UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES “UNIANDES”
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA MAESTRÍA EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
TRABAJO DE TESIS PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
TEMA: EFECTO IN VITRO ANTIMICROBIANO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LA HIERBA LUISA CYMBOPOGON CITRATUS SOBRE
STREPTOCOCCUS MUTANS
AUTORA: Q.F. GILER MIRANDA JENNIFER LIZETH
ASESORES: ING. OÑA CISNEROS FABIAN DAVID, MSc PHD(c)
DR. VITERI RODRIGUEZ JUAN ALBERTO, MSc
APROBACIÓN DEL ASESOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
CERTIFICACIÓN:
Quien suscribe, legalmente CERTIFICA QUE: El presente Trabajo de Titulación realizado por la Q.F. Giler Miranda Jennifer Lizeth, Estudiante del Programa de Maestría en Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, con el tema “EFECTO IN VITRO ANTIMICROBIANO DEL
EXTRACTO ETANÓLICO DE LA HIERBA LUISA CYMBOPOGON CITRATUS SOBRE STREPTOCOCCUS MUTANS”, ha sido prolijamente revisado, y cumple con todos los requisitos establecidos en la normativa pertinente de la Universidad Regional Autónoma de los Andes -UNIANDES-, por lo que se aprueba su presentación.
Ambato, abril del 2018
________________________________ _______________________________
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
Yo, Q.F. Giler Miranda Jennifer Lizeth, estudiante del Programa de Maestría de Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, declaro que todos los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, previo a la obtención del Grado Académico de MAGÍSTER, son absolutamente originales, auténticos y personales; a excepción de las citas, por lo que son de mi exclusiva responsabilidad.
Ambato, abril 2018
______________________________
Q.F. Giler Miranda Jennifer Lizeth
0915742258
DERECHOS DE AUTORA
Yo, Q.F. Giler Miranda Jennifer Lizeth, declaro que conozco y acepto la disposición constante en el literal d) del Art. 85 del Estatuto de la Universidad Regional Autónoma de los Andes, que en su parte pertinente dice: El patrimonio de la UNIANDES está constituido por “La propiedad intelectual sobre las Investigaciones, trabajos científicos o técnicos, proyectos profesionales y consultoría que se realicen en la Universidad o por cuenta de ella...”
Ambato, abril 2018
Q.F. Giler Miranda Jennifer Lizeth
0915742258
RESUMEN
Las propiedades demostradas por especies del género Poáceas se deben a su composición química, basada principalmente en flavonoides, diterpenos y triterpenos. El presente trabajo evaluó la actividad antimicrobiana in vitro del extracto etanólico de Cymbopogon citratus sobre Streptococcus mutans
mediante la técnica de difusión de disco en agar. Se evaluaron cuatro concentraciones del extracto etanólico al 25%, 50%, 75% y 100%; clorhexidina como control positivo y agua destilada estéril como control negativo. Las lecturas de los halos de inhibición se realizaron a las 24 horas posteriores a la incubación. Como resultado se encontró que los extractos etanólicos de C. citratus presentaron actividad antimicrobiana contra S. mutans (25%, HI promedio= 5.7 mm; 50% HI promedio= 6.8 mm: 75% HI promedio= 7.8 mm; 100% HI promedio= 12.1 mm). Se estableció que la actividad bactericida aumenta de forma proporcional a la concentración del extracto sobre S. mutans
(p0.001) pero su efecto en todos los casos es inferior al mostrado por el control positivo (Clorhexidina vs extracto al 100%; p0.001). En conclusión, existe un efecto bactericida in vitro mostrado por el extracto etanólico de C. citratus sobre S. mutans: sin embargo, estudios posteriores son necesarios para elucidar el efecto de un extracto acuoso de C. citratus mediante ensayos
in vitro en cepas aisladas de bacterias presentes en caries de pacientes y ensayos in vivo para evaluar su toxicidad con la finalidad de poder proponer al extracto de C. citratus como un posible adyuvante en el combate contra la caries en presentaciones tópicas o enjuagues bucales
ABSTRACT
ÍNDICE GENERAL
1. INTRODUCCIÓN ... 1
1.1. ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN ... 1
1.2. SITUACIÓNPROBLEMÁTICA ... 2
1.3. PROBLEMA CIENTÍFICO ... 3
1.4. OBJETODELAINVESTIGACIÓN ... 3
1.5. CAMPODEACCIÓN ... 3
1.6. LINEADEINVESTIGACIÓN ... 3
1.7. OBJETIVOGENERAL ... 3
1.8. OBJETIVOSESPECÍFICOS ... 3
1.9. IDEAADEFENDER(HIPÓTESIS)... 4
1.10. VARIABLESDELAINVESTIGACIÓN ... 4
1.11. METODOLOGÍA ... 4
Tipo de estudio ... 4
Cepa de estudio ... 4
Criterios de Inclusión y Exclusión: ... 4
1.12. PREPARACIÓN Y OBTENCIÓN DE EXTRACTOS. ... 5
1.13. ... 5
Extracto Etéreo. ... 5
Extracto Etanólico ... 5
Procedimiento microbiológico ... 5
Evaluación de la actividad bacteriana del extracto etanólico preparado con la técnica de difusión en disco. ... 5
1.14. ESQUEMADECONTENIDOS ... 5
1.15. APORTETEÓRICO ... 7
1.16. SIGNIFICACIÓNPRÁCTICA ... 7
1.17. NOVEDADCIENTÍFICA ... 8
2. CAPITULO I. MARCO TEORICO ... 9
2.1. POACEAS... 9
Diversidad ... 9
Hábito de Crecimiento ... 9
Tallos ... 9
Tallos aéreos ... 10
1.3.10 Fitoquímica ... 11
2.2. HIERBALUISA ... 11
Historia y origen ... 11
Cultivo ... 12
Usos ... 12
Química... 13
Farmacología ... 13
2.3. ACEITES ESENCIALES YEXTRACTOS ... 14
Generalidades del Aceite esencial del Cymbopogon Citratus... 14
Geranial ... 14
Polifenoles ... 14
2.4. STREPTOCOCCUS MUTANS ... 15
Tipo de microorganismo... 15
Transmisión, Colonización y estabilidad de Streptococcus mutans en cavidad oral... 15
Resistencia Antimicrobiana ... 16
Resistencia Antimicrobiana del Streptococcus Mutans ... 16
Potencia o actividad antimicrobiana ... 17
Sitios de acción de los antimicrobianos ... 17
2.5. CONCLUSIONES PARCIALES ... 18
2.6. DISEÑO EXPERIMENTAL ... 19
2.7. CARACTERIZACIÓN BOTÁNICA ... 19
2.8. MATERIAL VEGETAL Y OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS. ... 20
Recolección de la Muestra ... 20
Criterios de Inclusión y exclusión ... 20
Pruebas analíticas ... 20
Humedad ... 20
Cenizas totales ... 20
Cenizas Totales en Agua ... 21
Cenizas Totales en Ácido Clorhídrico. ... 21
The American Type Culture Collection (ATCC) ... 22
2.9. ESTUDIO ETNOFARMACOLÓGICO ... 23
2.10. CONCLUSIONES PARCIALES ... 24
3. CAPITULO III. MARCO PROPOSITIVO... 25
3.1. DESARROLLODELAPROPUESTA... 25
3.2. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA. ... 25
3.3. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS ... 25
Parámetros Físico Químicos ... 26
3.4. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS. ... 33
4. CONCLUSIONES ... 35
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Antecedentes De La Investigación
La medicina tradicional, medicina complementaria o medicina alternativa es el conjunto de conocimientos, aptitudes y prácticas basados en teorías, creencias y experiencias indígenas de las diferentes culturas, usados para el mantenimiento de la salud, así como para la prevención, el diagnóstico, la mejora o el tratamiento de enfermedades físicas o mentales, estas prácticas no están integradas al sistema de salud del país (1)
La medicina tradicional es parte del legado cultural de los pueblos indígenas e integra saberes transmitidos por generaciones sobre las cualidades curativas de las plantas. La riqueza natural de sus territorios permite acceder a una variedad de plantas con importantes propiedades medicinales. Su uso está muy extendido en las comunidades y varias de estas plantas han alcanzado reconocimiento en la farmacéutica moderna (2), por ejemplo, la Stevia como endulzante para personas diabéticas, ungüentos de Aloe vera, eucalipto en jarabes para la tos.
