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RESUMEN de la Tesis de la Ocean. Maria de Lourdes Trujillo Valle presentada como requisito parcial para la obtenciédn del grado de MAESTRO EN CIENCIAS en OCEANOLOGIA con opcién en ECOLOGIA MARINA. Ensenada, Baja California, México. Septiembre de 1992.
EVALUACION DE DOS SISTEMAS PARA LA PRODUCCION MASIVA DE MICROALGAS, EMPLEANDO UN MEDIO DE CULTIVO ARTIFICIAL.
Resumen aprobado por:
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Dr. Domenico Voltolina Director de Tesis
Se estudio la factibilidad de cultivar masivamente la microalga Chaetoceros sp. empleando agua de mar artificial, enriquecida con fertilizantes de uso agricola y con productos para uso veterinario, en condiciones climaticas aproximadamente equivalentes a las prevalecientes en la zona donde se pretendia llevar a cabo cultivos de esta microalga para fines comerciales. También se disefiaron dos modelos de sistema de cultivo paraevaluar eventuales diferencias de produccién y reconocer los problemas relacionados con la utilizaci6n de uno wu otro de los dos sistemas. Finalmente, se estudiéd la posibilidad de reutilizar el medio de cultivo, después de la cosecha de la biomasa, para bajar costos de produccién.
Pe QI EER LAI MEZ IES AE NZ Oe SUE Bee et ee Be EE eZ PPI Ue ey VY Ae ee Y APROBADAPORELSIGUIENTE COMITE:
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DR. DOMENICO VOLTOLINA LOBINA.- Director del Comité
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DR. L FERNANDO BUCKLE RAMIREZ.- Miembro del Comité
M.C. GILBERTO GAXIOLA CASTRO.- Miembro del Comité
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DRA. DIANA TENTORI SANTA CRUZ.- Miembro del doypité
DR. ERIC MELLINK
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DR. LUIS EDUKBpo°CALDERON AGUILERA.- Director de Estudios de Posgrado
e dgDepartament de Ecologia Marina
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CENTRO DE INVESTIGACION CIENTIFICA Y DE EDUCACION SUPERIOR DE ENSENADA.
DIVISION DE OCEANOLOGIA. DEPARTAMENTO DE ECOLOGIA.
EVALUACION DE DOS SISTEMAS PARA LA PRODUCCION MASIVA DE MICROALGAS, EMPLEANDO UN MEDIO DE CULTIVO ARTIFICIAL.
TESIS
que para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado
de MAESTRO EN CIENCIAS presenta:
Ocean. MARIA DE LOURDES TRUJILLO VALLE.
AGRADECIMIENTOS
A mi director de tesis, Dr. Domenico Voltolina, deseo expresarle mi mayor reconocimiento por todo su gran apoyo, conocimientos, dedicacién y entusiasmo brindados para el desarrollo del presente trabajo.
A los miembros de mi comité de tesis, Dra. Diana Tentori Santacruz, Dr. Luis Fernando Bickle Ramirez y M. en C. Gilberto Gaxiola Castro, por sus observaciones, sugerencias y constante apoyo para el mejoramiento de esta tesis.
Al Ing. Benito Canales Lopez de la Compafiia Palau-Bioquim, S.A. de C.V. su interés y por haber financiado el presente trabajo y mi estancia en Saltillo, Coahuila. A la familia Canales Farias y Sra. Carmelita Rumeyor por su hospitalidad y amistad.
Al Lic. Miguel A. Galvan C. y al Ing. Juan F. Fonseca Plazola, de la Compafia Fertilizantes Mexicanos, S.A. de C.V. por su amabilidad al haber facilitado los productos quimicos de su empresa y la informacién sobre sus caracteristicas. Al Ing. Jests Ortega Pérez de la Comisi6én Estatal de Servicios Ptblicos de Ensenada, por haber proporcionado informaciones sobre la calidad del agua de la ciudad de Ensenada y por su interés en este trabajo.
Al Bidl. Norberto Flores Acevedo, por su ayuda técnica para la construccién de los sistemas ensayados; al Téc. Francisco Valenzuela Buriel y al Oc. Eduardo Morales Guerrero por el apoyo recibido.
A la Cand. Dr. Roxana Rico Mora por su ayuda periddica en el laboratorio y por sus criticas y observaciones al manuscrito.
Ala M. en C. Blanca Claudia Farfan, Jefe del Departamento de Acuicultura, por apoyar de una u otra manera este trabajo y por los divertidos momentos compartidos.
A las secretarias del Departamento, Ma. Elena Corona y Karla Lopez por su atenta colaboracion.
A mis compafieros de generacién, especialmente al M. en C. Miguel Angel del Rio Portilla por su amistad e invaluable ayuda durante el andalisis estadistico. A los Oceandlogos: Norma Valle, Alma Giles, Alma Edith, Susana Alvarez, Ernesto Torres, Paty Hinojosa, Ana Tovar y Emilio Palacios por su bella amistad; a Irma M. por las interminables vueltas a los edificios del CICESE.
A mis padres:
Elvira Valle, por tu decidido apoyo y confianza, con particular admiracion por tu excepcional fortaleza de espiritu y por ser una gran mujer.
Efrain Trujillo, con el carifio de siempre.
A Moni Valle Diaz y Sara Gémez Miranda, por su invaluable amistad.
Al Dr. Domenico Voltolina, por su constante ayuda desinteresada, apoyo académico, moral y econémico; por todas sus finas atenciones y exquisita cocina.
II CONTENIDO INTRODUCCION. I.1 1.2 Antecedentes. Objetivos.
MATERIALES Y METODOS. II.1 II.2 II.3 II.4 II.5 .IT.6 II.7 II.8 IT.9.
Ensayos de crecimiento y evaluaciédn de biomasa. Agua de mar artificial.
Medios de cultivo. Analisis de nutrientes.
Ensayos con Phaeodactylum tricornutum. Sistemas de cultivo masivo.
II.6.1. Sistema de laberinto. II.6.2. Sistema de cascadas. Sistemas de cosecha.
Preparacién de los inéculos.
TI.8.1. Produccién de inéculo primario. II.8.2. Produccién de inéculo masivo.
11.8.3. Inoculacién de los sistemas de cascada y laberinto.
Tratamiento estadistico. III RESULTADOS.
III.1. Agua de mar artificial.
III.1.1. Composici6én de los ingredientes basicos. III.1.2. Ensayos con diferentes formulaciones. III.1.3. Evaluacién y seleccién.
III.2. Medio de cultivo simplificado.
III.2.1. Nutrientes en el agua de ciudad. TII.2.2. Selecci6n del medio.
III.3. Phaeodactylum tricornutum. III.3.1. III.3.2. ITI.4. Ensayos III.5. Ensayos III.6. Cultivos TII.6.1. ITI.6.2. III.6.3. TIT.6.4. TII.6.5. III.6.6. III.6.7. IV. DISCUSION.
IV.1. Agua de
Ensayos de laboratorio. Cultivos masivos.
de termotolerancia.
de halotolerancia.
masivos con Chaetoceros sp.
Masivo 1: 18 al 22 de Diciembre, 1990 (Figs. 14A.a y 14A.b; Tabla XXI). Masivo 2: 31 Diciembre 1990 al 18 de Enero, 1991 (Figs. 14A.c y 14A.d; Tabla
XXII).
Masivo 3: 4 al 23 de Marzo, 1991 (Figs. 14A.e y 14A.£; Tabla XXIII).
TII.6.3.1. Cultivos.
TII.6.3.2. Forma de crecimiento.
Masivo 4: 11 al 21 de Mayo, 1991 (Figs. 14B.a y 14B.b; Tabla XXV).
Masivo 5: 18 de Junio al 9 de Julio, 1991 (Figs. 14B.c y 14B.d; Tabla XXVI).
TII.6.5.1. Cultivos.
III.6.5.2. Forma de crecimiento.
Otros ensayos de cultivo masivo. Agosto-Septiembre, 1991.
Ensayos de cosecha.
mar artificial y medio de cultivo.
CONTENIDO (Continuacién)
IV.2. Evaluacién de los sistemas de cultivo masivo.
IV.3. Caracteristicas de tolerancia de Chaetoceros sp.
IV.4. Reutilizacién del medio.
V CONCLUSIONES.
LITERATURA CITADA.
lll 113 114
115
Figura
6A.
6B.
LISTA DE FIGURAS
Curva de calibraciédn para CH-X-1 con el fluorimetro Turner modelo 111. Se indican los intervalos de confianza (P < 0.01 y P < 0.05), la ecuacién de regresién empleada para calcular el nimero de células (Y), la cantidad de datos usados en ésta misma (n) y el coeficiente de determinacién
(r2).
Curva de calibraci6én para CH-X-l1 empleando el espectrofotémetro Hach modelo DR-EL/4. Se indican los intervalos de confianza (P < 0.01 y P < 0.05), la ecuacién de regresi6dn empleada para calcular el nimero de células (Y), la cantidad de datos usados en ésta misma (n) y el coeficiente de determinacién (r?2).
Curva de calibracién para CH-X-1 para el espectrofotémetro Milton Roy modelo Spectronic Mini20. Se indican los intervalos de confianza (P < 0.01 y P < 0.05), la ecuaci6n de regresi6dn empleada para calcular el nimero de células (Y), la cantidad de datos usados en ésta misma (n) y el coeficiente de determinacién (r2).
