Facultad de Ciencias Veterinarias
-UNCPBA-
Identificación de Staphylococcus spp. y
evaluación de la producción de biofilm
Ibarguren Quesada Sofía; Juliarena, Marcela; Monteavaro Cristina
Marzo, 2019
Identificación de Staphylococcus spp. y evaluación de la
producción de biofilm
Tesis de la Carrera de Licenciatura en Tecnología de los Alimentos, presentada como parte de los requisitos para optar al título de grado de Licenciado del estudiante:
Sofía Ibarguren Quesada
Director: Dra. Cristina Monteavaro
Codirector: Dra. Marcela A. Juliarena
RESUMEN
Los biofilms son comunidades complejas de microorganismos que crecen
inmersos en una matriz orgánica polimérica extracelular, que les permiten
adherirse a superficies húmedas, vivas o inertes. Estas sustancias protegen a
los microorganismos de agentes antimicrobianos, evitan la deshidratación y
aumentan la viabilidad. La leche es una matriz con un alto contenido de materia
orgánica lo cual predispone a la formación de biofilms. Staphylococcus es el
género más frecuentemente aislado a partir de leche y se ha comprobado por
varios autores su capacidad de formación de biopelículas ya sea en el tejido
mamario como en los equipos e instalaciones donde se pasteuriza y procesa la
leche. Existen distintas metodologías para la determinación de la producción de
biofilm, como la prueba del Rojo Congo (cualitativa) y el método de la
microplaca (semicuantitativa). También existen pruebas genotípicas mediante
la detección de los genes involucrados tanto en la síntesis de la matriz
extracelular como en la síntesis de proteínas que intervienen en el proceso de
formación del biofilm. Como objetivo se propuso identificar 20 aislamientos de
leche bovina y determinar la capacidad de formación de biofilm mediante
pruebas fenotípicas y genotípicas. De los 20 aislamientos estudiados 4
resultaron no pertenecer al género Staphylococcus. Los resultados obtenidos
de la identificación fueron S. aureus, S. haemolyticus, S. sciuri, S.
chromogenes, S. pseudointermedius, S. caseolyticus y S. hyicus. Con respecto
a la producción de biofilm, 10 aislamientos fueron positivos y 6 negativos a la
prueba del Rojo Congo, mientras que en la prueba de microplaca todos fueron
positivos en diferentes grados. Además en seis de los aislamientos se
detectaron al menos a uno de los genes analizados. De acuerdo con nuestros
resultados y coincidente con la bibliografía el método de la microplaca es el
más sensible para analizar la producción de biofilm.
INDICE
INTRODUCCIÓN 1
MARCO TEORICO 2
Características de los biofilms 2
Descripción de la formación de biofilm 3
Biofilm estafilocóccico 7
Importancia de las biopelículas en la Industria Alimentaria 13
OBJETIVOS 17
Objetivo General 17
Objetivos Específicos 17
MATERIALES Y MÉTODOS 18
Población de estudio 18
Identificación bioquímica bacteriana 18
Determinación fenotípica de biofilm 19
• Rojo Congo modificado 19
• Método de microplaca 19
Identificación genotípica bacteriana 21
• Extracción de ADN 21
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 21
RESULTADOS 23
Identificación bioquímica y genotípica bacteriana 23
Determinación fenotípica de biofilm 24
Detección genotípica de genes de responsables de la adhesión
intercelular 26
DISCUSIÓN 28
CONCLUSIÓN 31
LISTA DE TABLAS:
Tabla 1. Regla de clasificación de cepas formadoras de biofilm. 20
Tabla 2. Características de los primers utilizados en este estudio. 22
Tabla 3. Resultados de las pruebas bioquímicas de los aislamientos. 24
Tabla 4. Resultados de la producción de biofilm y presencia
de los genes relacionados en los aislamientos de Staphylococcus spp. 25
LISTA DE FIGURAS:
Figura 1. Descripción de la formación de biofilm. 7
Figura 2.
A. Tinción de Gram.
B. Microfotografía.
C. Colonia de Staphylococcus aureus (hemolítica) en Agar Sangre. 9
Figura 3. Desarrollo de biopelículas estafilocócicas. 10
Figura 4. Componentes predominantes de la matriz de biofilm
estafilocócica. 13
Figura 5. Foto del producto de amplificación del gen 16S rRNA. 23
Figura 6. Placa de Rojo Congo modificado. 25
Figura 7. Desarrollo de biofilm de los aislamientos estudiados en
microplaca de poliestireno de fondo plano. 26
Figura 8. Foto de los productos de amplificación de los genes
1 INTRODUCCIÓN
Los biofilms o biopelículas son comunidades complejas de microorganismos
que crecen inmersos en una matriz orgánica polimérica extracelular, que les
permiten adherirse a superficies húmedas, vivas o inertes (Navia et al., 2010).
Las biopelículas que se encuentran en la naturaleza consisten en comunidades
de microorganismos primarios viables y no viables protegidos por sustancias
poliméricas extracelulares polianiónicas fijadas a la superficie. Estas
sustancias pueden contener polisacáridos, proteínas, fosfolípidos, ácidos
nucleicos, ácidos teicoicos y otras sustancias poliméricas hidratadas con un
porcentaje de agua entre 85 y 95% (Chmielewski y Frank, 2003). Sus
principales funciones son proteger a los microorganismos de la biopelícula de
los agentes antimicrobianos, evitar la deshidratación, reforzar la resistencia al
estrés ambiental y permitir a los microorganismos mantener una reserva de
nutrientes (Carpentier y Cerf, 1993).
Un problema latente es la formación tanto a nivel industrial como doméstico de
estas biopelículas. En la mayoría de los casos su crecimiento y formación es
perjudicial, causando corrosión, obstrucción de tuberías, fallas en los equipos y
deficiencia en la transmisión de calor (ej. intercambiadores de calor en los
pasteurizadores), lo que resulta un elevado costo de limpieza y mantenimiento.
