de PSTPIP1 ... 69
1.1. Colocalización de PSTPIP1 con el citoesqueleto ... 71
1.2. Localización de los mutantes de PSTPIP1 ... 73
2. Fosforilación de PSTPIP1 ... 76
3. Interacción de PSTPIP1 con diferentes proteínas ... 78
3.1. Interacción de PSTPIP1 con WASP ... 79
3.2. Interacción de PSTPIP1 con Lyp ... 79
3.2.1. Expresión y localización de Lyp ... 79
3.2.2. Colocalización de PSTPIP1 y Lyp en la célula ... 80
3.2.3. Análisis de la interacción de PSTPIP1 con la proteína Lyp ... 82
3.2.4. Efecto de las mutaciones de PSTPIP1 en la interacción con Lyp ... 83
3.3. Interacción de PSTPIP1 con Pyrin ... 85
3.3.1. Expresión y localización de Pyrin ... 85
3.3.2. Fosforilación de Pyrin ... 86
3.3.4. Dominios de PSTPIP1 involucrados en su interacción con Pyrin ... 92
3.3.5. Dominios de Pyrin involucrados en su interacción con PSTPIP1 ... 95
3.3.6. Interacción de los mutantes de PSTPIP1 con Pyrin ... 97
3.3.7. Interacción de los mutantes de Pyrin con PSTPIP1 ... 100
4. Estudio del ensamblaje del inflamasoma de Pyrin ... 102
4.1. ASC: expresión, localización y fosforilación ... 103
4.2. Colocalización de Pyrin y ASC ... 104
4.3. Pyrin en la formación de specks ... 108
4.4. Colocalización de PSTPIP1 con ASC y Pyrin en el speck ... 110
4.5. PSTPIP1 en la formación de specks ... 112
4.6. Fosforilación en tirosinas en la formación de specks ... 114
Discusión ... 117
1. PSTPIP1 se localiza en la membrana plasmática ... 119
2. Las mutaciones asociadas al PAPA incrementan la fosforilación de PSTPIP1 por Abl 120 3. Las mutaciones de PSTPIP1 asociadas al PAPA afectan a la interacción con la fosfatasa Lyp de manera desigual ... 121
4. Interacción de Pyrin con PSTPIP1 ... 122
5. Pyrin se fosforila en tirosinas ... 123
6. PSTPIP1 participa en el ensamblaje del inflamasoma de Pyrin ... 124
7. Contribución de Abl y Lyp en la formación de specks ... 126
Conclusiones ... 129
El sistema inmunitario tiene como función defender al organismo frente a la infección por patógenos, tales como bacterias, virus u hongos. Para llevar a cabo esta función debe distinguir los patógenos de las propias células del organismo. Por ello, la respuesta inmune de un organismo consta de diversos mecanismos destinados a identificar y eliminar el agente extraño, pudiendo clasificar esta respuesta inmune en innata o adaptativa. La respuesta inmune innata es rápida e inespecífica y se inicia por el reconocimiento de los patógenos de forma genérica a través de receptores de reconocimiento de patrones (PRRsdel inglés Pattern-recognition receptors), presentes en células del sistema inmune innato tales como neutrófilos, monocitos, macrófagos y células dendríticas, permitiendo de este modo la detección temprana de patógenos en el sitio de la infección (Arostegui and Yague 2008, Savic, Dickie et al. 2012). Estos PRRs reconocen moléculas presentes en amplios grupos de microorganismos, llamados patrones moleculares asociados a patógenos, (PAMPs, del inglés Pathogen-associated molecular
patterns) y también reconocen moléculas del propio organismo que se generan como consecuencia del daño o el estrés celular, en este caso reciben el nombre de patrones moleculares asociados a daño (DAMPs, del inglés Danger-associated molecular patterns) (Elinav, Strowig et al. 2011). Cuando se estimulan los PRRs, se inicia la respuesta inflamatoria mediante la expresión de moléculas de adhesión y la secreción de citocinas y quimiocinas para reclutar células del sistema inmunitario al foco de infección. Por otro lado, la respuesta inmune adaptativa es más lenta y reconoce antígenos de forma específica a través de los receptores de los linfocitos T (TCR) y B (BCR). El organismo dispone de un amplio repertorio de estos receptores, capaces de responder prácticamente a cualquier antígeno, lo que a su vez presenta el riesgo de poder activarse contra los antígenos del propio organismo.
1.
El inflamasoma
Los PRRs pueden agruparse en dos grupos principales teniendo en cuenta su localización subcelular. En el primer grupo estarían incluidos los receptores de tipo Toll (TLRs, del inglés Toll-like receptors) y los receptores de tipo lectina (CLRs, del inglés C-type
Lectinreceptors). Estos PRRs son proteínas que se encuentran en la membrana plasmática y en endosomas, e inspeccionan el medio extracelular en busca de PAMPs y DAMPs (Kawai and Akira 2006, West, Koblansky et al. 2006). Un segundo grupo lo formarían tres familias que inspeccionan el medio intracelular. Estas tres familias incluyen los receptores de tipo RIG-I, (RLRs, del inglés RIG-I-like receptors), la familia de proteínas HIN200 y los receptores NLR (del inglés Nucleotide-binding oligomerization domain and leucine-rich repeat domain) (Takeuchi and Akira 2010).
Muchos de estos receptores inician la respuesta inflamatoria utilizando rutas de señalización aparentemente redundantes. Sin embargo, un grupo de PRRs, concretamente algunos miembros de la familia de los NLRs (NLRP3 y NLRC4), y la proteína AIM2 (protein
absent in melanoma 2) de la familia HIN200, señalizan formando inflamasomas (Eitel, Suttorp et al. 2010, Ellebedy, Lupfer et al. 2011), que son complejos multiproteicos intracelulares que desencadenan la activación de las caspasas-1 y -11(Kayagaki, Warming et al. 2011). Dicha activación es necesaria para el procesamiento de las interleuquinas -1 beta (IL-1β) y -18, que participan en numerosos procesos relacionados con la respuesta inflamatoria.
NLRP3 y NLRC4 presentan un dominio C-terminal que contiene múltiples motivos ricos en leucina, denominados LRRs (del inglés Leucine-rich repeat), responsable de la detección del ligando, seguido de un dominio NOD (del inglés Nucleotide-binding
oligomerization domain), también llamado NATCH, implicado en la inducción de cambios conformacionales y en la oligomerización del receptor. En el extremo N-terminal presentan un dominio efector, responsable de la activación de las caspasas proinflamatorias. Este dominio efector puede ser tanto un dominio CARD, como por ejemplo en NLRC4, o un dominio PYD, en el caso de los receptores NLRP3 (Schroder and Tschopp 2010). En el caso de AIM2, el dominio responsable de la detección del ligando y de la oligomerización del receptor es el dominio HIN200 y el dominio efector es un dominio PYD. Normalmente, los dominios PYD interaccionan con otros dominios PYD y los dominios CARD con otros dominios CARD, permitiendo el ensamblaje del receptor con proteínas adaptadoras y efectoras.
En el ensamblaje del inflamasoma participa una proteína adaptadora llamada ASC(del inglés apoptotic-associated speck like protein). Esta proteína consta de un dominio N-terminal PYD, por el que se une al dominio PYD del PRR, y un dominio C-N-terminal CARD, con el que interacciona con el dominio CARD de la caspasa-1 (Stehlik and Reed 2004, Chae, Aksentijevich et al. 2009). La presencia de ASC en el inflamasoma genera agregados perinucleares denominados specks, con un tamaño comprendido entre 1 y 2 μm (Fernandes-Alnemri, Wu et al. 2007), que acompaña al proceso de muerte celular inflamatoria denominado piroptosis (Cookson and Brennan 2001, Fernandes-Alnemri, Wu et al. 2007, Gavrilin, Abdelaziz et al. 2012).
