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Actividad antimicrobiana y expresión génica diferencial en fagocitos humanos infectados con micobacterias y Legionella pneumophila

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Academic year: 2021

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(1)

Universidad de León

Departamento de Biología Molecular

“Actividad antimicrobiana y expresión génica diferencial

en fagocitos humanos infectados con micobacterias

y Legionella pneumophila”

David Reyes Ruvalcaba

León, 2010

(2)

Los trabajos de investigación realizados en esta Memoria de Tesis Doctoral son parte de los proyectos: PI05/1288 financiado por el Fondo de Investigación Sanitaria. Ministerio de Sanidad y Consumo. Y LE07-04 financiado por la Junta de Castilla y León

El autor de esta Memoria ha sido beneficiario de una beca de postgrado (UACDJ-139) correspondiente al Programa de Mejoramiento del Profesorado de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez - Secretaría de Educación Pública, México.

(3)

Con la ayuda de Dios, los sueños sí se cumplen… a cualquier edad. Sherry Buchanon

Primero agradezco a Dios N.S. por haberme concedido la gracia de llegar hasta este momento. A mis padres (María Elena Ruvalcaba Hernández y Máximo Reyes Lara) por haberme dado la vida y la oportunidad de haberme enviado a la escuela, que es la mejor herencia que me han otorgado. A mis hermanos, Saúl, Favio y Ulises, y al resto de familiares (presentes y ausentes). Por su apoyo incondicional, mil gracias.

Mi más profundo y sincero agradecimiento al Dr. Octavio Miguel Rivero Lezcano por su paciencia y constante ayuda, sin la cual no hubiese logrado culminar este trabajo. Y a los demás miembros del Grupo de Investigación en la Inmunología de la Tuberculosis, Cristina y Carolina, gracias por su apoyo y consejos que me fueron muy rentables para poder concluir este objetivo. También agradezco al Hospital de León las facilidades proporcionadas para mi estancia en la Unidad de Investigación. Así mismo hago extensivo mi agradecimiento al personal de extracciones del Hospital de León por su ayuda desinteresada en la toma de muestras sanguíneas.

Agradezco de todo corazón la ayuda, consejos y apoyo proporcionado por dos personas muy queridas por mí, Héctor Reyes Leal y Martha de la Torre Grajiola, quienes a lo largo de este camino han estado ahí, en las buenas y en las malas.

Finalmente, no así menos importantes, a los Directivos de la UACJ, por las facilidades otorgadas para poder culminar este trabajo. Y a mis amistades les agradezco de corazón su apoyo moral y amistad.

(4)

Dedico este Tesis a mí amada e incansable esposa, Myrna Gabriela, y a nuestros hijos, Anayanci Carolina, David Eduardo y Jesús Alejandro. Gracias por su cariño, apoyo, consuelo y sobre todo por su paciencia y por seguirme en esta aventura que nos ha costado muchos sacrificios, pero también muy buenos momentos. Los quiero mucho.

Ab imo pectore

Lo bueno de los años es que curan heridas, lo malo de los besos es que crean adicción.

(5)
(6)

Índice General

--- i

Índice de Figuras

--- vii

Índice de Tablas

--- viii

Índice de Abreviaturas

--- ix

Introducción y Objetivos

Epidemiología de la tuberculosis

--- 1

Clasificación de las micobacterias y L. pneumophila

--- 3

Complejo Mycobacterium tuberculosis --- 3

M. tuberculosis --- 4

Otros miembros del CMT --- 5

Micobacterias no-tuberculosas --- 5

L. pneumophila --- 7

Patogénesis y patología de la tuberculosis

--- 8

Desarrollo de la enfermedad --- 9

Predisposición genética --- 10

Respuesta inmune frente a la tuberculosis

--- 11

Respuesta inmune innata o específica --- 11

Macrófagos --- 12

Interacción M. tuberculosis-macrófago, señalización intracelular y fagocitosis --- 13

Células epiteliales --- 15

Neutrófilos --- 16

Células dendríticas --- 17

Células NK --- 17

Respuesta Inmune adaptativa o específica --- 17

Respuesta inmune celular (linfocitos T-Th/Tc) --- 18

Células CD4+ o Th --- 18

Células CD8+ o Tc --- 19

Células T γδ --- 19

Células CD1-restricted αβ --- 19

Respuesta inmune humoral (linfocitos B) --- 19

(7)

Evasión de la respuesta inmune --- 22

Citocinas

--- 23

Citocinas pro-inflamatorias --- 23

Interferón gamma (IFNγ) --- 23

Factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) --- 25

Interleucina-12 (IL-12) --- 25

Otras citocinas pro-inflamatorias --- 26

Citocinas anti-inflamatorias --- 26

Interleucina-10 (IL-10) --- 26

Factor de crecimiento tumoral beta (TGFβ) --- 26

Interleucina-4 (IL-4) --- 27

Quimiocinas --- 27

Otras moleculas implicadas en la actividad antimicrobiana

--- 29

Defensinas --- 29

Catepsinas (CTS) --- 30

Bomba de protones dependiente de ATP --- 30

NADPH oxidasa --- 31

Óxido nítrico (NO) --- 32

Slc11a1 --- 32 Receptores de citocinas --- 33 IFNGR1 e IFNGR2 --- 33 TNFRSF1A --- 33

Objetivos

--- 35

Material y Métodos

Bacterias

--- 36 Cepas bacterianas --- 36

Manipulación y cultivo de bacterias

--- 37

Condiciones de cultivo --- 37

Individualización de bacterias --- 37

Cuantificación de bacterias --- 38

Células humanas

--- 39

Manipulación y cultivo de las células --- 39

(8)

Células sanguíneas humanas --- 39

Reactivos para la purificación de monocitos y neutrófilos --- 40

Solución tampón DPBS con BSA --- 40

ACD --- 40

Solución dextrano --- 40

Solución de KCL --- 40

Purificación y cultivo de monocitos --- 40

Purificación y cultivo de neutrófilos --- 41

Infecciones

--- 43

Reactivos específicos --- 43

TPA --- 43

Vit-D3 --- 43

Citocinas --- 43

Infecciones de líneas celulares --- 43

Infecciones de monocitos y neutrófilos --- 43

Cuantificación de bacterias intracelulares y extracelulares --- 44

Comprobación de la fagocitosis de micobacterias (tinción Kinyoun-Giemsa) --- 45

Reactivos específicos de la tinción Kinyoun-Giemsa --- 45

Solución Etanol-HCl --- 45

Colorante Giemsa --- 45

Solución A --- 45

Etanol --- 45

Tinción Kinyoun-Giemsa --- 45

Infecciones para cuantificación de citocinas --- 46

Infecciones para obtención de ADNc --- 46

Análisis estadístico --- 46

Cuantificación de citocinas

--- 48 Método ELISA --- 48 Método CBA --- 48 Análisis estadístico --- 49

Expresión génica

--- 50

(9)

Reactivos específicos --- 50 Solución TE --- 50 Solución TAE --- 50 SYRB green-fluoresceína --- 50 Genes diana --- 50 Diseño de cebadores --- 50

Obtención de ARN total y síntesis de ADNc --- 53

Estimación de las eficiencias de las reacciones de PCR --- 53

Estudio de expresión diferencial mediante qPCR en tiempo real --- 55

Resultados

Infecciones en diferentes tipos celulares

--- 56

Infecciones en células promielocíticas humanas (HL60) --- 56

Infección de células HL60 con M. avium --- 56

Efecto del suero en el crecimiento intracelular de mico- bacterias con grado distinto de patogenicidad en células HL60 infectadas --- 56

Infecciones en monocitos primarios --- 58

Infección de monocitos con M. avium y M. gordonae --- 58

Infecciones en células epiteliales pulmonares (A549) --- 59

Capacidad de los fagotitos humanos (monocitos y neutrófilos)

para eliminar a micobacterias no patógenas

--- 61

Actividad anti-microbiana de fagotitos humanos --- 61

Infección de monocitos y neutrófilos con bacterias de diferentes grado de patogenicidad --- 61

Cuantificación de micobacterias extracelulares y determinación de la fagocitosis --- 64

Patrón de secreción de citocinas en los fagotitos infectados --- 64

Cuantificación de citocinas pro y anti-inflamatorias --- 64

Neutralización de citocinas en monocitos infectados con M. tuberculosis y M. gordonae atenuada --- 66