Las esponjas húmedas utilizadas en la limpieza de las instalaciones ó utensilios
destinados a la preparación de alimentos, se consideran un ambiente propicio
para la formación de biofilm con microorganismos, tales como Staphylococcus
aureus, Salmonella enteritidis y Campylobacter jejuni entre otros (Navia et al.,
2 MARCO TEÓRICO
Características de los biofilms
Los biofilms son comunidades bacterianas que pueden estar conformadas por
una única especie o por múltiples especies microbianas englobadas en una
matriz de exopolisacáridos producida por las bacterias y adheridas a una
superficie viva o inerte (Lasa et al., 2005). En la naturaleza es la forma de
crecimiento más frecuente de las bacterias e incluso de la mayoría de los
patógenos. Este tipo de crecimiento permite la supervivencia de las bacterias
en un medio hostil y en algunos casos es el origen de varios procesos
infecciosos (Costerton et al., 1999). La presencia de biofilms es ubicua en la
naturaleza, convivimos cotidianamente con ellos, tanto que quizás sea
precisamente su ubicuidad la que les ha restado protagonismo (Uzcudun,
2004).
Este modo de crecimiento maximiza la obtención de nutrientes favoreciendo la
colonización, permitiendo la cooperación entre las bacterias por medio del
crecimiento en comunidad y beneficia a los microorganismos que lo forman,
pues, el biofilm confiere protección frente a los mecanismos de defensa del
hospedador y los protege de la acción de los agentes antimicrobianos
(Jefferson, 2004).
Aunque la composición de los biofilms es variable en función del sistema en
estudio, en general, el componente mayoritario es el agua, que puede
representar hasta un 97% del contenido total. Además de agua y de las células
bacterianas, la matriz del biofilm es un complejo formado principalmente por
exopolisacáridos secretados por las propias células que forman parte del
mismo. En menor cantidad se encuentran otras macromoléculas como
proteínas, ADN y productos diversos compuestos procedentes de lisis de las
bacterias (Uzcudun, 2004).
La formación de biofilms parece ser una estrategia adaptativa de supervivencia
bacteriana (Götz, 2002), ya que las células del interior del biofilm son más
resistentes a los factores ambientales desfavorables que sus homólogas
planctónicas. El crecimiento en biofilm ofrece importantes ventajas a las
3 • La matriz orgánica polimérica ofrece protección a los microorganismos ya que crea un microambiente en el que las condiciones ambientales
son más estables.
• Permite la supervivencia en nichos favorables, sin ser arrastrados de allí por el flujo de líquido.
• Facilita el aprovechamiento del agua, reduciendo la posibilidad de deshidratación.
• La matriz orgánica polimérica confiere resistencia frente a la acción de agentes adversos como los biocidas, anticuerpos y macrófagos.
• Incrementa la disponibilidad de nutrientes para su crecimiento.
• Se propicia por la cercanía las relaciones de comensalismo o cooperación entre organismos con aptitudes fisiológicas diferentes.
• Posibilita la transferencia de material genético (ADN), la proximidad favorece la transferencia horizontal de genes.
Debido a todos estos factores, los biofilms pueden tener graves consecuencias
en la industria alimentaria. Por ello, es preciso eliminar todos los
microorganismos de las superficies en contacto con los alimentos, antes de que
las contaminen y establezcan un biofilm que puede servir de reservorio de
microorganismos patógenos o alterantes (Piera, 2002).
Descripción de la formación de biofilm
El biofilm bacteriano empieza a formarse cuando alguna célula individual se
une inicialmente a una superficie. La capacidad de la célula para realizar
adherencia inicial depende de factores ambientales como la temperatura,
sustancias orgánicas y el pH, entre otros, y de factores genéticos que codifican
las funciones motrices, la sensibilidad ambiental, las adhesinas y otras
proteínas. Aunque la combinación de los factores que influyen en el desarrollo
del biofilm dependen en principio de la especie, algunas características son
comunes a la mayoría de bacterias estudiadas hasta ahora (Costerton et al.,
1999).
La formación de un biofilm, no es un proceso aleatorio sino que sigue una
4
adsorción reversible de la bacteria a la superficie, una unión irreversible, una
primera fase de maduración con crecimiento y división, la segunda fase de
producción del exopolímero, y el desarrollo final de la colonia con dispersión de
células colonizadoras (Figura 1).
Acondicionamiento de la superficie: El biofilm puede desarrollarse sobre casi
cualquier tipo de superficie, gracias a que previamente entra en contacto la
materia orgánica presente en el agua. En la interfase agua/superficie se
deposita una capa orgánica, que cambia las propiedades químicas y físicas de
la superficie y mejora las posibilidades de fijación de las bacterias (Piera,
2002).
La capacidad de unirse a diversos plásticos, cristales y metales aún el acero
inoxidable, depende de las proteínas específicas de su cubierta y de los
apéndices motrices. La acción del aire o de la humedad sobre el acero
inoxidable, poco a poco crea una capa de óxido de cromo sobre el que se pega
la materia orgánica y así se pre-acondiciona el sustrato para la adhesión de las
bacterias (Piera, 2002).
Adsorción y Fijación: La adhesión de los microorganismos a un sustrato puede
ser activa (por los flagelos, pili, adhesinas, cápsulas y cargas de superficie) o
pasiva (por gravedad, difusión y dinámica de fluidos). Las bacterias libres que
encuentran la superficie acondicionada, forman con ella una unión reversible
que depende de las cargas eléctricas de la bacteria. Son atracciones de tipo
electrostático o hidrófobicas y fuerzas de Van der Waals, sin unión química. Si
esta unión se mantiene suficiente tiempo, aparecen nuevas estructuras
químicas y físicas que la harán permanente (Piera, 2002).
En casos de gran densidad de población o ante la precariedad de nutrientes
que hay en el agua potable, algunos microorganismos son capaces de
responder individualmente con una alteración de su pared celular para hacerla
hidrófoba y, por lo tanto, con más afinidad hacia las superficies (Mayette,
1992). Cuando llegan a la capa base, más próxima a la pared de la tubería y
casi sin flujo de agua, son atraídos por la superficie y se produce la unión.
Durante la etapa de unión reversible las células bacterianas aún muestran
5
de limpieza. La unión “irreversible” significa el anclaje de apéndices bacterianos
y la producción de exopolímeros. La acción mecánica necesaria para eliminar
será mayor cuanto más tiempo lleve activo el biofilm (Piera, 2002).
Para adaptarse a la vida del biofilm, las bacterias sufren variaciones radicales.
