PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN
AMORTIGUADORA DE pH 7,2
DIAGNÓSTICO MICROSCÓPICO DEL PALUDISMO PROCEDIMIENTO
OPERATIVO ESTANDAR – DMP-POE-03A
1. OBJETIVO Y ALCANCE
Describir el procedimiento de preparación de la solución amortiguadora de pH 7,2 que se utilizará en la preparación de una solución de trabajo de colorante de Giemsa para la tinción sistemática de extensiones de sangre en el diagnóstico microscópico del paludismo.
Este procedimiento solo podrá modificarse con la aprobación del coordinador nacional del
aseguramiento de la calidad del diagnóstico microscópico del paludismo. Todos los procedimientos especificados en el presente documento son de obligado cumplimiento para todos los microscopistas responsables del diagnóstico microscópico del paludismo en los laboratorios nacionales de referencia, los laboratorios hospitalarios y los laboratorios básicos de los establecimientos de salud que llevan a cabo esta prueba.
2. INFORMACIÓN GENERAL
Los parásitos palúdicos se pueden ver con claridad al microscopio en extensiones de sangre correctamente teñidas. Se debe preparar una solución amortiguadora para diluir el colorante antes de teñir las
extensiones. El uso de una solución amortiguadora con el pH correcto ayuda a lograr una buena tinción. Este POE consta de tres componentes:
• la preparación de la solución amortiguadora de pH 7,2; • la preparación de los líquidos correctores al 2%, y
• la comprobación y el ajuste del pH de la solución amortiguadora.
El pH indica la acidez o alcalinidad de un líquido. Se basa en una escala que va de casi 0 (muy ácido) a 14 (muy alcalino). De los líquidos que no son ni ácidos ni alcalinos se dice que son neutros, de pH 7,0. El pH de un líquido se puede determinar mediante un medidor de pH o pehachímetro o un indicador cromático como el comparador de Lovibond®. También se pueden utilizar tiras de papel indicador, pero cuando el ambiente es muy húmedo se alteran rápidamente y dejan de ser fiables. Los programas nacionales de lucha antipalúdica pueden recomendar diferentes tipos de pehachímetros o comparadores. El personal de laboratorio deberá aprender a utilizar el sistema que esté disponible en sus instalaciones.
En el presente Procedimiento Operativo Estandar (POE) se describe el uso del comparador de Lovibond® para medir el pH de la solución amortiguadora.
El agua se puede acidificar o alcalinizar mediante la adición de unas sales llamadas «sales amortiguadoras» que se guardan cada una por separado hasta el momento de combinarlas en las proporciones correctas en un volumen fijo de agua para obtener el pH deseado. Las sales amortiguadoras se pesan en una balanza. Es importante guardarlas de forma correcta y que no absorban la humedad del aire, ya que si lo hacen, quedarán inservibles.
Hay en el mercado pastillas de amortiguador (o «tampón») que, mezcladas con una cantidad fija de agua (por lo general 1 litro), permiten obtener el pH deseado.
No es preciso pesarlas y resultan útiles en los laboratorios con pocos medios. Se ha preparado un POE
específico (DMP-POE-03b) para los laboratorios en los que se utilicen pastillas de amortiguador.
Aun así, es indispensable conservar las pastillas en un lugar seco, y dentro de un tubo hermético; de lo contrario absorben la humedad rápidamente y hay que desecharlas. A juicio de algunos profesionales, la tinción da peores resultados cuando se utilizan pastillas de amortiguador, pero no hay pruebas de ello.
3. SUMINISTROS, MATERIALES Y EQUIPOS
3.1. Preparación de la solución amortiguadora de pH 7,2
• Una balanza analítica con una precisión de 0,01 g (lo ideal es una balanza de vigas con dos platos; también sirven diversos tipos de balanzas eléctricas de un solo plato que son fáciles de usar); • papeles de filtro de 11 cm de diámetro;
• un matraz de Erlenmeyer de vidrio de 1 litro; • un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml;
• espátulas de madera (también sirven los depresores linguales, fáciles de conseguir); • 1 litro de agua destilada o desionizada;
• fosfato de potasio dihidrogenado (anhidro) (KH2PO4);
• fosfato disódico hidrogenado (anhidro) (Na2HPO4);
• papel para rotular, y
• un frasco de vidrio limpio y seco, con tapón de rosca, de 1 litro o de 500 ml.
3.2. Preparación de los líquidos correctores al 2%
• Una balanza analítica con una precisión de 0,01 g o mayor (lo ideal es una balanza de vigas con dos platos, o una balanza eléctrica de un plato);
• papeles de filtro de 11 cm de diámetro;
• dos frascos con tapón de vidrio, cada uno de 100 o 150 ml; • fosfato de potasio dihidrogenado (anhidro) (KH2PO4); • fosfato disódico hidrogenado (anhidro) (Na2HPO4); • unos 200 ml de agua destilada o desionizada; • espátulas de madera;
• dos vasos de precipitados de 250 ml; • una probeta graduada de 100 ml, y • etiquetas.