Activación de los fagotitos con citocinas y su efecto en la actividad anti-microbiana --- 68

(10)

Efecto del IFNγ y del TNFα en la actividad anti-

microbiana --- 68

Expresión génica de monocitos infectados con diferentes

bacterias

--- 70

Expresión génica mediante qPCR en tiempo real --- 73

Expresión génica de CCL20 en monocitos infectados con diferentes micobacterias --- 75

Discusión

Infecciones

--- 77

Infecciones en las líneas celulares HL60 y A549 --- 77

Infecciones en monocitos --- 78

Efecto del suero en el crecimiento intracelular de M. avium en monocitos --- 78

Obtención del modelo de infección --- 78

Actividad antimicrobiana de fagotitos humanos --- 79

Activación de los fagotitos con citocinas y su efecto en la actividad anti-microbiana --- 81

Patrón de secreción de citocinas en fagotitos infectados --- 82

Expresión génica mediante qPCR en tiempo real

--- 84

Expresión génica --- 84 Defensinas (DEFB 1, 2, 3, 4) --- 84 CTS D y G --- 85 NRAMP1 --- 85 Receptores de citocinas --- 86 IFNGR1 e IFNGR2 --- 86 TNFRSF1A --- 87

Subunidades de la bomba de protones dependiente de ATP (ATP6V1G1 y ATP6V0C) --- 87

Subunidades de la NADPH oxidasa (p47 phox y gp91 phox) --- 88

iNOS --- 88

Quimiocina CC ligando 20 --- 89

Conclusiones

Conclusiones

--- 91

(11)

Bibliografía

Bibliografía

--- 92

Anexos

Anexo 1

:

Publicación: Human phagocytes lack the ability to kill Mycobacterium gordonae, a non-pathogenic mycobacteria --- 113

(12)

Índice de Figuras

Figura 1: Incidencia de la tuberculosis a nivel mundial en el año 2007 --- 2 Figura 2: Incidencia de la tuberculosis respiratoria por Provincias en

Castilla y León. Tasa por cada 100.000 habitantes --- 2 Figura 3: Esquema de la pared celular de M. tuberculosis --- 5 Figura 4: Vías de entrada y transmisión de M. tuberculosis --- 9 Figura 5: Representación esquemática de la formación de las células

sanguíneas --- 13 Figura 6: Esquema de la formación del granuloma tuberculoso --- 21 Figura 7: Purificación de monocitos: separación de la capa de células

mononucleares (monocitos y linfocitos) del resto de los

componentes sanguíneos --- 41 Figura 8: Actividad anti-microbiana de los fagotitos (A, monocitos;

B; neutrófilos) --- 63 Figura 9: Activación de fagocitos con citocinas. La multiplicación intracelular

de las bacterias en monocitos (A) o neutrófilos (B) --- 69 Figura 10: Geles de agarosa de los genes diana p47 phox, gp91 phox, iNOS,

NRAMP1, CTSG y D, ATP6V1G1, ATP6V0C, TNFRSF1A,

INFGR1, IFNGR2 y CCL20 --- 71 Figura 11: Geles de agarosa de los genes de las DEFB1, 2, 3 y 4 --- 72

(13)

Índice de Tablas

Tabla 1: Clasificación científica de M. tuberculosis y L. pneumophila --- 7

Tabla 2: Bacterias utilizadas --- 36

Tabla 3: Descripción de los genes utilizados --- 51

Tabla 4: Cebadores utilizados --- 52

Tabla 5: Comparación de la supervivencia de micobacterias de diferente grado de patogenicidad, a diferentes concentraciones de suero --- 57

Tabla 6: Efecto del suero en el crecimiento de las micobacterias --- 58

Tabla 7: Efecto del suero en el crecimiento de micobacterias en monocitos infectados --- 59

Tabla 8: Supervivencia de micobacterias en línea celular A549 --- 60

Tabla 9: Prueba t de student para la igualdad de medias en neutrófilos infectados - 64

Tabla 10: Cantidad de citocinas liberadas de fagocitos infectados --- 66

Tabla 11: Actividad anti-microbiana de monocitos frente a M. tuberculosis y M. gordonae atenuada en presencia de anticuerpos de neutralización anti-citocinas --- 67

Tabla 12: Expresión génica de diversos genes en ADNc de monocitos --- 74

Tabla 13: Expresión génica de CCL20 en monocitos infectados con dos cepas diferentes de M. tuberculosis --- 76

Tabla 14: Expresión de CCL20 en monocitos infectados con micobacterias de diferente grado de patogenicidad --- 76

(14)

Índice de abreviaturas

% Porcentaje

> Mas de

º C Grado centígrado

7H2O Hepta hidratado

A549 Línea celular epitelial pulmonar (adenocarcinoma humano) ADC Citrato Ácido Dextroxa, siglas en inglés

ADN Ácido Desoxi-Ribonucleico

ADNc Ácido Desoxi-Ribonucleico complementario AELC Asociación Europea de Libre Comercio Anti-CD Anti-cluster of differentiation

anti-IL-β1 Anti-Interleucina Beta 1

APC Células Presentadoras de Antígenos, siglas en inglés ATP6V0C Subunidad V0C de la bomba de protones vacuolar ATP6V1G1 Subunidad V1G1 de la bomba de protones vacuolar CBA “Cytometric Bead Array”, siglas en inglés

cc Centímetro cúbico

CCL20 Quimiocina CC ligando 20

CCR6 Receptor de quimiocina 6 CD cluster of differentiation

CMA Complejo Mycobacterium avium

CMT Complejo Mycobacterium tuberculosis

Ct Ciclo umbral

CTS Catepsina

DE Desviación estándar

DEFB- Defensina β-

dH2O Agua destilada

dNTP´s Di-Nucleotidos Tri-Fosfato

EDTA Etilen-Diamino Ácido Tetra-acético, siglas en inglés EF1α Factor de elongación1 alfa

ELISA “Enzime-linked immunosorbent assays”

g velocidad angular + radio

(15)

GM-CSF Granulocito-Macrófago Factor Estimulante de colonias gp91 phox subunidad gp91 de la NADPH oxidasa

gr Gramo

HCl Ácido clorhídrico

IFN-γ Interferón gamma

IgG1 Inmunoglobulina G 1

IL- Interleucina-

INFGR1 Receptor de la cadena alfa del Interferón gamma INFGR2 Receptor de la cadena beta del Interferón gamma iNOS2 Oxido nítrico sintetasa 2A

Kb Kilo base

KCl Cloruro de potasio

KDa Kilo dalton

KH2PO4

MIP3α Proteína Inflamatoria del Macrófago 3 alfa

ml Mililitro

mM Mili molar

mm Milímetro

MOI “Multiplicity of infection”

M-SFM Medio de macrófagos libre de suero

N Normal

Na2PO4 Fosfato de sodio

NaCl Cloruro de Sodio

NK Células Asesinas Naturales, siglas en inglés

nM Nano Molar

nm Nanómetro

NRAMP1 Resistencia natural-asociada a la proteína 1 del macrófago p47 phox subunidad p47 de la NADPH oxidasa

PAM´s Patrones moleculares asociados a patógenos

pb Pares de bases

PBS Tampón de fosfato salino

PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa

pg Picogramo

(16)

PMA forbol 12-miristato 13-acetato

PRR´s Receptores de reconocimiento de patógenos qPCRrt PCR cuantitativa en tiempo real

RD Regiones de diferencia

SFB Suero fetal bovino

SFM Medio libre de suero

Slc11a1 Gen acarreador de solutos de la familia 11 miembro 1 SPSS Paquete estadístico de las ciencias sociales, siglas en ingles

TAE Tris-ácido acético-EDTA

Tc Célula T citotóxica

TE Tris-EDTA

TGF-β1 factor de crecimiento tumoral β1

Th Célula T helper

TNFRSF1A Receptor del factor de necrosis tumoral de la súper familia 1A TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa

TPA forbol 12-miristato 13-acetato UFC Unidad formadora de colonias

V Versión

Vit-D3 1,25 dihidroxicolecalciferol

W Watts

w/v Peso / volumen, siglas en inglés

µg Microgramo

(17)
(18)

EPIDEMIOLOGÍA DE LA TUBERCULOSIS

Uno de los principales problemas de salud publica a nivel mundial es la tuberculosis, que durante siglos ha azotado a la humanidad, y actualmente es considerada como una enfermedad emergente [van Soolingen et al., 1997]. El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el surgimiento de cepas multirresistentes están contribuyendo al aumento de la mortalidad por tuberculosis, que es considerada como una enfermedad curable [Olleros et al., 2005].