El cambio del medio donde se encuentran activa diferentes genes que codifican
nuevas proteínas estructurales y enzimas. Estos genes y proteínas son los que
explican la fijación y la resistencia de las bacterias incluidas en las biopelículas
ante los antibióticos o los desinfectantes. Se han podido identificar 800
proteínas que cambian de concentración a lo largo de las cinco fases de
desarrollo. Así mismo se dan las condiciones para que se produzca el
intercambio de material genético (Singh et al., 2002).
Maduración: Las condiciones de estabilidad presentes en este ambiente,
favorecen el crecimiento y la división de las células y permite iniciar la
fabricación de una mezcla de polímeros polianiónicos, limosa y pegajosa, que
se excreta al exterior y mantiene unidas las bacterias entre ellas y con la
superficie (Piera, 2002).
La composición del exopolímero es poco conocida, pero consta de
polisacáridos o glicoproteínas de diversos azúcares, como glucosa, fructosa,
manosa, N- acetilglucosamina y otros. También puede contener proteínas
libres, fosfolípidos, ácidos nucleicos o ácidos teicoicos. Su estructura, a partir
de grupos de polisacáridos neutros o portadores de cargas eléctricas, actúa
como un sistema de intercambio iónico para atrapar y concentrar los nutrientes
que encuentren (Chmielewski y Frank, 2003).
En un biofilm maduro, la mayor parte de su volumen está ocupado por la matriz
laxamente organizada (75-95%) alrededor de unas pocas bacterias (5-25%),
que proporciona una cubierta gelatinosa y deslizante a la superficie colonizada,
con un considerable volumen de agua disponible (Piera, 2002).
Cooperación entre especies: Al cabo de pocos días de la primera colonización,
otros microorganismos quedan atrapados en la biopelícula por captación física
y atracción electrostática. Hongos o bacterias sin movilidad propia serán
6
producir sus propios residuos que serán aprovechados por otros
microorganismos (Piera, 2002).
Desde el biofilm más simple, como puede ser una colonia bacteriana en agar
nutritivo, al más complejo, la comunidad metabólica coopera de una manera
compleja. Las diferentes especies viven en un nicho mínimo, especializado y
hecho a medida. Si una especie genera residuos tóxicos, otra los eliminará. Así
se consigue coordinar los recursos bioquímicos de todos los habitantes del
biofilm; se reúnen las diferentes enzimas de los que disponen numerosas
especies de bacterias para abastecerse de aportes nutritivos que ninguna
especie sola podría digerir. También servirán para responder a la acción de
diversos biocidas (Piera, 2002).
Crecimiento y dispersión: La colonia, en división continua, libera
periódicamente unas pocas células que se repartirán corriente abajo. La
formación de nuevos biofilm a partir de estas células se ve favorecida porque
desde el biofilm original se liberan residuos y nutrientes que prepararan la
nueva superficie con la cubierta orgánica de acondicionamiento y sirve para
alimentar las bacterias. Esta colonización está relacionada con la evolución y la
supervivencia de la bacteria a largo plazo (Mayette, 1992).
El nivel de estrés ambiental y la transición entre entornos diferentes son unos
de los factores principales que influyen en esta liberación celular. Las
condiciones del flujo hídrico son uno de los principales factores. Si se,
establece un equilibrio entre el crecimiento de la colonia y el movimiento del
agua se liberan pocas células del biofilm mientras que si el flujo es intenso o
turbulento aumenta la liberación de células e incluso pueden desprenderse
7 Figura 1. Descripción de la formación de biofilm (obtenida en: http://sedici.unlp.edu.ar).
Biofilm estafilocóccico
En el mismo momento en que se acaba la limpieza de un depósito o en una
conducción de agua, empieza a desarrollarse el biofilm. Si ponemos un cristal
limpio y estéril en una corriente de agua que contenga nutrientes mínimos, al
cabo de un tiempo variable se habrá formado un ecosistema microbiano que
establecerá complejas relaciones individuales y se trasformará en una masa de
polisacáridos producida extracelularmente por los mismos pobladores (Biofilm
Online Manual, 1998).
La capacidad de formación de biofilm no parece estar restringida a ningún
grupo específico de microorganismos y hoy se considera que bajo condiciones
ambientales adecuadas todos los microorganismos son capaces de formar
biofilms (Lasa et al., 2005).
En la producción láctea argentina uno de los contaminantes más frecuentes de
8
causante de mastitis de mayor prevalencia en la mayoría de los tambos de las
cuencas lecheras nacionales y/o es parte de la microbiota normal de la la piel
de la ubre de la vaca (Bonetto, 2014).
El género Staphylococcus tiene morfología de cocos gram positivos agrupados
en racimos, catalasa positivos, aerobios anaerobios facultativos, inmóviles,
oxidan y fermentan la glucosa, toleran hasta un 10% de cloruro de sodio
(halófilos), son mesófilos, velogénicos y las colonias son lisas, redondas,
cremosas, ligeramente convexas de 1 a 4 mm de diámetro (Figura 2).
Este género Staphylococcus comprende 42 especies, las cuales pueden
subdividirse en dos grandes grupos de acuerdo con la producción de
coagulasa. La mayoría de estas especies son coagulasa negativa, con
excepción de Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius,
Staphylococcus pseudointermedius que son estafilococos coagulasa positiva
(ECP) y Staphylococcus hyicus que es coagulasa variable; éstas han sido
aisladas de mastitis, aunque hace falta más información acerca de la
prevalencia e incidencia de cada especie. Los estafilococos coagulasa
negativos (ECN) que se aíslan con mayor frecuencia comprenden
Staphylococcus simulans, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus warneri y
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus
chromogenes, Staphylococcus cohnii y Staphylococcus haemolyticus que son
parte de la microbiota de la piel de los pezones y usualmente pueden ocasionar
9
A B C
Figura 2.
A. Tinción de Gram. Cocos gram positivo, agrupados en racimos
irregulares (1000X).
B. Microfotografía, tomada con un microscopio electrónico de barrido. Se
observa morfología de coco, carencia de flagelo y asociación en racimo.
C. Colonia de Staphylococcus aureus (hemolítica) en Agar Sangre.
(Obtenidas en:
http://microbitosblog.com/2011/08/03/staphylococcus-aureus-epidermidis-saprophyticus/).