El inflamasoma de NLRP3 o Cryopyrin, es el inflamasoma mejor caracterizado. Estímulos proinflamatorios como el ATP, toxinas de bacterias o cristales de ácido úrico, activan el inflamasoma de NLRP3, lo que induce su oligomerización a través de los
dominios NOD y el reclutamiento de pro-caspasa-1 a través del adaptador ASC (Figura 1).
Figura 1: Estructura de los inflamasomas NLRP3, NLRC4 y AIM2. Dominio CARD (caspase-recruitment domain), LRR (leucine-rich repeat), NACHT/NOD (nucleotide-binding and
oligomerization domain), HIN-200 domain y PYD (pyrin domain). Imagen modificada de Eitel,
Suttorp et al. 2010.
La formación de este complejo desencadena la activación de caspasa-1 y el procesamiento de pro-IL-1β a su forma madura. A su vez, la activación de caspasa-1 por el inflamasoma, desencadena el proceso de piroptosis, que es un tipo de muerte celular programada (Cookson and Brennan 2001, Fernandes-Alnemri, Wu et al. 2007, Gavrilin, Abdelaziz et al. 2012). Mutaciones en el gen que codifica para la proteína NLRP3 originan un aumento en la liberación de IL-1β que desemboca en una serie de enfermedades autoinflamatorias, entre las que destacan el Síndrome de Muckle-Well (MWS) y el síndrome periódico asociado a cryopyrin (CAPS, del inglés Cryopyrin-associated periodic
syndrome) (Martinon, Burns et al. 2002). En este sentido, ratones deficientes en el dominio NLR de la proteína NLRP3, muestran un descenso en la secreción de IL-1β y en la respuesta inmune, ante la presencia de un antígeno específico (Eisenbarth, Colegio et al. 2008).
Al igual que NLRP3, el inflamasoma de AIM2, que se activa por ADN citoplasmático, recluta caspasa-1 a través de la proteína adaptadora ASC. Sin embargo, el inflamasoma NLRC4, que se activa por proteínas bacterianas, contiene un dominio CARD por el cual se une directamente al dominio CARD de caspasa-1, aunque la presencia de ASC potencia la formación de este inflamasoma (Wen, Miao et al. 2013).
2.
Enfermedades autoinflamatorias
Paul Ehrlich propuso en 1910 el concepto de horror autotoxicus, actualmente conocido como autoinmunidad, para describir la reacción del sistema inmune contra los propios tejidos y células del portador. El ataque del sistema inmune sobre el propio huésped da lugar a distintas patologías que inicialmente se agruparon bajo el nombre de enfermedades autoinmunes. Estas enfermedades se caracterizan por la presencia de autoanticuerpos y/o de linfocitos T o B capaces de reconocer antígenos propios. Sin embargo, en ciertas patologías anteriormente incluidas en este grupo, se produce una reacción inflamatoria en ausencia de infección y sin que se detecte activación de linfocitos T o B, ni formación de autoanticuerpos. Estas patologías han pasado a denominarse enfermedades autoinflamatorias.
Enfermedades autoinflamatorias monogénicas Enfermedades de fiebres periódicas
FMF (Fiebre Mediterránea Familiar)
CAPS (Síndromes periódicos asociados a Cryopyrin) TRAPS (Síndromes periódicos asociados al receptor TNF)
MKD/HIDS (Deficiencias de mevalonato quinasa / Síndrome asociado a hiperinmunoglobulina D)
Enfermedades con lesiones piogénicas
PAPA (Síndrome artritis piogénica, pioderma gangrenoso y acné) DIRA (Deficiencia del agonista del receptor de IL-1)
Síndrome de Majeed
Enfermedades con lesiones granulomatosas
Síndrome Blau
Enfermedades con psoriasis
DITRA (Deficiencia en el agonista del receptor IL-36)
Enfermedades con lipodistrofia inducida por paniculitis
JMP (Síndrome de contracturas articulares, atrofia muscular y lipodistrofia inducida por paniculitis)
CANDLE (Dermatosis neutrofílica atípica crónica con lipodistrofia y temperatura elevada)
NNS (Síndrome Nakajo-Nishimura)
Otras enfermedades
APLAID (Síndrome de deficiencia de anticuerpos asociados a PLCγ-2 y desregulación inmune)
Tabla 2. Clasificación de las enfermedades autoinflamatorias monogénicas atendiendo a las características clínicas. Datos obtenidos de Ozen and Bilginer 2014.
El término de enfermedad autoinflamatoria se remonta al año 1999 y fue descrito por Daniel Kastner (McDermott, Aksentijevich et al. 1999), cuando englobó una serie de enfermedades con manifestaciones clínicas similares. La mayoría de estas enfermedades
son enfermedades hereditarias monogénicas, que siguen un patrón de herencia mendeliano, con presencia de mutaciones que afectan a genes codificantes de proteínas implicadas en la respuesta inmune innata (Geha, Notarangelo et al. 2007). Estas enfermedades, dada su baja prevalencia en la población, con menos de 5 casos/10.000 habitantes, se incluyen dentro de las denominadas enfermedades raras según el criterio de la Unión Europea. En muchos casos a pesar de considerarse enfermedades de carácter hereditario, su diagnóstico presenta dificultades debido a la ausencia de antecedentes familiares y de marcadores bioquímicos que faciliten su identificación (Arostegui 2011).
Las enfermedades autoinflamatorias monogénicas se pueden clasificar atendiendo a sus características clínicas como se puede ver en la Tabla 2 (Ozen and Bilginer 2014). También existen otro tipo de enfermedades, de origen poligénico, que además de presentar características propias de enfermedades autoinflamatorias presentan características propias de enfermedades autoinmunes. Es el caso de la artritis reumatoide o el lupus.
3.
Síndrome de artritis piogénica estéril, pioderma gangrenoso y
acné (PAPA)
El síndrome PAPA (del inglés pyogenic sterile arthritis, pyoderma gangrenosum and
acne; MIM 604416) fue descrito en 1997 (Lindor, Arsenault et al. 1997) en una familia donde individuos de diferentes generaciones padecían la enfermedad con un patrón de herencia autosómica dominante (Wise, Bennett et al. 2000). Se caracteriza por su baja frecuencia en la población mundial, con aproximadamente unos 50 casos descritos (Arostegui and Yague 2008).
Los primeros síntomas de la enfermedad se manifiestan en los primeros 10 años de vida, en forma de artritis con afectación de las articulaciones principales (Lindor, Arsenault et al. 1997, Wise, Bennett et al. 2000, Tallon and Corkill 2006).Estos pacientes presentan infiltración de polimorfonucleares en el tejido sinovial, que en ocasiones precisan de drenajes quirúrgicos para la evacuación de retenciones purulentas. Estos síntomas pueden ser acompañados por manifestaciones cutáneas como el pioderma gangrenoso, caracterizado por lesiones eritematosas quísticas localizadas sobre todo en extremidades inferiores, que pueden llegar a ulcerarse y cronificarse (Figura 2). Con el cambio hormonal estos pacientes desarrollan acné quístico, que también puede llegar a cronificarse (Lindor, Arsenault et al. 1997, Wise, Bennett et al. 2000).
Figura 2. Ilustración de síntomas característicos del síndrome PAPA. En la imagen de la izquierda se observa artritis en la extremidad inferior como manifestación de la enfermedad. La imagen de la derecha muestra una lesión en la piel característica del pioderma gangrenoso. Imagen tomada de Carol A. Wise et al 2002.
Se ha detectado una elevada producción de IL-1β y del factor de necrosis tumoral (TNFα) en leucocitos de sangre periférica de estos pacientes (Edrees, Kaplan et al. 2002, Shoham, Centola et al. 2003, Cortis, De Benedetti et al. 2004). A pesar de la existencia de hallazgos típicos de una inflamación sistémica, no existe un diagnóstico claro de la enfermedad.