La Organización Mundial de la Salud, en el año 2009, informa que el número estimado de nuevos casos de tuberculosis para el año 2007, fue de 9,27 millones (139 por 100.000 habitantes) entre ellos 4,1 millones de nuevos casos bacilíferos, es decir el 44,0 % del total (61 por cada 100.000 habitantes) y aproximadamente 1,37 millones (14,8 %) son VIH-positivos.

Para ese año se estimó que 13,7 millones fueron casos prevalentes de tuberculosis (206 por 100.000 habitantes) de los cuales 687.000 (5 %) eran VIH-positivos. La cifra estimada de defunciones, en ese mismo año, fue de 1,32 millones VIH-negativos y adicionalmente 456.000 casos fueron VIH-positivos [WHO, 2009].

En España la tuberculosis en al año 2007 presentó una incidencia de todas las formas de 13.103 casos (tasa de 30 por cada 100.000 habitantes) [WHO, 2009]. Y una tasa de 15,1 por cada 100.000 habitantes de tuberculosis respiratoria [Enfermedades de Transmisión Respiratoria, JCyL, 2009]. La prevalencia fue de 10.320 casos (tasa de 23 por cada 100.000 habitantes). Siendo la mortalidad fue de 1.375 casos (tasa de 3 por cada 100.000 habitantes) [WHO, 2009]. En la Fig.1 se representa esquemáticamente la incidencia de la tuberculosis a nivel mundial para el año 2007, donde se observa que España se encuentra en el rango de 25 a 49 por cada 100.000 habitantes.

(19)

Fig. 1: Incidencia de tuberculosis a nivel mundial en el año 2007, [WHO 2009].

De acuerdo con el Boletín Epidemiológico de Castilla y León (Enfermedades de Transmisión Respiratoria, año 2007) en la comunidad de Castilla y León, se registraron 458 casos de todas las formas clínicas de tuberculosis (tasa de 18,11 casos por 100.000 habitantes). Siendo la incidencia más elevada en el grupo de edad de 20 a 45 años, otro grupo de edad que presenta una alta incidencia fue el de 75 a 80 años De todas las provincias de esta Comunidad, la provincia de León presentó la más alta incidencia con 20,91 por cada 100.000 habitantes (Fig. 2), y la de Zamora la más baja (3,04 casos por 100.000 habitantes) [Enfermedades de Transmisión Respiratoria, JCyL, 2009].

Fig. 2: Incidencia de tuberculosis respiratoria por Provincias en Castilla y León. Tasa por cada 100.000 habitantes. [JCyL,2009].

(20)

CLASIFICACIÓN DE LAS MICOBACTERIAS Y L.

PNEUMOPHILA

Las micobacterias están ampliamente distribuidas en la naturaleza y se incluyen tanto bacterias saprofitas como patógenas, tienen una amplia gama de huéspedes que va desde plantas a humanos [Pieters, 2001]. Las cepas patógenas, que incluyen a M. leprae y los miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT), como M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, y M. canettii, que son los micro-organismos cuya recuperación del cuerpo humano esta casi siempre asociada con la enfermedad. Dentro del grupo de las micobacterias también encontramos a las llamadas no tuberculosas que comprende a todas las otras especies de micobacterias que pueden causar trastornos pulmonares que se asemejan a la tuberculosis [Piersomoni y Scarpano, 2008]. Las micobacterias que causan la enfermedad tuberculosa se pueden englobar en dos grandes grupos: CMT y micobacterias no tuberculosas (MNT).

Complejo Mycobacterium tuberculosis

El CMT comprende varias especies de micobacterias muy parecidas entre si, estrictamente responsables de la tuberculosis humana y zoonótica. Son bacterias de crecimiento lento, ácido resistentes, y genéticamente comparten secuencias idénticas de la fracción 16S del ARN ribosomal y más del 99.0 % de su secuencia nucleotídica es idéntica. Sin embargo, difieren significativamente en su morfología, bioquímica, y en el rango de huéspedes que afectan [Boddinghaus et al., 1990; Sreevatsan et al., 1997].

El alto grado en la conservación de secuencias del ADN entre las micobacterias pertenecientes al CMT, ha limitado el desarrollo de herramientas diagnósticas a nivel molecular para identificar los miembros individuales. No obstante, estudios filogenéticos recientemente han puesto en evidencia regiones del genoma que exhiben múltiples polimorfismos, que han sido colectivamente designados como regiones de diferencia (RD) [Liebana et al., 1996; Gordon et al., 1999; Brosch et al., 2002; Mostowy et al., 2002;van Embden et al., 2000]. La comparación del ADN total de la cepa de referencia de M. tuberculosis H37RV con el genoma de otras micobacterias del

(21)

complejo, han revelado la existencia de 16 RD, de un tamaño entre 2 y 12,7 Kb presentes en el genoma de M. tuberculosis pero ausentes en otros miembros del CMT [Gordon et al., 1999; Brosch et al., 2002; Mostowy et al., 2002; Mostowy et al., 2004]. Debido a que los loci RD parecen haberse acumulado secuencialmente y están diferencialmente distribuidos entre varios grupos de micobacterias del CMT, estos han sido propuestos como marcadores genéticos para diferenciar entre subespecies de este complejo [Brosch et al., 2002; Huard et al., 2003; Mostowy et al., 2004].

M. tuberculosis

La bacteria M. tuberculosis fue descubierta por Heinrich Hermann Robert Koch (1843-1910) a finales del siglo XIX (1882) [Koch, 1982]. Es un patógeno intracelular, que puede ocasionar patología grave, es de lento crecimiento y aerobio estricto [Pieters, 2001]. Pertenece a la familia Mycobacteriaceae, la clasificación científica se muestra en la tabla 3, y es considerado como el agente principal causante de la tuberculosis humana en el mundo [van Soolingen et al., 1997]. Tras varias décadas de disminución de la incidencia de la tuberculosis, a mediados de los ochenta se produjo un drástico incremento. Las principales causas para el desarrollo de esta enfermedad son debidas a las malas condiciones económicas y sociales de la población, así como la extensión de la epidemia del VIH [Hartmann y Plumm, 1999; Raja, 2004].

Las causas de la virulencia de M. tuberculosis aun no se conocen del todo, ya que no tienen factores de virulencia clásicos como la producción de toxinas. Se han realizado estudios de mutación de genes para determinar los factores que la hacen virulenta tanto en modelos humanos como de animales. Y se ha observado que genes que codifican para enzimas que intervienen en la síntesis de la pared celular se relacionan con la patogenicidad de la bacteria. La pared celular (Fig. 3) es una estructura compleja formada por proteínas, lípidos y carbohidratos, que son diferentes a las demás bacterias, Un ejemplo es el lipoarabinomanano (LAM), el mayor componente de la pared celular, que es un complejo glicolípido que contiene repeticiones del disacárido arabinosa-manosa y que es un importante inmunomodulador [Smith, 2003]. Se ha observado que esta molécula es un potente inhibidor de la actividad del IFNγ en macrófagos de ratón [Chan et al., 1991].

(22)

Fig. 3: Esquema de la pared celular de M. tuberculosis (1); Lípidos externos (2); Ácidos micólicos (3); Arabinogalactano (4); Péptido glicano (5); LAM (6); Fosfatidilinositol monóxido (7); Membrana plasmática (8).

Otros miembros del CMT

Aunque M. tuberculosis se conoce como el principal agente causal de la tuberculosis humana, se ha reconocido la importancia epidemiológica de la transmisión zoonótica de M. bovis al humano, ocasionada por estar en contacto o consumo de productos de animales infectados [Zumárraga et al., 1999; Michael, 2002; Ayele et al., 2004; Fritsche et al., 2004]. También se ha documentado la coinfección con M. bovis variedad BCG, en niños y M. bovis en pacientes infectados con el VIH [Samper et al., 1997: Hesseling et al., 2004].