S. aureus presenta diferentes factores de virulencia como: proteína A, cápsula,
enzimas extracelulares como la coagulasa, leucocidina, hemolisina, la
capacidad de formar biopelículas y además pueden presentar genes de
resistencia a los antibióticos (Roberson et al., 1996). Alimentos contaminados
con la enterotoxina estafilocócica secretada por S. aureus puede afectar al
hombre produciendo diversos síntomas como náuseas, vómitos, diarrea,
malestar y debilidad. Raramente la enfermedad es mortal, pero puede
complicarse, presentándose a veces deshidratación y shock (Anmat, 2013).
La habilidad de Staphylococcus spp. de formar biofilm in vivo se considera uno
de los principales factores de virulencia en su patogénesis de la mastitis,
favoreciendo la colonización del tejido mamario y su resistencia a los agentes
antimicrobianos (Arslan y Özkardes, 2007). Las vías regulatorias para la
formación de biofilm varían entre las cepas (Melchior et al., 2006), por lo que
resulta interesante saber si las diferencias de expresión resultante entre
aislamientos se pueden atribuir a diferentes genotipos (Peña y Uffo, 2013).
Además, los estafilococos también pueden adherirse directamente a superficies
10
varias moléculas estafilocócicas específicas también se han implicado en la
unión a la superficie. Estas incluyen la autolisina principal de S. epidermidis
(AtlE) y su homólogo de S. aureus (Atl) y los ácidos teicoicos de la pared
(WTA) en S. aureus (Bose et al., 2012).
Figura 3. Desarrollo de biopelículas estafilocócicas. La unión de las células a una superficie (en el caso de las biopelículas unidas a la superficie) se produce
a través de interacciones hidrofóbicas en una superficie abiótica o a través de
proteínas de superficie que se unen de manera específica a las proteínas de la
matriz del huésped. El crecimiento de la biopelícula en la etapa de proliferación/
maduración se acompaña de la producción de componentes de la matriz
adhesión intercelular (como PIA, eDNA y proteínas), así como factores
perturbadores (como PSM y enzimas secretadas degradativas). (Extraída de
Otto, 2018).
Durante la segunda etapa del desarrollo de la biopelícula, etapa de
proliferación y maduración de la matriz, las microcolonias que se han formado
después del acoplamiento crecen por proliferación y las células secretan
moléculas poliméricas para formar la matriz de biofilm (Figura 3). Los polímeros
de matriz de biopelículas tienen una naturaleza química divergente e incluyen
polisacáridos, proteínas y ácidos teicoicos. Además de esas moléculas
11
células muertas contribuyen a la matriz del biofilm, principalmente el ADN que
se libera de las células muertas (ADN extracelular (eDNA)) (Otto, 2018).
Los estafilococos producen un exopolisacárido llamado polisacárido de
adhesión intercelular (PIA), un homopolímero de N-acetilglucosamina unido por enlaces β-1-6 (Figura 4). Este polisacárido presenta un carácter catiónico
debido a la eliminación, catalizada por enzimas, de ∼15 a 20% de los grupos N-acetilo después de la secreción. Esta característica puede ser importante
para la interacción electrostática con otros polímeros de superficie y, por lo
tanto, para la formación de la matriz de biopelícula extracelular pegajosa (Mack
et al,. 1996; Vuong et al., 2004). No parece haber un "anclaje" específico para
PIA en la superficie de la célula, y se ha demostrado directamente que esta
función no se cumple con los ácidos teicoicos de la pared (Vergara et al., 2008). La biosíntesis de PIA se realiza mediante las proteínas codificadas por el locus
del gen ica (adhesión intercelular), que comprende los genes icaA, icaD, icaB e
icaC (Figura 4). Los genes icaA e icaD codifican enzimas N-acetilglucosamina
transferasa, que sintetizan PIA. La sola expresión de icaA induce una baja
actividad enzimática, pero la coexpresión de icaA e icaD lleva a un incremento
significativo en la actividad enzimática y se relaciona con la expresión
fenotípica del polisacárido capsular (Arciola et al., 2002). El crecimiento de la
cadena depende de la presencia de IcaC, una proteína de membrana que se
supone que es el exportador de PIA. Además, la enzima IcaB, que se
encuentra en la superficie bacteriana, es la desacetilasa de PIA. La
desacetilación es crucial para la retención de PIA en la superficie y las diversas
funciones que cumple PIA en la fisiología estafilocócica, que además de la
formación de biofilm comprende una mayor resistencia a los péptidos
antimicrobianos (AMP) y la fagocitosis de neutrófilos (Vuong et al., 2004).
Por delante del operón ica se encuentra el gen icaR, que se transcribe en la
dirección opuesta al operón icaADBC. icaR es un represor del operón ica.
Varios estudios han demostrado que la formación de biopelículas in vitro o in
vivo se puede lograr mediante aislamientos de S. epidermidis o S. aureus que
no albergan el locus ica, aunque la extensión, estructuración y robustez de las
biopelículas PIA-negativas parece ser más bajo que las formadas por PIA, al
12
aislamientos de S. aureus, la formación de biopelículas parece ser
predominantemente dependiente de proteínas. Estudios anteriores informaron
diferencias entre aislamientos resistentes y sensibles a la meticilina al respecto,
mientras que un estudio más reciente se indica que tanto los aislamientos de S.
aureus resistentes a la meticilina como los sensibles, forman biofilms casi
exclusivamente dependientes de proteínas (Pozzi et al., 2012; Loughran et al.,
2014). En contraste, S. epidermidis requiere de PIA para formar biopelículas,
con una contribución adicional mediada por proteínas (Rohde et al., 2007).
Distintas proteínas de la superficie también se han implicado en la adhesión
intercelular, pero en muchos de esos casos es difícil distinguir entre una unión
superficie / tejido y una función de adhesión intercelular genuina. Estas
proteínas contienen muchas proteínas de unión a la superficie de la familia
MSCRAMM (microbial surface components recognising adhesive matrix
molecules) además de la proteína asociada al biofilm (Bap), que se encuentra
en los aislamientos de mastitis de S. aureus, de los cuales un homólogo (Bhp)
está presente en S. epidermidis (Cuccarella et al., 2001). En apoyo de una
participación específica en la formación de matrices, se ha informado
recientemente que Bap se ensambla en matrices amiloideas para promover el
13 Figura 4. Componentes predominantes de la matriz de biofilm estafilocócica. El exopolisacárido PIA (izquierda), producido por muchos aislamientos de S.
aureus y S. epidermidis, es un homopolímero de N-acetilglucosamina unidos por enlaces β-1-6. Este exopolisacárido se sintetiza en la célula por la actividad
combinada de las enzimas de membrana IcaA e IcaD y es probable que se
exporte por IcaC. La enzima IcaB unida a la superficie extracelular elimina un
cierto porcentaje (∼15 a 20%) de restos N-acetilo, lo que le da a la molécula PIA neutral una carga neta positiva, anclando el PIA a la superficie celular
cargada negativamente. Además del locus icaADBC, también está presente un
gen regulador, icaR (extraída de Otto, 2018).
