(En Español)
IFA de IgM contra la Fiebre Q
Código del Producto IF0200M
Rev. J
Inmunoensayo Fluorescente Indirecto (IFA) para la
Detección de Anticuerpos IgM Humanos contra
Coxiella burnetii
Para Uso Diagnóstico in vitro
PROPOSITO DE LA PRUEBA
El IFA de IgM contra la Fiebre Q de Focus Diagnostics sirve para la detección y semicuantitación de la respuesta de anticuerpos humanos IgM contra los antígenos de fase I y fase II de Coxiella burnetii y para ayudar en el diagnóstico de la Fiebre Q.
RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA
Coxiella burnetii, el organismo que causa la fiebre Q, es un parásito intracelular obligado (familia Rickettsiae), de distribución mundial. Es único en este grupo
de organismos ya que tiene una fase de transición, similar a las transiciones liso-rugoso de los liposacáridos que se ven en las bacterias gramnegativas. Los aislados virulentos son del tipo fase I, mientras que se requiere el paso en huevos o cultivo celular para seleccionar la fase II de transición avirulenta. Estas fases son serológicamente distinguibles y muy útiles en el serodiagnóstico de las infecciones tanto agudas como crónicas por C. burnetii 1-9.
Reservorios importantes de C. burnetii incluyen el ganado vacuno, corderos y cabras. Evidencia reciente también ha implicado como reservorios a los roedores, así como a los gatos que se alimentan de éllos. La infección en estos animales es enzoótica y casi siempre inaparente. La Rickettsia infecta a los humanos vía inhalación de partículas de polvo y aerosoles contaminados y por el manejo e ingestión de carne y leche infectada.
Fiebre Q tiene un período de incubación de aproximadamente 2 a 3 semanas. Síntomas agudos incluyen la aparición de fiebre, que alcanza un máximo cerca de 40 °C en 2 a 4 días y que declina gradualmente en 1 a 2 semanas, acompañado de malestar, anorexia, mialgia, debilidad e intensa cefalea. Daño hepático con hepatomegalia ocurre a menudo llegando a causar la formación de granulomas hepáticos cuando el tratamiento es retrasado o el diagnóstico es inadecuado. Fiebre Q puede manifestarse también como neumonitis o bronquitis. Endocarditis es una secuela infrecuente, después de una fase latente prolongada y requiere que haya daño valvular cardíaco preexistente1. El laboratorio realizará las pruebas IFA de IgM e IgG de Fiebre Q en forma concurrente para determinar la presencia de anticuerpos contra fase I y fase II. La presencia de IgG contra los antígenos de fase II es indicativo de enfermedad aguda. La presencia de IgG contra los antígenos de fase I son indicativos de enfermedad crónica.
Durante la enfermedad aguda, los títulos de IgG contra antígenos de fase II son más altos que los de IgG contra los antígenos de fase I. Durante la enfermedad crónica, los títulos de IgG contra los antígenos de fase I son más altos o iguales que los de los antígenos de fase II. En el suero agudo temprano, los títulos de IgM contra fase II pueden ser más altos y aparecer más rápido que los títulos de IgG contra la fase II.
Título contra el Antígeno de fase Estado de la enfermead
Fase II > Fase I Aguda
Fase II ≤ Fase I Crónica o Convaleciente
El IFA de IgM de Fiebre Q de Focus Diagnostics utiliza C. burnetii (Tipo nueve millas). Cada lámina contiene ocho celdas; y, cada celda contiene dos áreas individuales: un área para antígeno de fase I y un área para antígeno de fase II de C. burnetii. Los organismos de C. burnetii han sido diluídos en una matriz de saco vitelino para añadir contraste de fondo.
PRINCIPIO DEL METODO
El Inmunoensayo de Anticuerpos Fluorescente Indirecto (IFA) es un procedimiento "sandwich" de dos etapas. En la primera etapa, el suero del paciente se diluye en diluyente de muestra, se añade a la celda de la lámina apropiada en contacto con el sustrato y se incuba Después de la incubación, la lámina es lavada en salina tamponada de fosfato para eliminar los anticuerpos séricos no ligados. En la segunda etapa, cada celda de antígeno se cubre con anticuerpos anti-IgM marcados con fluoresceína. La lámina se incuba para permitir que los complejos antígeno-anticuerpo reaccionen con el anti-IgM marcado con fluoresceina. Después de que la lámina es lavada, secada, y montada, se examina usando microscopía de fluorescencia. Las reacciones positivas aparecen como rickettsias fluorescentes color verde-manzana brillante con un fondo de matriz de saco vitelino. Títulos finales semicuantitativos se obtienen por evaluación de diluciones seriadas de los especímenes positivos.