En cuanto a la terapia, cabe la posibilidad de aplicar tanto tratamientos quirúrgicos donde se practican diversos drenajes en las articulaciones, como tratamientos farmacológicos donde destacan los glucocorticoides y los antiinflamatorios no esteroideos (Lindor, Arsenault et al. 1997, Wise, Bennett et al. 2000, Tallon and Corkill 2006). Debido a la falta de una respuesta positiva de duración prolongada a estos tratamientos, se han empleado agentes biológicos como el infliximab, que bloquea el TNFα (Cortis, De Benedetti et al. 2004, Stichweh, Punaro et al. 2005). Además, la presencia de elevados niveles de IL-1β en pacientes de PAPA ha llevado a utilizar bloqueantes de IL-1β, como el anakinra (Dierselhuis, Frenkel et al. 2005).
En el año 2002 se identificó PSTPIP1 (del inglés proline serine threonine
phosphatase-interacting protein 1)como el gen responsable del PAPA (Wise, Gillum et al. 2002). En concreto, se identificaron dos mutaciones, A230T y E250Q, en el gen PSTPIP1 que codifica para la proteína PSTPIP1, localizado en el cromosoma 15q22-24 (Yeon, Lindor et al. 2000, Wise, Gillum et al. 2002). Este gen se expresa predominantemente en células hematopoyéticas (monocitos y neutrófilos) y en la actualidad se han descrito más de una decena de mutaciones, en esta proteína, asociadas con el PAPA (Lindor, Arsenault et al. 1997, Wise, Gillum et al. 2002, Tallon and Corkill 2006, Renn, Helmer et al. 2007,
Smith, Allantaz et al. 2010, Geusau, Mothes-Luksch et al. 2013).
4.
PSTPIP1
PSTPIP1, denominada también como CD2BP1 (del inglés CD2 binding protein 1) por su interacción con la proteína de superficie CD2 de linfocitos T (Nishizawa, Freund et al. 1998), se identificó primeramente en ratón (Spencer, Dowbenko et al. 1997).PSTPIP1 se encuentra asociada con la actina cortical y con los lamelipodios durante el ciclo celular, lo que sugiere la implicación de esta proteína en la reorganización del citoesqueleto de actina (Spencer, Dowbenko et al. 1997). PSTPIP1 posee una proteína homóloga PSTPIP2 (del inglés proline-serine-threonine-phosphatase-interacting protein 2), localizada en el cromosoma 18q21.3-22. Ambas proteínas comparten aproximadamente un 41% de sus aminoácidos pero a diferencia de PSTPIP1, PSTPIP2 carece del dominio carboxilo SH3 (Wu, Dowbenko et al. 1998). Mutaciones en PSTPIP2 identificadas en ratónproducen un fenotipo estrechamente relacionado con la enfermedad autoinflamatoria en humanos, denominada osteomielitis multifocal crónica recurrente (CRMO) (Golla, Jansson et al. 2002), caracterizada por lesiones óseas, que ocasionalmente puede presentar manifestaciones en la piel.
La proteína PSTPIP1 formada por 416 aminoácidos, consta de un dominio FCH (Fes-CIP4) en el extremo N-terminal, seguido de un dominio coiled-coil (CC) y un dominio SH3 (Src Homology 3) en el extremo carboxilo. La agrupación de los dominios FCH y CC constituye un dominio F-BAR (FCH-BAR o EFC Extended-FCH) (Itoh, Erdmann et al. 2005) (Figura 3), que es un tipo de dominio BAR presente en la superfamilia de proteínas BAR (del inglés Bin, Amphiphysin, Rvs) (Frost, Perera et al. 2008), implicadas en procesos de remodelación de la membrana (Frost, De Camilli et al. 2007).
Por el dominio F-BAR, PSTPIP1 interacciona con la proteína Pyrin (Shoham, Centola et al. 2003) implicada en la enfermedad autoinflamatoria Fiebre Mediterránea Familiar (FMF, del inglés Familial Mediterranean fever) y con fosfatasas de tipo PEST (Spencer, Dowbenko et al. 1997). A través del dominio SH3, PSTPIP1 interacciona con la quinasa Abl (Cong, Spencer et al. 2000), la proteína WASP (Rohatgi, Ma et al. 1999), CD2 (Li, Nishizawa et al. 1998) y con el ligando de Fas (FasL), capaz de formar un complejo trimérico constituido por las proteínas FasL, PTP-PEST y PSTPIP1 (Baum, Kirkin et al. 2005). En linfocitos T, PSTPIP1 actúa como proteína adaptadora en la formación de complejos constituidos por la proteína de superficie CD2 y la proteína WASP, ambas implicadas en la formación de la sinapsis inmunológica (Badour, Zhang et al. 2003).
Figura 3. Estructura de la proteína PSTPIP1, constituida por eldominio F-BAR (FCH, CC) y el dominio carboxilo SH3. Localización de las principales mutaciones responsables del PAPA, y de la Tyr-345, donde la quinasa Abl fosforila a PSTPIP1.
Mediante secuenciación se identificaron las mutaciones A230T y E250Q (Wise, Bennett et al. 2000), localizadas en los exones 10 y 11 respectivamente, en dos familias distintas afectadas por la enfermedad PAPA. Estudios realizados en macrófagos derivados de monocitos de cuatro pacientes de PAPA con las mutaciones A230T y E250Q (Cortesio, Wernimont et al. 2010), revelaron deficiencias tanto en la quimiotaxis como en la migración. Además, estos macrófagos presentaron una alteración en su estructura y un descenso en el número de podosomas, estructuras ricas en actina localizadas en la superficie externa de la membrana plasmática de la célula. En un paciente que presentaba un fenotipo característico de la enfermedad PAPA fue identificada la mutación E250K (Touitou, Lesage et al. 2004). Junto a ella, se identificó la mutación D266N, ambas localizadas en el exón 11 (Tabla 5).
Wang et al (Wang, Hoing et al. 2013) generaron una cepa de ratón deficiente en la proteína PSTPIP1, y en este ratón deficiente en PSTPIP1 expresaron el mutante responsable del PAPA, PSTPIP1-A230T. La ausencia de PSTPIP1 no afectó a la respuesta inflamatoria, puesto que macrófagos de ratón carentes de la proteína respondían de la misma forma a la activación del inflamasoma NLRP3, NLRC4 y AIM2, lo que llevó a pensar que la proteína PSTPIP1 no era necesaria para la activación de caspasa-1 en el proceso inflamatorio que inician estas proteínas. Los ratones portadores de la mutación A230T experimentaron un retraso en el crecimiento, con niveles elevados de citoquinas
proinflamatorias en la circulación y un fenotipo que no mostraba los síntomas principales de la enfermedad, como la artritis piogénica o el pioderma gangrenoso (Wang, Hoing et al. 2013). Esto último puede deberse a las diferencias existentes entre especies.
Se ha descrito que la presencia de las mutaciones A230T y E250Q en la proteína PSTPIP1, disminuye su capacidad de interacción con la fosfatasa PTP-PEST (Wise, Gillum et al. 2002), produciéndose una hiperfosforilación de PSTPIP1 y un incremento en su interacción con la proteína Pyrin (Shoham, Centola et al. 2003). Esto lleva a pensar que PSTPIP1 y Pyrin puedan estar funcionalmente ligadas en procesos inflamatorios. Se ha observado que mutaciones en la proteína PSTPIP1 ejercen un efecto dominante negativo en Pyrin (Shoham, Centola et al. 2003), inhibiendo su actividad antiinflamatoria, lo que lleva a un incremento en la producción de IL-1β. Además, estas mutaciones en PSTPIP1 provocan una alteración en el balance de la unión de las proteínas Pyrin, ASC y PSTPIP1 (Fernandes-Alnemri, Wu et al. 2007, Yu, Fernandes-Alnemri et al. 2007), lo que conduce a la activación del inflamasoma, desembocando en el proceso de muerte celular y secreción de IL-1β (Waite, Schaner et al. 2009).