La característica más notable del gen bap es la presencia de una extensa
región de repetición, en la que las repeticiones son idénticas incluso a nivel de
nucleótidos. Aunque no se ha establecido la función biológica de las
repeticiones, es posible especular que esta región podría servir para proyectar
la parte amino terminal de la proteína desde la superficie celular y promover la
interacción con las superficies abióticas, los componentes de la célula
hospedadora u otras bacterias (Cuccarella et al., 2001)
El gen bap se ha encontrado en cepas de S. aureus, S. epidermidis, S.
chromogenes, S. xylosus, S. simulans y S. hyicus aisladas de glándulas
14 Importancia de las biopelículas en la Industria Alimentaria
El interés actual de la industria alimentaria por los biofilms, que se forman en
las superficies de los equipos de elaboración de los alimentos, está relacionado
con la posibilidad de que se produzca la transferencia de los microorganismos
desde la superficie de los equipos al alimento que entra en contacto con ella,
con el consiguiente riesgo, ya sea por el deterioro del producto o para la salud
pública (San José y Orgáz, 2010).
El principal problema sanitario de los biofilms en la Industria Alimentaria es que,
al resistir muchos de los tratamientos de limpieza y desinfección
convencionales, los microorganismos alojados pueden hacerse persistentes en
la planta y comportarse como reservorios de patógenos, que en algún
momento pueden transferirse al alimento, antes, durante o después del
procesado (Moretro y Langsrud, 2004).
Puesto que estas formaciones pueden contener microorganismos patógenos y
presentar una mayor resistencia a la desinfección, se incrementan las
probabilidades de contaminación del producto y de provocar infecciones
alimentarias, razón por la que se considera que la presencia de biofilms en las
superficies de contacto de la industria alimentaria constituye un evidente riesgo
para la salud. La presencia de biofilms en estas superficies es la causa
principal de contaminación del producto final. Las consecuencias de esta
contaminación pueden conducir a pérdidas económicas debidas tanto al
necesario rechazo del producto como, incluso, al desarrollo de enfermedades,
si intervienen microorganismos patógenos (Piera, 2002).
Además del riesgo de contaminación, el desarrollo de biofilms puede interferir
en diferentes procesos y causar daños en los equipos. En sistemas de agua
potable el crecimiento de biopelículas pueden obstruir las cañerías
disminuyendo su velocidad y su capacidad de transporte originando un
incremento en el consumo energético. La formación de biofilm en
intercambiadores de calor y torres de refrigeración puede reducir la
transferencia de calor y como consecuencia su eficiencia en el proceso.
15
debido a la producción de ácido por parte de las bacterias (Chmielewski y
Frank, 2003).
En la industria láctea se emplean los sistemas de ultrafiltración y de ósmosis
inversa durante el fraccionamiento de la leche. Estos filtros y membranas
tienen poros de diámetro muy pequeño y están continuamente en contacto con
el alimento; la más mínima adsorción microbiana bloquearía los poros y
provocaría la saturación del filtro. Esto produciría una reducción del flujo con
las consiguientes pérdidas de rendimiento y de producto (Piera, 2002).
Otro aspecto importante en la industria láctea es la formación de depósitos en
intercambiadores de calor, problema que causa la reducción de la eficiencia y
el aumento de la caída de presión, afectando la economía de las plantas de
procesamiento. Como resultado de la formación de estos depósitos existe la
posibilidad del deterioro en la calidad del producto por que el fluido no se pude
calentar a la temperatura requerida y a que los depósitos desalojados por el
flujo del fluido pueden causar contaminación (Navia et al., 2010). Al ser la leche
un fluido biológico complejo, las respuestas térmicas de sus constituyentes
difieren uno del otro, pudiéndose clasificar los depósitos en dos tipos. El tipo A,
corresponde a proteína y se llevan a cabo a temperaturas entre 75 -110°C.
Estos depósitos son blancos, suaves y esponjosos y su composición es de 50-
70% de proteínas, 30-40% de minerales y 4-8% de grasa. Los depósitos tipo B,
corresponden a minerales y se presentan a temperaturas superiores a 110°C.
Estos depósitos son duros de color gris, y su composición es de 70-80% de
minerales, 15-20% de proteínas y 4-8% de grasa (Bansal y Chen, 2006). La
formación de estos depósitos promueve la adhesión de microorganismos a la
superficie de la transferencia de calor, formándose una bioincrustación. La
presencia de microorganismos en el flujo del proceso y/o en la capa de
depósitos no solo afecta la calidad del producto, sino que también tiene
influencia en el proceso (Yoo et al., 2006).
La presencia de los biofilms están llevando a una revisión general de las
normas higiénicas en la industria alimentaria y, dentro de los sistemas de
16
y ajustados a los detalles de operación, diseño y status de mantenimiento de
17 OBJETIVOS
Objetivo General
Caracterizar Staphylococcus aislados de leche bovina provenientes de vacas
con mastitis e identificar y analizar la producción de biofilm.
Objetivos Específicos
• Identificar mediante pruebas fenotípicas los aislamientos de Staphylococcus spp. obtenidos a partir de leche bovina provenientes de vacas con mastitis.
• Identificar genotípicamente aislamientos de Staphylococcus spp. obtenidos a partir de leche bovina provenientes de vacas con mastitis, mediante el uso
del ARNr 16s (específico para género Staphylococcus spp.).
• Determinar fenotípicamente la capacidad para producir biofilm en las cepas de Staphylococcus previamente aisladas, mediante la prueba del Rojo
Congo y de la microplaca.
• Detectar los genes involucrados en la producción de biofilm: bap, icaA e icaD.