Cymbopogon citratus es una hierba de la familia Poaceae (Gramineae), nativa del Sureste de Asia, pero actualmente crece en todo el mundo, principalmente en las regiones tropicales y sabanas. Conocida con el nombre común, según los diversos países, de ‘hierba luisa’, ‘caña santa’, ‘lemongrass’, ‘té limón’, ‘citronela’ y otros(3).
En medicina tradicional, Cymbopogon citratus es utilizada en la forma de decocción o infusión como antiespasmódico, hipotensor, antipirético y tranquilizante (4). Los diversos extractos preparados de esta planta han mostrado actividades como antioxidante(5)(6), hipocolesterolémica(7)(8), sedante(9) (10), antiinflamatoria (11) (12), hipoglicemiante(13), antifúngica contra
Epidermophyton flocosum, Trichophyton rubrum y Candida albicans (14) (15), inhibición de Staphylococcus aureus y Escherichia coli(16) y sobre Salmonella
de iniciación y promoción en el colon de ratas(18), así como inhibición de la fase temprana de hepatocarcinogénesis en ratas (19).
La actividad antibacteriana de la Hierba Luisa sobre la bacteria causante del acné (Propionibacterium acnes) se observa en la inhibición de la misma desde la concentración de 0.05 % al 5 % por lo cual la CMI (concentración mínima inhibitoria) fue de 0.05 µg/ml (20). El aceite esencial del Cymbopogon citratus (Hierba Luisa) posee efecto antibacteriano in vitro sobre el Streptococcus mutans siendo la concentración inhibitoria mínima del aceite esencial 1.25% y la concentración mínima bactericida (CMB) del aceite esencial del
Cymbopogon citratus (hierba Luisa) fue de 1.25 (21). El desarrollo de la industria química de productos alimentarios, farmacéuticos y cosméticos e incluso en el área médica de aplicación terapéutica, ha dejado en evidencia que los aceites esenciales de origen vegetal tienen un amplio uso contra varios microorganismos.
1.2. SITUACIÓN PROBLEMÁTICA
La resistencia a los antimicrobianos (RAM) pone en peligro la eficacia de la prevención como políticas de estado y el tratamiento de una serie cada vez mayor de infecciones por virus, bacterias, hongos y parásitos. La RAM supone una amenaza cada vez mayor para la salud pública mundial y requiere medidas por parte de todos los sectores del gobierno y la sociedad (22). S. mutans es un residente normal de la cavidad oral humana reconocido como uno de los principales agentes etiológicos de la caries(23).
El estudio de la resistencia de S. mutans a antibióticos betalactámicos en una población de riesgo a endocarditis infecciosa demostró que el 50% de los pacientes estudiados tenían en cavidad oral S.mutans y la resistencia de
S.mutans a la amoxiclina fue 15% y el 20%, estas bacterias expresaron como mecanismo la producción de beta-lactamasas (24) .
lesiones congénitas. En términos mundiales, entre el 60% y el 90% de los niños en edad escolar y cerca del 100% de los adultos tienen caries dental, a menudo acompañada de dolor o sensación de molestia (25).
1.3. Problema Científico
¿Cuál será el efecto antimicrobiano del extracto etanólico de la Hierba Luisa contra Streptococcus mutans?
1.4. OBJETO DE LA INVESTIGACION
Actividad antimicrobiana de la Hierba Luisa “Cymbopogon citratus”
1.5. CAMPO DE ACCION
Evaluación de la actividad antimicrobiana de la Hierba Luisa mediante análisis fitoquímico y microbiológico de su extracto etanólico al 75%.
1.6. LINEA DE INVESTIGACION Estudios microbiológicos
1.7. OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto antimicrobiano de la Hierba Luisa “Cymbopogon citratus” sobre Streptococcus mutans
1.8. OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Preparar el extracto etanólico al 75%.
• Medir los halos de inhibición producidos por el extracto etanólico de
Hierba luisa en concentraciones del 4%, 5% y 15%, sobre el cultivo de
• Comparar la susceptibilidad del Streptococcus mutans frente al extracto
etanólico al 4%, 5% y 15%, el control positivo Clorhexidina al 0.12% y el control negativo agua destilada estéril.
1.9. IDEA A DEFENDER (HIPOTESIS)
La Hierba luisa tiene efecto antimicrobiano sobre el Streptococcus mutans
1.10. VARIABLES DE LA INVESTIGACIÓN
Variable Independiente Crecimiento de S. mutans en medio de cultivo
Variable Dependiente. - Efecto in vitro antimicrobiano del extracto etanólico de “Cymbopogon citratus”
1.11. METODOLOGIA Tipo de estudio
Analítico experimental no controlado
Cepa de estudio
Streptococcus mutans ATCC 25175
Muestra
Hojas frescas de Hierba Luisa adquiridas en el Mercado de Sauces 9 ubicado al Norte de la ciudad de Guayaquil
Criterios de Inclusión y Exclusión:
• Inclusión: todas las hojas frescas, adultas
• Exclusión: hojas negras, con daños de putrefacción, hojas quemadas
por el sol.
Muestra 1
1.12. Preparación y Obtención de extractos.
1.13.
Estos se obtienen mediante la separación de porciones biológicamente activas presentes en los tejidos de las plantas, con el uso de un solvente (alcohol, agua, mezcla de estos u otro solvente selectivo) y un proceso de extracción adecuado (28).
Extracto Etéreo.