Sistema de cultivo en laberinto. A: vista de planta. Las flechas indican el sentido de bombeo; los asteriscos, los puntos de aireacioén. B: vista lateral. Se indican algunas de las laminas separadoras; las flechas indican la direccién del flujo.
Sistema de cultivo en cascadas. Las flechas indican la direccién del flujo, los asteriscos la ubicacién de los puntos de aireacién.
Curvas de crecimiento de los ensayos para la formulacién del agua de mar artificial. a: ensayo 1, AMN; b: ensayo 2,
AMA.1; c: ensayo 3, AMA.2; d: ensayo 4, AMA.3; e: ensayo
5, AMA.4; £: ensayo 6, AMA.5 (10% AMN). Método de evaluacién de biomasa: recuentos con hematocitémetro.
Curvas de crecimiento de los ensayos en que se empleé el 10% (a) y 1% (b) de agua de mar natural. Método de evaluaci6n de biomasa: recuentos con hematocitémetro.
19
19
35
Figura 6C. 7A. 7B. 7C. 10.
LISTA DE FIGURAS (Continuacién)
Curvas de crecimiento de los ensayos de formulacién de agua de mar artificial. a: ensayo 7, AMA.6; b: ensayo 7', AMA.6; c: ensayo 8, AMA.7; d: ensayo 9, AMA.8; e: ensayo 10, AMA.9. Método de evaluaci6n de biomasa: fluorimetria "in vivo”.
Curvas de crecimiento de los ensayos con agua de mar artificial y fertilizantes 2ESW. a: ensayo 1, AMA.6+2ESW; a': ensayo 1', AMA.6+2ESW; b: ensayo 2, AMA.8+2ESW; c: ensayo 3, AMA.7+2ESW. Método de evaluacién de biomasa: fluorimetria "in vivo".
Curvas de crecimiento de los ensayos con agua de mar artificial AMA.7 y fertilizantes agricolas. a: ensayo 4, AMA.7+Fert.1; b: ensayo 5, AMA.7+Fert.1+Fe-EDTA; c: ensayo 6, AMA.7+Fert.X; c': ensayo 6', AMA.7+Fert.X; d: ensayo 7, AMA.7+Fert.Y; d': ensayo 7', AMA.7+Fert.Y. Método de evaluacién de biomasa: fluorimetria "in vivo".
Curvas de crecimiento de los ensayos con agua de mar artificial AMA.7 y fertilizantes agricolas. a: ensayo 8, AMA.7+Fert.2; a’: ensayo 8', AMA.7+Fert.2; b: ensayo 9, AMA.7+Fert.Z; b': ensayo 9', AMA.7+Fert.Z. Método de evaluacién de biomasa: fluorimetria "in vivo”.
Curvas de crecimiento de los ensayos de formulacién de agua de mar artificial con Phaoedactylum tricornutum. a: ensayo 7P, AMA.6; a’: ensayo 7P', AMA.6; b: ensayo 8P, AMA.7; c: ensayo 9P, AMA.8; d: ensayo 10P, AMA.9. Método de evaluacién de biomasa: fluorimetria "in vivo".
Curvas de crecimiento de los ensayos con agua de mar artificial y fertilizantes 2ESW con Phaoedactylum tricornutum. a: ensayo 1P, AMA.6+2ESW; b: ensayo 2P, AMA.8+2ESW; c: ensayo 3P, AMA.7+2ESW. Método de evaluacién de biomasa: fluorimetria "in vivo".
Figura 11. 12A. 12B. 13A. 13B. 13¢. 14A. 14B.
LISTA DE FIGURAS (Continuacién)
Curvas de crecimiento de los ensayos de termotolerancia sometidos a ciclos de temperaturas. a: ensayo 1, ciclos 5-18°C; a’: ensayo 2, ciclos 5-18°C; b: ensayos con ciclos de 26-35-26-21°C (con cambio cada 6 horas, nétese la diferente escala de tiempo [horas]). Método de evaluacién de biomasa: Spectronic Mini20.
Curvas de crecimiento a diferentes temperaturas. a: ensayo 3, 15°C; a’: ensayo 4, 15°C; b: ensayo 5, 18°C; b': ensayo 6, 18°C. c: ensayo 7, 25°C; d: ensayo 8, 30°C. Método de evaluacién de biomasa: Spectronic Mini20.
Curvas de crecimiento de los ensayos de termotolerancia. a: ensayo 9, 35°C; b: ensayo 10, 40°C. Método de evaluaci6n de biomasa: Spectronic Mini20.
Curvas de crecimiento de los ensayos de halotolerancia. a: ensayo 1, 50/00; a': ensayo 2, 50/00; b: ensayo 3, 100/00; b’: ensayo 4, 100/00; b"": ensayo 5, 100/00; b'"": ensayo 6, 100/00. Método de evaluacién de biomasa: Spectronic Mini20.
Curvas de crecimiento de los ensayos de halotolerancia. a: ensayo 7, 150/00; a’: ensayo 8, 150/00; b: ensayo 9, 200/00; b': ensayo 10, 200/00. Método de evaluacién de biomasa: Spectronic Mini20.
Curvas de crecimiento de los ensayos de halotolerancia. a: ensayo 11, 300/00; a': ensayo 12, 300/00; a"': ensayo 13, 300/oo; a'"’: ensayo 14, 300/00. Método de evaluacién de biomasa: Spectronic Mini20.
Curvas de crecimiento de los cultivos masivos hechos en los sistemas de Cascadas y Laberinto. a: Masivo 1: Diciembre 1990; b: Masivo 1: Diciembre 1990; c: Masivo 2: Enero 1991; d: Masivo 2: Enero 199]; e: Masivo 3: Marzo 1991; £: Masivo 3: Marzo 1991. Método de evaluaci6én de biomasa: Hach DR-EL/4.
Curvas de crecimiento de los cultivos masivos hechos en los sistemas de Cascadas y Laberinto. a: Masivo 4: Mayo 1991; b: Masivo 4: Mayo 1991; c: Masivo 5: Junio-Julio 1991; d: Masivo 5: Junio-Julio 1991. Método de evaluacién de biomasa: Hach DR-EL/4.
Tabla II TI IV VI VII VIII VITI VIII IX
LISTA DE TABLAS
Concentraciones de los nutrientes empleados para la formulacién de medios (A: grado analitico; TT: grado técnico; F: fertilizantes; H: Hemofer 200).
Caracteristicas de las aguas de las ciudades de Saltillo y de Ensenada.
Caracteristicas quimicas de la sal de salina de Tampico, Tamaulipas (en gramos/100 g).
Composicién quimica de la dolomita.
Ensayos de crecimiento con agua de mar natural (Ensayo 1) y con diferentes formulaciones de agua de marartificial. Se indican los valores promedio de la concentracién celular, su desviaci6n estandar y el valor de w (divisiones/dia) calculado con los promedios de la concentracién celular. Los ensayos 6' y 6" no tuvieron repeticiones y por esto no se reportan valores de desviacién estandar.
Continuacién. Continuacién.
Resultados del andlisis estadistico de los ensayos con agua de mar artificial.
Prueba a posteriori de los ensayos con agua de mar artificial.
Ensayos de crecimiento utilizando el medio simplificado con diferentes formulaciones de agua de mar artificial. Se indican los valores promedio de la concentracién celular, su desviacién estandar y el valor de pw (divisiones/dia) calculado con los promedios de la concentracién celular. Continuacidén.
Continuacion.
Resultados del andalisis estadistico de los ensayos con medios simplificados.
Prueba a posteriori de los ensayos con medios simplificados.
Tabla XI XII XITI XIITa XIV XV XV XVI XVII XVIII
LISTA DE TABLAS (Continuacién)
Ensayos de crecimiento con la especie Phaeodactylum tricornutum con diferentes formulaciones de agua de mar artificial y distintas combinaciones de nutrientes. Biomasa medida como fluorescencia "in vivo", sin transformaci6n a namero de células.
Datos de crecimiento de Phaeodactylum tricornutum en los ensayos de cultivo masivo.
Ensayos de termotolerancia de Chaetoceros sp. a ciclos de temperatura. Los datos de concentracién celular se refieren a recuentos con hematocit6metro en muestras combinadas con las tres réplicas, por la consistencia de las lecturas de su densidad dptica. Por este motivo no se reportan valores de desviacién estandar.
Ensayos de termotolerancia de Chaetoceros sp. sometidos a diferentes ciclos de temperatura, cada 6 horas. Se indican los valores promedio de la concentraci6n celular, su desviacién estandar y el valor de wu (divisiones/dia) calculado con los promedios de su densidad déptica.
Datos de temperatura atmosférica de la ciudad de Saltillo. Afios 1941-1970. Fuente: Secretaria de Agricultura y Recursos Hidraulicos. Sin fecha.
Ensayos de termotolerancia de Chaetoceros sp. a temperaturas entre 15 y 40°C. Los datos de concentracié6n celular se refieren a recuentos con hematocitémetro en muestras combinadas con las tres réplicas, por la consistencia de las lecturas de su densidad dptica. Por este motivo no se reportan valores de desviaci6én estandar.
Continuacién.
Resultados del andalisis estadistico de los ensayos de termotolerancia.
Prueba a posteriori de los ensayos de termotolerancia.
Tabla XVIII XVIII XIX XX XXI XXII XXTIT XXTV XXV XXVI XXVIT XXVITI XXIX
LISTA DE TABLAS (Continuacién)
Continuacién.