• Comparar la presencia de los genes icaA, icaD y bap con los resultados obtenidos de las pruebas de Rojo Congo y microplaca realizadas para
18 MATERIALES Y MÉTODOS
Población de estudio
Se trabajó, durante los meses de septiembre y octubre de 2018 con 20 cepas
previamente aisladas provenientes de leche bovina de diez tambos
procedentes de la Cuenca Mar y Sierra. Todas estas cepas fueron aisladas en
el Laboratorio de Microbiología, FCV-UNCPBA. Las mismas eran causantes de
mastitis en los animales de los cuales se extrajeron las muestras.
También se empleó una cepa conocida productora de biofilm como control
positivo y una cepa no productora de biofilm como control negativo.
Identificación bioquímica bacteriana
Se realizaron pruebas bioquímicas siguiendo la tabla de identificación de Cowan and Steel’s (Barrow y Felthan, 1993).
A partir de aislamientos criopreservados a -20°C se reactivaron en placas de
Agar Sangre, incubadas 24 h a 37°C. A partir de las colonias obtenidas se
realizó extendido y coloración de Gram. A continuación se realizaron los
cultivos puros en Agar triptosoya (ATS). A partir de este cultivo puro se realizó
la prueba de catalasa, y las siembras en diferentes medios para las siguientes
pruebas metabólicas:
• Oxidación y fermentación de la glucosa • Hemólisis
• Coagulasa
• Voges Proskauer
• ADNasa
• Fructuosa
• Manitol
• Lactosa
• Ureasa
19 Determinación fenotípica de biofilm
Inoculo: Se sembró una anzada de cada aislamiento en caldo Tripteína Soya suplementado con 1% de glucosa (CTSg) y se incubaron a 35ºC durante toda
la noche. A partir de los caldos se procedió a realizar la determinación
fenotípica de la formación de biofilm.
• Rojo Congo modificado
Se utilizó un medio de cultivo sólido que contiene por cada litro: 36 g de Agar
infusión cerebro corazón, 0,8 g de Rojo Congo, 50 g de sacarosa, 1,5% de
cloruro de sodio y 2% de glucosa. Luego de sembrar las placas mediante
estriado, las mismas se incubaron durante 24 h a 37ºC en aerobiosis, en donde
se realizó una primera lectura de los resultados. Luego de esto, se dejaron las
placas por 24 h más a temperatura ambiente y se realizó una segunda lectura.
Las colonias productoras de biofilm, son aquellas que muestran rugosidad y
coloración negra, mientras que las colonias no productoras de biofilm son de
aspecto liso y coloración roja (Rachid et al., 2000).
• Método de microplaca
A partir de los caldos sembrados de cada aislamiento, se realizaron diluciones
en proporción 1:100 de cada cepa con CTS glucosado al 1%. Las diluciones
fueron sembradas por triplicado en microplacas de 96 pocillos de poliestireno
de fondo plano. Se utilizaron 6 pocillos en cada microplaca como control
negativo, los mismos contenían CTS con glucosa al 1% sin inocular. Se
incubaron las microplacas a 35ºC durante 24 h. Luego, se midió el crecimiento
de las cepas en la microplaca, sin agitación previa para garantizar la integridad
de las biopelículas en un lector de ELISA a una longitud de onda de 570 nm. El
contenido de los pocillos se descartó en un contenedor con lavandina diluida al
10%.
Se realizaron tres lavados con solución buffer PBS pH 7,2 a temperatura
ambiente, agregando por lavado, 200μl en cada pocillo, con el fin de remover
las bacterias planctónicas. Se tuvo en cuenta el pipetear con cuidado para no
comprometer la integridad del biofilm y el vaciado se realizó con un movimiento
20
La fijación del biofilm, se realizó agregando 150 μl metanol en cada pocillo. Se
lo dejó actuar durante 20 minutos. Las placas se vaciaron con un movimiento
rápido y se dejaron secar a temperatura ambiente, en posición invertida
durante toda la noche.
La capa adherida de biofilm, se tiñó con Cristal Violeta utilizado para la tinción
de Gram (cristal violeta al 2%), agregando en cada pocillo 150 μl dejándolo
actuar por 15 minutos. Luego de pasado este tiempo, se lavó con agua de la
canilla hasta observar que no queden restos de colorante y se dejó secar a
temperatura ambiente.
Antes de la lectura, se realizó una elución con 150 μl de alcohol-acetona en
proporción 80:20, para que la medición sea homogénea. Se dejó actuar por al
menos 30 minutos con la tapa para evitar evaporación. Por último se midió a
densidad óptica (DO) con un lector de ELISA a 570 nm.
Con los datos obtenidos se realizaron los cálculos necesarios para clasificar las
cepas de acuerdo a su capacidad de formar biofilm. El valor de corte por DO
(DOc) se definió como el valor de la media del blanco más tres desviaciones
estándar (DE), esto se realiza con el fin de corregir las densidades ópticas de
las cepas eliminando lo correspondiente al colorante absorbido por el medio y
la superficie y de este modo conocer lo que realmente corresponde a la
formación del biofilm de cada cepa (Stepanovic et al., 2007).
Una vez obtenida la DO se corrigieron las DO promedio de cada cepa
obteniendo una DO ajustada (DOa) que sirvió para la clasificación de las cepas
según la formación de biofilm que hayan presentado de acuerdo a lo reflejado
en la tabla 1.
Tabla 1. Regla de clasificación de cepas formadoras de biofilm.
No productoras de biofilm DOa ≤ DOc
Débiles productoras de biofilm DOc < DOa ≤ 2xDOc
Productoras moderadas de biofilm 2xDOc< DOa ≤ 4xDOc
Fuerte productora de biofilm DOa ≥ 4xDOc.
21 Identificación genotípica bacteriana
• Extracción de ADN
La extracción del ADN cromosómico de los aislamientos seleccionados e
realizó según el protocolo descripto en Thiran et al. (2018) con pequeñas
modificaciones. Colonias de cultivos bacterianos de 24-48 h en Agar Sangre se resuspendieron en 100 μl de Solución buffer Tris-EDTA pH 8 y se incubaron a
95ºC durante 10 minutos. Luego se centrifugaron a 14000 rpm por 5 minutos y
el sobrenadante se conservó a -20ºC.
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La identificación molecular del género Staphylococcus se realizó por detección
del gen 16S rRNA mediante la técnica de PCR descripta en Ciftci et al. (2009).