Pesar 25 g. de droga seca y molida y extraerlos con 200 ml de éter etílico por maceración durante 48 horas. Se obtiene el extracto y el residuo sólido (secar y pesar) (28).
Extracto Etanòlico
A la droga agotada con el éter etílico, extraer por maceración con etanol al 75% (tres veces el peso del residuo en volumen) durante 48 horas se obtiene el extracto y el residuo sólido (secar y pesar) (28).
Procedimiento microbiológico
Cultivos bacterianos de Streptococcus mutans en medio de crecimiento Agar sangre a los cuales se les colocaron discos de papel filtro embebidos con las diferentes soluciones, divididos en 3 grupos: G1: Extracto hidroalcohólico al 4%, G2: Extracto hidroalcohólico al 5%, G3: Extracto hidroalcohólico al 15% (28).
Evaluación de la actividad bacteriana del extracto etanólico preparado con la técnica de difusión en disco.
Una vez conocidas las concentraciones para cada extracto, se preparó inóculos bacterianos de Streptococcus mutans con criterios de sensibilidad: difusión 12mm y se sembró en cajas Petri con agar sangre. Se rotuló las placas indicando el número de ensayo y la posición de los discos, así como también el control positivo (28).
2.1. POACEAS Diversidad
Descripción botánica de poaceaes Hábito de Crecimiento
Tallos
Tallos aéreos 1.3.10 Fitoquímica 2.2. HIERBA LUISA Historia y origen Cultivo
Usos Química Farmacología
2.3. ACEITES ESENCIALES Y EXTRACTOS
Generalidades del Aceite esencial del Cymbopogon citratus Geranial
Polifenoles
2.4. STREPTOCOCCUS MUTANS
Tipo de microorganismo
Transmisión, Colonización y estabilidad de Streptococcus mutans en cavidad oral
Resistencia Antimicrobiana
Resistencia Antimicrobiana del Streptococcus Mutans Potencia o actividad antimicrobiana
Sitios de acción de los antimicrobianos 2.5. CONCLUSIONES PARCIALES 2.6. DISEÑO EXPERIMENTAL
2.7. CARACTERIZACIÓN BOTÁNICA
2.8. MATERIAL VEGETAL Y OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS. Recolección de la Muestra
Criterios de Inclusión y exclusión Pruebas analíticas
Cenizas Totales en Agua
Cenizas Totales en Ácido Clorhídrico. Pruebas microbiológicas.
The American Type Culture Collection (ATCC) 2.9. CONCLUSIONES PARCIALES
3. CAPITULO III. MARCO PROPOSITIVO
3.1. DESARROLLO DE LA PROPUESTA
3.2. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA. 3.3. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
Parámetros Físico Químicos
3.4. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS.
1.15. APORTE TEÓRICO
Los principios activos de la familia de Terpenos presentes en las hojas de Hierba Luisa pueden ser extraídos en forma de aceite esencial de alta pureza y su extracto etanólico que serán evaluados microbiológicamente.
La presente investigación aportará estudios previos de esta planta en lo que respecta al desarrollo de fitofármacos e incluso productos de higiene odontológicos; considerando que el Streptococcus mutans está presente permanentemente en la cavidad bucal y está vinculado a la caries dental.
1.16. SIGNIFICACIÓN PRÁCTICA
El extracto etanólico de la Hierba Luisa contra la cepa Streptococcus mutans; demuestra el uso de los metabolitos secundarios de plantas en el tratamiento natural de enfermedades.
1.17. NOVEDAD CIENTÍFICA
En la presente investigación se busca evaluar el comportamiento del
Streptococcus mutans frente a los compuestos presentes en el extracto etanólico de la Hierba Luisa, de modo tal que la información obtenida aporte al desarrollo de la investigación de la resistencia microbiana.
2. CAPITULO I. MARCO TEÓRICO
2.1. Poaceas Diversidad
Familia con cerca de 700 géneros y 11 000 especies en el mundo (29)
Descripción botánica de poaceaes
Son plantas anuales o perennes, herbáceas, subleñosas hasta leñosas, cespitosas, con o sin rizomas. Hojas alternas, dísticas, formadas por vaina, lámina y lígula, a veces pseudopecioladas dichos seudopecíolos están formados por agostamiento de la base de la lámina generalmente ausentes (30) (31); lígula membranosa, membranoso-ciliada o pilosa, raramente ausente.
Inflorescencia formada por flores agrupadas en espiguetas, estas reunidas en panícula típica, panícula de ramos unilaterales espiciformes o contraídos, menos comúnmente, espiga (31) .
Hábito de Crecimiento
En general son hierbas, si bien pueden ser leñosas, como los bambús tropicales, cespitosas, rizomatosas o estoloníferas. Por la duración de su ciclo de vida pueden ser anuales, bienales o perennes. Las gramíneas anuales, como es lógico suponer, se reproducen una sola vez durante su ciclo vital (el caso del trigo o de la avena, por ejemplo). Las especies perennes, en cambio, pueden reproducirse varias veces, en general anualmente, o una sola vez. En el primer caso se denominan iteróparas, la mayoría de las especies de pastos, por ejemplo, y, en el segundo caso, semélparas, como es el caso de las diferentes especies bambúes (31).
Tallos
ellos nacen las hojas y las yemas. Los entrenudos son a veces algo achatados en la zona donde se desarrollan las ramificaciones. Un poco más arriba del nudo existe un meristema intercalar en forma de anillo que determina el alargamiento del tallo. En algunos géneros existen de dos a seis nudos muy próximos entre sí (los cuales se denominan nudos compuestos), cada uno de los cuales lleva su correspondiente hoja. En Cynodon dactylon, por ejemplo, los nudos están en grupos de a dos por lo que las hojas parecen opuestas. En general los entrenudos basales son más cortos que los superiores; cuando hay varios nudos basales muy próximos, las hojas parecen arrosetadas, es decir, se disponen de forma tal que simulan formar una roseta basal de hojas. Los principales tipos de tallos en las gramíneas son los siguientes (31):
Tallos aéreos
Tallos erectos o ascendentes: generalmente con entrenudos cortos en la base y gradualmente más largos hacia el ápice. Pueden ser simples o ramificados.
Tallos rastreros: que crecen recostados sobre el suelo, arraigando en los
nudos; frecuentemente presentan nudos compuestos, como
en Stenotaphrum y Cynodon. Cuando los tallos rastreros originan nuevas plantas en cada nudo se denominan estolones (31).
Tallos flotantes: los cuales flotan en el agua gracias a los entrenudos huecos o a la presencia de aerénquima (31).
Tallos subterráneos
• Pseudobulbos: son engrosamientos de los entrenudos basales envueltos
por sus vainas foliares. Son poco frecuentes en las gramíneas, algunos ejemplos son Amphibromus scabrivalvis y Phalaris tuberosa (31).