Continuacidén.
Resultados del andalisis estadistico de los ensayos de halotolerancia.
Prueba a posteriori de los ensayos de halotolerancia. Cultivos masivos, Diciembre 1990. Muestras tomadas después de mezclar mecAanicamente el cultivo. (C/M a.m.: con mezcla, a las 7 a.m.).
Cultivos masivos, Enero 1991. Muestras tomadas a las 7 a.m. antes de mezclar mecanicamente el cultivo (S/M a.m.) y después de mezclarlo mecanicamente (C/M a.m.).
Cultivos masivos, Marzo 1991. Muestras tomadas después de mezclar mecanicamente el cultivo a las 7 a.m. (C/M a.m.) y 7 p.m. (C/M p.m.).
Cultivos masivos, Marzo 1991. Nimero de células/ml y tasas de crecimiento (divisiones en 24 horas) a distancia de 12 horas, durante la fase exponencial.
Cultivos masivos, Mayo 1991. Muestras tomadas después de mezclar mecdnicamente el cultivo a las 7 a.m. (C/M a.m.).
Cultivos masivos, Junio-Julio 1991. Muestras tomadas después de mezclar mecanicamente el cultivo a las 7 a.m. (C/M a.m.) y 7 p.m. (C/M p.m.)
Cultivos masivos, Julio 1991. NGmero de células/ml y tasas de crecimiento (divisiones en 24 horas) a distancia de 12 horas, durante la fase exponencial.
Biomasa de Chaetoceros sp. cosechada durante los ensayos de cultivo masivo de Mayo a Julio de 1991. Datos expresados en gramos de peso seco por 50 litros. Para transformar los datos a peso himedo, multiplicar los pesos secos por 4.0.
Cultivos de Chaetoceros sp. diluidos con medio liberado del 30% (a) y 50 % (b) de la biomasa, filtrando a través de malla Nitex de 10 uu
Tabla
XXX
" XXXTI
XXXIT
XXXTITT
Cultivos de Chaetoceros sp. diluidos con medio liberado del 30% (a) y 50 % (b) de la biomasa, centrifugando a
20,000 r.p.m.
Concentraci6én de iones mayores del agua de marartificial (g/l) y en agua de mar natural (recalculada por una salinidad de 30°/9. de los datos reportados en Burton, 1980). La ©= fuera de paréntesis se refiere al agua de la ciudad de Saltillo, la = en paréntesis se refiere al agua de Ensenada. NA: No analizado.
Comparacién de costos para la preparacién de 10,0001 de medio de cultivo (en U.S. $), utilizando las mezclas comerciales mas baratas en el mercado. Para la sal de salina no refinada, que no se comercializa, se empled el costo por saco de la sal que se ocupa en suavizadores de agua de ciudad. La dolomita es un producto de desecho de varias industrias (cementera, agroquimica, minera, etc.) y se le asigné un costo simbélico de 1 délar/500 g. Concentraci6én déptima al punto de cosecha, tiempo de generaci6én en ese punto, % de cosecha y cosecha diaria por sistema de 200 litros. Los datos de peso seco por 10° células se tomaron de Ldépez Elias (1990). Los datos de Mayo (*) se estimaron a partir de los datos de densidad del inéculo inicial, cinco dias antes del inicio del experimento y de los datos de densidad dptica del dia anterior.
107
110
EVALUACION DE DOS SISTEMAS PARA LA PRODUCCION MASIVA DE MICROALGAS, EMPLEANDO UN MEDIO DE CULTIVO ARTIFICIAL.
I. INTRODUCCION.
El uso de las algas para el acondicionamiento de suelos agricolas tiene una larga historia. En Europa y Asia se emplearon tradicionalmente macroalgas como fuente de sustancia organica, para la renovacién de nutrientes y de elementos esenciales (Metting et al., 1990). También se ha documentado bien la utilizaci6n de microalgas para la misma finalidad, sobre todo aprovechando la habilidad de varias cianoficeas de fijar nitrégeno atmosférico. Esta ultima practica es tan exitosa, que en la actualidad existen en la India varios laboratorios gubernamentales que distribuyen microalgas a los agricultores para sembrarlas en los arrozales, con considerables incrementos en la produccién y con ahorros de fertilizantes de hasta el 25%. (Roger et al., 1985; Venkataraman, 1986).
Otro aspecto importante de considerar en las actividades agricolas, son los problemas causados porlas bacterias y los hongos patégenos que proliferan en el suelo. Las multiples investigaciones hechas con cultivos de microalgas han mostrado que algunas especies poseen actividades antibacteriales (Kogure, et al., 1979). Por informacién bibliografica, se sabe también que algunos extractos de algas verdes y de dinoflagelados tienen funciones antifungales (Sharma et al., 1966; Halvorsen et al., 1984). En particular, Gauthier (1969) encontré6 que el extracto de Asterionella notata Grunow inhibe el crecimiento
de algunos hongos como Candida albicans, Penicillium sp. y Aspergillus sp. y Pesando et al. (1979) reportaron cinco especies de diatomeas que tienen una actividad significativa contra hongos patégenos, tres de las cuales pertenecen al género Chaetoceros (Ch. lauderi Ralfs; Ch. pseudocurvisetum Mangin y Ch. sociale Lauder). Se puso un especial interés en Ch. lauderi cuya actividad antibacteriana ya habia sido demostrada por Aubert y Gauthier (1966) y Aubert y Gambarotta (1972) y se encontré que la concentracién minima inhibitoria del extracto de esta diatomea, que se determiné con los hongos Microsporum gypseum y Sporothrix schenckii, fue del é6rden de 150-200 ug, que es comparable con los productos antifungales clasicos. Se concluyé que la sustancia antibacterial, que es un polisacarido de alto peso molecular, también es responsable de la actividad antifungal del extracto de la diatomea. Las microalgas producidas en cultivo pueden ser empleadas para
3 1988; Kawaguchi, 1980; Richmond, 1986a; Soong, 1980; Soeder, 1980; Soeder, 1986). El aislamiento e identificacién de productos biolégicamente activos, como el identificado en Chaetoceros lauderi, podria ampliar todavia mas el campo de utilizaci6n de las microalgas.
La fase mas delicada para obtener microalgas masivamente, y poder destinarlas a las actividades mencionadas anteriormente, es el disefio del sistema de produccién, que tiene que ser adecuado a las caracteristicas del organismo que se quiere cultivar, a la climatologia de la regiédn y a los
recursos locales.
I.1 Antecedentes.
En 1989 se proporcioné a la Compafiia "Palau-Bioquim", S.A. de C.V., de Saltillo, Coahuila, una pequefia cantidad de un cultivo de la diatomea marina Chaetoceros sp. (referencia C.1.C.E.S.E.: CH-X-1) que fue aislada en el Laboratorio de Microalgas del Departamento de Acuicultura por Trujillo-Valle (Voltolina et al., 1991) y que actualmente se esta empleando en varios proyectos de investigacion.
"Palau-Bioguim" opinéd que, debido a los pequefios voliimenes de cultivo empleado (1 ml de cultivo por cada 5,000 cm? de suelo tratado), el fenémeno podria deberse a la accién de las enzimas responsables del metabolismo del silicio de esta diatomea sobre la fraccién silicea del suelo arcilloso, transformandola en un producto amorfo y aumentando de esta forma la porosidad del suelo (Canales-Lépez, 1989).
En otros ensayos con la misma microalga también se noté que ésta aparentemente tiene una accién fungicida sobre el hongo Phymatotrychum
omnivorum, que causa la enfermedad conocida por los agricultores como "pudrici6én texana”" (Ing. Agrénomo Victor Pefia, Univ. Auton. Agr. A. Narro, com. pers.).
Las observaciones anteriores han interesado a la Compafiia "Palau-Bioguim", que pidid la colaboracién del Departamento de Acuicultura del C.I.C.E.S.E. para disefiar y ensayar un sistema de produccién masiva de la diatomea Chaetoceros sp., que por motivos logisticos la misma Compafia deseaba ubicar, de ser posible, en sus instalaciones de Saltillo, Coahuila.
Considerando que Saltillo se ubica dentro de una zona arida y muy alejada de regiones costeras, para cultivar esta especie de microalga marina es necesario emplear un medio basado en agua de mar artificial, utilizando para su enriquecimiento los materiales disponibles en ese lugar, adaptarla a
este medio y probar su cultivo en las condiciones climatolégicas a las que ‘se va a ver sometido el cultivo a través del ajfio.
5 comerciales, se requeria un estudio detallado de los factores que hubieran podido elevar los costos de producci6n, como por ejemplo la composicién del agua de mar, las fuentes de nutrientes y los limites de tolerancia térmica de Chaetoceros sp., de los cuales dependen la posibilidad de operar el sistema de cultivo a cielo abierto o la necesidad de mantenerlos en invernaderos, con control de la temperatura.
Debido a todo lo anterior, el presente trabajo tiene varios objetivos especificos, que se detallan a continuacidn.
1.2 Objetivos.
El objetivo general del proyecto es el disefio de un sistema de produccién masiva a pequefia escala de una microalga plancténica marina, para la eventual comercializaci6n de la biomasa producida, empleando agua de mar artificial. Para su logro, se plantearon los siguientes objetivos especificos:
a) Disefiar, ensayar y seleccionar un medio de cultivo basado en agua de mar artificial y fertilizantes agricolas.
d) Estudiar la posibilidad de reutilizar el medio de cultivo después de cosechar
II. MATERIALES Y METODOS.
II.1 Ensayos de crecimiento y evaluacién de biomasa.