Para la detección genotípica de dos genes responsables de la adhesión
intercelular icaA e icaD se realizó una PCR específica también descripta en
Ciftci et al. (2009). Todas las reacciones de PCR fueron realizadas en un volumen final de 15 μl. Los primers utilizados y la longitud del segmento
amplificado se detallan en la tabla 2. Los productos de PCR se observaron
mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5% teñidos con sybr safe.
La detección del gen bap se realizó por PCR específica descripta por Cucarella
et al. (2004) con las modificaciones realizadas por Vautor et al. (2008). Los
primers utilizados se describen en la tabla 2. Los productos de PCR se
observaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% teñidos con sybr
22 Tabla 2. Características de los primers utilizados en este estudio.
Primers Secuencia 5´ 3´ Amplicón Referencia
ARNr 16S F
ARNr 16S R
AACTCTGTTATTAGGGAAGAACA
CCACCTTCTCCGGTTTGTCACC
756 bp Ciftci et al., 2009
icaA F
icaA R
CCTAACTAACGAAAGGTAG
AAGATATAGCGATAAGTGC
1315 bp Ciftci et al., 2009
icaD F
icaD R
AAACGTAAGAGAGGTGG
GGCAATATGATCAAGATA
381 bp Ciftci et al., 2009
bap F
bap R
CCCTATATCGAAGGTGTAGAATTGCAC
GCTGTTGAAGTTAATACTGTACCTGC
23 RESULTADOS
Identificación bioquímica y genotípica bacteriana
A partir de los resultados obtenidos de las pruebas Oxidación y fermentación
de la glucosa realizados a los 20 aislamientos en estudio, se identificaron 16
cepas que pertenecían al género Staphylococcus spp. Estos resultados fueron
confirmados por análisis genético del gen 16S rRNA (Figura 5). En cuanto a la
tinción de Gram, todas las cepas observadas fueron gram positivas, agrupadas
en racimos (características propias del género). En la tabla 3 se muestran los
resultados de las pruebas bioquímicas realizadas y la identificación de las
especies de Staphylococcus.
Figura 5. Foto del producto de amplificación del gen 16S rRNA corrido en gel de agarosa al 1,5% y teñido con syber safe. El segmento amplificado tiene una
longitud de 756 pb. Calle 1: marcador de PM de 1 Kb (15 bandas: 100 pb, 200
bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 700 bp, 1000 bp, 1500 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000
bp, 5000 bp, 6000 bp, 8000 bp, 10000 bp). Calle 2: control negativo (agua).
Calle 3: control positivo. Calle 4: control negativo. Calle 5-8, 10-13, 15-16:
muestras positivas. Calle 9 y 14: muestras negativas
24 Tabla 3. Resultados de las pruebas bioquímicas de los aislamientos.
Cepa Hem Coag. Man Fruct
. V
P
DNAs
a
Lact. Sac Red.
Nit.
Urea Identif.
A1 NH + - + + + + + - - S. pseudointermedius
A2 β + + + + + + + + + S. aureus
A3 NH - - + - - + + + + S. chromogenes
A4 NH - - + - + + - - - S. caseolyticus
A5 β + + + + + + + + + S. aureus
A6 NH + + + + + + + + + S. aureus
A7 NH + - + + - + + + + S. pseudointermedius
A8 β - + - - - - + + + S. haemolyticus
A9 NH - - + - + + + + + S. hyicus
A10 NH - - + + - + - + - S. haemolyticus
A11 β + + + + + + + + + S. aureus
A12 NH - + + - - + + + - S. sciuri
A13 NH + + + + + + + + + S. aureus
25
Referencias: Hem, hemólisis; Coag.: coagulasa; Man., manitol; Fruct.,
fructuosa; VP, acetoina; Lact. , lactosa; Sac., sacarosa; Red. Nit. , reducción de nitratos a nitritos; NH, no hemolítico; β, beta hemolítico
Determinación fenotípica de biofilm
A través del ensayo de Rojo Congo se determinó que 10 cepas resultaron
positivas para la formación de biofilm (62,5%), presentando rugosidad y
coloración negra, mientras que 6 cepas resultaron negativas (37,5%) ya que
presentaron color rojo y aspecto liso (Figura 6). En la tabla 4 se muestran los
resultados de las dos técnicas utilizadas.
A15 β + + + + + + + + + S. aureus
26 Figura 6. Placa de Rojo Congo
modificado. A modo ilustrativo se muestra una placa realizada
en el laboratorio.
Tabla 4. Resultados de la producción de biofilm y presencia de los genes relacionados en los aislamientos de Staphylococcus spp.
Referencias: RC, Rojo Congo; M, Moderado; D, Débil; F, Fuerte Cepa
Produccion de biofilm Presencia de gen
Identificación Rojo
Congo
Microplaca icaA icaD bap
A1 + M + + - S. pseudointermedius
A2 + M + + - S. aureus
A3 - F - - - S. chromogenes
A4 - F - - - S. caseolyticus
A5 + M + + - S. aureus
A6 + M - - - S. aureus
A7 + M - + - S. pseudointermedius
A8 - F - + - S. haemolyticus
A9 - F - - - S. hyicus
A10 - F - + - S. haemolyticus
A11 + M - - - S. aureus
A12 - F - - - S. sciuri
A13 + M - - - S. aureus
A14 + F - - - S. caseolyticus
A15 + M - - - S. aureus
A16 + D - - - S. aureus
Cepa positiva
27
A partir del análisis de las densidades ópticas en la prueba de microplaca
(Figura 7) y de la aplicación de la fórmula de Stepanovick et al. (2007) los
resultados obtenidos fueron:
• No productoras de biofilm: ninguna cepa. • Débiles productoras de biofilm: 1 cepa (6,25%). • Moderadas productoras de biofilm: 8 cepas (50,0%). • Fuertes productoras de biofilm: 7 cepas (43,75%).
Figura 7. Desarrollo de
biofilm de los aislamientos
estudiados en Microplaca
de poliestireno de fondo
plano.
Detección genotípica de genes de responsables de la adhesión intercelular
De las 16 cepas estafilocócicas analizadas se encontró la presencia del gen
icaA en 3 cepas y del gen icaD en 6 cepas (Tabla 4, Figura 8). Dos cepas
identificadas como S. aureus y una de las cepas de S. pseudointermedius
presentaban ambos genes icaA e icaD. Las cepas que sólo presentaban el gen
icaD fueron identificadas como S. haemolyticus (2) y S. pseudointermedius (1).