1.3.10 Fitoquímica
Las hemicelulosas y los polisacáridos de pectinas de la pared celular primaria de los pastos son muy diferentes de los de las demás espermatofitas, tanto en estructura como en las particularidades de la composición de los xiloglucanos.21 Los polisacáridos son menos ramificados que en todas las demás familias de plantas, si bien esta afirmación está basada en un muestreo todavía escaso de especies. Las poáceas pueden ser cianogenéticas o no. Cuando son cianogenéticas, los compuestos cianogenéticos son derivados de la tirosina. Pueden presentar alcaloides (a veces isoquinolina, pirrolizidina e indol). Raramente puede haber proantocianidinas y cianidinas, en cantidades traza, y sólo en representantes de las subfamilias Panicoideae y Chloridoideae.
Los flavonoides se han hallado sólo en algunos
géneros, BoutelouaGlyceria y Melica,22 cuando están presentes son quercetina, o kaempferol junto con quercetina. El ácido elágico y la arbutina no se han encontrado en ningún miembro de la familia. Raramente se encuentran saponinas y sapogeninas, así como también oxalatos libres (por ejemplo, en Setaria) (32).
2.2. HIERBA LUISA Historia y origen
Francisco Hernández en el siglo XVI relata el uso del zacate limón como antiespasmódico, antipalúdico, antitusígeno, carminativo, diaforético, “dolor alcohólico”, estimulante y “rubefaciente”. Es hasta el siglo XX que la Sociedad
finalmente la Sociedad Farmacéutica de México reitera su uso como
antiespasmódico y eupéptico (46).
Cultivo
El pasto de limón se usa ampliamente en Asia como hierba, particularmente en Tailandia, Laos, Sri Lanka y en la cocina caribeña. Tiene un sabor y aroma similares al del limón y puede secarse, pulverizarse o usarse fresco. El tallo es difícil de ingerir, exceptuando la parte interna. Sin embargo, puede molerse finamente conservando el aceite aromático. El principal constituyente del aceite del pasto-limón es el citral (46).
Usos
Se usa comúnmente en infusiones de té, sopas y currys, lo mismo que en pescados y mariscos. Se usa más frecuentemente como té en los países africanos (46).
El pasto de limón del este de la India (Cymbopogon flexuosus), también conocido como pasto de Cochin Pasto de Malabar, es originario de Camboya, India, Sri Lanka, Myanmar y Tailandia mientras que el pasto de limón del Oeste (Cymbopogon citratus) se presume tiene su origen en Malasia mientras ambos son usados invariablemente la especie C. citratustiene un perfil más encaminado hacia la cocina. En la India la especie C. citratus es usada como hierba medicinal y en perfumes. El pasto citronella (Cymbopogon nardus y Cymbopogon winterianus) es similar a las especies descritas arriba, pero crece hasta una altura de 2 m y los tallos en la base son en color rojo (46).
Aquellas especies son usadas para la producción de aceite de citronela, el cual es usado en jabones, como repelente de mosquitos, insecticidas, y velas, también aromaterapia, la cual es famosa en Bintan, Indonesia. Los principios químicos activos de la citronella, geraniol y citronelol son antisépticos, de ahí su uso en desinfectantes caseros y jabones. Al lado de la producción de aceite, el pasto citronella tiene uso culinario como “té de limón” o “de Ceylan”. En
Química
Las partes aéreas de la planta contienen un aceite esencial en el que se han identificado los monoterpenos: alcanfor, borneol, camfeno, cineal, citral, citronelal, citronelol, fenchona, geranial, geraniol, 6-metil hep-5-en-ona, limoneno, linalol, mentol, mentona, mirceno, neral, acetato de nerol, nerol, ocimeno, pineno, terpineol, terpinoleno y los sesquiterpenos alfa-oxobisabolona, beta-cadineno y humuleno. En las hojas se han detectado el beta-sitosterol y los triterpenos cimbopogenol, cimbopogona y cimbopogonol (46).
Farmacología
Varios estudios demuestran que el aceite esencial ejerce una actividad antibiótica contra las bacterias Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis, Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, Mycobacterium smegmatis,
antimicótica contra los hongos Candida albicans, C. pseudotropicalis y otros hongos; y antimutagénica (46).
El extracto acuoso de las hojas ejerció una acción hipotérmica en ratas al ser administrado por vía intraperitoneal a la dosis de 0.05g/kg. Este mismo extracto presentó una actividad antiinflamatoria y diurética en ratas por vía intragástrica y también una actividad inhibitoria de la movilidad intestinal en ratones al
administrarse por vía intraperitoneal, efecto que fue reproducido en íleon de conejo con una fracción insaponificable de la hoja y en íleon de rata con un extracto acuoso de las hojas (46).
En el hombre, el extracto acuoso de la hoja provocó un estado de ansiedad en
2.3. Aceites Esenciales Y Extractos
Generalidades del Aceite esencial del Cymbopogon Citratus
La planta de Cymbopogon citratus proporciona entre el 0,5-0,7% de aceite esencial, líquido amarillo transparente, de olor cítrico, formado por los compuestos siguientes: geranial y neral, (compuestos mayoritarios), geraniol, neral, furfural, citronelal, metilheptenona y Beta mirceno. El aceite esencial de
Cymbopogon citratus tiene actividad antimicrobiana sobre E. coli, Bacillus
Subtilis y Staphylococcus aureus, esta actividad se debe al geranial y al neral
(47).
Geranial
Citral, Geranial, 3,7-dimethyl-2,6-octadienal o lemonal, con fórmula química C10H16O, es un par de terpenoides con dobles isómeros. está presente en los aceites de varias plantas, incluyendo Backhousia citriodora (90-98%), Litsea citrata (90%), Litsea cubeba(70-85%), Cymbopogon (65-85%), Leptospermum liversidgei (70-80%), Ocimum gratissimum (66.5%), Lindera citriodora ( 65%), Calypranthes parriculata (sobre 62%), petitgrain (36%), Aloysia citriodora (30-35%), Eucalyptus staigeriana (26%), Melissa officinalis(11%), lima (6-9%), limón (2-5%), y naranja (48)
Polifenoles
2.4. Streptococcus mutans Tipo de microorganismo
Streptococcus mutans es un coco Gram positivo, dispuesto en cadena, no móvil, catalasa negativa, productor rápido de ácido láctico con capacidad de cambiar un medio de pH 7 a pH 4.2 en, aproximadamente, 24 horas. Fermentador de glucosa, lactosa, rafinosa, manitol, inulina y salicina con la producción de ácido. Normalmente no desamina la arginina para producir amoniaco. Usualmente no producen ni hemólisis ni decoloración en agar sangre, es principalmente alfa o gamma hemolítico en agar sangre de cordero, aunque se han reportado unas pocas cepas hemolíticas. Streptococcus mutans se ha subclasificado en varios tipos con base en las propiedades inmunológicas, biológicas y genéticas: los serotipos de Streptococcus mutans son c, e, f y k. El hábitat natural de S. mutans es la boca humana. En cavidad oral, las colonias se adhieren muy cerca de la superficie del diente e igualmente se puede recuperar en lesiones cariosas. Puede aislarse frecuentemente de heces en humanos y ratas. Aunque S. mutans no se distribuye ampliamente en animales salvajes, se ha aislado en monos, murciélagos, ratas salvajes habitantes de campos de cultivo de caña de azúcar y de monos Rhesus. Igualmente, se ha aislado en ratas y hámsteres de experimentación (49).