PRESENTACION
El kit IFA de IgM contra Fiebre Q de Focus Diagnostics contiene materiales suficientes para realizar 80 determinaciones.
Láminas de Sustrato de Fiebre Q Ag
Q Fever Substrate Slides REF IF0201 Diez láminas de ocho celdas cada una. Cada celda contiene dos áreas individuales para el antígeno: un área de antígeno de C. burnetii inactivado fase I y otro de antígeno de C. burnetii inactivado fase II. La suspensión de saco vitelino se utiliza en la preparación de la lámina para incrementar la adherencia de los cuerpos de C. burnetii y para producir un fondo para la lectura microscópica. Las láminas selladas son estables hasta la fecha marcada en la etiqueta de los paquetes de láminas cuando son almacenados de 2 a 8 °C. Para evitar la condensación, permita que las láminas alcancen la temperatura ambiente antes de abrir los paquetes sellados.
Nota: La mayoría de los microscopios fluorescentes invierten la imagen del portaobjetos. Cuando se visualicen a través del microscopio, los antígenos aparecerán en orden inverso con respecto al que se muestra a continuación.
Conjugado de IgM, 2.5mL CONJ IgM
IgM Conjugate, 2.5mL REF IF0002
Un frasco de anti-IgM humana de cabra purificada por afinidad cromatográfica y marcada con fluoresceína, específica para cadena mu. Contiene la contratinción azul de Evan, estabilizador de proteína y conservante. Estable hasta la fecha marcada en la etiqueta cuando es almacenada entre 2 y 8 °C.
Control Positivo IgM de Fiebre Q, 0.25mL CONTROL +
Q Fever IgM Positive Control, 0.25mL REF IF0212 Un frasco de suero humano envasado a dilución de prueba. Contiene conservante. Estable de 2 a 8 °C hasta la fecha de validez marcada en la etiqueta. No lo use si presenta turbidez, descoloración u otra indicación de contaminación bacteriana. Permita que alcance la temperatura ambiente poco antes de usar. La congelación y descongelación repetida es perjudicial y debe ser evitada.
Control Negativo de Fiebre Q, 0.25mL CONTROL –
Q Fever Negative Control, 0.25mL REF IF0213 Un frasco de suero humano envasado a dilución de prueba. Contiene conservante. Estable de 2 a 8 °C hasta la fecha de validez marcada en la etiqueta. No lo use si presenta turbidez, descoloración u otra indicación de contaminación bacteriana. Permita que alcance la temperatura ambiente antes de usar. No lo pretrate o diluya. La congelación y descongelación repetida es perjudicial y debe ser evitada.
Diluyente de Pretratamiento IgM, 5mL DIL IgM
IgM Pretreatment Diluent, 5mL REF IF0209 Dos frascos que contienen suspensión de saco vitelino y suero IgG anti-humano de cabra (cadena pesada-específico), con conservante. Estable entre 2 y 8 °C hasta la fecha de validez marcada en la etiqueta. Permita que alcance la temperatura ambiente antes de usar.
Medio de Montaje, 2.5 mL REAG MONT
Mounting Medium, 2.5 mL REF IF0007 Un frasco gotero que contiene glycerol tamponado con PBS a un pH de 7.2 ± 0.1. Contiene conservante. Estable de 2 a 8 °C hasta la fecha de validez marcada en la etiqueta. Permita que alcance la temperatura ambiente antes de usar.
PBS BUF
PBS REF IF0005
Un frasco de salina tamponada de fosfato (PBS) en polvo. Reconstituya con 1 litro de agua destilada (o purificada). La solución reconstituída es tampón 0.01 M a un pH 7.2 ± 0.1. Antes y después de la reconstitución, almacene el PBS entre 2 y 8 °C. Permita que alcance la temperatura ambiente antes de usar. No lo use si presenta turbidez, descoloración u otra indicación de contaminación bacteriana.