M. africamun es una micobacteria que se subdivide en dos tipos, el tipo I, que se considera como epidémico en el Este de África y el tipo II, en el oeste de África [Frothingham et al., 1993]. M. canetti, considerada como la más ancestral de las micobacterias causante de tuberculosis [Mostowy y Behr, 2005], encontrada anecdóticamente en un niño somalí en 1993 [van Soolingen et al., 1997]. M. microti, micobacteria que afecta a pequeños roedores del campo [Wells, 1953], también ha sido aislada en humanos [van Soolingen et al., 1998]. M. caprae, es una rara enfermedad en el ganado [Aranaz et al., 1999; Aranaz et al., 2003], además de ser una tuberculosis zoonótica en humanos [Blaas et al., 2003].

Micobacterias no-tuberculosas

Las micobacterias no tuberculosas [American Thoracic Society, 1990], han sido también descritas como micobacterias atípicas [Pinner, 1935], anónimas [Runyon, 1959], no clasificadas [Corpe et al., 1963] o ambientales [Caminero-Luna, 2001]. Estas

(23)

bacterias incluyen a todas las especies que no forman parte del CMT. Pueden producir infecciones con muchos de los síntomas de la tuberculosis. A pesar de que estas micobacterias son comunes, por lo general causan infección solo en las personas con un sistema inmunitario debilitado (inmunocomprometido, principalmente pacientes con SIDA). La mayoría de estas bacterias viven libres como saprofitas y están ampliamente distribuidas por todo el mundo y en una gran variedad de reservorios ambientales, especialmente en el agua (dulce o salada) y en la tierra. Aunque también se han aislados del polvo, aerosoles y biofilms de sistemas de distribución de agua para consumo [Collins et al., 1984; Rodgers et al., 1999; Caminero-Luna, 2001; Falkinham, 2002].

Estas micobacterias son patógenos oportunistas capaces de ocasionar linfadenitis e infecciones en: pulmones, piel, tejidos blandos, articulaciones y huesos [Benson, 1994; Benson y Ellner, 1993; Wallace et al., 1990; Wolinsky, 1979]. Las infecciones de piel, tejidos blandos, articulaciones y huesos, ocasionadas por las MNT, están asociadas a heridas traumáticas o quirúrgicas [Wallace et al., 1990; Fitzgerald et al., 1995; Sanders et al., 1995].

Las micobacterias no tuberculosas conforman un grupo muy amplio, pero para nuestro estudio solo vamos a considerar tres: Complejo M. avium (CMA), M. kansasii y M. gordonae. El CMA incluye tres especies reconocidas (M. avium, M. intracellulare y M. chimaera) y otros organismos no clasificados (denominados como especies de Mycobacterium avium-intracellulare grupo X). Son de lento crecimiento, bacilos ácido resistentes y no pigmentados [Piersimoni, 2008]. Se ha observado que la incidencia de la enfermedad que producen ha aumentado en los últimos años [McGarvey y Bermudez, 2002]. M. kansasii es, después del CMA, la especie de MNT mas frecuente, responsable de la enfermedad pulmonar en individuos inmunocomprometidos. Es una micobacteria de lento crecimiento. En España, en pacientes con SIDA es la especie más frecuentemente aislada [Caminero-Luna, 2001]. M. gordonae es una micobacteria saprofita, que es frecuentemente aislada e identificada en los laboratorios, y casi siempre considerada como no patogénica, pero ocasionalmente produce patología pulmonar. Es de lento crecimiento y ácido resistente. Se encuentra ampliamente distribuida en el medio ambiente agua, tierra, y leche no esterilizada [Douglas et al., 1986; Weinberger y Berg, 1992].

(24)

L. pneumophila

L. pneumophila es la bacteria causante de la legionelosis o enfermedad de los legionarios, una forma grave de neumonía que en ocasiones produce una infección sistémica, y que se ve particularmente en individuos inmunocomprometidos que tienen un mecanismo de respuesta inmune deficiente [Nakachi, et al., 2000]. Esta bacteria es un bacilo facultativo intracelular, Gram negativo [Müller et al., 1996]. Se clasifica en la Clase de las Proteobacterias gamma y la Familia Legionellacae (clasificación científica se muestra en la tabla 1). Es considerada como un microorganismo exigente en cuanto a sus condiciones de cultivo ya que requiere de un pH óptimo, estrechos rangos de temperatura y no crecen en condiciones anaeróbicas [Brenner et al., 1979].

Tabla 1: Clasificación científica de M. tuberculosis y L. pneumophila

Reino Bacteria Bacteria

Filum Actinobacteria Proteobacteria

Clase Actinobacteria Proteobacteria gamma

Orden Actinomycetales Legionellale

Familia Mycobacteriaceae Legionellaceae

Género Mycobacterium Legionella

Especie M. tuberculosis L. pneumophila

Nombre binomial Mycobacterium tuberculosis Legionella pneumophila

Esta bacteria invade a los pulmones y tiene la capacidad de reproducirse en las células que la fagocitan, como los monocitos y macrófagos alveolares [Horwitz y Silverstein, 1980], leucocitos polimorfonucleares [Horwitz, 1984], También se ha observado que se reproduce en la línea celular promielocítica HL60 [Marra et al., 1990] y la línea celular U937 [Pearlman et al., 1988].

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PATOGÉNESIS Y PATOLOGÍA DE LA TUBERCULOSIS

M. tuberculosis es una bacteria que tiene predilección por el tejido pulmonar rico en oxígeno. La principal ruta de entrada al organismo es la vía respiratoria (Fig. 4). La micobacteria se difunde desde el sitio inicial de la infección en el pulmón por el tejido linfático y la sangre a otras partes del cuerpo, siendo el ápice pulmonar y los nódulos linfáticos regionales sus sitios preferentes. Los sitios de difusión extrapulmonar son la pleura, el tejido linfático, hueso, el sistema genito-urinario, las meninges, peritoneo y la piel; esto sucede en aproximadamente el 15% de los enfermos con tuberculosis [Raja, 2004].

La transmisión de la infección tuberculosa es casi siempre por la vía aérea, siendo éste un proceso de entrada natural, por el mecanismo de la respiración del sujeto receptor. Otras vías de entrada, poco comunes, son la digestiva, dérmica o mucosa, que requieren de situaciones especiales o anómalas en el huésped, como lo son la pérdida de continuidad en las superficies expuestas (heridas o lesiones).

Para su transmisión es conveniente tomar en consideración dos condiciones que nos permitan valorar el riesgo transmisor:

La fuente: Que es el reservorio emisor del agente infeccioso (persona enferma). En algunas ocasiones, poco comunes, la fuente puede ser un animal enfermo. La emisión de bacterias depende del carácter bacilífero de la fuente. Los principales bacilíferos son los enfermos activos de tuberculosis laríngea o pulmonar, los enfermos portadores de tuberculosis con cepas más virulentas y los enfermos con SIDA.

El vehículo transmisor: Son los aerosoles emitidos por las personas enfermas, las gotas que se desprenden de un estornudo o un acceso de tos, generalmente, son gotas que se evaporan rápidamente y los residuos de esta evaporación son pequeñas gotas que contienen a la micobacteria llamados núcleos goticulares de Wells que, por su pequeño tamaño (1-10 µm), son capaces de mantenerse

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suspendidos en el aire [Rodríguez-Bayarri y Madrid-San Martín, 2004; Bates y Nardell, 1995].

Fig. 4: Vías de entrada y transmisión de M. tuberculosis.

Desarrollo de la enfermedad

Los núcleos goticulares de Wells son inhalados y hospedados en las vías respiratorias dístales (alvéolos). Las micobacterias son fagocitadas por los macrófagos alveolares, iniciando una cascada de eventos que puede resultar en una eliminación de la infección o progresión de la infección a enfermedad activa. Aunque el riesgo de desarrollar la enfermedad activa, varia de acuerdo al tiempo de la infección, edad, la resistencia del huésped así como la virulencia del Mycobacterium [Pieters, 2001].

La tuberculosis con frecuencia se presenta de forma asintomática o como una infección latente. La mayoría de los pacientes contiene la enfermedad de 2 a 10 semanas con el subsiguiente desarrollo de una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardada. En aproximadamente el 5% de las personas infectadas el control de la replicación del microorganismo es inadecuada, y desarrollan la enfermedad después de un periodo de latencia de 1 a 2 años posteriores a la infección (tuberculosis primaria). En otro 5% la contención del organismo falla dando como resultado el desarrollo de la enfermedad en algún momento de su vida (tuberculosis postprimaria) [Hartmann y Plumm, 1999; Flynn y Chan, 2001; van Crevel et al., 2002; Flynn et al., 2003]. La tuberculosis pulmonar se puede manifestar clínicamente como tuberculosis primaria o post-primaria.