Todas las pruebas de crecimiento para definir la formulacién del agua de mar artificial, la del medio de cultivo, los limites de termotolerancia y de halotolerancia asi como los ensayos de reutilizacién del medio de cultivo se hicieron por triplicado, en matraces Erlenmeyer de 125 ml con 100 ml de medio.
El crecimiento se midi6 con varias técnicas, todas descritas en Voltolina et al. (1989), segiin la disponibilidad instrumental: en los ensayos llevados a cabo en la ciudad de Saltillo (Figs. 6A y 6C) y para los ilustrados en las figuras 7B y 7C, se hicieron recuentos directos del nimero de células por mililitro con un hematocitémetro de 0.1 mm de profundidad, con rejilla de Neubauer.
Para los demas ensayos de crecimiento en diferentes formulaciones de agua de mar artificial y en medios simplificados, la biomasa se midi6 con un fluorimetro marca Turner modelo 111.
Para medir la concentracién celular en los ensayos de termotolerancia, halotolerancia y de cosecha que se llevaron a cabo en el laboratorio, se empleé un espectrofot6émetro marca Milton Roy modelo Spectronic Mini20 a una longitud de onda de 605 nm.
Las longitudes de onda a emplearse con los dos. diferentes espectrofotémetros se determinaron experimentalmente con la técnica descrita en Sorokin (1973) y todas las lecturas hechas con el fluorimetro y con los espectrofotémetros Hach DR-EL/4 y Spectronic Mini20 se transformaron en los valores equivalentes de concentraci6n celular empleando las curvas de calibraci6n correspondientes (Figuras 1, 2 y 3 respectivamente).
En estas figuras se puede notar que con el espectrofotémetro Hach los datos resultaron mayormente dispersos y que el porcentaje de la varianza de Y¥ explicado (r2) es notablemente inferior que con los otros dos instrumentos. Esto no es el reflejo de la inferior calidad de ese instrumento, dado que lecturas sucesivas de una misma muestra resultaron en general muy semejantes, con una variabilidad de + 1% o inferior, para los tres instrumentos. Se piensa mas bien que el amplio intervalo de valores de concentracién celular posible para un mismo valor de densidad dptica (y viceversa) se deba en parte al mayor camino éptico del Hach (2.5 cm comparadoe con 1 cm del Spectronic Mini20) y a la turbidez variable de los cultivos masivos, resultante del crecimiento bacteriano y de la formacién de cantidades variables de particulas de diferentes dimensiones, todo ello aparentemente relacionado con la variabilidad de la temperatura de estos cultivos.
Y=1073(X) - 20957
"|
9
co a bry type tip tig peor
0
3s 6
9, (12
FLUORESCENCIA (x10 )
Figura 1, Curva de calibracion para CH-X-1 con el fluorimetro Turner modelo 111. Se indican los
intervalos de confianza (P ( 0.01 y P ¢ 0.05), la ecuacién de regresién empleada para calcular el numero de células (Y), la cantidad de datos usados en ésta misma (n) y el coeficiente de determinacion (r2),20F' T T T T T 7 7 T T T TT TTT 7 T uy T TS
, Y= -44934(X)+4370534 |
no I6E o~y 0.05 = 89
-SUPE 20.014 e~
Me
1
“126
q
e OF ]
~ BF q
Bae
obi
1
65 105
DENSIDAD OPTICA
Figura 2. Curva de calibracién para CH-X-1 empleando el espectrofotdmetro Hach modelo DR-EL/4. Se indican los intervalos de confianza (P ( 0.01 y P ¢ 0.05), la ecuacién de regresién empleada para calcular el nimero de células (Y), la cantidad de datos usados en ésta misma (n) y el coeficiente de determinacidn (r2).
ek TT
L teen
Y: 30019 (X) -55 936
wo 12 SS 0.01 . 4
oO L n:-65 ]
2 OF
‘
< 6F
:
~o 3 a
°
0.05
~
0 l 1 L L L L Il I foam x L
55 SSS
85. +95
05
DENSIDAD OPTICA
compararon los valores de las tasas de crecimiento ( ) en la fase exponencial, ya que tasas diferentes indican la superioridad o la inferioridad de una o mas condiciones.
Para el calculo, se empleé la férmula: Nt = No kvt
donde:
Nt = ntimero de células al tiempo t No = ntmero inicial de células k = constante
u = tasa de crecimiento
t = intervalo de tiempo (t - to)
que se resuelve para wu de la forma siguiente:
= (log, Nt - log, No) / t
11
En el contexto presentado, solamente se estan considerando cambios positivos (aumentos) de la poblacién, dado que la tasa de crecimiento es la variable que mas se utiliza en el campo de la microalgologia para tomar decisiones sobre las condiciones mas apropiadas para la producci6n de microalgas. Por otro lado, hay que tomar en consideracién que la tasa real de crecimiento de una poblacién depende de dos factores, o sea de la tasa de natalidad (N) y de la tasa de mortalidad (D) segtin la férmula w = N - D, por lo cual es posible concebir que yw pueda tener un valor negativo, cuando disminuye la densidad de la poblacién bajo estudio. En el presente trabajo se emplean los términos tasa de crecimiento, tiempo de divisi6n o de generacién, tasa de mortalidad y otros términos afines, solamente en relacién con el valor positivo o negativo de la tasa de crecimiento (wu), sin que ésto implique un conocimiento directo de las tasas reales de natalidad y de mortalidad.
II.2 Agua de mar artificial.
Se decidi6 iniciar los ensayos con agua de salinidad cercana a la del laboratorio de Acuicultura del C.I.C.E.S.E., que se mantiene en general entre
30 y 32°/o0.
Ya que al inicio de este trabajo no se contaba con datos sobre las caracteristicas quimicas de aguas y sal, las variaciones a esta formulaci6n basica se hicieron suponiendo una dureza insignificante de las aguas de ciudad y una composicién del 100% de cloruro de sodio para la sal de salina. Las caracteristicas quimicas de aguas y sal asi como las modificaciones a la formulaci6n del agua de mar artificial y los motivos para ellas se dan
en la secci6n de resultados.
II.3 Medios de cultivo.
Inicialmente, para averiguar la efectividad de las formulaciones del agua de mar artificial, se comparé el crecimiento de Chaetoceros sp. en medio f (marino) y medio f (artificial), este Gltimo preparado después de conocer la
concentracién de los nutrientes mayores en el agua de ciudad, cuyas concentraciones pueden ser elevadas en las aguas continentales, sobre todo por lo que se refiere al contenido de silicatos. De esta forma, sélo se agregé al medio artificial la concentracién de nutrientes necesaria para lograr una concentraci6n molar igual a la del medio control.
13
Con el propésito de reducir los costos de preparacién de los medios de cultivo se buscaron fuentes alternativas y econdémicas de los nutrientes
mayores, que sustituyeran las que se emplean en el medio control.
Como Saltillo se encuentra en una regién tradicionalmente agricola, se opté por aprovechar los fertilizantes de la empresa Fertilizantes Mexicanos, S.A. que los produce y comercializa para toda la Nacién. La composici6n de
cada uno de éstos se encuentra detallada en un documento interno de esta
empresa (Anénimo, 1984). Entre las varias posibilidades se eligi6 utilizar como
fuentes de nitrédgeno y fésforo (NH4)2S04 (Sulfato de Amonio) y (NH4)2HPO«
Tabla I, Concentraciones de los nutrientes empleados para la formulacidn de medios (A
grado técnico; F: fertilizantes; H: Hemofer 200), : grado analitico; 1: HEDIOS
f 2ESW Fert.1 Fert.2 Fert .¥ Fert .Y Fert.2
Constituyeate: ,
NaNO3 (A) 1,760 mM - - -
-WHaNOs (P)
‘
0.50 mM
-
-
-
.
-(NH4)2$04 (P) = - 1.76 mi 1.76 mM 1.76 mi 1,76 mH 1,76 mi (WH4)2 HPO, (F) - - 0.072 mM 0.072 mM 0.072 mH 0.072 mM 0.072 mi
Nag HPO, (1) - 0.06 mi - - - - .
Nala POq (A) 0.072 mH - - - - “
-Nag Sid3.9H20 (A) 0.108 mH - - - .
Na2$i03.5H20 (7) - 0.10 mM 0.108 mM 0.108 mM 0.108 mu 0,108 mH 0.108 mH
Tris-buffer 1,320 mM “ - - - - x
Fe-RDTA 23.4 mM = = = 23.4 ml 23.4 mM
-CoCly 0.100 pm(A) - 5.3 nM(H) 53 nM(H) ~ 53 nM(H)
-MnCly 0.180 ja - - - ~ -
-Nag Ho, 0.060 pm 2 - - - .
-CuS04 0.080 pm ss - - - _
-Zn804 0.160 pan(A) = 0.31 nM(H) 3,1 n(#) * 3.1 M(H) = Cianocobalamina (Biz) 1,000 pg(A) - 0.02 pg (H) 0.2 pg (H) - 0.2 pg (H)
-Biotina 1.000 jug
15 11.4 Analisis de nutrientes.