MATERIALES ADICIONALES REQUERIDOS 1. Cubreláminas de 24 X 50 mm
2. Tubos de ensayo y gradilla, tubos de microcentrifugación o placa microtítulo para diluciones séricas 3. Centrifugador clínico
4. Incubador entre 35 y 37 °C o baño María para incubación de láminas 5. Refrigerador entre 2 y 8 °C
6. Botella plástica de lavado
7. Pipetas calibradas o de pistón con puntas desechables
8. Jarras Coplin o utensilio para tinción de láminas con sujetador de láminas 9. Balón volumétrico o cilindro graduado limpio de 1 litro
10. Cámara húmeda para incubación de láminas 11. Agua destilada o purificada
12. Reloj
13. Papel absorbente
14. Microscopio de Fluorescencia. Parámetros recomendados Filtro de excitación 470-490nm Filtro barrera 520-560nm
Fuente de luz HBO 100W, mercurio
Objetivo 20-40X, calidad de fluorescencia, altamente seco ESTABILIDAD Y MANIPULACION
1. Los kits son estables hasta el fin de mes indicado en la fecha de validez cuando son almecenados a 2 a 8 °C. 2. No use los kits o reactivos si están vencidos.
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ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Este kit es únicamente para uso diagnóstico in vitro.
2. Todos los productos sanguíneos deben ser tratados como potencialmente infecciosos. Los materiales de los cuales se ha derivado este producto (incluyendo el control negativo), han sido analizados con métodos aprobados por el FDA con resultados negativos, por la presencia de antígenos de superficie de hepatitis B, anticuerpos de hepatitis C y de VIH-1/2 (SIDA). Sin embargo, como ningún método conocido puede garantizar un 100% de seguridad que los productos derivados de sangre humana no transmitirán esos u otros agentes infecciosos, todos los controles, muestras de suero y el equipo que entre en contacto con estos especímenes, deberán ser considerados como potencialmente infecciosos y descontaminados o desechados tomando las precauciones de bioseguridad necesarias. El CDC y los institutos nacionales de la salud recomiendan que los agentes potencialmente infecciosos estén manejados en el nivel 2 de Biosafety.11,12
3. La congelación y descongelación repetida es perjudicial y debe ser evitada. 4. Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (18 a 25 ºC) antes de usar.
5. Las láminas de sustrato contienen C. burnetti inactivada. Sin embargo, las láminas deben ser consideradas potencialmente infecciosas y manejadas apropiadamente.
6. El azul de Evan es cancerígeno; no obstante, su concentración en este producto es inferior al umbral notificable (inferior al 0,1 %). 7. No sustituya o mezcle reactivos de diferentes lotes de kits o fabricantes.
8. Use únicamente los protocolos descritos en este prospecto. Si los intervalos o temperaturas de incubación empleados en la prueba no son los especificados, los resultados pueden ser erróneos.
9. Contaminación cruzada de los especímenes de los pacientes en una lámina puede causar resultados erróneos. Añada los especímenes de pacientes y maneje con cuidado las láminas para evitar mezclar suero de celdas adyacentes.
10. La contaminación bacteriana de especímenes séricos o reactivos puede provocar resultados erróneos. Use técnicas asépticas para evitar la contaminación bacteriana.
11. El medio de montaje contiene entre 30 y 60% de glicerol, lo que puede causar irritación si se inhala o entra en contacto con la piel. En caso de inhalación o contacto, deben tomarse inmediatamente medidas de primeros auxilios.
OBTENCION Y PREPARACION DE ESPECIMENES
El suero es el espécimen preferido. Ningún intento se ha hecho para evaluar la compatibilidad del ensayo con otros especímenes. Suero hiperlipidémico, hemolítico o contaminado puede causar resultados erróneos: por lo tanto su uso debe ser evitado.