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Síntomas generales: Son los más frecuentes y a veces pasan desapercibidos. Astenia, anorexia, ligera elevación febril, alteración en la curva de peso, modificaciones del carácter. La fiebre puede ser el síntoma principal.

Síndrome de hipersensibilidad a las proteínas del bacilo, como el eritema nodoso y la querato-conjuntivitis flictenular. Sugiere una etiología tuberculosa, pero puede ser debido a otras causas.

Síntomas respiratorios: Tos, dolor torácico, expectoración, hemoptisis. Los cuales son poco frecuentes [Milburn, 2001].

La tuberculosis postprimaria es poco frecuente en la infancia; ocurre principalmente en la adolescencia después de haber estado infectado durante varios años. Puede producirse como consecuencia de una reactivación endógena, por las micobacterias que han estado en estado latente desde que ocurrió la infección primaria, o bien proceder del exterior y producir una reactivación exógena. Los síntomas son los propios de la tuberculosis del adulto: Fiebre, tos, astenia, anorexia, dolor torácico, esputo hemoptoico [Wallis y Jonson, 2001].

Predisposición genética

En 1926 en la ciudad de Lubeck, Alemania, hubo un trágico accidente durante un programa de vacunación con el bacilo de Calmette-Guérin, donde 249 niños fueron vacunados una bacteria viva de M. tuberculosis virulenta, y aunque 76 murieron, 173 sobrevivieron. Esta desafortunada experiencia mostró que hay una amplia variación de grados de la inmunidad innata contra M. tuberculosis [Bellamy, 2005]. Estudios posteriores han demostrado que la presencia de polimorfismos o de defectos genéticos en ciertos genes favorecen la infección contra M. tuberculosis. Un ejemplo es el gen NRAMP1 (resistencia natural-asociada a la proteína 1 del macrófago) [Liu et al., 1995], actualmente conocido como Scl11a1 (miembro 1 de la familia 11 de transportador de solutos) [Wyllie et al., 2002].

Otros ejemplos son el caso de mutaciones en los genes que codifican el receptor 1 del interferón γ, implicados en la diseminación infecciosa de BCG posterior a una vacunación [Cassanova et al., 1996], y el receptor 2 del interferón γ, que han dado lugar a infecciones por micobacterias no tuberculosas [Bellamy, 2005]. Lo mismo sucede en personas con deficiencias genéticas en los sistemas de producción de las interleucinas 12 y 23 [Ottenhoff et al., 2005].

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RESPUESTA INMUNE FRENTE A LA TUBERCULOSIS

El sistema inmunológico innato es activado después de la invasión de los microorganismos patógenos, y coordina la defensa de huésped durante las primeras horas y días posteriores a la infección. Aunque, el sistema inmunológico innato es muy eficaz con la mayoría de los patógenos, la especificidad es conferida sólo por la activación secundaria de inmunidad adquirida regulada por los linfocitos T y B [Netea et al., 2004].

Respuesta inmune innata o inespecífica

La respuesta inmune innata forma parte de los mecanismos inespecíficos que representa el primer sistema defensivo del organismo, siendo de especial importancia la protección del organismo frente a las infecciones. Los mecanismos que conforman la inmunidad de tipo innato están constituidos por las barreras naturales, que son la piel y las mucosas, que no sólo actúan aislando al individuo del exterior sino que también exhiben actividades bactericidas y promotoras de la inflamación debido a la presencia de múltiples moléculas, factores y células con función defensiva. Estas células se caracterizan por su capacidad para actuar de manera inmediata sin requerir de un aprendizaje previo siempre que algún patógeno sobrepasa las barreras naturales.

En la respuesta inmune innata de los pulmones (espacio alveolar) intervienen una serie de células que incluyen a los macrófagos alveolares y las células epiteliales del pulmón (células alveolares tipo I y tipo II) que son el primer contacto con los patógenos. Además de neutrófilos, linfocitos B, células dendríticas, células NK [Raja, 2004; Rivas-Santiago et al., 2005]. También intervienen factores solubles como la mucina, lisosima, lactoferrina [Knowels y Boucher, 2002], surfactantes, fosfolipasa A2 [Freguson y Schlesinger, 2000], defensinas, catelicidinas [Ganz, 2002], inmunoglobulinas y proteínas del complemento [van Crevel et al., 2002], cuya función es mantener la homeostasis pulmonar y la eliminación de partículas o bacterias que entren por el tracto respiratorio.

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La llegada de M. tuberculosis hasta el espacio alveolar significa que ha superado la barrera muco-ciliar del tracto respiratorio. Los macrófagos alveolares, que constituyen la primera línea de defensa, establecen el primer contacto con la micobacteria, junto con las células epiteliales, y va a ser crucial para definir el control de la infección o el desarrollo de la enfermedad. La fagocitosis de la micobacteria es principalmente llevada a cabo por los macrófagos alveolares a través de diversos mecanismos y es favorecida por la proteína surfactante A, producida por las células epiteliales alveolares tipo II, ya que aumenta la interacción entre la micobacteria y los macrófagos [Freguson y Schlesinger, 2000].

Macrófagos

Los macrófagos, al igual que otras células sanguíneas tienen su origen en la médula ósea (Fig. 5), se forman a partir de las células madre, unidad formadora de colonias granulosito-macrófago, monoblasto, promonocito y finalmente monocito, este último pasa al torrente circulatorio para dirigirse a un órgano blanco y ahí se introduce al micro-ambiente local para ser diferenciado como célula específica y heterogénea, que en el caso de los pulmones, se diferencia a macrófago alveolar, donde residen durante varios años [Ma et al., 2003].

Los macrófagos juegan un papel doble en la defensa del huésped, pues son un componente de la respuesta inmune innata, pero también actúan como células accesorias importantes en la respuesta inmune adaptativa [Ma et al., 2003], dado que son células presentadoras de antígenos [Rivas-Santiago et al., 2005].

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Fig. 5: Representación esquemática de la formación de las células sanguíneas.

Interacción M. tuberculosis-macrófago, señalización intracelular y fagocitosis

Raja caracteriza la secuencia de interacción macrófago-M. tuberculosis y el papel de los macrófagos en la respuesta inmune del huésped en un proceso de cinco etapas: 1. Unión de la superficie del M. tuberculosis al macrófago; 2. fusión fagosoma-lisosoma; 3. crecimiento micobacteriano inhibición/muerte; 4. reclutamiento de células inmunes secundarias a la respuesta inflamatoria local, y 5. presentación de antígenos de las células T para el desarrollo de la inmunidad adquirida [Raja, 2004].

Durante las primeras etapas de reconocimiento, los macrófagos pueden interactuar de dos maneras con las micobacterias: pueden hacerlo de forma directa con los receptores de superficie de los macrófagos; o se puede establecer gracias a diversos elementos séricos que el macrófago puede reconocer de manera específica, como los anticuerpos o, de manera inespecífica como los componentes del complemento o proteínas de la fase aguda, los cuales funcionan como opsoninas. [Hirsch et al., 1994].

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Inicialmente, la fagocitosis no opsónica realizada por los macrófagos es crítica para la defensa del huésped en el pulmón, debido a que en el fluido bronco-alveolar no inflamatorio no hay cantidad suficiente de opsoninas [Linehan et al., 2000].

Los macrófagos alveolares son el primer tipo celular involucrado en la fagocitosis de M. tuberculosis. Luego de este primer encuentro, las células dendríticas y los macrófagos derivados de monocitos también forman parte del proceso fagocítico [van Crevel et al., 2002]. La endocitosis de M. tuberculosis involucra diferentes receptores de las células fagocíticas, que actúan en el reconocimiento del bacilo tuberculoso. En los macrófagos humanos, los receptores primarios para el reconocimiento de M. tuberculosis son el receptor de manosa y el receptor de complemento 3, mientras que para las células dendríticas, el principal receptor es DC-SIGN [Tailleux (b) et al., 2003]. Esta micobacteria, también es reconocida por los receptores tipo Toll (TLR), como el TLR2, TLR 9 y TLR4 [Heldwein y Fenton 2002; Quesniaux et al., 2004], que se unen a ligandos pro-inflamatorios como lipoproteínas, peptidoglicanos complejos, lípidos y LAMs. Otros receptores participantes en este proceso son: el receptor de la proteína surfactante A que facilita la entrada de M. tuberculosis a los macrófagos [Gaynor et al., 1995], pneumocitos tipo II [Bermúdez y Goodman, 1996] o neutrófilos [Ernst, 1998]; el receptor “scavenger” clase A , que se unen a los sulfolípidos de la micobacteria [van Crevel et al., 2002], las lecitinas de unión a manosa [Garred et al., 1997] y la dectina-1 [Yadav y Schorey, 2006].