El contenido de nutrientes en los fertilizantes y su concentraci6dn en los ensayos de cultivo masivo se midieron con las técnicas descritas en el manual del espectrofotémetro Hach DR-EL/4 (Hach, 1980) y con los reactivos de la misma Compafiia, después de comprobar las respectivas curvas de -calibracién. Se efectuaron los siguientes andalisis:
Nitrégeno, en forma de nitratos: con el método para altas concentraciones (rango 0-30 mg/1), usando NaNO3 de grado analitico para lacurva de calibracién. Fésforo, en forma de ortofosfato reactivo: con el método para baja concentracién (rango 0-2 mg/1): se hizo la curva de calibracié6n con NaH2P04.H20
(Fosfato de Sodio Monobasico) de grado analitico.
Silicio, en forma de silicato reactivo: con el método para baja concentraci6én (0-2 mg/l), calibrando con Na2Si03.9H20 (Metasilicato de Sodio) de grado analitico.
Nitrégeno Amoniacal: el Sulfato de Amonio y la parte nitrogenada del Fosfato Diaménico se analizaron con el método Nessler para concentraciones entre 0 y 2 mg/l. Para la calibraci6n se empleé Sulfato de Amonio de grado analitico.
Fertilizante (NH4)2HPO4: 9.5 g/1;
[P]= 0.072 M y [N]= 0.143 M Fertilizante (NH4)2S04: 116.16 g/l;
(N]= 1.760 M Reactivo Na2Si03.5H20: 22.896 g/1;
[Si]= 0.108 M
Con los fertilizantes seleccionados, se ensayaron dos diferentes razones
N:P, tomando en consideracién que la gran mayoria de las microalgas crecen
_normalmente en razones N:P que pueden variar entre 10:1 y 20:1. También
se hicieron pruebas de crecimiento enriqueciendo al medio con el quelante
Fe-EDTA en la misma concentraci6én que se emplea con el medio control y
finalmente, se procedié a enriquecer el medio con vitamina Biz, que en un
principio no se habia agregado al medio, porque se tiene conocimiento de
que Chaetoceros sp. no la requiere para crecer normalmente, al menos en
medios formulados con agua de mar natural. Para este fin, se utilizé6 un
suplemento vitaminico de uso veterinario (Hemofer 200) que contiene vitamina
Biz, Hierro con dextrano, Cobalto y Zinc. Como se desconoce la actividad
quelante del dextrano contenido en el Hemofer 200, se prob6 a enriquecer o
no al medio con Fe-EDTA para averiguar si existia un exceso de iones libres
de Fe, Co y Zn.
II.5 Ensayos con Phaeodactylum tricornutum.
17
en medio artificial se tardaron mas de lo esperado, se hicieron ensayos de cultivo con la diatomea marina Phaeodactylum tricornutum (referencia C.I.C.E.S.E.: PH-T-1) con los mismos medios empleados para CH-X-1 dado que ya se conocia que esta cepa acepta medios formulados con agua de mar artificial preparada con sal de salina ( M. en C. R.O. Cafiizares Villanueva, Centro de Investigacién y de Estudios Avanzados del I.P.N., com. pers.).
Il.6 Sistemas de cultivo masivo.
Los dos sistemas de producci6én masiva se disefiaron en base a las descripciones de algunos sistemas de produccién mencionados en la literatura
(e.g. Richmond, 1986b; Borowitzka y Borowitzka, 1988). La velocidad de flujo
se establecié de manera que permitiera la recirculacién completa del cultivo, entre los puntos de cosecha y reinédculo, en un periodo de 24 horas, que es el tiempo aproximado de duplicaci6n de Chaetoceros sp. en condiciones de cultivo masivo al exterior (Flores-Acevedo, 1991).
II.6.1 Sistema de laberinto.
El sistema se cubri6 completamente con polietileno transparente de
invernadero para minimizar problemas de contaminacién atmosférica y edlica,
evaporacién o diluciédn por lluvias.
Los 200 litros de cultivo fluyen continuamente entre el primero y el
ultimo canal a una velocidad de 0.7 cm/min con ayuda de una bomba peristaltica
Ismatec 7615-60 que trabaja a 60 r.p.m. con seis puntos de contacto y de
dos mangueras de silicdn de 5 mm de didmetro interno. El flujo a través de
éstas (140 ml/min) permite que la totalidad del cultivo sea recirculado en
un periodo de 24 horas.
El cultivo se mantuvo en suspensién por medio de aireaci6n, proveida
por una bomba de acuario y cuatro piedras de burbuja fina colocadas a
intervalos regulares en el sistema (Fig. 4) y ademas el cultivo se mezclaba
manualmente cada 12 horas.
11.6.2 Sistema de cascadas.
El sistema consiste de cuatro estanques circulares de plastico opaco,
con capacidad de 100 1 cada uno, colocados a alturas progresivamente
decrecientes como se muestra en la figura 5.
Antes de usar los estanques, se lavaron con vapor a presién para
curtirlos, y se recubrieron con silicédn las pocas irregularidades del fondo
para evitar zonas te sedimentacién.
Como en el caso anterior, el volumen total del cultivo fue de 200 1, con
volamenes de agua progresivamente decrecientes (70, 60, 40 y 30 1) entre el
mas elevado y el mas bajo, en el cual se fij6é el punto de cosecha. De esta
COSECHA
'
190.2m NIVEL DEL AGUA
f > /
LY] ,” 7 ye 4
Iz /
47, L4 a,
VA? 4 é
0)
UXO
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t 1.00m f
Figura 4. Sistema de cultivo en laberinto. A: vista de planta. Las flechas indican el sentido de bombeo; los asteriscos, los puntos de aireaci6n. B: vista lateral. Se indican algunas de las laminas separadoras; las flechas indican la direccién del flujo.
COSECHA _
60 L
+
40 L
¥VWA
30.L
denso y la densidad va aumentando progresivamente en los estanques sucesivos, raz6én por la cual contienen voliimenes progresivamente menores, para permitir una adecuada penetracién de la luz.
Para mantener constante el nivel en los estanques_ se instalé un sistema de tuberias, que sirven para promover la mezcla del medio de cultivo e interconectar todo el sistema. El cultivo pasa desde la superficie de un estanque hasta el fondo del siguiente. De esta forma se asegura que el medio permanezca en cada estanque el tiempo previsto por la velocidad de flujo.
Una toma superficial en el Ultimo de los estanques, transporta el cultivo mas denso al punto de cosecha y de alli hacia el fondo del primero de ellos, con una velocidad de flujo regulada con una bomba peristaltica del mismo modelo y caracteristicas del sistema anterior.
Dos mangueras de silicén de 5 mm de diaémetro interno conectadas a esta bomba permiten la circulacién continua del cultivo con un flujo de 140 ml/min, con la cual se obtienen tiempos de residencia en los estanques de 8.3, 7.1, 4.8 y 3.6 horas desde el cultivo superior hasta el mas bajo, sumando aproximadamente las 24 horas prefijadas.
Como en el caso anterior, para minimizar problemas de contaminacién, evaporacién o de dilucién por lluvias, cada uno de los estanques fue protegido con plastico polietileno de tipo invernadero. Asimismo, también se usd una bomba de aireacién y se colocéd una piedra de aireacién en cada estanque, para ayudar a mantener las células en suspension y los cultivos se mezclaron
21 Il.7 Sistemas de cosecha.
En los ensayos de cosecha se colocé una bandeja rectangular de 13.5 X 22.5 cm, cubierta con malla Nitex de diferentes aberturas (95, 57 y 40 um). La bandeja se mantuvo con un Aangulo de inclinacién de aproximadamente 15 grados, sobre el primer estanque (70 1) y primer canal para cosechar directamente el cultivo que transportaban las dos mangueras
del Gltimo tanque (30 1) y dltimo canal de las cascadas y laberinto,
respectivamente, en los cuales el cultivo era mas denso por las razones antes expuestas.
En el caso de las cascadas, la bandeja estaba perforada en dos puntos de la parte inferior, de los cuales salian dos mangueras de plastico Tygon que llevaban el medio de cultivo, después de la cosecha, hacia el fondo del estanque de 70 1; la fraccién de cultivo que pasaba libremente por la malla
sin ser cosechado, servia de esta forma como reinéculo.
En el sistema de laberinto, el cultivo escurria a lo largo de la bandeja y el reinéculo caia directamente sobre la superficie del primer canal.
I1.8 Preparacién de los inéculos.
11.8.1 Produccién de inéculo primario: se llevé a cabo en el laboratorio
de microalgas hasta el nivel de 15 1, por inoculacién sucesiva desde tubo de
ensayo (10 ml) a Erlenmeyer (125 ml), Fernbach (2,000 ml) y finalmente Carboy
(15 1), siempre empleando el mismo medio artificial a usarse en los cultivos
masivos.
II.8.2 Produccién de inéculo masivo: para ésto, el inéculo primario se
agreg6 al tanque de 70 1 0 al de 301 del sistema de cascadas, segtn la
densidad del inéculo primario, en donde se dejaba crecer hasta alcanzar la
densidad deseada.