En el caso de la mutación no relacionada con el síndrome PAPA, W232A, localizada en el dominio coiled-coil, se observó que inhibe la interacción de PSTPIP1 con la fosfatasa de tirosinas PTP-HSCF (del inglés PTP- hematopoietic stem cell fraction) (Wu, Dowbenko et al. 1998), tanto in vitro como in vivo.
4.1.
El dominio F-BAR
El dominio F-BAR es el más frecuente dentro de la familia BAR de proteínas (Figura 4), la cual también incluye los dominios I-BAR y N-BAR. La cristalización del dominio F-BAR de varias proteínas ha mostrado que consta de un grupo de hélices agrupadas en un cilindro capaz de oligomerizarse, siendo su estructura básica un dímero (Gallop, Jao et al. 2006, Henne, Kent et al. 2007, Shimada, Niwa et al. 2007).
Los dominios F-BAR están implicados en procesos de tubulación y remodelación de la membrana, descrito por primera vez en las proteínas amphiphysin (Takei, Slepnev et al. 1999) y endophilin (Ringstad, Nemoto et al. 1997). Estudios relacionados con estos dominios sugieren que la formación de invaginaciones tubulares es el resultado del balance entre la deformación de la bicapa y las propiedades sensoras de ciertas proteínas asociadas a la membrana, que contrarrestan el proceso de tubulación (Itoh, Erdmann et al. 2005). Es el caso de la proteína Dinamina (Hinshaw 2000), responsable de la fisión de túbulos y formación de vesículas endocíticas. En este sentido, la formación de túbulos es un proceso atribuido a la disminución en la rigidez de la membrana, debido a una pérdida
progresiva del citoesqueleto de actina correspondiente a la membrana plasmática (Itoh, Erdmann et al. 2005).
Figura 4. Filogenia de la superfamilia de dominios BAR. PSTPIP1 se encuentra agrupada dentro de la familia F-BAR. Imagen modificada de Suetsugu, Toyooka et al. 2010.
Dentro de las proteínas con dominios F-BAR, se han identificado varias proteínas, además de PSTPIP1, con un dominio SH3 en el extremo carboxilo, como FBP17 (Kamioka, Fukuhara et al. 2004) y CIP4 (Zimmermann, Opitz et al. 2002). FBP17, a través del dominio SH3, es capaz de unirse a la proteína Dinamina y participar en el proceso de tubulación de la membrana (Kamioka, Fukuhara et al. 2004), el cual es un proceso dependiente de actina (Takano, Toyooka et al. 2008).
Las proteínas PSTPIP1 y FBP17, en presencia de liposomas, forman estructuras tubulares asociadas a la membrana, las cuales representan vesículas endocíticas que aún no han sufrido el proceso de escisión (Tsujita, Suetsugu et al. 2006, Henne, Kent et al.
2007). Se determinó que el dominio F-BAR por si sólo es suficiente para formar filamentos (Waite, Schaner et al. 2009). Por otro lado, se comprobó que dichos filamentos no colocalizan directamente con los filamentos intermedios o microtúbulos (Shoham, Centola et al. 2003), lo que lleva a pensar que la integridad de los filamentos de PSTPIP1 depende de un sistema intacto de microtúbulos.
El dominio F-BAR participa en la dimerización de estas proteínas. La interacción de estos dímeros con los fosfolípidos de la membrana plasmática se encuentra mediada por aminoácidos básicos (R y K) con cadenas laterales con carga positiva, situados en la superficie cóncava del dominio F-BAR, lo que induce la deformación de la membrana y la formación de invaginaciones tubulares (Henne, Kent et al. 2007, Shimada, Niwa et al. 2007, Suetsugu, Toyooka et al. 2010) (Figura 5 A y B). En el caso de PSTPIP1, se ha propuesto que puede formar un dímero (Waite, Schaner et al. 2009) o bien, un trímero (Yu, Fernandes-Alnemri et al. 2007). No obstante, la estructura del dominio F-BAR no ha sido resuelta.
Figura 5. Invaginaciones tubulares en la membrana originadas por las estructuras diméricas del dominio F-BAR. A. Unión de proteínas con dominios BAR o F-BAR a la membrana plasmática para inducir la curvatura de la membrana. B.Proteínas con un dominio F-BAR, entre las que se encuentran FBP17, CIP4 y PSTPIP1. Imagen modificada de Suetsugu, Toyooka et al. 2010.
En el modelo propuesto por Andrea L. Waite et al (Waite, Schaner et al. 2009), PSTPIP1 existe como dímero y presenta una estructura ligeramente curvadaque recibe el nombre de banana-shape (Figura 6 A). Este dímero es capaz de modelar suavemente la curvatura de membrana. Las mutaciones asociadas al síndrome PAPA, presentes en el dominio F-BAR, se encuentran localizadas en la superficie convexa, de manera que no interfieren en la interacción de PSTPIP1 con los fosfolípidos de membrana (Waite, Schaner et al. 2009) (Figura 6 B).
Figura 6. Modelo molecular del dímero de PSTPIP1 denominado banana-shape. A. La zonas de color azul indican la presencia de aminoácidos con carga positiva, mientras que el color rojo marca las regiones con aminoácidos cargados negativamente. Rotación de 90° sobre el eje x que deja ver la carga positiva de la superficie cóncava, que se unirá a los fosfolípidos de membrana.B. Dímeros de PSTPIP1, donde cada molécula se ha marcado en azul y verde. Localización de las mutaciones del PAPA en la superficie convexa. Imagen modificada de Andrea L. Waite et al 2009.
4.2.
Relación de PSTPIP1 con el citoesqueleto
PSTPIP1 se localiza en regiones de la célula ricas en actina, entre las que se incluye el citoesqueleto cortical y los lamelipodios. La sobreexpresión de PSTPIP1 en la línea celular de fibroblastos de ratón 3T3 produjo la extensión de filopodios (Wu, Spencer et al. 1998), lo que sugiere que PSTPIP1 es una proteína asociada al citoesqueleto (Spencer, Dowbenko et al. 1997). Se ha observado que PSTPIP1 regula la movilidad celular, en concreto es un componente importante del urópodo de leucocitos, donde colocaliza con la proteína Dinamina. Esta interacción está relacionada con la regulación de procesos como la endocitosis y el tráfico de membrana y en ella interviene el dominio SH3 de PSTPIP1 (Cooper, Bennin et al. 2008). Mutaciones en la proteína PSTPIP1 provocan alteraciones en el tráfico de leucocitos, lo que contribuye al fenotipo de la enfermedad en pacientes con síndrome PAPA, caracterizado por un infiltrado de neutrófilos al tejido en ausencia de infección.
Otra proteína de levaduras, Cdc15 (Spencer, Dowbenko et al. 1997), homóloga de PSTPIP1, se encuentra implicada en la formación del anillo de actina durante la citoquinesis.