Una vez que se ha unido la micobacteria con el fagocito, el colesterol de la membrana del macrófago se acumula en el sitio de entrada de la bacteria, y se produce una invaginación de la bacteria a través de la pared celular formando el fagosoma [Gatfield y Pieters, 2000].

Las células tratan de controlar la infección y al mismo tiempo producen varias citocinas como IL1β, IL-6, IL-10, TNFα e IL-12, para el reclutamiento y activación de células del sistema inmunológico [Rivas-Santiago et al., 2005]. La activación de los macrófagos infectados se manifiesta de distintas maneras. El fagosoma madura y se fusiona con los lisosomas, que aportan potentes enzimas hidrolíticas. Estas enzimas funcionan a pH ácidos (4,5-5,0), que se produce gracias la bomba de protones dependiente de ATP, la H+-ATPasa vacuolar, que se encuentra en la membrana [Mellman et al., 1986]. Los macrófagos activados también producen especies reactivas de oxígeno (agua oxigenada, anión superóxido, etc.) y nitrógeno (óxido nítrico). Sin

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embargo, la habilidad de las especies reactivas de oxígeno para aniquilar a M. tuberculosis solo ha sido demostrado en ratones [Flesch y Kaufmann, 1987; Raja, 2004]. El óxido nítrico es sintetizado por la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS2 o NOS2), que utiliza como sustrato arginina. Aunque su importancia en la defensa del huésped contra M. tuberculosis ha sido documentada tanto en estudios in vitro como in vivo, en modelos de ratón, su papel en infecciones humanas es controvertido [Shiloh y Nathan, 2000].

Se ha argumentado que la 1,25 dihidroxivitamina D3 induce la expresión de iNOS2 e inhibición en la actividad de M. tuberculosis en la línea celular macrofágica humana HL-60 [Rockett et al., 1998]. Hay estudios donde se han encontrado niveles de expresión de ARMm de la NOS2 en macrófagos infectados con M. tuberculosis tratados con IFNγ, no así en los no tratados, encontrándose una mayor cantidad de ARNm en macrófagos co-cultivados con linfocitos y tratados con INFγ [Bonecini-Almeida et al., 1998]. También se han encontrado altos niveles de expresión de NOS2 en macrófagos obtenidos de lavados broncoalveolares de individuos con tuberculosis pulmonar [Nicholson et al., 1996].

Células epiteliales

Inicialmente se pensó que el primer contacto lo establecía M. tuberculosis con los macrófagos alveolares. Sin embargo, actualmente se sabe que las micobacterias infectan a las células epiteliales alveolares, como una alternativa para evadir las agresiones del medio y escapar de los macrófagos. Debido a que al inicio de la infección hay relativamente pocos macrófagos alveolares para fagocitar a las micobacterias, son las células epiteliales las que pueden ser invadidas. Se han realizado ensayos de adherencia e invasión en la línea celular epitelial alveolar tipo II humana (A549) con diferentes micobacterias (M. tuberculosis H37Rv y H37Ra y con M. avium) y se observó que estás micobacterias pueden invadir y replicarse intracitoplasmáticamente [Bermúdez y Goodman, 1996]. Las células epiteliales del tracto respiratorio también poseen receptores de reconocimiento de patógenos, como las lectinas de unión a manosa, TLR y CD14 [Netea et al., 2004; Hogg, 2004]. Se ha demostrado que estas células secretan quimiocinas para el reclutamiento de neutrófilos, linfocitos y monocitos al pulmón [Rivas-Santiago et al., 2005]. Asimismo, también producen péptidos antimicrobianos como las defensinas (β-defensina-2) y las catelicidinas (LL-37). Este tipo de péptidos pueden activar a las células dendríticas inmaduras, dando como

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resultado un aumento de moléculas co-estimuladoras [Biragyn et al., 2002; Davidson et al., 2004].

Neutrófilos

Los neutrófilos son de las primeras células que se activan en la respuesta inflamatoria [Sibille y Reynolds, 1990]. Aunque la tuberculosis se caracteriza por la migración predominante de momocitos/macrófagos al sitio de infección, la respuesta más temprana a la invasión del tejido por la micobacteria es una afluencia de neutrófilos con menos monocitos/macrófagos [Kobayashi et al., 1985]. Por otro lado, los neutrófilos tienen un papel importante en la protección contra la infección micobacteriana [Appelberg et al., 1995] a través de la producción de quimiocinas [Riedel y Kaufmann, 1997]. Además, han mostrado que producen varias citocinas como IL-1, IL-6, IL-8, TNFα, receptor antagonista de IL-1 y MIP1α [Kasahara et al., 1998]

En estudios in vivo, se ha demostrado que los neutrófilos pueden aniquilar a la cepa no virulenta de M. tuberculosis (H37Ra) [Majeed et al., 1998]. Los neutrófilos, en su papel defensivo frente a las infecciones microbianas, pueden emplear sistemas microbicida oxidativos o no oxidativos. En los gránulos de los neutrófilos se encuentran las defensinas, que son las más abundantes entre una serie de proteínas y péptidos antimicrobianos [Fu, 2003]. Se ha observado que las defensinas producidas por los neutrófilos son activas contra micobacterias no tuberculosas [Ogata et al., 1992], M. tuberculosis H37Ra, así como también en aislados clínicos de M. tuberculosis [Miyakawa et al., 1996].

Existe una discrepancia con respecto a si los neutrófilos utilizan la vía oxidativa o la no oxidativa frente a M. tuberculosis. Hay estudios que demuestran la activación de la vía oxidativa en la infección de neutrófilos con este bacilo [May y Spagnuolo, 1987; González-Cortés et al., 2009]; pero otros autores consideran que el mecanismo antimicrobiano principal es no oxidativo, asociado a la producción de las defensinas [Kisich et al., 2002]. Hay un estudio realizado por Jones y Amirault, donde se observa en presencia de la superóxido dismutasa y la catalasa fallan en la disminución del aniquilamiento de M. tuberculosis, por lo que estos investigadores consideran que el mecanismo de acción de los neutrófilos es el no oxidativo [Jones y Amirault, 1990]. Además Martineau et al., han demostrado la importante participación de los neutrófilos en la inmunidad innata frente a la tuberculosis, actividad que está asociada con la

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producción de sus péptidos antimicrobianos como LL-37 y la lipocalina-2que limitan el crecimiento de la bacteria [Martineau et al., 2007].

Células dendríticas

Las células dendríticas son una familia de células presentadoras de antígenos derivadas tanto del tejido mieloide como linfoide [Robinson et al., 1999], con una excelente capacidad de interactuar con las células T y modular su respuesta [Reis e Sousa et al., 1999]. La interacción entre las células dendríticas presentes en las vías aéreas y la micobacteria, se considera que es crítica para la respuesta inmune y para determinar el resultado de la infección. Förstch et al., observaron que las células dendríticas son huéspedes importantes para M. tuberculosis, ya que esta micobacteria se puede multiplicar dentro de ellas [Förstch et al., 2000].Sin embargo, estos hallazgos no fueron corroborados por Tailleux et al., que llegó a la conclusión de que la supervivencia intracelular de M. tuberculosis se redujo en estas células.[Tailleux (a) et al., 2003].

Células NK

Las células NK representan aproximadamente el 10% del total de linfocitos en sangre periférica [Cooper et al., 2001]; son consideradas como células efectoras de la inmunidad innata, ya que reconocen y lisan células infectadas y son productoras de citocinas como el IFNγ [Schierloh et al., 2007]. Se ha demostrado que M. bovis BCG puede interactuar directamente con las células NK en ausencia de monocitos/macrófagos y puede inducir la producción de IFNγ, y el aumento de su actividad citotóxica [Esin et al., 2004].