II.8.3 Inoculacién de los sistemas de cascada y laberinto: se retiré la
mitad del inéculo masivo, y se agregé cuidadosamente en uno de los extremos
del sistema de laberinto, que previamente habia sido Nenado con el medio
artificial hasta aproximadamente el nivel de 150 1, agregando al mismo tiempo
al otro extremo del laberinto la cantidad de medio faltante para aforar a 200
1. Con este método se intenté reducir la mezcla rapida del inédculo y mantenerlo
en un volumen limitado del sistema, ya que en general la probabilidad de
éxito de un cultivo masivo, sobre todo al exterior, aumenta con la densidad
del inéculo. Se reemplazé al mismo tiempo el volumen de inéculo retirado del
sistema de cascadas con un igual volumen de medio y se inici6é la recirculacién
en los sistemas con la velocidad de flujo indicada (140 ml/min), hasta lograr
23
Cuando en cada cultivo se midieron densidades épticas aproximadamente
iguales en los puntos inicial y final y en uno o dos puntos intermedios de
los sistemas (entre 24 y 48 horas), se inicié el monitoreo del crecimiento de
los cultivos y de las siguientes variables:
Temperatura: se mantuvo un registro diario de las temperaturas maximas
y minimas alcanzadas en los cultivos de cada sistema.
Concentracién celular: a través de mediciones de densidad éptica en
cada uno de los tanques (cascadas) y en los canales inicial, intermedio y
final del laberinto, con el espectrofotémetro Hach DR-EL/4 (estas mediciones,
en su mayoria, fueron hechas cada 12 horas). En la seccién de resultados
los datos se reportan como promedio de estas mediciones.
pH: con un potenciémetro Leeds and Northrup, Cat. 7401.
Salinidad: con un refractémetro de campo Atago 8810 (Argent
Laboratories), después de filtrar la muestra a través de un filtro de papel
Whatman No. 4. En caso de detectarse cambios de salinidad se reponia el
volumen de agua faltante, dividiéndolo proporcionalmente entre los estanques
para el sistema de cascadas o distribuyéndolo en forma igual entre los diez
canales del laberinto.
Nutrientes: para cuantificar el consumo de nutrientes en los cultivos se
tomaron muestras cada tercer o cuarto dia en diferentes puntos de cada
sistema, que se mezclaron y filtraron con filtros de fibra de vidrio Whatman
GF-C. De esta forma se obtuvieron muestras de agua libre de células y se
procedié a hacer el andalisis de cada nutriente empleando la metodologia y
los reactivos descritos en el manual de operacién del espectrofotémetro Hach
faltantes, evitando asi que el medio fuese limitante e impidiera el desarrollo
normal del cultivo. Con algunas excepciones, las vitaminas se agregaron al
medio en la misma proporcién que los nitratos.
Il.9 Tratamiento estadistico.
Para todas las pruebas estadisticas el nivel de significancia establecido
fue de a = 0.05.
En el analisis estadistico de los ensayos de crecimiento con diferentes
medios se utilizaron los valores de la tasa de crecimiento ( wu )
correspondientes a los tres primeros dias de la fase de crecimiento exponencial
de las tres réplicas de cada uno de los ensayos, es decir nueve datos de py
por cada tratamiento.
Para los ensayos de halotolerancia, por los motivos reportados en el
inciso III.5, se contrastaron las biomasas producidas en un dia establecido.
En ambos casos, se hicieron previamente las pruebas de normalidad y
homogeneidad de varianzas con las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y de
Bartlett respectivamente. Los datos que resultaron normales y con varianzas
homogéneas, se contrastaron mediante una prueba de andlisis de varianza
de una via (ANOVA) y las diferencias se identificaron con la prueba de
comparacién miltiple de Student-Newman-Keuls (SNK). En el caso de los datos
no normales y de los normales con varianzas no homogéneas se empleé la
prueba de Kruskal-Wallis y las diferencias se identificaron a través del
25
En el caso de los cultivos masivos, las tasas de crecimiento promedio
desde el inicio del experimento hasta el dia en el cual cada sistema alcanzé
su densidad maxima, 0 sea hasta cuando el valor de la uw acumulada no indicé
un descenso, se contrastaron con una prueba t.
Para las pruebas de normalidad, ANOVA, Kruskal-Wallis, analisis de
intervalos multiples y pruebas de t de Student se empled el programa
STATGRAPHICS versi6én 4.0, y para la prueba a posteriori SNK, se us6é el
Ill. RESULTADOS.
Debido a la naturaleza del trabajo, algunos de los resultados se discuten
parcialmente en esta seccién, indicando por qué se consideré mas conveniente
proceder en esa forma o para justificar la necesidad de llevar a cabo ensayos
adicionales.
ItI.1 Agua de mar artificial.
III.1.1 Composicién de los ingredientes basicos.
En las Tablas II, III y IV se observa la composici6én de las aguas de las
ciudades de Saltillo y Ensenada, de la sal de salina y de la dolomita, bases
para formular el agua de mar artificial que se utiliz6 en los ensayos que se
describen a continuacié6n.
Los datos relativos a las aguas de ciudad fueron facilitadas por las
respectivas Comisiones Estatales de Servicios Puiblicos, con la excepci6n de
los datos de nutrientes del agua de Ensenada, que se obtuvieron a través
del analisis con los métodos ya mencionados de tres muestras tomadas a
intervalos de dos semanas, sin que se encontraran diferencias importantes
entre ellas.
La sal de salina fue analizada en los Laboratorios Michelson de Los
Angeles, E.U.A. y los datos sobre la composici6n de la dolomita fueron
27
Tabla II. Caracteristicas de las aguas de las ciudades de Saltillo y de Ensenada.
SALTILLO ENSENADA
pH 7.0 7.5
Conductividad 200.0 u Mohs 1000.0 Mohs Cloro residual 2.0 p.p.m 0-0.2 p.p.m
Cloruros 10.0 p.p.m 313.0 p.p.m
Dureza calcica 212.0 p.p.m 200.0 p.p.m Dureza magnésica 212.0 p.p.m 113.0 p.p.m Carbonatotbicarbonato 242.0 p.p.m 207.0 p.p.m Sulfatos 112.0 p.p.m
Silicatos (como Si) 0.066 mM 0.05 mM
Nitratos (como N) 0.16 mM
Ortofosfatos (como P) 1.30 uM
gramos/100 g).
Tabla III. Caracteristicas quimicas de la sal de salina de Tampico, Tamaulipas (en
Cloruros: Sodio: Sulfatos: Magnesio:
Potasio:
Calcio:
Bicarbonatos:
Tabla IV. Composici6n quimica de la dolomita.
Ca
Mg
CO3
Si02 Otros
g/100 g
IiI.1.2 Ensayos con diferentes formulaciones.
En la Tabla V y en las figuras 6A, 6B y 6C se describen y comentan
los resultados de todos los ensayos que se llevaron a cabo para definir la
formulacién de agua de mar artificial mas conveniente para los objetivos de
este trabajo.
Ensayo 1: Agua de mar natural (AMN; Fig. 6A.a).
Este experimento se repitid tres veces, en conjunto con los tres ensayos
siguientes, como control de los mismos. La curva de crecimiento de Chaetoceros
sp. y los parametros poblacionales que se presentan en la figura y tabla
respectivas son el compendio de estos tres experimentos, y demuestran que
esta cepa tiene un crecimiento rapido, equivalente al mencionado en Voltolina
et al. (1991), a pesar del diferente origen del agua de mar natural y de la
falta de control de temperatura que vari6, durante los experimentos 1 a 6,
entre 18 y 25°C.
Ensayo 2: Agua de mar artificial: (AMA.1; Fig. 6A.b)
Sal de salina: 32 g
Agua de ciudad (Saltillo): 1 litro
Nutrientes: f
Crecimiento: negativo
29
Ensayo 3: (AMA.2; Fig. 6A.c)
Sal de salina: 32 g
Dolomita: 0.05 g, parcialmente acidificada con 7 ml de HCl comercial (Acido
muriatico)
Agua de ciudad (Saltillo): 1 litro
Nutrientes: f
Crecimiento: aclimatacién larga, crecimiento lento, baja biomasa.
Hipdétesis: como no se contaba todavia con un andalisis del agua de ciudad,
se supone una limitacién por bicarbonato.
Ensayos 4 y 5: (AMA.3 y AMA.4; Figs. 6A.d y 6A.e)
Sal de salina: 32 g
NaHCO3: 5mM (AMA.3) y 2.5 mM (AMA.4)
Dolomita: 0.05 g, parcialmente acidificada (20 ml de acido muriatico)
Agua de ciudad (Saltillo): 980 ml
Nutrientes: f
Crecimiento: negativo o nulo
Hipétesis: falta de un factor de crecimiento diferente de los metales traza y
vitaminas presentes en la mezcla f y también probar con 10% de agua de
mar natural y 90% de artificial mas cationes divalentes.
Ensayo 6: (AMA.5; Fig. 6A.f£)
Sal de salina: 28.8 g
Agua de mar natural: 100 ml
Agua de ciudad (Saltillo): 875 ml
Nutrientes: f
Crecimiento: similar al control, después de dos dias de aclimatacién.
Con este medio enriquecido con el 50% mas de silicatos se hizo un ensayo
con un cultivo de 10 litros (Fig. 6B.a), que result6 igualmente satisfactorio,
con la finalidad de usar este cultivo para inocular un tanque con 90 litros
del mismo medio sin agua de mar natural, para investigar la posibilidad de
evitar el gasto de transporte de agua de mar para los cultivos masivos,
empleando un inéculo ya aclimatado a un medio parcialmente artificial (Fig.
6B.b). En este caso el crecimiento fue muy bajo y se decidiéd seguir ensayando
con otras formulaciones de agua de mar artificial, dejando como filtima solucién
la de investigar la posibilidad de utilizar agua de mar natural en porcentajes
intermedios entre el 10%, que result6 satisfactoria, y el 1% con el cual no
se obtuvo crecimiento.