La interacción de PSTPIP1, a través del dominio SH3, con la proteína WASP (Rohatgi, Ma et al. 1999, Yang and Reinherz 2006), promueve la implicación de estas proteínas en la regulación del citoesqueleto de actina (Symons, Derry et al. 1996, Wu, Spencer et al. 1998). Así, mientras que PSTPIP1 de forma individual se localiza
predominantemente en el citoesqueleto cortical, en presencia de WASP, ambas proteínas se distribuyen formando estructuras filamentosas dentro del citoplasma (Wu, Spencer et al. 1998). Macrófagos procedentes de pacientes con síndrome Wiscott-Aldrich, donde aparece mutada la proteína WASP, mostraron un defecto en la formación y migración de podosomas (Linder, Nelson et al. 1999, Calle, Chou et al. 2004), al igual que los macrófagos de pacientes con síndrome PAPA (Cortesio, Wernimont et al. 2010). Estas similitudes encontradas en pacientes con estas dos patologías diferentes, sugieren que PSTPIP1 esté implicada en la regulación de la formación de podosomas a través de la interacción con la proteína WASP. Experimentos posteriores realizados por Starnes et al(Starnes, Bennin et al. 2014), determinaron que PSTPIP1 es una proteína adaptadora que regula tanto la transición de podosomas a filopodios, como la migración invasiva de macrófagos. Observaron además, que la mutación R405C de PSTPIP1 origina filopodios capaces de degradar la matriz extracelular y de ocasionar daño en el tejido, proceso que ocurre en pacientes con síndrome PAPA.
Estudios sobre la localización intracelular de PSTPIP1 sugieren que Pyrin modula la distribución de PSTPIP1 en la célula (Waite, Schaner et al. 2009), donde las fibras organizadas formadas por PSTPIP1 en células transfectadas adquieren un aspecto reticular con forma de rama, similar al que presenta Pyrin. De este modo, cuando se estudiaron las mutaciones responsables del PAPA, A230T y E250Q, en presencia de Pyrin (Waite, Schaner et al. 2009), se apreció un patrón reticulado al igual que la forma silvestre, demostrando así que dichas mutaciones no afectan a la integridad de estos filamentos. Pese a esto, no se ha determinado un efecto claro de las mutaciones de PSTPIP1 en la formación de filamentos (Waite, Schaner et al. 2009).
4.3.
Fosforilación de PSTPIP1 por la quinasa de tirosina Abl
Mediante ensayos de dos híbridos se demostró que PSTPIP1, a través de su dominio SH3, interacciona con el extremo carboxilo de Abl. Además, se observó que PSTPIP1 se fosforila en la tirosina 345 por la quinasa Abl (Cong, Spencer et al. 2000).
Abl es una quinasa de tirosinas perteneciente a la familia de quinasas Abl, que incluye, además de la quinasa Abl (Abl1), la quinasa Arg (Abl2) (Bradley and Koleske 2009).Estas quinasas regulan diversos procesos biológicos, como la movilidad celular, el desarrollo del sistema nervioso e inmune, o la apoptosis. Aunque el proceso mejor caracterizado en el que aparece involucrada esta familia de quinasas es la regulación de los cambios que ocurren en el citoesqueleto (Ridley, Schwartz et al. 2003) que regulan alteraciones de la forma y movimiento de la célula. La proteína de fusión BCR-ABL
(Groffen, Stephenson et al. 1984, Raitano, Whang et al. 1997), originada por la fusión de la proteína Abl y del gen BCR, se ha relacionado con el desarrollo de la leucemia mieloide crónica, CML (del inglés chronic myelogenous leukemia) (Wong and Witte 2004). Abl es una quinasa ubicua (Lewis, Baskaran et al. 1996), que se localiza tanto en el citoplasma como en el núcleo. Se han encontrado dos isoformas de Abl en vertebrados, la isoforma Abl 1a (Abl I en ratón) y Abl 1b, ambas en humano (Abl IV en ratón) (Figura 7).
Figura 7. Estructura de la quinasa Abl correspondiente a las dos isoformas, en ratón (Abl I y IV) y en humano (Abl 1a y 1b). Dominio SH3 y SH2 en el extremo amino, seguido del dominio quinasa. Motivos ricos en Pro (PxxP) marcados en rojo, la región de unión a ADN, en gris y los dominios de unión a actina-F (F) y actina-G (G). Además, se muestran las regiones de localización nuclear (NLS) en amarillo y la región de exportación al núcleo (NES) en azul. Imagen modificada de Bradley and Koleske 2009.
La quinasa Abl consta de un dominio SH3, que reconoce secuencias ricas en Pro, y de un dominio SH2, por el cual se une a péptidos fosforilados en tirosinas (Advani and Pendergast 2002). A continuación presenta un dominio quinasa (Nagar, Hantschel et al. 2003) similar al de la familia de Src-quinasas, seguido de cuatro motivos ricos en Pro (PxxP). Por último, en la mitad carboxilo terminal, Abl presenta un dominio de unión a ADN y dos dominios de unión a actina, uno a la filamentosa (F) y otro a la globular (G). Además, a lo largo de su secuencia, Abl presenta tres secuencias de localización nuclear NLS (del inglés nuclear localization sequences)(Miao and Wang 1996, Wen and Van Etten 1997), y una secuencia de exportación nuclear, NES (del inglés nuclear export sequence) (Taagepera, McDonald et al. 1998) (Figura 7).
5.
Familia de fosfatasas de tirosina PEST
La familia de fosfatasas de tirosina de tipo PEST la componen tres proteínas; PTP-PEST (PTPN12), PTP-HSCF (PTPN18) y Lyp (PTPN22) (del inglés lymphoid tyrosine
phosphatase). Todas ellas comparten un dominio fosfatasa en el extremo amino, seguido de una región variable rica en prolina, ácido glutámico, serina y treonina, lo que da el nombre de PEST (Susan Spencer et al., 1997), y un motivo conservado en el extremo carboxilo denominado CTH (del inglés C-Terminal Homology) (Figura 8). Todas las
fosfatasas de la familia PEST se localizan en el citoplasma, aunque algunos trabajos sostienen que la fosfatasa PEP, homólogo de Lyp en ratón, se puede localizar también en el núcleo (Flores, Roy et al. 1994). La proteína Lyp es el miembro mejor caracterizado de esta familia de fosfatasas tipo PEST (Davidson, Shi et al. 2010) y según los datos publicados, las fosfatasas de tirosina, PTP-PEST y PTP-HSCF (Spencer, Dowbenko et al. 1997, Cote, Chung et al. 2002), interaccionan a través del dominio carboxilo CTH con PSTPIP1.
Figura 8. Estructura de las fosfatasas de tirosina de tipo PEST. Lyp (PTPN22), PTP-PEST (PTPN12) y PTP-HSCF (PTPN18). Estas enzimas presentan un dominio catalítico o dominio fosfatasa en el extremo amino de su secuencia, y el motivo CTH rico en Pro, conservado en el extremo carboxilo. Además, Lyp y PTP-PEST presentan otros motivos ricos en Pro que le permiten interaccionar con diversas proteínas (P1-P4).
5.1.
Lyp
El gen PTPN22, que codifica para la fosfatasa de tirosina linfoide Lyp, fue identificado en 1999 por Cohen et al(Cohen, Dadi et al. 1999). La fosfatasa Lyp actúa como regulador negativo de la señalización a través del receptor de linfocitos T (TCR) (Gjorloff-Wingren, Saxena et al. 1999). Se ha observado que en linfocitos, Lyp se localiza en el citosol de la célula rodeando al núcleo, de modo que muy poca cantidad de proteína se sitúa en la membrana plasmática (Bottini, Musumeci et al. 2004).Lyp presenta un dominio fosfatasa en el extremo amino, al igual que las otras dos fosfatasas de la familia PEST (Figura 8), y una región no catalítica, denominada PEST, en la que destaca la presencia de varios motivos ricos en prolina, P1, P2 y CTH.