Obtención y manejo de los especímenes
Obtenga las muestras sanguíneas asépticamente usando técnicas de venopunción aprobadas por personal calificado11. Permita que las muestras se coagulen a temperatura ambiente antes de centrifugarlas. Transfiera el suero asépticamente a un recipiente estéril fuertemente sellado para almacenaje entre 2 y 8 °C. Si la evaluación va a ser retardada más de cinco días, la muestra debe ser congelada a –20 °C o menos. Daños de congelo y descongelo podrían ocurrir, si los especímenes se guardan en congeladores con ciclos de auto-descongelación. Descongele y mezcle bien las muestras antes de usarlas. Un suero agudo debe ser obtenido al inicio de la enfermedad; un suero convaleciente debe ser obtenido 2 a 4 semanas más tarde.
Preparación de los Especímenes
Los anticuerpos séricos IgG pueden competir con los IgM resultando en falsos negativos. Falsos positivos pueden resultar cuando el factor reumatoide (IgG en complejos) está presente en el espécimen. Por lo tanto, se recomienda mucho el pretratamiento del suero para eliminar anticuerpos anti-IgG libres y en complejos.
Prepare diluciones de prueba 1:16 de suero del paciente como sigue: mezcle 5µL de suero de paciente con 75µL de Diluyente de pretratamiento IgM en tubos de microcentrífuga o en una placa microtítulo; y deje reposar al menos 5 minutos para que la reacción de inmunoprecipitación ocurra. La muestra diluída puede ser usada como tal, o puede ser centrifugada para separar el suero del precipitado. El precipitado no interferirá con la prueba.
Cuando sea necesario determinar títulos finales, use PBS para diluir serialmente los especímenes pretratados. PROCEDIMIENTO
1. Saque las láminas del refrigerador. Para evitar condensación, permita que alcanzen la temperatura ambiente antes de abrir los paquetes de láminas. 2. Añada 25µL de Control Positivo, a la celda apropiada de la lámina. Use PBS para diluir serialmente el control Positivo 32-veces más que la dilución del
frasco. Añada 25µL de cada dilución seriada a la celda apropiada de la lámina.
3. Añada 25µL de Control Negativo, tal como viene en el frasco, a la apropiada celda. No diluya el Control Negativo.
4. Por cada muestra del paciente a evaluar, añada aproximadamente 25µL de la dilución de la muestra preparada (vea Preparación del Especimen, arriba) a una celda apropiada de la lámina. Haga anotaciones para identificar más tarde cada celda cuando se lean los resultados.
5. Incube las láminas en una cámara húmeda por 90 ± 2 minutos de 35 a 37 °C.
6. Retire las láminas de la cámara húmeda y enjuague cada una con un chorro suave de PBS. No apunte el chorro directamente a las áreas de antígeno de las celdas. Enjuague una fila a la vez para evitar que los especímenes se mezclen. Lave las láminas sumergiéndolas en Coplin o en una jarra de tinción con PBS durante 10 minutos.
7. Sumerja las láminas lavadas momentaneamente en agua destilada o purificada y permita que se sequen al aire. 8. Añada aproximadamente 25 µL de Conjugado de IgM a cada celda de la lámina.
9. Incube las láminas en una cámara húmeda por 30 ± 2 minutos entre 35 a 37 °C. 10. Repita los pasos de lavado 6 y 7.
11. Coloque unas gotas de Medio de Montaje en la lámina y cubra con un cubreláminas de 24 X 50 mm. Elimine cualquier burbuja y el exceso de medio de montaje con papel absorbente.
12. Examine las celdas con una magnificación final de 400X en un microscopio de fluorescencia equipado apropiadamente. Para fluorescencia óptima, lea las láminas el mismo día que se desarrolla el ensayo. Si esto no es posible, almacene las láminas en la oscuridad entre 2 y 8 °C hasta por 24 horas.
CONTROL DE CALIDAD
Cada serie (cada vez que una lámina, o grupo de láminas, sean procesadas) debe incluir tanto los controles Positivos como los Negativos.
1. Si se desea una lectura de 1+ en la Lectura del Control, diluya el Control Positivo (vea Procedimiento, arriba) 1:8 y lea el área antigénica de fase I. Debido a las diferentes condiciones de laboratorios, incluyendo el equipo, la lectura 1+ del Control de Lectura puede variar ± 1 en una dilución doble. Al efectuar la dilución, los organismos de fase I y de fase II pueden exhibir diferentes intensidades de fluorescencia y diferentes títulos de punto final.