Los siguientes ensayos se llevaron a cabo en el Laboratorio de Acuicultura
del C.I.C.E.S.E. en Ensenada, donde el crecimiento se midi6 en unidades de
fluorescencia "in vivo".
Ensayos 7 y 7': (AMA.6; Figs. 6C.a y 6C.b)
Se decidi6 repetir la prueba con agua de mar preparada sélo con sal de
salina, para comprobar el resultado anterior dado el cambio en la calidad del
31
Sal de salina: 30 g
Agua de ciudad (Ensenada): 1 litro
Nutrientes: f
Crecimiento: aunque algo mejores de los obtenidos en Saltillo, los datos
confirman que esta formulacié6n es limitante para el crecimiento de Chaetoceros
sp.
Hipétesis: como en el caso de los experimentos anteriores, se supuso una
limitaci6n debida a un desequilibrio en el sistema de los carbonatos y/o a
falta de cationes divalentes.
Ensayos 8, 9 y 10: (AMA.7, AMA.8 y AMA.9; Figs. 6C.c, 6C.d y 6C.e)
Sal de salina: 30 g
Dolomita: 0.05 g, sin acidificar (AMA.7) o completamente acidificada (AMA.8 y
AMA.9)
Borato de sodio.10H20: 0.16 g (AMA.9)
Nutrientes: f
Agua de ciudad (Ensenada): 1 litro
Crecimiento: se not6é que el agua de mar preparada con 30 g de sal de salina
y 0.05 g de dolomita no acidificada result6 en un crecimiento comparable a
Tabla V. Ensayos de crecimiento con agua de mar natural (Ensayo 1) y con diferentes formulaciones de agua de mar artificial. Se indican los valores promedio de la concentracién celular, su desviaciédn estandar y el valor de wp (divisiones/dia) calculado con los promedios de la concentracién celular. Los ensayos 6' y 6" no tuvieron repeticiones y
por esto no se reportan valores de desviaci6n estandar.
Ensayo Dias cél./ml Desviacién BL
estandar
1 fe) 50000
1 187777 21107 1.90
2 542778 150749 1.53
3 1107500 211746 1.02
4 1027500 258126 -0.10
5 1526667 304182 0.57
2 0 50000
J, 47777 3068 -0.06
2 20833 5314 -1.19
3 0 50000
1 65926 10116 0.39
2 67500 3600 0.03
3 103889 4157 0.62
4 271111 18786 1.38
5 575278 11732 1.08
4 0 50000
1 32500 16513 -0.62
2 27777 3869 -0.22
3 35555 14694 0.35
4 25277 8203 -0.49
5 0 50000
1 43333 8525 -0.20
2 52777 15311 0.28
33
Tabla V. Continuacion.
Ensayo Dias cél./ml Desviacién LL
estandar
6 0 50000
1 71388 5152 0.51 2 80000 3788 0.16 3 255278 11311 1.67 4 825555 130934 1.69 5 1350000 120510 0.70 6 1813611 176245 0.42 7 2832777 485646 0.64
6' 0 37375
1 119166 - 1.67 2 395833 = 1.73 3 907500 - LlL9 4 1388333 = 0.61 5 1943333 - 0.48 6 1615000 = -0.26 7 1049000 - -0.62
6" 0 113500
1 200000 = 0.81 2 258333 - 0.36 3 85000 = -1.60 4 144000 - 0.76 5 159000 = 0.14 6 225832 - 0.50
7 0 18671
1 56823 2169 1.60 2 131454 2879 1.21 3 692355 93980 2.39 4 1046432 143946 0.59 5 1414566 62610 0.43
7 0 24695
Ensayo Dias cél./ml Desviaci6n LL estandar
8 0 17667
1 34066 3413 0.94
2 75230 5458 1.14
3 498583 137195 2:12
4 895832 62610 0.84
5 1263966 125221 0.49
9 0 18671
1 33062 4515 0.82
2 77572 14877 1.23
3 554138 119028 2.83
4 812166 155179 0.55
5 1130099 70994 0.47
10 0 20679
1 40424 2063 0.96
2 76568 4044 0.92
3 543094 134014 2.82
4 828899 204941 0.61
35
12 12
104
10
8 |
3
6
6
44
ao
2-
GQ
2
b
0 T T T T T t 1 ' T 04 q T UJ ] qT ' T T T
0
2
4
6
8
0
0
2
4
6
8
10
12
12
24
C
24
d
+ 4
0 T T T T T 1 0 T T T T I v T T T
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
12 12
10- 10
8- 3
Spyt+
o
4- 4+
2- e 244 f
0 Y T T T vr T Y T 0 1 T T T T T T T T T
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
Dias Dias
Figura 6A. Curvas de crecimiento de los ensayos para la formulacién del agua de mar artificial. a: ensayo 1, AMN; b: ensayo 2,
AMA.1; c: ensayo 3, AMA.2; d: ensayo 4, AMA.3; e: ensayo 5,
AMA.4: £: ensayo 6, AMA.5 (10% AMN). Método de evaluaci6n
Mm Mr
oO 1 oO 1
oN
CARBOY J
Jef
Cel./ml
(Log,
|
fi
TANQUE
.
q
ne
b
J 1 0 a
ae ca nc i (ea aaa | T
"4 2 4 6 8 lo 0 2 4 6 8 10
Dias
Dias
37
10-4 8
6-
4-2]
b
Figura 6C. Curvas de crecimiento de los ensayos de formulacién de agua de mar artificial. a: ensayo 7, AMA.6; b: ensayo 7°, AMA.6;
c: ensayo 8, AMA.7; d: ensayo 9, AMA.8; e: ensayo 10, AMA.9.
11.1.3 Evaluacién y seleccién.
En total se hicieron 11 ensayos de crecimiento para definir la composicién
del agua de mar artificial. Los valores promedio de la tasa de crecimiento
durante la fase de crecimiento exponencial se resumen en la Tabla V. Uno
de los ensayos se descarté para el andlisis estadistico porque el crecimiento
fue negativo desde un comienzo (Fig. 6A.b), que inicialmente se atribuydé a
falta de disponibilidad de cationes divalentes y/o de carbonatos y de
bicarbonatos que posteriormente se agregaron al medio en forma de dolomita.
Estadisticamente los datos resultaron normales y con varianzas no
homogéneas; con el andalisis de Kruskal-Wallis se encontraron diferencias
altamente significativas, indicando que al menos uno de los tratamientos es
significativamente diferente de los demas (Tabla VI).
La prueba a posteriori fue el andlisis de intervalos miUltiples (Minima
Diferencia Significativa), con la cual se obtuvieron tres grupos homogéneos
(Tabla VII). Aunque buena parte de los medios ensayados se encuentran
dentro de un mismo grupo, se eligié el nimero 8, correspondiente a la
formulacién AMA.7, por ser de composicién mas sencilla y de facil preparacién.
Ademas se observé en la practica la misma respuesta en crecimiento para los
medios preparados con dolomita acidificada o no acidificada pero mantenida
39
Tabla VI. Resultados del andalisis estadistico de los ensayos con agua de mar artificial.
Prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov:
0.08674 < 0.14117 (tablas)
Los datos son normales.
Prueba de Bartlett para homogeneidad de varianzas: P = 0.02 < 0.05
Varianzas no homogéneas.
Prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis: Nivel de significancia: 4.8 K 107
Tabla VII. Prueba a posteriori de los ensayos con agua de mar artificial.
Ensayo: Recuentos: Promedio: Grupos Homogéneos:
3 9 -0.21 *
III.2 Medio de cultivo simplificado.
III.2.1 Nutrientes en el agua de ciudad.
En comparacion con el medio control, la concentracién de los nutrientes
mayores presentes en el agua de ciudad result6 ser elevada sélo en el caso
del silicio (32 mg/l: 0.05 mM), lo que representa aproximadamente el 50% del
silicio en el medio f. En el caso de los nitratos y de los fosfatos, los contenidos
en el agua de ciudad representan aproximadamente el 10% y el 2%
respectivamente. Por este motivo, sdlo se corrigieron las cantidades de los
silicatos y del sulfato o del nitrato de amonio empleados para la formulacién
de los siguientes medios simplificados.
III.2.2 Selecci6n del medio.
En lo siguiente y en las figuras 7A a 7C se describen y comentan los
resultados de los ensayos de crecimiento con los medios simplificados descritos
en la Tabla I.
Contemporaneamente con las tltimas pruebas descritas en el apartado
III.1.2, se iniciaron otros ensayos para definir la mejor forma de uso de
fertilizantes agricolas y/o sales de grado técnico para la formulacién del
medio de cultivo.
Considerando que estas sales contienen impurezas de diferente naturaleza,
se probé inicialmente un medio (2ESW) cuya efectividad con agua de mar
natural se habia comprobado anteriormente, (Trujillo-Valle, datos no
41
Ensayos 1 y 1’: (AMA.6+2ESW; Figs. 7A.a y 7A.a')
AMA.6: 1 litro
Nitrato de amonio: 0.5 mM
Fosfato de sodio dibasico: 0.06 mM Silicato de sodio: 0.1 mM
Crecimiento: se consideréd que el crecimiento en este medio podria ser
satisfactorio. Sin embargo, se decidi6 probar el enriquecimiento con dolomita
acidificada (AMA.8) o sin acidificar (AMA.7) para garantizar una fuente de
carbono inorganico y de los cationes divalentes.