Lyp presenta un polimorfismo, C1858T, asociado con varias enfermedades autoinmunes como la diabetes tipo I (Bottini, Musumeci et al. 2004), la artritis reumatoide (Begovich, Carlton et al. 2004), o el lupus eritematoso sistémico (LES) (Kyogoku, Langefeld et al. 2004). Este polimorfismo cambia la R620 por un W en el motivo rico en Pro, P1, lo que provoca una disminución de la unión de Lyp con Csk (Begovich, Carlton et al. 2004, Bottini, Musumeci et al. 2004, de la Puerta, Trinidad et al. 2013), una quinasa de
tirosina que actúa como regulador negativo de las Src quinasas. La variante W620 presenta mayor actividad fosfatasa que el alelo mayoritario Lyp-R620, y además inhibe la señalización por el TCR de forma más eficiente que la proteína silvestre (Yu, Sun et al. 2007). Por ello, esta variante de Lyp es considerada como una variante de ganancia de función (Vang, Congia et al. 2005).
6.
Pyrin
Pyrin es una proteínade 781 aminoácidos codificada por el gen MEFV. Seexpresa en neutrófilos, eosinófilos, monocitos, en células dendríticas y en las líneas celulares monocíticas U937 y THP-1 (Chae, Centola et al. 2000, Diaz, Hu et al. 2004, Chae, Aksentijevich et al. 2009), y a niveles inferiores en fibroblastos de tejido afectado por inflamación (Waite, Schaner et al. 2009). La expresión de Pyrin es estimulada por mediadores de la inflamación como LPS, IFN-γ (interferón gamma), TNFα (del inglés
tumor necrosis factor) y es inhibida por IL-4, IL-10 o TGFβ (del inglés Transforming growth factor beta).
Pyrin presenta una localización citoplasmática, capaz de colocalizar con microtúbulos cuando se transfecta transitoriamente en células HeLa y COS-7 (Mansfield, Chae et al. 2001), mientras que en granulocitos, células dendríticas y fibroblastos, presenta un patrón de distribución predominantemente nuclear (Diaz, Hu et al. 2004). Estas diferencias en cuanto a la distribución pueden ser debidas a la existencia de diferentes variantes de la proteína (Chen, Bykhovskaya et al. 2000, Diaz, Hu et al. 2004) o a la interacción con otras proteínas, lo cual podría afectar a su localización en la célula.
En esta proteína se reconocen cuatro dominios, PYRIN, B-box, coiled-coil y B30.2 (Figura 9) (Simon and van der Meer 2007, Hesker, Nguyen et al. 2012). En el extremo amino de la proteína se localiza el dominio PYRIN también llamado PYD. A través de este dominio, Pyrin es capaz de interaccionar con la proteína adaptadora ASC, que media la activación de caspasa-1 en el complejo multiproteico conocido como inflamasoma (Chae, Aksentijevich et al. 2009). También se ha descrito que a través del extremo amino, Pyrin puede interaccionar de manera indirecta con dos proteínas importantes en el proceso de inflamación, la proteína pro-caspasa-1 y el complejo quinasa IκB, involucrado en la inactivación del factor de transcripción NF-κB (Chae, Aksentijevich et al. 2009). El efecto de Pyrin en la activación de NF-κB no está claro, ya que en diferentes estudios de coexpresión de las proteínas Pyrin y ASC, se ha observado tanto un efecto activador como inhibidor, o ausencia de efecto alguno, sobre la activación de NF-κB (Masumoto, Taniguchi et al. 1999, Stehlik, Fiorentino et al. 2002, Yu, Wu et al. 2006, Hesker, Nguyen et al. 2012).
En cualquier caso, Pyrin puede incrementar la activación de NF-κB a través de p65 e IκB (Chae, Wood et al. 2008). Pyrin, a través del dominio bZip, interacciona con p65 lo que sugiere que la función reguladora de Pyrin sobre NF-κB, parezca específica de p65 (Stein, Baldwin et al. 1993).
Se ha descrito que Pyrin interacciona con elementos del citoesqueleto, como tubulina (Mansfield, Chae et al. 2001), a través de su extremo amino (Figura 9). Se ha comprobado además, que Pyrin colocaliza con actina en estructuras laminares (Waite, Schaner et al. 2009), aunque todavía no se ha identificado el dominio implicado.
Figura 9. Ilustración de los dominios presentes en Pyrin. Dominio Pyrin o PYD (1-92) implicado en la interacción con la proteína adaptadora ASC, dominio B-box (370-413) y dominio coiled-coil (413-442). A través de estos dos dominios, B-box y coiled-coil (BBCC), Pyrin interacciona con la proteína PSTPIP1. Un cuarto dominio B30.2 en el extremo carboxilo (580-775), a través del cual Pyrin interacciona con caspasa-1. Imagen realizada a partir de los datos de Chae, Aksentijevich et al. 2009.
A través de los dominios B-box y coiled-coil (BBCC) (Figura 9), Pyrin interacciona con PSTPIP1 (Shoham, Centola et al. 2003). Se ha demostrado que el dominio B-box por sí sólo, es necesario pero no suficiente para interaccionar con PSTPIP1. Además el segmento BBCC se encuentra implicado en la localización de Pyrin en el sitio activo de polimerización de actina. El dominio carboxilo B30.2, al igual que el dominio PYD, aparece involucrado en la regulación de caspasa-1 a través de la unión al dominio catalítico (Chae, Aksentijevich et al. 2009) (Figura 9), pero en este caso la interacción del dominio B30.2 con caspasa-1 inhibe la activación y como consecuencia, la liberación de IL-1β(Yu, Wu et al. 2006). Entre el dominio bZip y el B-box, Pyrin es cortada por caspasa-1 en el Asp-330 (Chae, Aksentijevich et al. 2009), originando un fragmento de 330 aminoácidos capaz de incrementar la activación de NF- B, independientemente de ASC. Los mutantes de Pyrin que presentan mutaciones localizadas en el dominio B30.2 son cortados de una forma más eficiente que la proteína entera, de ahí que el 70% de los mutantes en este dominio se encuentren en la forma fraccionada (Chae, Wood et al. 2006, Chae, Wood et al. 2008).
Cuando se llevó a cabo la clonación del gen MEFV, se pensó que Pyrin podía ser un factor nuclear debido a la presencia de dos secuencias de localización nuclear, un dominio bZip y un dominio con dedos de zinc, B-box (Diaz, Hu et al. 2004). Se observó que el fragmento amino de Pyrin (N330) presenta localización nuclear, y que niveles endógenos de la proteína en fibroblastos, células dendríticas y polimorfonucleares mostraban un patrón nuclear, que difiere de la distribución citoplasmática observada en monocitos. Por otro lado, el fragmento N330 cuando es fosforilado es capaz de unirse a miembros de la familia de proteínas 14-3-3 (Chae, Wood et al. 2008), lo que causaría su retención en el citosol.
6.1.
Inflamasoma de Pyrin
Basándose en el establecimiento de un sistema celular en la línea HEK-293, con expresión estable de las proteínas ASC y caspasa-1 (Yu, Wu et al. 2006), se demostró que Pyrin regula el proceso de inflamación a través de un tipo de inflamasoma diferente al anteriormente descrito para NLRP3. En este caso, la interacción de Pyrin con la proteína adaptadora ASC media el ensamblaje de un complejo trimérico denominado inflamasoma de Pyrin, constituido por la interacción de las proteínas Pyrin, ASC y pro-caspasa-1 (Bryan, Dorfleutner et al. 2010). En este complejo, el dominio PYD de Pyrin se uniría al dominio PYD de ASC y el dominio CARD de la pro-caspasa-1 se uniría al dominio CARD de ASC. (Figura 10) (Waite, Schaner et al. 2009). Esta hipótesis, llamada “hipótesis del inflamasoma de Pyrin” (Yu, Wu et al. 2006), apoya el efecto proinflamatorio de Pyrin, que participa en el procesamiento de IL-1β a través de la formación del citado complejo ternario. Investigaciones posteriores realizadas en la línea THP-1 (Fernandes-Alnemri, Wu et al. 2007) apoyan esta hipótesis tras observar que Pyrin se induce por infección retroviral, resultando en la activación de caspasa-1 y liberación de IL-1β.