Transmisión, Colonización y estabilidad de Streptococcus mutans en cavidad oral
mutans se ha asociado con la habilidad de colonizar y resistir el stress ambiental (50).
Resistencia Antimicrobiana
• La resistencia a los antimicrobianos (RAM) pone en peligro la eficacia de
la prevención y el tratamiento de una serie cada vez mayor de infecciones por virus, bacterias, hongos y parásitos (51).
• La RAM supone una amenaza cada vez mayor para la salud pública
mundial y requiere medidas por parte de todos los sectores del gobierno y la sociedad (51).
• El éxito de la cirugía mayor y la quimioterapia se vería comprometido en
ausencia de antibióticos eficaces (51).
• La prolongación de la enfermedad, la necesidad de más pruebas y la
utilización de fármacos más caros aumentan el costo de la atención sanitaria a los pacientes con infecciones resistentes en comparación con el de los pacientes con infecciones no resistentes (51).
• Cada año, 480 000 personas presentan TB multirresistente, y la
farmacorresistencia empieza a complicar también la lucha contra el VIH y el paludismo (51).
La RAM se produce cuando los microorganismos (bacterias, hongos, virus y parásitos) sufren cambios al verse expuestos a los antimicrobianos (antibióticos, antifúngicos, antivíricos, antipalúdicos o antihelmínticos, por ejemplo). Los microorganismos resistentes a la mayoría de los antimicrobianos se conocen como ultrarresistentes. Como resultado, los medicamentos se vuelven ineficaces y las infecciones persisten en el organismo, lo que incrementa el riesgo de propagación a otras personas (51).
Resistencia Antimicrobiana del Streptococcus Mutans
farmacocinéticas favorables (52). La prevalencia de resistencia a la amoxicilina de S. mutans varía según el consumo o no de antibióticos β-lactámicos. Los
resultados muestran que el tratamiento con este tipo de antibióticos produce una baja sustancial en la recuperación de cepas de S. mutans, lo que significa que continúa siendo un tratamiento efectivo de la mayoría de infecciones odontogénicas y para profilaxis de endocarditis; pero es evidente que producen un desequilibrio en los ecosistemas orales (53).
Potencia o actividad antimicrobiana
La potencia o actividad de los antibióticos se calcula comparando el grado de inhibición de microorganismos sensibles y específicos determinada por concentraciones conocidas del antibiótico analizado y una sustancia de referencia. Las sustancias de referencia empleadas en los ensayos, son sustancias cuya actividad se ha definido por un organismo reconocido por la autoridad sanitaria nacional. En los antibióticos puede haber ligeros cambios químicos que se traducen en pérdida de actividad antimicrobiana que no pueden demostrarse por métodos químicos, por esta razón, en caso de duda respecto a la actividad de un antibiótico, los métodos de valoración microbiológica prevalecen sobre los métodos químicos (54).
Sitios de acción de los antimicrobianos
Se considera antimicrobiana cualquier sustancia que inhiba el crecimiento de los microorganismos. El agente ideal debería tener toxicidad máxima para el patógeno y provocar mínimo daño a los tejidos del huésped. Esta característica se denomina "toxicidad selectiva" y es mayor cuando el fármaco bloquea una vía metabólica que está ausente en las células de los mamíferos o es radicalmente diferente de la que poseen las bacterias (64)
Los agentes que inhiben la síntesis proteica incluyen los aminoglucósidos, las tetraciclinas, el cloranfenicol, los macrólidos, las lincosaminas y el ácido fusídico. Los aminoglucósidos son los únicos con actividad bactericida; los restantes son bacteriostáticos, la adquisición de resistencia a los antimicrobianos disminuye mediante la reducción del uso inadecuado de antibióticos. (64).
2.5. Conclusiones Parciales
1. La Hierba Luisa es una planta con un alto contenido de sustancias antimicrobianas, por un lado, su aceite esencial rico en terpenoides, del cual el de mayor presencia es el Citral un conocido compuesto antimicrobiano; por otro contenido de compuestos polifenólicos y flavonoides, que no solamente son antioxidantes, sino que también presentan actividad antimicrobiana.
2. El extracto etanólico (hidroalcohólico al 75%) es un extracto eficiente, pues el etanol es un solvente polar que atraviesa con mayor facilidad la membrana celular y así poder aislar selectivamente compuestos polares, como los polifenoles totales y flavonoides, entre otros.
3. La acción antimicrobiana de los fenoles es más eficiente en bacterias Gram positivas
4. Los polifenoles presentan efecto bacteriostático sobre S mutans,
estudios mostraron una notoria disminución y falta de adherencia en la
formación de la placa (65)
CAPITULO II. MARCO METODOLÓGICO
La Modalidad del presente trabajo investigativo es Cualitativa y Cuantitativa, con un diseño experimental y por alcance es una investigación Correlacional
Se evaluó la actividad antimicrobiana del extracto etanólico de hierba luisa
Cymbopogon citratus a distintas concentraciones, la planta fue adquirida en un mercado del norte de Guayaquil, aunque se siembra y cosecha preferentemente en la región Costa con clima cálido y buena irrigación.
2.6. Diseño Experimental
En el presente estudio se observará el efecto de los compuestos aislados de las hojas de Hierba Luisa, su extracto etanólico sobre S. mutans. Las diluciones a trabajar serán a 25%, 50% y 75% y el procedimiento microbiológico a seguir será la técnica por difusión de disco, mismo que es un método cualitativo y cuantitativo. El diseño experimental de esta investigación conlleva observar el efecto del extracto bruto etanólico de C. citratus sobre S. mutans en diluciones prestablecidas de 25%, 50%, 75% y 100%. Para realizar el análisis estadístico de los datos, se aplicó ANOVA de una sola vía con ajuste de Bonferroni para establecer la diferencia entre el tratamiento control y las distintas diluciones del extracto. Un análisis de ANOVA de dos vías se aplicó para establecer las diferencias entre tratamientos con un ajuste de prueba de Tukey. La significancia, se reportó con un intervalo de confianza del 95% y significancia estadística menor o igual a 0.05. Para realizar estos cálculos, se empleó los programas estadísticos SPSS 13.0 y Graphpad Prism 7 con software bajo licencia institucional.
2.7. Caracterización Botánica
2.8. Material vegetal y obtención de los extractos. Recolección de la Muestra
La Recolección de “atados” que son hojas de Hierba Luisa se realizó en el
Mercado de Sauces 9 de la ciudad de Guayaquil Ecuador
Criterios de Inclusión y exclusión
a) Inclusión: hojas adultas, enteras, color verde uniforme
b) Exclusión: hojas pequeñas que no han llegado a la adultez, atacadas por insectos, ennegrecidas, quemadas por el sol, viejas o descompuestas.