2. El Control Negativo debe exhibir reactividad insignificante a todos los puntos. La fluorescencia que no empareja la morfología y la distribución del control positivo se considera negativa.
Si los controles no muestran estos resultados, los resultados del paciente se deben considerar inválidos y la prueba deberá repetirse. INTERPRETACION DE RESULTADOS
La óptica del microscopio y la condición y el tipo de la fuente de luz determinarán la intensidad promedio de la fluorescencia y los títulos finales. Lea primero las celdas de los controles cada vez que haga una determinación para asegurar la interpretación correcta.
Lectura de las Láminas
Lea la intensidad de la fluorescencia de los cuerpos citoplasmáticos en cada área y valore la fluorescencia como sigue: 2 a 4+ Fluorescencia citoplasmática verde-manzana moderada a intensa.
1+ Fluorescencia citoplasmática definitiva, pero atenuada, equivalente a la observada en el control positivo en su título final de referencia. Negativa No hay fluorescencia o la fluorescencia es igual a la observada en la celda del Control Negativo (o menos que el título final). Interpretación de Resultados de los Especímenes de Pacientes
El recíproco de la dilución sérica más alta que produce fluorescencia verde-manzana definitiva (1+) se denomina el título final. La seroconversión se define como un cambio en el título final de anticuerpos entre las muestras agudas y convalecientes de no reactivo (anticuerpos no detectables) a reactiva (anticuerpos detectables) cuando la muestra aguda no es reactiva.
Un incremento cuádruple en el título final de anticuerpos IgM se considera evidencia de una infección actual o aguda. Sin embargo, la seroconversión por sí sola puede no ser diagnóstica de infección actual o reciente: un cambio en el título final de IgM de <1:16 a 1:16 no debe ser considerado un incremento cuádruple y puede ser insignificativo. Esto es válido para fase I y/o fase II.
Reactividad con ambos Antígenos Fase I y Fase II ≥ 1:16 con ambos
antígenos fase I y fase II
Positivo. Muy sugerente de infección reciente por C. burnetii. Los títulos de anticuerpos Fase I mayores o iguales a los títulos de anticuerpos fase II son consistentes con infección crónica o fase convaleciente de Fiebre Q.
< 1:16 con ambos antígenos fase I y fase II
Negativo. Ningún anticuerpo se ha detectado. Evidencia en contra de infección reciente por C. burnetii. Use la siguiente matriz para determinar el estado de la enfermedad Fiebre Q en el especimen:
Título a la fase de antígeno Estado de la enfermedad
Fase II > Fase I Aguda
Fase II ≤ Fase I Crónica o Convaleciente
Absorción al saco vitelino
Si hay anticuerpos naturales presentes contra las proteínas del huevo en el suero a evaluar, el saco vitelino los absorberá, reduciendo así la posibilidad de fluorescencia no-rickettsial.
LIMITACIONES
1. Ningún antígeno de fase del de C. burnetii ha reaccionado en forma cruzada con otras rickettsias o bacterias de forma suficiente como para producir reacciones positivas falsas2.
2. Los resultados obtenidos con este método se deben usar en conjunto con la información clínica disponible al médico asistente.
3. Las respuestas serológicas dependen de tiempo. Los especímenes obtenidos muy temprano en la infección pueden no tener niveles de anticuerpos detectables. Si se sospecha de fiebre Q, obtenga un segundo espécimen 2 a 3 semanas más tarde y evalúelo en paralelo con la muestra original.
RESULTADOS ESPERADOS
1. En sueros de Fiebre Q, es común encontrar títulos de IgM de 1:64 o mayores. En Fiebre Q aguda, los anticuerpos contra antígenos de fase II son usualmente mayores que el título contra antígenos de fase I. Aunque una elevación tanto en los títulos de fase I como de fase II pueden ocurrir en especímenes posteriores, el título de fase II permanece mayor.