Aunque primero se creía que tenían solamente actividad citotóxica contra células tumorales y células infectadas por virus, ahora se conoce que son mediadores importantes en la respuesta inmune innata frente a una variedad de microorganismos patógenos incluyendo bacterias intracelulares [Lodoen y Lanier, 2006]. Se conoce que las células NK producen granulisina, que asociada con la perforina pueden matar micobacterias [Korbel et al., 2008].

Respuesta inmune adaptativa o específica

Las principales células de la respuesta inmune adaptativa son los linfocitos, que se desarrollan a partir de progenitores linfoides inmaduros (pre-linfocitos) y se dividen

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en dos grandes grupos, linfocitos B y linfocitos T. Los linfocitos B están especializados en la producción de anticuerpos. Los linfocitos T son responsables de las respuestas inmune celular y de tipo retardada [LeBien y Tedder, 2008]. La respuesta de inmunidad adaptativa es específica y su desarrollo depende en gran medida de la eficiencia de la inmunidad innata, ya que si los macrófagos alveolares no son capaces de controlar la infección se favorece una respuesta inmunitaria humoral (Th2), que no es protectora en la tuberculosis y que se caracteriza por la producción de citocinas como 4, 5, IL-6, IL-10, IL-13 y TGF-β, las cuales antagonizan la respuesta de inmunidad celular tipo Th1, eficiente en infecciones causadas por microorganismos intracelulares y caracterizada por la producción de citocinas como IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18 y TNF-α [Rivas-Santiago et al., 2005]

La respuesta inmune celular a la tuberculosis involucra macrófagos, células T CD4+, células CD8+ y células T γδ. Los macrófagos son críticos en el control de la infección por M. tuberculosis porque ellos albergan la bacteria en un compartimiento intracelular y presentan los antígenos de la micobacteria, vía MHC clase II, a las células T CD4+ [Pai et al., 2003].

Respuesta inmune celular (linfocitos T –Th/Tc)

Los linfocitos T reconocen y responden solo a antígenos presentados por las células presentadoras de antígeno. Dentro de las células T encontramos principalmente a los linfocitos T “helper” (Th) o CD4+ y a los linfocitos T citotoxicos (Tc) o CD8+.

Células CD4+ o Th

M. tuberculosis reside principalmente en una vacuola de los macrófagos, que evoluciona de fagosoma a fagolisosoma y donde en última instancia se produce la degradación del patógeno. Los péptidos que se originan se unen a las moléculas MHC clase II y son presentados a las células CD4+. Estas células son las más importantes en la respuesta de protección contra la tuberculosis [Hartmann y Plum, 1999; Flynn y Chan, 2001].

Las células T CD4+ pueden desarrollar al menos dos fenotipos que están asociados con distintos perfiles de expresión de citocinas después de la estimulación antigénica: a) Células Th-1 que son inducidas por la IL-12 y producen INFγ, TNFα e IL-2; estas citocinas activan intracelularmente la capacidad microbicida de los macrófagos e inician y mantienen la respuesta inflamatoria granulomatosa protectora. b)

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Células Th-2, son inducidas por la IL-4 y producen grandes cantidades de esta citocina y de otras, incluyendo IL-5, IL- 10 e IL-13. Un subgrupo de células T CD4+, son las Th-17 que son inducidas por el TGFβ y la IL-6, sostenida, al menos en parte por la IL-23, y produce altas concentraciones de IL-17. Las células Th-17 al parecer pueden ser importantes en la inmunidad protectiva o pueden estar más involucradas en la respuesta patológica que ocurre durante la progresión de la tuberculosis así como en la respuesta autoinmune [Hoft, 2008].

Células CD8+ o Tc

Las células CD8+ pueden reconocer y eliminar células diana infectadas con patógenos intracelulares. Los antígenos peptídicos son presentados a ellas por las moléculas MHC clase I y pueden reconocer células diana infectadas con M. tuberculosis y destruirlas. Estas células citolíticas pueden reaccionar con antígenos proteicos y lipídicos derivados de la micobacteria [Hoft, 2008]. Los linfocitos CD8+ son capaces de producir IFNγ e IL-4 y así pueden desempeñar un papel en la regulación del equilibrio de las células Th1 y Th2 en los pulmones de pacientes con tuberculosis [McDonough et al., 1993].

Células T γγγγδδδ δ

Las células T γδ producen citocinas después de una estimulación con antígenos. Se concentran en la superficie epitelial y pueden ser un mecanismo de defensa temprano en el inicio de una invasión con patógenos ambientales. En humanos y en macacos, pero no en ratones, en la infección con M. tuberculosis se generan los subtipos γ9+δ2, que esta asociada con una protección parcial a la tuberculosis. [Hoft, 2008].

Células CD1-restricted ααααββββ

Estas células pueden presentar moléculas lipídicas micobacterianas a las células T γδ, estimulando tanto la respuesta específica de citocinas a la micobacteria como a la actividad citolítica [Hoft, 2008].

Respuesta inmune humoral (linfocitos B)

El papel definitivo de los linfocitos B en la defensa del huésped frente a M. tuberculosis aún no está muy esclarecido. Algunos autores han considerado poco importante la participación de los linfocitos B y de los anticuerpos en la tuberculosis [Turner et al., 2001]. Sin embargo, los linfocitos B están presentes en un gran número

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de granulomas tuberculosos de humanos y ratones [Bosio et al., 2000]. Recientemente, se han identificado estructuras dominantes parecidas a los folículos en la periferia del granuloma en pulmones con tuberculosis y se ha sugerido que las células B puede jugar un papel importante en la inmunidad local [Ulrichs et al., 2004].

Granuloma tuberculoso

La formación del granuloma tuberculoso se inicia con la infección de los macrófagos alveolares por M. tuberculosis, resultando en la producción de citocinas, quimiocinas y la aparición una respuesta inflamatoria, con la afluencia de monocitos, neutrófilos y células dendríticas. En este punto los bacilos son fagocitados por las células dendríticas y transportados desde el pulmón hasta los nódulos linfáticos donde se encuentran las células T naïves (Fig. 6). Posteriormente, las células T y B efectoras y nuevos monocitos migran desde la sangre hacia el pulmón y a través del tejido pulmonar se dirigen hacia el sitio de la infección. El lento crecimiento de la micobacteria (tiempo de duplicación, aproximadamente 24 horas in vivo) previene que se produzca una abrumadora infección micobacteriana antes de la respuesta granulomatosa. Una vez que las células llegan al sitio donde están los macrófagos infectados, forman una estructura para contener la infección, el granuloma. En el cual las células T interactúan con los macrófagos infectados y son activadas para el control de la infección. Debido a que esta activación no es muy exitosa las bacterias permanecen dentro del granuloma. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la bacteria es controlada por un largo período [Scott-Algood et al., 2005].

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Fig. 6: Esquema de la formación del granuloma tuberculoso.

El granuloma esta formado por dos tipos de macrófagos, los activados, con citoplasma más abundante (macrófagos epiteloides) y los no activados. Además, también participan en este proceso formas multinucleadas de células gigantes de Langerhans, células T (CD4+ y CD8+), células NK y células γδ y fibroblastos [Co et al., 2004; Salgame, 2005]. En la formación y mantenimiento del granuloma, es importante resaltar la importancia del TNFα como citocina clave de este mecanismo de defensa [Co et al., 2004; Scott-Algood et al., 2005].

Los macrófagos, a través del granuloma, pueden contener a la micobacteria en un período de latencia por décadas. Sin embargo, M. tuberculosis puede reactivarse como resultado de un fallo en el sistema inmune, con la consecuente liberación de los microorganismos del granuloma y la progresión de la enfermedad a clínicamente activa [Skeiky y Sadoff, 2006].

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Evasión de la respuesta inmune

M. tuberculosis presenta diversas estrategias para evadir la respuesta inmune. La pared celular de las micobacterias tiene mucha importancia en la resistencia a los mecanismos de defensa del huésped, ya que su alto contenido lipídico dificulta la degradación de la bacteria por las enzimas lisosomales; además, existen proteínas como la superóxido dismutasa, catalasa, peroxidasa y el sistema thioredoxina que degradan los radicales libres de oxígeno y de otras sustancias que podrían atravesar la paredde la micobacteria [Andersen et al., 1991]. Otros componentes de la pared micobacteriana son los glucolípidos fenólicos I y LAM que son potentes secuestradores de los radicales de oxígeno [Chan et al., 1991]. Otro lípido, la trealosa 6,6´dimicolato, forma parte de la cápsula de la micobacteria, y actúa sobre las mitocondrias inhibiendo la respiración y la fosforilación oxidativa e inhibe la migración de los leucocitos [Daffé y Ettienne, 1999].