De las hojas seleccionadas se separó un atado para realizar las pruebas físico químicas, aquellas que cumplieron el criterio de inclusión, fueron secadas a 60°c, luego se trituraron manualmente, logrando una cantidad de 35g.
Pruebas analíticas
Para todas las pruebas analíticas se trabajó las muestras por triplicado.
Humedad
Llevar al horno secador las cáscaras para extraer la humedad de las mismas a 60ºC durante 4 horas (22).
Porcentaje de humedad de la muestra:
% H = (p – p”)/ p x 100 p = peso inicial de la muestra
p”= peso final de la muestra
Cenizas totales
Con la ayuda de 2 crisoles previamente tarados, pesamos 2 gr. de muestra vegetal seca y molida en cada crisol, y llevamos a la mufla por el lapso de 3 horas a 750ºC, pasado este tiempo dejar en secador y pesar (22)
M2 = Masa de crisol con cenizas
M1 = Masa de crisol con muestra de ensayo
M = Masa de crisol vacío
Cenizas Totales en Agua
Pesar 2 g de muestra vegetal seca y molida en dos crisoles respectivamente, llevar a la Estufa por 3 horas a 750ºC, pasado este tiempo dejar en secador y pesar (22).
M2 = Masa de crisol con cenizas
M1 = Masa de crisol con muestra de ensayo
M = Masa de crisol vacío
C=𝑴𝟐−𝑴𝑴𝟏−𝑴𝑿𝟏𝟎𝟎
Cenizas Totales en Ácido Clorhídrico.
En el crisol con ceniza colocar 2 ml de HCl al 10 %, tapar el crisol con papel aluminio, poner agua a hervir previamente en un vaso de precipitación, posteriormente procedemos a filtrar el contenido del crisol con papel filtro tarado, con la ayuda del agua caliente realizamos varios enjuagues al papel filtro con residuo descartando el líquido del filtrado, en el último enjuague tomamos una muestra del líquido y le adicionamos 1 gota de HNO3 y de 1-2 gotas de AgNO3, si se obtuviese un color blanco en el líquido se procederá a seguir los enjuagues del papel filtro con agua caliente hasta que el líquido al adicionarle las gotas de reactivo no tomasen ningún color; es decir, queden transparente. Luego de esto poner el papel filtro con residuo en el crisol correspondiente para llevarlo a la mufla por 2 horas, a 750 ºC (22).
Pruebas microbiológicas.
sangre Mueller Hilton, incubándose por 24 horas a 37°C. Todos los cultivos se conservaron en refrigeración, a 4°C. A partir de las bacterias cultivadas en el agar nutritivo fueron seleccionadas cuatro o cinco colonias de cada una y se diluyeron en solución salina, hasta alcanzar una turbidez igual a la del tubo 0,5, de la escala de MacFarland. Luego, se efectuó una siembra masiva sobre agar Mueller Hinton, se colocaron los sensidiscos con las respectivas diluciones y se procedió a la incubación, a 37°C por 24 horas, para observar la presencia de halos de inhibición (Sánchez, 1998).
Se trabajó como control positivo con Clorhexidina al 0.12% y control negativo Agua destilada. En la difusión en disco, las cepas diluidas se sembraron masivamente sobre el agar y se colocaron en la superficie del medio cuatro discos de papel de filtro (Whatman) de 6mm de diámetro, impregnados con 0,2mL de cada una de las diluciones de aceite esencial y agua destilada, como control negativo y se incubaron a 37°C, por 24 horas. Ambas pruebas, se efectuaron por triplicado. Posteriormente, se midió el diámetro del halo de inhibición del crecimiento de los microorganismos y se procedió al cálculo del porcentaje del efecto inhibitorio relativo respecto al control positivo, que se procedió aplicando la siguiente expresión (Martínez, 1996):
% 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑜𝑟𝑖𝑜 =𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 ℎ𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 ℎ𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 × 100
The American Type Culture Collection (ATCC)
Es un recurso privado único, no lucrativo dedicado a la colección, preservación y distribución de los cultivos auténticos de: microorganismos vivos, virus, DNA genomas, plantas, y de células humanas y animales (ATCC, 2006) (ATCC, AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION, 2006)
2.9. Estudio Etnofarmacológico
El uso de hierba luisa en forma de decocción está muy generalizado en la región Costa ecuatoriana, su preferencia se debe a su sabor suave a limón y su agradable aroma; en ocasiones se bebe como sustituto de café. Sin embargo, en las zonas rurales se toma como medicina natural para tratar dolores estomacales, cólicos de gases y para inducir el sueño. La presente investigación etnofarmacológica se llevó a cabo en el centro del cantón Flavio Alfaro, Provincia de Manabí Ecuador.
Para obtener la información necesaria se realizó una encuesta en una población de 50 personas que presentan una edad de 50 a 70 años, conformada por amas de casa, abuelas-os y familiares, la edad de la población se definió porque poseen conocimiento de los beneficios medicinales de algunas plantas. La información recabada queda expresa en la tabla 1
Tabla 1. Plantas con Uso Medicinal. - Cantón Flavio Alfaro
PLANTA MEDICINAL CONOCIMIENTO (50
PERSONAS)
Porcentaje %
ALFALFA 50 100 %
AJO 35 70 %
BOLDO 47 94 %
HIERBA LUISA 28 56 %
MANZANILLA 50 100 %
CHANCAPIEDRA 50 100 %
LLANTEN 49 98 %
EUCALIPTO 47 94 %
OREGANO 49 98 %
COLA DE CABALLO 45 90 %
RUDA 50 100 %
Fuente. Autora
Las plantas medicinales más utilizadas en el sector de estudio son alfalfa, chancapiedra, manzanilla, sábila y ruda. La hierba Luisa es utilizada con más frecuencia como bebida aromática, una parte de la población si conoce su uso medicinal.
2.10. Conclusiones Parciales
1. Las pruebas físico químicas expresan resultados que pueden relacionarse con el hábitat de la planta estudiada, tales como humedad y cenizas.
2. Se utilizó la elaboración de extractos como un procedimiento de laboratorio que permite extraer compuestos polares de muestras vegetales, con un rendimiento eficiente y con alta pureza.
3. El extracto etanólico presenta como ventaja sobre el acuoso, es que penetra mejor las membranas celulares y puede extraer los compuestos orgánicos polares.
4. Los extractos son vehículos que contienen las compuesto polifenólicos y presenta la ventaja de que no se modifican las características de estos. 5. A través de la técnica de difusión de disco es viable obtener valores
tanto cualitativos como cuantitativos del comportamiento antimicrobiano del aceite esencial frente a una bacteria.