2. En fiebre Q crónica, generalmente se observa una situación opuesta. Los títulos de fase I se elevan en especímenes tardíos mientras que los títulos de fase II disminuyen o permanecen constantes. Los títulos de fase I son significativamente más altos, a veces mucho más altos que cuádruples, en especímenes de pacientes cuyas muestras se han obtenido tarde en la enfermedad de fiebre Q crónica2-9.
3. Los títulos de anticuerpos clase IgM aparecen muy temprano en la enfermedad, alcanzando títulos máximos contra antígenos de fase II en tercera semana y declinando a niveles muy bajos en la semana 14. Los títulos contra antígenos de fase I siguen el mismo patrón, aunque a niveles mucho menores, y pueden no ser detectados inicialmente hasta la convalecencia.
4. En el caso de hepatitis granulomatosa crónica, los títulos de IgM contra los antígenos de fase I y fase II están algo elevados, siendo los títulos de fase II iguales o mayores que los títulos de fase I. Los títulos observados en endocarditis por Fiebre Q son similares en magnitud, aunque los títulos de fase I son a menudo mayores que los títulos de fase II 2,3,5,6,8,9.
CARACTERISTICAS ESPECIFICAS DE RENDIMIENTO Sensibilidad y Especificidad
Un total de 15 sueros fueron evaluados de anticuerpos IgM contra los antígenos de fase I y fase II de Coxiella burnetii con el IFA de IgM contra la Fiebre Q de Focus Diagnostics y con un IFA estándar de un laboratorio de referencia. Hubo una correlación del 100% entre los dos métodos. Ambas pruebas dieron resultados positivos de anticuerpos contra antígenos de fase I en 14 de 15 sueros y positivos de anticuerpos contra antígenos de fase II en 12 de 15 sueros. Los títulos finales alcanzados con ambos métodos de antígenos de fase I y fase II en los 15 sueros se encontraron con una diferencia de una dilución doble.
Focus Diagnostics vs. Método Estándar de un Laboratorio de Referencia Sensibilidad Relativa (Fase I) 100% (14/14) Sensibilidad Relativa (Fase II) 100% (12/12)
El kit IFA de IgM contra la Fiebre Q de Focus Diagnostics fué evaluado con 200 sueros humanos seleccionados al azar submitidos a un laboratorio de referencia para la determinación del estado inmune contra enfermedades infecciosas. Se determinó que los sueros eran negativos para el procedimiento requerido. Estos sueros fueron luego evaluados según las instrucciones del kit de IgM contra la Fiebre Q. Todos los 200 sueros dieron resultados claramente negativos. Varias muestras (3.5%) exhibieron fluorescencia inespecífica de fondo, que no interfirió con los resultados de la prueba. Los controles del kit funcionaron en rangos aceptables en todas las determinaciones.
Focus Diagnostics vs. Ensayo Estándar de un Laboratorio de Referencia
Especificidad Relativa 100% (200/200)
Reactividad Cruzada
Un total de 17 sueros con anticuerpos IgM contra otras enfermedades por rickettsias o bacterias fueron evaluados con dos lotes diferentes del kit IFA de IgM contra Fiebre Q para determinar si sueros de pacientes con anticuerpos IgM contra otras enfermedades puede causar reacciones positivas falsas con este método. Ningún antígeno de fase de C. burnetii reaccionó de forma cruzada con los sueros evaluados.
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Reproducibilidad
Para determinar la variación inter-prueba con el IFA de IgM de Fiebre Q, 2 sueros de pacientes con anticuerpos IgM contra antígenos de fase I y fase II de Fiebre Q (un positivo alto y uno positivo bajo) y 1 suero de paciente negativo de IgM de Fiebre Q fueron analizados en diez láminas diferentes. En tres láminas adicionales (una para cada suero descrito arriba), las ocho celdas de cada una fueron llevadas a la misma dilución para determinar la variación de la fluorescencia intra-prueba. No hubo variación inter-prueba en los títulos finales observados entre las diez láminas diferentes en los 3 sueros de pacientes. El suero del paciente exhibió la misma fluorescencia en cada celda de la lámina, indicando no variación intra-prueba.
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El manual de instrucciones del kit está disponible en francés, alemán, italiano y español en www.focusdx.com, y en otros idiomas de su distribuidor local.
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PI.IF0200M-ES Rev. J Escrito el día: 17 octubre 2016
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