De manera similar a lo que ocurre con el resto de inflamasomas, la interacción de Pyrin con la proteína ASC (Yu, Wu et al. 2006, Yu, Fernandes-Alnemri et al. 2007, Gavrilin, Abdelaziz et al. 2012) da lugar a la formación de specks de ASC, proceso que desencadena la piroptosis o muerte celular programada (Waite, Schaner et al. 2009).
Se ha identificado la Tyr-144, localizada en el dominio CARD, como posible sitio de fosforilación de ASC. Aunque no se ha identificado la quinasa que fosforila ASC en la Y144, se ha demostrado que las quinasas Syk y Jnk están implicadas en la vía que lleva a su fosforilación (Hara, Tsuchiya et al. 2013).
Figura 10. Esquema de la organización del inflamasoma de Pyrin, constituido por las proteínas Pyrin, ASC y pro-caspasa-1 Reclutamiento de pro-caspasa-1 a través de la asociación de la proteína adapatadora ASC y Pyrin, por unión de los dominios PYD de ambas.
Pyrin constituye el sensor de un inflamasoma que puede ser activado por
Francisella novicida o Burkholderia cenocepacia, ambos patógenos oportunistas que causan inflamación en el hospedador (Gavrilin, Abdelaziz et al. 2012), o también por estrés ribotóxico mediado por la MAP kinasa p38. Además, este inflamasoma también puede activarse por la acción de diversos patógenos que inactivan las proteínas Rho GTPasas mediante su modificación por glicosilación, ribosilación del ADP o desamidación (Yang, Xu et al. 2014). Sin embargo,Pyrin no interacciona directamente con las proteínas Rho modificadas y en la actualidad no se conoce elmecanismo de señalización por el cual las modificaciones de la GTPasa Rho induce la activación de Pyrin.Por otro lado, la unión de los mutantes A230T y E250Q de la proteína PSTPIP1 a Pyrin, induce la activación del inflamasoma de Pyrin (Fernandes-Alnemri, Wu et al. 2007).
Pyrin se ha considerado durante mucho tiempo una proteína reguladora de la inflamación. Dicha función se ha visto envuelta en una gran controversia, ya que no se ha podido establecer si su función es pro- o antiinflamatoria.
Generalmente se considera que la FMF es una enfermedad hereditaria autosómica recesiva, por lo que se ha considerado que las mutaciones que originan la FMF serían mutaciones de pérdida de función (Chae, Komarow et al. 2003), lo que ha llevado a pensar que Pyrin actuaría como regulador negativo de ciertas vías de la inflamación. Esa idea fue recogida en la llamada “hipótesis de secuestro” (Chae, Komarow et al. 2003), donde se propone que Pyrin, a través de la unión y reclutamiento de la proteína adaptadora ASC, bloquea la activación de IL-1β. En este sentido, Pyrin estaría compitiendo con caspasa-1
por la unión a ASC (Figura 11 A). Ratones con una forma truncada de la proteína Pyrin mostraron indicios de la implicación de Pyrin en la regulación del inflamasoma, pero no se observó un fenotipo relacionado con la enfermedad FMF (Chae, Komarow et al. 2003).
Figura 11. Pyrin desarrolla un papel regulador negativo sobre el procesamiento de IL-1β. A.
Efecto inhibitorio de Pyrin en la activación de caspasa-1. Unión de Pyrin a la proteína adaptadora ASC, de manera que la recluye fuera del inflamasoma. Interacción a través del dominio B30.2 de Pyrin con el dominio CARD de pro-caspasa-1. Esquema modificado de Chae, Komarow et al. 2003. B. Ensamblaje de las proteínas Pyrin, ASC y pro-caspasa-1 para la autoactivación de caspasa-1 y liberación de IL-1β. Adaptación del esquema propuesto por Chae, Wood et al. 2006.
Trabajos posteriores determinaron que Pyrin a través de su dominio carboxilo B30.2, se une a las subunidades p20 y p10 de caspasa-1 (Chae, Wood et al. 2006, Papin, Cuenin et al. 2007), inhibiendo su actividad catalítica de forma independiente de ASC
(Figura 11 B). En este sentido, mutaciones en el dominio B30.2 de Pyrin mostrarían una reducción en la interacción con caspasa-1 y en la inhibición de la secreción de IL-1β. Este modelo no tiene en cuenta observaciones previas, donde la proteína Pyrin humana se induce como un mediador temprano, ante un estímulo inflamatorio (Chae, Centola et al. 2000). Por otro lado, Pyrin en ratón carece del dominio carboxilo B30.2 (Chae, Centola et al. 2000), lo que sugiere que la inhibición de caspasa-1 por medio de este dominio no es una función conservada de Pyrin.
Se ha considerado la posibilidad de que las mutaciones en la proteína Pyrin, asociadas al síndrome FMF, sean mutaciones de ganancia de función (Yu, Wu et al. 2006, Chae, Cho et al. 2011), a través del incremento de la respuesta inmune frente a patógenos. Se desarrolló un modelo de ratón knockin (Chae, Cho et al. 2011) en el cual se insertó el dominio B30.2 de la proteína Pyrin humana en la de ratón con las tres mutaciones más frecuentes localizadas en el dominio B30.2 (M680I, M694V y V726A). Dicha inserción produjo un fenotipo que se asemeja al de pacientes con FMF, con activación de caspasa-1 y secreción de IL-1β, tras la estimulación con LPS sólo. Estos datos apoyarían la idea del efecto de ganancia de función de las mutaciones en el gen MEFV.
Más tarde, otro grupo estableció una línea knockout en ratón deficiente en el gen
MEFV (Hesker, Nguyen et al. 2012) donde observaron que macrófagos procedentes del peritoneo, en respuesta a estímulos inflamatorios, incrementaban la liberación de IL-1β en comparación con ratones silvestres. Pyrin, en condiciones normales, estaría bloqueando la asociación de las proteínas ASC y caspasa-1 en el inflamasoma, lo que lleva a pensar que Pyrin actuaría como regulador negativo, donde mutaciones responsables de la FMF se consideran mutaciones de pérdida de función. Por el contrario, no se observó que Pyrin estuviera implicada en la vía de activación de NF-kB, como observaron anteriormente Chae et al (Chae, Wood et al. 2008).
6.2.
Fiebre Mediterránea Familiar
Mutaciones en el gen MEFV, que codifica para la proteína Pyrin (French 1997), causan la enfermedad conocida como Fiebre Mediterránea Familiar (FMF). Este gen, situado en el cromosoma 16p13.3, consta de 10 exones que codifican para la proteína Pyrin. Se trata de una enfermedad hereditaria de carácter recesivo (MIM 249100), con prevalencia en poblaciones del Mediterráneo oriental, como judíos sefardíes, armenios, turcos y árabes, en las que aparece con una frecuencia de 1:200 (Chae, Aksentijevich et al. 2009).
La FMF fue el primer síndrome de fiebre periódica identificado por su base genética en 1997 (French 1997, Bernot, Heilig et al. 1998).Se caracteriza por la presencia de episodios inflamatorios breves, que afectan principalmente al peritoneo, la pleura o la piel, y que van acompañados de fiebre recurrente, con temperaturas que pueden alcanzar los 40-41°C. El desarrollo de la enfermedad comienza a edades tempranas, y se caracteriza por un importante infiltrado de polimorfonucleares al tejido afectado. La complicación más grave de la enfermedad es la amiloidosis, producida como consecuencia de una acumulación de la proteína amiloide A del suero, denominada con las siglas SAA (del inglés Serum amyloid A), la cual es un reactante de fase aguda sintetizado en hígado (Livneh, Langevitz et al. 1999). Esta acumulación es consecuencia de procesos inflamatorios repetidos no controlados (Arostegui and Yague 2007), que pueden ocasionar un fallo renal, y que en los casos más extremos puede llegar a producir la muerte.