6. La medición del Halo de Inhibición es el referente para determinar el grado de sensibilidad de una bacteria frente a un agente objeto de estudio
3. CAPITULO III. MARCO PROPOSITIVO
3.1. DESARROLLO DE LA PROPUESTA
El extracto etanólico de las hojas de B. genistelloides mostraron actividad inhibitoria contra S. mutans, comprobado por las diversas concentraciones y diluciones aplicados en este estudio.
3.2. Evaluación de la actividad antibacteriana.
Para determinar si los datos obtenidos en el laboratorio de los halos de inhibición causados por el extracto etanólico de la Cymbopogon citratus, se realizaron cuadros estadísticos de los promedios de los halos para comprobar la distribución de los datos y la confiabilidad de ellos.
Las pruebas de actividad antibacteriana realizadas por los métodos de difusión en disco mostraron que el extracto Cymbopogon citratus presenta actividad antimicrobiana frente a S. mutans en las tres réplicas.
La eficacia encontrada con el extracto etanólico de Cymbopogon citratus puede compararse con otros estudios, donde se concluye que el extracto metanólico, de esta planta, tienen una actividad contra bacterias Gram positivas (B. subtilis
y S. aureus). En cuanto a lo señalado por Martínez (2017), en este estudio el extracto etanólico por si solo si inhibió a P. aeruginosa. Según Kumara et al. (2006) esta planta tiene un efecto inhibitorio alto frente a S. aureus, pero no trabajó en S. mutans, que, en cambio, en este trabajo presento Sensibilidad Límite
3.3. Análisis de los Resultados
Parámetros Físico Químicos
Para los parámetros físico químicos de Cymbopogon citratus los resultados obtenidos son:
Tabla 2. Parámetros físico químicos de Cymbopogon cutratus.
PARÁMETRO PORCENTAJE
HUMEDAD 75.5 %
CENIZAS TOTALES 1.25 %
CENIZAS SOLUBLES EN AGUA 0.65 %
CENIZAS INSOLUBLES EN HCl 0.33 %
El alto contenido de humedad se debe a que la muestra de Cymbopogon citratus fue recolectada durante la temporada invernal, la alta presencia de lluvias favorece la presencia de agua en los tejidos, y en el caso de querer extraer aceites esenciales estos ven disminuida su presencia y calidad por el mismo motivo.
El volumen de extracto etanólico preparado con la muestra desecada y triturada fue de 100ml, se separaron 25 ml para la concentración al 100%, de este extracto al 75% se realizaron las diluciones al 4%, 5% y 15%, aplicando la fórmula:
Tabla 3. Volúmenes de extracto etanólico de Cymbopogon citratus diluido.
CONCENTRACION 4% 1875 ml
CONCENTRACION 5% 1500 ml
CONCENTRACIÓN 15% 500 ml
En cuanto a la determinación del efecto inhibidor del extracto etanólico de la Hierba Luisa Cymbopogon citratus en concentraciones de 4%, 5% y 15 % sobre el crecimiento del in vitro de Streptococcus mutans. Se compararon la sensibilidad del Streptococcus mutans frente al extracto etanólico, a la clorhexidina al 0.12% como control positivo y al agua destilada como el control negativo. Se utilizó la escala de Duraffourd para determinar las escalas de milímetros de los halos de inhibición, esta escala demuestra si existe sensibilidad de la bacteria, en este caso la Streptococcus mutans frente al extracto etanólico.
Tabla 4. Escala de Duraffourd para la determinación del efecto antibacteriano en función del diámetro del halo de inhibición.
Criterio de Sensibilidad
Nula < 6 mm
Sensibilidad límite 6 - 14 mm
Sensibilidad media 14 - 20 mm
Sumamente sensible > 20 mm
Tabla 5. Tabla de resumen de datos que incluye datos estadísticos descriptivos de la medición de los halos generados a partir de los tratamientos aplicados a cada cultivo.
Control (Clorhexidina) T1 (25%) T2 (50%) T3 (75%) T4 (100%)
Minimum 14,83 5,65 6,725 7,825 12,08
25% Percentile 14,83 5,65 6,763 7,825 12,08
Median 15,73 5,725 6,838 7,85 12,08
75% Percentile 15,78 5,8 6,906 7,85 12,1
Maximum 15,78 5,8 7 7,85 12,1
Mean 15,44 5,725 6,842 7,842 12,08
Std. Deviation 0,4782 0,08216 0,09443 0,01291 0,01291
Std. Error of Mean 0,1952 0,03354 0,03855 0,00527 0,00527
Lower 95% CI of mean 14,94 5,639 6,743 7,828 12,07
Upper 95% CI of mean 15,94 5,811 6,941 7,855 12,1
Coefficient of variation 3,10% 1,44% 1,38% 0,16% 0,11%
Geometric mean 15,44 5,725 6,841 7,842 12,08
Geometric SD factor 1,032 1,014 1,014 1,002 1,001
Sum 92,65 34,35 41,05 47,05 72,5
Tabla 6. Parámetros de análisis y matching para análisis de datos de evaluación por pruebas estadísticas
Repeated measures ANOVA summary
Assume sphericity? Yes
F 1979
P value <0,0001
P value summary ****
Statistically significant (P < 0.05)? Yes
Geisser-Greenhouse's epsilon 0,2857
R square 0,9975
Bajo los parámetros ajustados y establecidos en la Tabla 7 se llevaron a cabo todos los análisis posteriores. Con el propósito de evaluar si existe diferencia entre los resultados obtenidos a partir de cada plato sujeto de estudio se llevó a cabo un análisis de comparación de filas.
Los resultados se los puede visualizar en la Tabla 7. Los resultados muestran que no existe diferencias estadísticamente significativas entre filas, pero sí entre columnas, por lo que se infiere que el sesgo entre platos queda desestimado, otorgando robustez al ensayo.
Tabla 7. Resultados del análisis de diferencia entre platos de cultivo y entre tratamientos aplicados, incluidos en el estudio.
ANOVA table SS DF MS F (DFn, DFd) P value
Treatment (between columns) 396 4 99,01 F (1,143, 5,714) = 1979 P<0,0001 a
Individual (between rows) 0,2227 5 0,04453 F (5, 20) = 0,8901 P=0,5062 b
Residual (random) 1,001 20 0,05003
Continuando con el análisis de datos, se procede a correr un ANOVA de una sola vía de múltiples comparaciones con un ajuste de Bonferroni (Bonferroni's multiple comparisons test), con un intervalo de confianza al 95% y una significancia fijada en menor o igual a 0.05, con el objetivo de establecer diferencias entre los tratamientos aplicados al cultivo in vitro de S. mutans. Los resultados de las múltiples comparaciones se muestran en la Tabla 8 y la Ilustración 1.
Tabla 8. Resultados del análisis de one-way ANOVA para comparación del tratamiento control versus diluciones de extracto etanólico.