3.3. Comprobación y ajuste del pH de la solución amortiguadora
• Solución amortiguadora en un matraz de Erlenmeyer; • los dos frascos de los líquidos correctores, y
• un pehachímetro (portátil o de mano) o un indicador cromático del pH y los elementos asociados.
Si va a utilizar el comparador de Lovibond®, necesitará:
• Dos cubetas de vidrio para el indicador cromático del pH; • un frasco de azul de bromotimol (indicador), y
4. PROCEDIMIENTO
DIAGRAMA DE FLUJO DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD
4.1. Preparación de la solución amortiguadora de pH 7,2
1. Pese 0,7 g de fosfato de potasio dihidrogenado (KH2PO4).
2. Transfiera el KH2PO4 pesado a un vaso de precipitados de vidrio. Añada 150 ml
de agua. Remueva con una espátula hasta que la sal se disuelva.
3. Pese 1 g de Na2HPO4.
4. Añada el Na2HPO4 a la solución
contenida en el vaso de precipitados y remueva.
5. Vierta la solución en el matraz de Erlenmeyer y enrase hasta la marca de
1 litro con agua.
6. Vierta la solución amortiguadora en un frasco de vidrio. Rotule el frasco y documéntelo en el libro de registro del
control de la calidad.
7. Guarde la
solución amortiguadora en un lugar fresco y resguardado de la luz
solar.
1. Pese 0,7 g de fosfato de potasio
dihidrogenado (KH2PO4) en una balanza de
vigas con dos platos:
Asegúrese de que el fiel de la balanza esté en el cero ajustando el tornillo correspondiente del brazo derecho. Coloque un papel de filtro en cada platillo y ponga el fiel en el cero, esta vez moviendo la masa de gramos a lo largo del brazo con la escala de gramos. Desplace la masa de gramos otros 0,7 g más y la balanza estará lista para pesar el KH2PO4. Con una espátula de madera vaya depositando KH2PO4 sobre el papel de filtro del plato de la izquierda hasta que llegue a los 0,7 g.
2. Transfiera el KH2PO4 pesado al vaso de precipitados de vidrio, añada unos 150 ml de agua y remueva con una espátula limpia hasta que la sal se disuelva.
3. Pese 1 g de Na2HPO4.
Coloque un papel de filtro nuevo en el plato de la izquierda. Vuelva a poner el fiel de la balanza a cero como antes, pero esta vez ajuste la masa de gramos en 1 g. Con una espátula limpia y seca, vaya agregando Na2HPO4 en el plato de la izquierda y equilibrando el peso tal como se ha descrito anteriormente.
4. Añada el Na2HPO4 a la solución contenida en
el vaso de precipitados y remueva como se ha indicado en el paso 2.
5. Cuando las sales se hayan disuelto, vierta la solución en el matraz de Erlenmeyer y enrase hasta la marca de 1 litro con agua.
6. Vierta la solución amortiguadora en un frasco de vidrio. Rotule el frasco claramente y documéntelo en el libro de registro del control de la calidad con la fecha de preparación, la fecha de caducidad y el nombre de la persona que ha preparado la solución amortiguadora.
Solución amortiguadora, pH 7,2 Fecha de preparación: 3 de junio de 2015
Fecha de caducidad: 10 de junio de 2015 Preparada por: Nombre Apellido
7. Guarde la solución amortiguadora durante un máximo de 7 días con el frasco perfectamente cerrado y en un lugar fresco y resguardado de la luz solar. Se recomienda utilizar un frasco
DIAGRAMA DE FLUJO DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD
4.2.1. Preparación de la solución de Na2HPO4 al 2%
1. Pese 2 g de Na2HPO4.
2. Añádalos a 100 ml de agua en un vaso de precipitados. Remueva hasta que la
sal se disuelva.
3. Vierta la solución en un frasco de vidrio y rotule este.
4. Guarde el frasco en un lugar fresco y resguardado de
la luz solar.
4.2.2. Preparación de la solución de KH2PO4 al 2%
1. Pese 2 g de KH2PO4.
2. Añádalos a 100 ml de agua en un vaso de precipitados limpio y remueva hasta
que la sal se disuelva.
3. Vierta la solución en un frasco de vidrio y rotule este.
4. Guarde el frasco en un lugar fresco y resguardado de la luz
solar.
4.2.1. Preparación de la solución de Na2HPO4 al 2%
1. Pese 2 g de Na2HPO4.
2. Añádalos a 100 ml de agua en un vaso de precipitados limpio y remueva con la espátula hasta que la sal se disuelva.
3. Vierta la solución en uno de los frascos de vidrio y rotule este como «Na2HPO4 al 2%».
Escriba en la etiqueta la fecha de preparación y el nombre de la persona que preparó el líquido corrector.