En la actualidad se han identificado más de 300 mutaciones asociadas a la enfermedad FMF (Infevers database: http://fmf.igh.cnrs.fr/infevers), muchas de las cuales corresponden a sustituciones de un aminoácido (Chae, Aksentijevich et al. 2009). Tan sólo algunos de estos cambios presentan efectos clínicos, siendo la mayoría cambios extremadamente raros y con efectos mínimos. Se ha establecido recientemente la relación entre el desarrollo de la enfermedad y la presencia de determinadas mutaciones en el gen
MEFV como M694V, M694I, V726A (Naimushin, Lidar et al. 2011).
Un porcentaje alto de mutaciones asociadas al desarrollo de la FMF, reside en el dominio B30.2 de Pyrin, codificado por el exón 10 (Chae, Wood et al. 2006). Por el contrario, el dominio PYD rara vez aparece mutado en la FMF. Los estudios se han centrado por tanto en las mutaciones localizadas en el dominio B30.2, el cual no se encuentra conservado en especies inferiores, lo que sugiere que todas estas mutaciones son de aparición reciente (Chae, Wood et al. 2008, Chae, Cho et al. 2011, Naimushin, Lidar et al. 2011). Se han identificado 17 mutaciones en el gen MEFV asociadas a la FMF en varios grupos étnicos. Las mutaciones E148Q, M680I, M694V y V726A representan el 66% de las mutaciones de MEFV presentes en pacientes con FMF, estando tres de ellas (M680I, M694V y V726A) localizadas en el dominio B30.2 de la proteína Pyrin (Tabla 6). La elevada frecuencia de estas mutaciones en diversas poblaciones procedentes del Mediterráneo oriental, indica una selección heterocigota (Chae, Centola et al. 2000).
Se ha descrito la variación E248Q como una mutación de baja penetrancia y con síntomas leves de la enfermedad, aunque datos recientes muestran que dicha mutación posee una frecuencia similar en pacientes y en controles, lo que sugiere que sea un
polimorfismo benigno (Naimushin, Lidar et al. 2011).
Actualmente, existen datos que hacen referencia al incremento en la activación de caspasa-1 debido a la presencia de mutaciones en la proteína Pyrin asociadas a la enfermedad FMF (Chae, Wood et al. 2008).
6.3.
Interacción de Pyrin y PSTPIP1
La interacción de PSTPIP1 con Pyrin se detectó mediante un ensayo de dos híbridos en el que Pyrin se utilizó como cebo (Shoham, Centola et al. 2003). PSTPIP1 y Pyrin son proteínas que se expresan en células hematopoyéticas y que además se encuentran asociadas al citoesqueleto (Chae, Komarow et al. 2003). Ambas proteínas están implicadas en la producción de IL-1β a través de la activación de caspasa-1 (Yu, Fernandes-Alnemri et al. 2007). Las mutaciones de PSTPIP1, A230T y E250Q, aumentan la interacción entre ambas proteínas, lo que desencadena un incremento en la liberación de IL-1β. La interacción PSTPIP1/Pyrin y la implicación de estas proteínas en enfermedades de carácter autoinflamatorio ha llevado a proponer que PSTPIP1 y Pyrin participan en una vía de señalización común, cuya alteración desemboca en las enfermedades PAPA y FMF. La interacción entre dichas proteínas se ve incrementada por la fosforilación de PSTPIP1 por la quinasa Abl.
Alnemri et al (Yu, Fernandes-Alnemri et al. 2007) describieron que tanto PSTPIP1 como Pyrin existen como homotrímero, y que la unión de PSTPIP1 a Pyrin induce el ensamblaje del inflamasoma de Pyrin (Figura 12). Estos autores han propuesto un modelo en el que Pyrin, en reposo, presenta el dominio PYD replegado sobre el dominio B-box, haciendo así imposible el reclutamiento de ASC. Cuando PSTPIP1 se une al dominio B-box de Pyrin, la estructura de Pyrin se abre, quedando el dominio PYD accesible para su interacción con ASC, produciéndose la activación de la caspasa-1 y la liberación de IL-1β. Los mutantes de PSTPIP1, A230T y E250Q, presentan una mayor afinidad por Pyrin, por lo que serían más eficientes que la proteína nativa en la activación del inflamasoma de Pyrin (Yu, Fernandes-Alnemri et al. 2007).
Figura 12. Ensamblaje del complejo formado por las proteínas Pyrin, PSTPIP1 y ASC.
Activación del proceso de inflamación a través de la activación del inflamasoma de Pyrin, mediado por la unión del homotrímero de PSTPIP1. Imagen modificada de Fernandes-Alnemri, Wu et al. 2007.
Un modelo propuesto posteriormente sostiene que PSTPIP1 es necesaria, junto con la proteína Pyrin, para el reclutamiento de la proteína adaptadora ASC y para la formación del inflamasoma (Waite, Schaner et al. 2009). El balance de la interacción de estas tres proteínas se encuentra alterado por mutaciones asociadas a la proteína PSTPIP1, pero no por mutaciones en la proteína Pyrin (Waite, Schaner et al. 2009). Estos datos sugieren que las mutaciones asociadas al PAPA alteran la distribución celular de la proteína PSTPIP1, de manera que la señalización inflamatoria se encuentra afectada.
La transfección de los mutantes A230T y E250Q de PSTPIP1 junto con las proteínas Pyrin y ASC, reveló que PSTPIP1 se localiza en el speck de ASC junto con Pyrin en un 95% de los casos (Waite, Schaner et al. 2009). Estos datos corroboran tanto la capacidad de unión de los mutantes de PSTPIP1 a Pyrin, como el hecho de que PSTPIP1 sea reclutada al speck a través de su interacción con Pyrin.
El objetivo general de este trabajo consiste en la caracterización de la proteína PSTPIP1 implicada en el desarrollo del síndrome PAPA y en el análisis de su interacción con otras proteínas implicadas en enfermedades del sistema inmune, tales como Pyrin, responsable de la enfermedad FMF, o la fosfatasa Lyp, responsable de diversas enfermedades autoinmunes. Para ello, nos planteamos los siguientes objetivos:
1. Caracterizar la proteína PSTPIP1 a través del estudio de su regulación por fosforilación en tirosinas y de su patrón de localización.
2. Analizar la interacción de PSTPIP1 con la fosfatasa de tirosinas, Lyp. 3. Analizar la interacción de PSTPIP1 con Pyrin.
1.
Materiales
1.1.
Soluciones y tampones
LAEMMLI BUFFER 4X Tris-HCl (Merck) 240 mM, pH 6,8 SDS (Sigma) 8% Glicerol (Fluka) 40% β-Mercaptoetanol (Sigma) 5% Azul de bromofeno (0,008%) PERVANADATO Ortovanadato sódico(Sigma) 200 mM H2O2 30%
TAMPÓN DE ELECTROFORESIS
Tris (Merck) 25 mM Glicina (Scharlab) 0,2 M SDS (Sigma) 1%
TAMPÓN FOSFATO SALINO (PBS) pH 7,4
NaCl (Scharlab) 136 mM KCl (Merk) 2,7 mM Na2HPO4 (Scharlab) 8 mM KH2PO4 (Merk) 1,5 mM TAMPÓN DE QUINASA HEPES (Sigma) 60 mM, pH 7,5 MgCl2 (Merck) 3mM MnCl2 (Merk) 3 mM
Ortovanadato sódico (Sigma) 3 μM
TAMPÓN DE REACCIÓN
DTT 1,2 mM ATP 10 μM