Bonferroni's multiple comparisons test Mean Diff, 95,00% CI of diff, Adjusted P Value
Control (Clorhexidina) vs. T1 (25%) 9,717 8,962 to 10,47 <0,0001 a
Control (Clorhexidina) vs. T2 (50%) 8,6 7,817 to 9,383 <0,0001 a
Control (Clorhexidina) vs. T3 (75%) 7,6 6,847 to 8,353 <0,0001 a
Control (Clorhexidina) vs. T4 (100%) 3,358 2,624 to 4,093 <0,0001 a
a Diferencia estadísticamente significativa
Tabla 9. Resultados de comparación entre tratamientos (two-way ANOVA). Existe diferencia significativa entre cada uno de ellos.
Tukey's multiple comparisons test Mean Diff, 95,00% CI of diff, Adjusted P Value
Control (Clorhexidina) vs. T1 (25%) 9,717 9,619 to 9,814 <0,0001 a
Control (Clorhexidina) vs. T2 (50%) 8,6 8,502 to 8,698 <0,0001 a
Control (Clorhexidina) vs. T3 (75%) 7,6 7,502 to 7,698 <0,0001 a
Control (Clorhexidina) vs. T4 (100%) 3,358 3,261 to 3,456 <0,0001 a
T1 (25%) vs. T2 (50%) -1,117 -1,214 to -1,019 <0,0001 a
T1 (25%) vs. T3 (75%) -2,117 -2,214 to -2,019 <0,0001 a
T1 (25%) vs. T4 (100%) -6,358 -6,456 to -6,261 <0,0001 a
T2 (50%) vs. T3 (75%) -1 -1,098 to -0,9023 <0,0001 a
T2 (50%) vs. T4 (100%) -5,242 -5,339 to -5,144 <0,0001 a
T3 (75%) vs. T4 (100%) -4,242 -4,339 to -4,144 <0,0001 a
a Diferencia estadísticamente significativo
Mediante el uso de la Ecuación 1, se procede a obtener los datos del porcentaje de inhibición a partir de los datos mostrados en la Tabla 5, obtenida del software estadístico.
% 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑜𝑟𝑖𝑜 =𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 ℎ𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 ℎ𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 × 100
% Efecto Inhibitorio =12,08
15,44 × 100
3.4. Discusión de los Resultados Obtenidos.
Con el fin de cumplir con los objetivos del presente estudio, en primera instancia se verificó que la muestra vegetal recolectada corresponda a
Cymbopogon citratus, los resultados de estos análisis se muestran en el apartado de anexos. Mediante experimentos controlados in vitro se llevaron a cabo pruebas para medir el efecto bactericida del extracto etanólico de C. citratus sobre S. mutans. Un extracto bruto etanólico, obtenido a partir de C. citratus, se probó a contracciones de 25%, 50%, 75% y 100% en 6 repeticiones independientes, frente a S. mutans por el método de difusión de disco.
En cada ensayo sobre S. mutans, todas las diluciones mostraron actividad bactericida. El extracto bruto etanólico al 25% mostró una actividad inhibitoria promedio de 5,7 mm, mientras que la concentración al 50% mostró una actividad inhibitoria promedio de 6,8 mm. Los extractos etanólicos al 75% y al 100% mostraron una alta actividad antibacteriana, respecto de los extractos al 25% y 50%, contra S. mutans con un halo de inhibición promedio de 7,8 mm y 12,1 mm, respectivamente. Estos hallazgos son comparables con otros estudios en los que se mostró eficiencia de efecto inhibitorio de especies vegetales contra S. mutans (31-33). En lo referente a la especie de C. citratus, los extractos foliares presentan algunas actividades farmacológicas, como antidiarreicos antiinflamatorios además de actividades antimicrobianas (27). Las bacterias cariogénicas son conocidas por su capacidad de adherencia a las superficies dentales (41–43). Los extractos de C. citratus se han estudiado por su efecto antiadherente sobre las bacterias cariogénicas en el proceso de formación de placa dental (26). Los compuestos triterpénicos activos aislados del extracto alcohólico de C. citratus ha sido demostrados previamente para ser un potencial agente antiplaca al inhibir el crecimiento de S. aureus, por citar un ejemplo (42, 43).
estadística de Tukey, para establecer similitudes o diferencias entre todos los tratamientos. Los resultados mostraron que entre todos los tratamientos existe diferencias estadísticamente significativas y que, además, la actividad bactericida está directamente relacionada, o es directamente proporcional, con el incremento en la concentración del extracto, tal y como se puede observar en la ilustración 1 y en la tabla 9.
Análisis posteriores, con el propósito de elucidar si el efecto del extracto etanólico al 100% fue similar al presentado por el Clorhexidina, se llevó a cabo un cálculo referente al porcentaje del efecto inhibitorio del extracto. El resultado encontrado ratificó el potencial efecto del extracto al arrojar una tasa porcentual de 78,23%. Este resultado, en particular, muestra claramente que el efecto del extracto es similar al mostrado por la Clorhexidina a pesar de que el análisis estadístico mostrará que su efecto in vitro es distinto (T4 vs Clorhexidina).
Todos los resultados presentados en el presente estudio apoyan y sustentan la idea de la actividad bactericida in vitro del extracto etanólico de C. citratus
frente a una cepa de S. mutans. Sin embargo, en el presente estudio, se ha evaluado el efecto del extracto etanólico en concentraciones más altas y bajas. Es evidente, que un extracto acuoso de C. citratus deberá ser probado en futuros ensayos, pues es el medio de consumo altamente aceptado por comunidades rurales en relación a los datos obtenidos en el estudio etnofarmacológico, a más de ser necesario el suprimir el sesgo que se pudiese generar por la presencia del etanol en el extracto probado. Por otra parte, si bien es claro que el extracto alcohólico puede mostrar un sesgo en los resultados debido a la acción del etanol y potenciar el efecto del extracto como se ha dicho anteriormente, resulta evidente el incremento de la actividad del extracto conforme su concentración aumenta datos que valida el efecto por sí mismo del extracto, y de las moléculas inherentes a él.
4. CONCLUSIONES
El extracto etanólico de Cymbopogon citratus, a las concentraciones de
25%, 50%, 75% y 100%, presentó actividad antimicrobiana de acuerdo al diámetro de los halos de inhibición.
La actividad antimicrobiana del extracto etanólico de Cymbopogon citratus sobre S. mutans versus la actividad del control positivo Clorhexidina fue similar numéricamente, aunque sin una significancia estadística positiva.
El porcentaje inhibitorio del extracto etanólico a una concentración del
100% representa un 78,23% de inhibición lo cual indica una acción antibacteriana alta cuando su porcentaje de inhibición relativo es >70%.
Estudios posteriores son necesarios para elucidar el efecto del extracto
acuoso mediante ensayos in vitro en cepas aisladas de bacterias presentes en la caries y ensayos in vivo antes de usarlo como enjuague bucal preventivo y componentes de pasta dental.
5. RECOMENDACIONES
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