Los macrófagos infectados por M. tuberculosis disminuyen su capacidad para presentar antígenos vía MCH clase II y la co-estimulación de las células Th. Estos defectos al parecer están relacionados con la disminución de la expresión de moléculas clase II por los macrófagos infectados [Hmama et al., 1998].

También hay estudios que refieren que las micobacterias virulentas son capaces de inhibir la fusión de los fagosoma con los lisosomas, debido a la liberación de derivados sulfatados a partir de la glicoproteína trehalosa 2-sulfato, que detiene la maduración del lisosoma en el estadio de endosoma temprano [Keane et al., 1997]. Así mismo, la proteína que contiene una capa de triptófano-aspartato (TACO), es la causante de la incapacidad de los fagosomas, que contienen a las micobacterias, para fusionarse con los lisosomas [Ferrari et al., 1999].

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CITOCINAS

El reconocimiento de M. tuberculosis por células fagocíticas de la inmunidad innata conduce a la activación celular y la producción rápida de citocinas pro y anti-inflamatorias. Estas citocinas, incluyendo a las quimiocinas, reclutan células inflamatorias a las áreas de infección, y coordinan las respuestas inflamatoria e inmune adaptativa en contra de la micobacteria.

Las citocinas son mediadores de comunicación celular, de bajo peso molecular, las cuales incluyen las interleucinas (IL), interferones (IFNs), factores de crecimiento, factores estimulantes de colonias, y otros grupos. Estas moléculas son liberadas por una variedad de células y por lo general actúan localmente en un tejido que afectan a las células adyacentes de una forma paracrina. Las citocinas también pueden actuar dentro de una célula (intracrina), afectan a la misma célula después de la liberación (autocrina), o viajar a través de la circulación para actuar a distancia de forma endocrina. Las citocinas llevan a cabo funciones importantes en la fisiología normal como en las respuestas del huésped a la infección o de otras amenazas exógenas de la integridad del organismo. Un principio importante que emerge es que la respuesta biológica en un órgano o tejido refleja un equilibrio entre los niveles locales de citocinas pro-inflamatorias y anti-pro-inflamatorias. Por lo tanto, una enfermedad crónica puede ser consecuencia de la producción excesiva de citocinas pro-inflamatorias o la producción inadecuada de citocinas anti-inflamatorias. [Arend y Gabay, 2004]. La respuesta inflamatoria a M. tuberculosis no solo es crucial para el control inicial de la infección sino que también pueden contribuir en el control de la infección crónica y la patología asociada [Flynn y Chan, 2001].

Citocinas pro-inflamatorias Interferón gamma (IFNγ)

El IFN fue descrito por primera vez como un producto capaz de interferir con la replicación viral de células infectadas con virus [Isaacs y Lindenmann, 1988]. En humanos, los IFNs, han sido clasificados en tres tipos, sobre la base de la secuencia de

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sus genes, la localización cromosómica, y la especificidad de los receptores [Pestka et al., 2004]. El tipo I, que incluye 13 formas del IFNα, y una forma para los IFNs β, ω, ε, y κ. Estas moléculas señalizan a través de un receptor expresado de forma ubicua, compuesto por dos cadenas: IFN-αR1 e IFN-αR2. El IFN tipo II sólo incluye el IFNγ, que señaliza por vía de un receptor expresado de forma ubicua, compuesto por las subunidades IFN-γR1 e IFN-γR2. Y el IFN tipo III, del cual se han identificado tres miembros, IFN-λ1 (IL-29), IFN-λ2 (IL-28A) y el IFN-λ3 (IL-28B), actúa a través de un receptor compuesto de dos cadenas: un IFN-λ específico IFN-λR1 expresado selectivamente por ciertos tipos celulares y otro expresado ubicuamente, el IL-10Rβ, el cual forma parte de los receptores de la IL-10, IL-22 e IL-26. En modelos experimentales de infecciones en ratones in vivo, se ha observado que los IFN-α/β, son esenciales para la inmunidad de la mayoría de los virus, mientras que el IFN-γ es importante para la inmunidad a un número menor de virus, además de bacterias, hongos, y parásitos. El papel preciso de IFN-λ no ha sido bien dilucidado [Zhang et al., 2008].

El IFNγ es una citocina prototipo de la respuesta celular Th1, y es esencial para un control efectivo de M. tuberculosis en el huésped. Es producida por las células T tanto por CD4+ como las CD8+, y por las células NK. Estimula una respuesta micobactericida en macrófagos de ratón caracterizada por la inducción de la NOS2 [Flynn y Chan, 2001]. El IFNγ puede aumentar la presentación de antígenos y el reclutamiento de los linfocitos CD4+ y CD8+. Aunque la producción de IFNγ, que por si sola no es suficiente para el control de la infección por M. tuberculosis, es requerida para la respuesta protectora a éste patógeno. La producción del INFγ por los diferentes tipos celulares, en la fase temprana de la respuesta inmune, tiene un papel significativo en la activación, diferenciación y expansión de las células Th1 específicas de antígeno. Estas células son la mayor fuente de INFγ durante la respuesta inmune adaptativa y es necesaria para el control de la fase crónica de la infección. Por eso cualquier alteración a nivel de la señalización del INFγ puede causar un desarrollo de la enfermedad. Se ha observado que en personas con mutaciones en los genes que codifican la proteína INFγ presentan infecciones graves a micobacterias, incluyendo las poco patógenas como las no tuberculosas o M. bovis atenuado (BCG) y a la bacteria Salmonellae. Dichos

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defectos genéticos son principalmente a nivel de sus receptores (INF-γR) [Ottenhoff et al., 2005].

Factor de necrosis tumoral alfa (TNFααα) α

El TNFα es la citocina típica proinflamatorias y es producida por monocitos, macrófagos, células dendríticas y células T cuando se exponen a M. tuberculosis y a productos micobacterianos. Desempeña un papel importante en la formación del granuloma en tuberculosis y tiene propiedades inmuno-reguladoras. En estudios tanto in vivo como in vitro en el modelo de ratón se ha observado que el TNFα sinergiza con IFNγ e induce en los macrófagos activados a la producción de NO y RNI vía NOS2 usando como substrato L-arginina [Flynn y Chan, 2001].

El TNFα es importante en la contención de la infección por M. tuberculosis, en la prevención de la diseminación, y afecta la migración celular. También tiene influencia en la expresión de moléculas de adherencia, quimiocinas y receptores de quimiocinas [Raja, 2004]. En pacientes con artritis reumatoide o con la enfermedad de Crohn, que reciben tratamiento con anticuerpos monoclonales (anti-TNFα) se ha advertido una asociación con la reactivación de la tuberculosis [Dinarello, 2003].

Interleucina-12 (IL-12)

La IL-12 es una citocina heterodimérica perteneciente a una familia de varias citocinas que incluye la IL-23, IL-27 [Trinchieri, 2003], y la IL-35 [Collison y Vignali, 2008]. El heterodímero IL-12p70, de la IL-12, esta formado por dos subunidades, la p35 y p40, las cuales para que presenten actividad biológica requieren de la interacción con el complejo IL-12R, compuesto por IL-12Rβ1 e IL-12Rβ2. En estudios con ratones con ausencia de la subunidad IL-12p40 se ha detectado una disminución de la respuesta inmune a las micobacterias, dando como resultado una disminución en la producción de IFNγ, y aumento del crecimiento bacteriano y de la mortalidad [Khader et al., 2005]. Es producida después de la fagocitosis de la micobacteria por los macrófagos y las células dendríticas, e induce la diferenciación de las células T en células Th1 y la producción de IFNγ [Flynn y Chan, 2001; van Crevel et al., 2002; Berrington y Hawn, 2007]. Algunos receptores tipo toll (TLR2, TLR4) cuando se activan inducen la producción de IL-12 y de TNFα [Verreck et al., 2004].

Referencias

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