4. Guarde el frasco de Na2HPO4 al 2% en un lugar fresco y resguardado de la luz solar.
4.2.2. Preparación de la solución de KH2PO4 al 2%
1. Pese 2 g de KH2PO4 .
2. Añádalos a 100 ml de agua en un vaso de precipitados limpio. Remueva con una espátula hasta que la sal se disuelva. 3. Vierta la solución en uno de los frascos de
vidrio y etiquételo como «KH2PO4 al 2%».
Escriba en la etiqueta la fecha de preparación y el nombre de la persona que preparó el líquido corrector.
4. Guarde el frasco de KH2PO4 al 2% en un lugar fresco y resguardado de la luz solar.
DIAGRAMA DE FLUJO DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD 4.3. Comprobación y ajuste del pH de la
solución amortiguadora
A continuación se describe el método de medición del pH con el comparador de Lovibond®.
1. Vierta un poco de la solución amortiguadora que va a analizar en cada una de las cubetas de vidrio
del indicador cromático hasta la marca de los 10 ml.
2. Coloque una cubeta en el compartimento de la izquierda del indicador cromático de pH como cubeta
de referencia.
3. Pipetee 0,5 ml del indicador azul de bromotimol en la otra cubeta, mezcle y coloque la cubeta en el compartimento
de la derecha.
4. Gire el disco hasta que el color sea igual que el de la cubeta de la derecha.
5. Ajuste el pH de la solución amortiguadora en el matraz de Erlenmeyer mediante la adición de dos
o tres gotas del líquido corrector que proceda.
6. Repita los pasos 1 a 5 hasta conseguir un pH de 7,2.
4.3. Comprobación y ajuste del pH de la solución amortiguadora
Compruebe siempre el pH de la solución amortiguadora antes de usarla. Para ajustar el pH, añada a la solución pequeñas cantidades de los líquidos correctores: Na2HPO4 al 2% si el pH es
inferior a 7,2 (demasiado ácido) o KH2PO4 al 2%
si el pH es superior a 7,2 (demasiado alcalino). Se pueden realizar los ajustes como se indica a continuación.
Método de medición del pH con el comparador de Lovibond®:
1. Vierta un poco de la solución
amortiguadora que va a analizar en cada una de las cubetas de vidrio del indicador cromático hasta la marca de los 10 ml.
2. Coloque una cubeta en el compartimento de la izquierda del indicador cromático de pH como cubeta de referencia.
3. Pipetee 0,5 ml del indicador azul de bromotimol en la otra cubeta, mezcle y coloque la cubeta en el compartimento de la derecha.
4. Mientras sostiene el comparador sobre un fondo blanco y bien iluminado, gire el disco hasta que el color sea igual que el de la cubeta de la derecha.
5. Ajuste el pH de la solución amortiguadora en el matraz de Erlenmeyer mediante la adición de dos o tres gotas del líquido corrector que proceda: Na2HPO4 para alcalinizarla y KH2PO4 para acidificarla.
Remueva con una espátula limpia.
6. Repita los pasos 1 a 5 para volver a comprobar el pH de la solución
amortiguadora. Continúe hasta alcanzar el pH correcto de 7,2.
5. NOTAS SOBRE EL PROCEDIMIENTO
• Existen muchos tipos de medidores de pH. Se recomienda que el personal aprenda a utilizar los sistemas disponibles en sus laboratorios respectivos.
• Lo ideal es conservar la solución amortiguadora en un lugar fresco y resguardado de la luz solar directa. Se recomienda utilizar un frasco oscuro o un frasco de vidrio transparente envuelto en papel de estraza para prevenir la proliferación de bacterias, hongos o algas.
• Compruebe regularmente que la solución no está contaminada.
• No conserve la solución amortiguadora durante más de 7 días para evitar que el pH cambie y que la solución se contamine.
• Compruebe sistemáticamente el pH de la solución amortiguadora antes de usarla y anote el resultado en el libro de registro del control de la calidad.
6. CONTROL DE LA CALIDAD Y DOCUMENTACIÓN
Lleve a cabo una verificación de control de la calidad en cada lote de solución amortiguadora recién preparada y sistemáticamente antes de usarla, y anote el resultado en el libro de registro del control de la calidad. Véase el DMP-POE-03c: Control de la calidad de la solución madre de colorante de Giemsa y de la solución amortiguadora.
7. POE RELACIONADO
DMP-POE-03c: Control de la calidad de la solución madre de colorante de Giemsa y de la solución amortiguadora
8. REFERENCIA
Organización Mundial de la Salud. Bases del diagnóstico microscópico del paludismo. Parte I. Guía del alumno. Segunda edición. Ginebra; 2014.
9. DOCUMENT HISTORY
Fecha
(mmm/aaaa) Versión Observaciones Persona responsable (Nombre y apellido)
Ene 2016 1
Examinado y redactado en su versión definitiva por expertos, editado y
formateado
Glenda Gonzales, Funcionaria técnica,