28 Figura 8. Foto de los productos de amplificación de los genes icaA e icaD corridos en gel de agarosa al 1,5% y teñido con syber safe. Los segmentos
amplificados tienen una longitud de 1315 pb (icaA) y 381 pb (icaD). Se observa
bandeado inespecífico Calle 1: marcador de PM de 1 Kb (15 bandas: 100 pb,
200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 700 bp, 1000 bp, 1500 bp, 2000 bp, 3000 bp,
4000 bp, 5000 bp, 6000 bp, 8000 bp, 10000 bp). Calle 2: control negativo
(agua). Calle 3-4: muestras positivas icaA. Calle 5-6: muestras negativas Calle
7: muestra positiva icaA e icaD. Calle 8: control positivo. Calle 9: control
negativo. Nota: Se observa bandeado inespecífico en algunas muestras a 158
bp.
29 DISCUSIÓN
El biofilm es definido como una comunidad de células microbianas asociadas
en una matriz extracelular principalmente de polisacáridos. La importancia del
biofilm es reconocido tanto en contextos médicos, ambientales e industriales.
En las últimas décadas se han descripto que la mayoría de los
microorganismos (bacterianos y fúngicos) presentan la capacidad de producir
biofilm, ya sea para iniciar un proceso patológico ó aumentar su viabilidad en el
medio ambiente. A nivel industrial son un problema económico-sanitario debido
a que pueden colonizar superficies inertes y afectar los procesos de
elaboración de productos alimentarios. Varios mecanismos de producción de
biofilm están siendo estudiados. La producción de biofilm no sólo depende de
la presencia de genes involucrados en la codificación de las sustancias
extracelulares sino que también depende de factores ambientales como
superficies disponibles, presencia de material orgánico, corriente de efluídos o
de gases, etc. (Piera, 2002; Navia et al., 2010; Tellez, 2010;).
En la producción primaria láctea, una de las principales patologías que causa
grandes pérdidas económicas es la mastitis clínica y subclínica. Esta infección
intramamaria usualmente contamina la leche ordeñada, especialmente de
vacas con mastitis subclínica. De acuerdo a varios estudios realizados en la
República Argentina, los microorganismos más prevalentes pertenecen al
género Staphylococcus (Calvinho, 2005; Larriestra, 2013). Desde hace varios
años, en el laboratorio de Microbiología, FCV-UNCPBA, se está trabajando en
la identificación y caracterización de Staphylococcus presentes en muestras de
leche provenientes de vacas con mastitis de la región de la Cuenca Mar y
Sierra.
En este estudio la mayoría de las cepas fueron identificadas como
Staphylococcus aureus (43,75%), microorganismo descripto como más
prevalente en los tambos argentinos (Calvinho y Tirante, 2005). Además se
encontró otro estafilococo coagulasa positiva, S. pseudointermedius (12,5%); y
S. hyicus que es coagulasa variable (6,25%).
También se aislaron los siguientes estafilococos coagulasa negativos S. sciuri
30
(12,5%); que como describió Bonetto (2014) usualmente pueden ocasionar
formas subclínicas de mastitis, a excepción de S. caseolyticus.
Uno de los mecanismos de acción patógena de Staphylococcus es la
adherencia mediante la producción de biofilm. Se han descripto distintos
métodos para analizar la producción de biofilm. Los dos más utilizados son el
método en placa de Rojo Congo (cualitativo), en el cual se detecta la
producción de polisacáridos extracelulares, y el método de microplaca
(semicuantitativo), en el cual se analiza en forma estática la producción de
biofilm por adherencia a la placa de poliestireno. Coincidentemente con lo
descripto en la bibliografía (Kord et al., 2018), en este estudio se detectaron
menos cepas positivas a la producción de biofilm por el método de Rojo Congo
que por el método de la microplaca.
Varios genes han sido asociados a los mecanismos de producción de biofilm.
En el género Staphylococcus se han identificado como más importantes los
genes del operon ica y por otro lado se ha detectado el gen bap, especialmente
en muestras aisladas de glándulas mamarias bovinas (Götz, 2002; Potter et al.
2009).
De las 16 cepas de Staphylococcus aisladas detectamos la presencia de los
genes icaA e icaD simultáneamente en 3 cepas: S. aureus (2/7) y en una de las
dos cepas de S. pseudointermedius. Por otro lado detectamos sólo la presencia
del gen icaD en 3 cepas: S. pseudointermedius y en las dos cepas de S.
haemolyticus aisladas. En ninguna de las cepas aisladas detectamos el gen
bap. Pinheiro et al. (2016) hallaron también cepas de S. haemolyticus con sólo
la presencia del gen icaD.
Los resultados obtenidos aportan importante información sobre las
características de las cepas presentes en nuestra región. Cabe mencionar que
los diferentes métodos utilizados son herramientas adecuadas y disponibles en
nuestra institución.
Si analizamos los tres métodos estudiados y teniendo en cuenta las
características del proceso de formación del biofilm, podemos relacionar que el
31
análisis genético detecta la presencia de genes pero no su expresión.
Finalmente el método de la microplaca está diseñado utilizando placas para
cultivos celulares, de modo que provee la superficie adecuada para la
adherencia de células, primer paso necesario en la formación de las
biopelículas.
Este trabajo forma parte de un proyecto de investigación enfocado en detectar
con celeridad y certeza los factores de virulencia presentes en las cepas de
Staphylococcus. Estas cepas representan un grave problema debido a que
afectan tanto a nivel de la salud pública como de la salud animal. Por otro lado,
la presencia de biopelículas en la industria láctea es un problema que impacta
en términos de tecnología, que ocasiona pérdidas económicas y por lo tanto se
deben establecer estrategias eficientes de control con respecto a la prevención
32 CONCLUSIÓN
• La metodología utilizada para la identificación nos permitió determinar
las especies de Staphylococcus presentes en las muestras de leche
procesadas.
• De las técnicas aplicadas para analizar la producción de biofilm, el método de la microplaca es el más sensible aunque es el más lento para
la obtención de resultados y permite semicuantificar.
• Este método es factible de realizar en un laboratorio de mediana y baja complejidad.
• Los otros dos métodos se pueden utilizar como screning.
• Según los resultados obtenidos, tanto fenótipicos como génotípicos para la formación de biofilm, se puede concluir que aunque algunas cepas
carezcan de todos los genes estudiados (icaA, icaD y bap), tienen el
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