Ensayo 2: (AMA.8+2ESW; Fig. 7A.b)
Crecimiento: no se considerdé satisfactorio.
Ensayo 3: (AMA.7+2ESW; Fig. 7A.c)
Crecimiento: no se consider6 satisfactorio.
En base a los resultados del ensayo con el medio f en AMA.7 (Fig. 6C.c) se
decidi6d seguir utilizandolo como substrato y probar otros fertilizantes
agricolas. Entre los varios a disposicién se eligieron el fosfato diaménico,
enriquecido con sulfato de amonio y con silicato de sodio de grado técnico.
También se agregé una cantidad del complejo vitaminico Hemofer 200 (Pfizer)
Ensayo 4: (AMA.7+Fert.1; Fig. 7B.a)
AMA.7: 1 litro
Sulfato de amonio: 116.16 mg ({N]: 1.76 mM)
Fosfato diaménico: 9.5 mg ([P]: 0.07 mM; [N]: 0.14 mM)
Silicato de sodio: 22.9 mg ({Si]: 0.11 mM)
Hemofer: 0.01 ml
Crecimiento: se midid como aumento diario del nimero de células y aunque
la tasa de crecimiento fue satisfactoria, la maxima concentraci6én celular no
alcanz6é el mill6n de células por mililitro. Con el experimento sucesivo, se
comprobé que ésto no se debe a un exceso de iones metalicos libres.
Ensayo 5: (AMA.7+Fert.1+Fe-EDTA; Fig. 7B.b)
El medio de cultivo fue el descrito en el ensayo anterior, pero se agregé un
quelante (Fe-EDTA) en concentracién igual a la del medio f (23.4 mM/litro)
Crecimiento: no se consideré substancialmente diferente del obtenido en el
ensayo anterior. En base a estos resultados se probé el mismo medio, agregando
o no una cantidad de vitaminas equivalente al 20% de la contenida en el
medio £ y de quelante equivalente a la del medio f.
Ensayos 6 y 6°: (AMA.7+Fert.X; Figs. 7B.c y 7B.c')
AMA.7: 1 litro
Fe-EDTA: 23.4 mM
43
Ensayos 7 y 7°: (AMA.7+Fert.Y; Figs. 7B.d y 7B.d")
AMA.7: 1 litro
Fe-EDTA: 23.4 mM
Hemofer: 0.1 ml
Fertilizantes: igual que Fert.1
Ensayos 8 y 8': (AMA.7+Fert.2; Figs. 7C.a y 7C.a')
AMA.7: 1 litro
Hemofer: 0.1 ml
Fertilizantes: igual que Fert.1l
Ensayos 9 y 9°: (AMA.7+Fert.Z; Figs. 7C.b y 7C.b’)
AMA.7: 1 litro
Fertilizantes: como Fert.1l
Crecimiento: se puede notar de las figuras correspondientes que todos los
medios con vitaminas crecieron bien y aleanzaron biomasas finales superiores
alos medios sin ese enkiqueciniente, y que ambos son independientes de la
presencia del quelante. Por este motivo, se eligiéd el medio descrito para los
ensayos 8 y 8’.
En total se hicieron 15 ensayos incluyendo al medio control. Los valores
promedio de las tasas de duplicaci6n durante la fase de crecimiento exponencial
Tabla VIII. Ensayos de crecimiento utilizando el medio simplificado con diferentes formulaciones de agua de mar artificial. Se indican los valores promedio de la concentracién celular, su desviaci6n estandar y el valor de u (divisiones/dia) calculado con los promedios de la concentracién celular.
Ensayo Dias cél./ml Desviacién LL
estandar
1 0 26703
1 79915 820 1.58
2 298787 24634 1.90
3 855338 23665 1.51
4 1475810 116066 0.78
r 0 24695
1 82927 6710 1.74
2 121414 5580 0.55
3 205080 20351 0.75
4 364382 31604 0.82
2 0 25699
1 43771 820 0.76
2 114386 3786 1.38
3 235200 21145 1.04
3 0 22687
1 36743 3757 0.69
2 89286 7068 1.28
3 199391 23603 1.15
4 0 21000
1 31000 4000 0.56
2 34000 5000 0.14
3 64000 16000 0.89
4 130000 5000 1.02
5 370000 33000 1.51
6 602000 55000 0.70
7 825000 49000 0.45
Tabla VIII. Continuacién.
Ensayo Dias cél./ml Desviacién LL
estandar
5 ) 18000
1 18000 1000 0.04
2 31000 5000 0.77
3 42000 6000 0.44
4 107000 26000 1.35
5 297000 17000 1.46
6 472000 85000 0.67
7 791000 56000 0.74
8 840000 40000 0.08
6 0 62000
1 30700 14000 2.31
2 541000 25000 0.81
3 633000 17000 0.22
4 529000 28000 -0.25
5 593000 104000 0.16
6" 0 62000
1 64000 6000 0.05
2 96000 4000 0.58
3 121000 11000 0.32
4 140000 15000 0.20
5 179000 15000 0.35
7 0 62000
1 324000 14000 2.39
2 854000 75000 1.39
3 1631000 29000 0.93
4 1956000 2000 0.26
5 2422000 134000 0.30
7 0 62000
1 205000 43000 1.73
2 538000 61000 1.39
3 1576000 96000 1.55
4 1983000 247000 0.33
Tabla VIII. Continuacién.
Ensayo Dias cél./ml Desviacion a estandar
8 0 79000
1 257000 17000 1.70
2 863000 50000 1.74
3 1254000 20000 0.53
4 1731000 0 0.46
5 2354000 166000 0.44
8" 1 79000
2 243000 19000 1.63
3 768000 74000 1.65
4 1469000 52000 0.93
5 2063000 407000 0.49
1810000 54000 -0.18
9 0 79000
1 228000 18000 1.53
2 404000 17000 0.82
3 588000 63000 0.54
4 668000 20000 0.18
5 559000 30000 -0.25
9" 0 79000
1 82000 3000 0.06
2 95000 19000 0.20
3 113000 20000 0.25
4 148000 22000 0.38
47
12 12
10-4 107
8
8+
65 6-4
45 47 ‘
ss 0 T T T T T T T T T 0) T T T T T T 1 T T T o 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 4
€
~ (12 12
S 107
10
8
8-1
4
4-7
4-24 b 24 C
0 TT 1 1 TT 0 tot T—1—T
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
Dias Dias
Figura 7A. Curvas de crecimiento de los ensayos con agua de mar artificial y fertilizantes 2ESW. a: ensayo 1, AMA.6+2ESW; a":
ensayo 1’, AMA.6+2ESW; b: ensayo 2, AMA.8+2ESW; c: ensayo
3, AMA.7+2ESW. Método de evaluaci6n de biomasa: fluorimetria
Cél./
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(Log,
) ~w
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an
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»
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|
nm |
!
oO 7
10
3-6
=
2
b
0
0 2 4 6 8 10
12 io
Figura 7B: Curvas de crecimiento de los ensayos con agua de mar artificial AMA.7 y fertilizantes agricolas. a: ensayo 4, AMA.7+Fert.1; b: ensayo 5, AMA.7+Fert.1+Fe-EDTA; c: ensayo
6, AMA.7+Fert.X; c': ensayo 6", AMA.7+Fert.X; d: ensayo 7,
AMA.7+Fert.Y; d':
evaluacién de biomasa: fluorimetria "in vivo".
7
49
12 l2
10-7 lo
87 3
6
6
a 45 '
24
0
2
q
0 | 0 eee 0 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
12 12 10-
io-To
ee
6 6
47 47 1 27 b 2 b 0 Le a a 0 eee
0 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
Figura 7C: Curvas de crecimiento de los ensayos con agua de marensayo 8,
ensayo 9,
Método de artificial AMA.7 y fertilizantes agricolas. a:
Estadisticamente los datos obtenidos con los ensayos descritos resultaron
normales y con varianzas no homogéneas. Con la prueba de Kruskal-Wallis
se encontré que existen diferencias altamente significativas entre los valores
obtenidos (Tabla IX).
Con el andalisis de intervalos miltiples, se formaron ocho grupos
homogéneos (Tabla X). Entre los pertenecientes al grupo que contenia el
medio control (medio £ en agua de mar natural) se decidié elegir al medio
simplificado de composicién mas sencilla, que recallé en la seleccién del medio
sin enriquecimiento del quelante Fe-EDTA (Fert.2 de la Tabla I).
TII.3 Phaeodactylum tricornutum.
III.3.1 Ensayos de laboratorio.
Para esta diatomea se probaron las formulaciones de agua de mar artificial
preparada con agua de la ciudad de Ensenada, sal de salina sin dolomita
(AMA.6), con dolomita no acidificada (AMA.7), acidificada (AMA.8), y AMA.8
enriquecida con borato de sodio (AMA.9), mas los nutrientes del medio f (Fig.
8) o con doble cantidad de los fertilizantes del medio ESW (Fig. 9). La Tabla
XI da un resumen de estos ensayos de crecimiento.
Es de hacer notar que varios ensayos tuvieron que darse por terminados
antes que alcanzaran la fase estable, debido a problemas con el control de
temperatura del laboratorio. De todas formas, esta especie acept6 con mayor
o menor éxito todas las formulaciones probadas, con tasas de crecimiento y/o
