Desarrollo y aplicación de herramientas para la
evaluación de la calidad del medio marino del
País Vasco: bioensayos con
Paracentrotus lividus y Corophium spp.
Tesis Doctoral dirigida por:
Dr. Javier Franco San Sebastián
Dr. Joxe Mikel Garmendia Etxandi
Memoria para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas presentada
por:
Iratxe Menchaca Cortazar
AUTORIZACION DEL/LA DIRECTOR/A DE TESIS
PARA SU PRESENTACION
Dr. Javier Franco San Sebastián con N.I.F. 30579539 G
como Director/a de la Tesis Doctoral: Desarrollo y aplicación de herramientas para
la evaluación de la calidad del medio marino del País Vasco: bioensayos con
Paracentrotus lividus y Corophium spp.
realizada en el Departamento Zoología y Biología Celular Animal
por el Doctorando Don/ña. Iratxe Menchaca Cortazar,
autorizo la presentación de la citada Tesis Doctoral, dado que reúne las condiciones
necesarias para su defensa.
En Leioa a 22 de diciembre de 2009
EL/LA DIRECTOR/A DE LA TESIS
PARA SU PRESENTACION
Dr. Joxe Mikel Garmendia Etxandi con N.I.F. 72441408 X
como Director/a de la Tesis Doctoral: Desarrollo y aplicación de herramientas para
la evaluación de la calidad del medio marino del País Vasco: bioensayos con
Paracentrotus lividus y Corophium spp.
realizada en el Departamento Zoología y Biología Celular Animal
por el Doctorando Don/ña. Iratxe Menchaca Cortazar,
autorizo la presentación de la citada Tesis Doctoral, dado que reúne las condiciones
necesarias para su defensa.
En Leioa a 22 de diciembre de 2009
EL/LA DIRECTOR/A DE LA TESIS
ACTA DE GRADO DE DOCTOR
ACTA DE DEFENSA DE TESIS DOCTORAL
DOCTORANDO DOÑA. Iratxe Menchaca Cortazar
TITULO DE LA TESIS:
Desarrollo y aplicación de herramientas para la evaluación de la calidad del medio
marino del País Vasco: bioensayos con Paracentrotus lividus y Corophium spp.
El Tribunal designado por la Subcomisión de Doctorado de la UPV/EHU para calificar
la Tesis Doctoral arriba indicada y reunido en el día de la fecha, una vez efectuada la
defensa por el doctorando y contestadas las objeciones y/o sugerencias que se le han
formulado, ha otorgado por___________________la calificación de:
unanimidad ó mayoría
En
a
de
de
EL/LA PRESIDENTE/A,
EL/LA SECRETARIO/A,
Fdo.:
Fdo.:
Dr/a: ____________________ Dr/a: ______________________
VOCAL 1º,
VOCAL 2º,
VOCAL 3º,
Fdo.:
Fdo.:
Fdo.:
Dr/a:
Dr/a:
Dr/a:
LA DOCTORANDA,
una beca de Formación de Tecnólogos durante los años 2005-2007 y una beca predoctoral durante los años 2007-2010, por parte de la Fundación Centros Tecnológicos- Iñaki Goenaga.
Además, diversos proyectos han contribuido a que el presente trabajo haya podido llevarse a cabo:
- Proyecto “Estudios para el desarrollo de un laboratorio de ecotoxicología”,
(2005-2006), financiado por el Dpto de Industria, Comercio y Turismo del
Gobierno Vasco programa SAIOTEK”.
- Proyecto “Cultivo de organismos clave para la evaluación y gestión de
sedimentos marinos y portuarios” (2006-2007), financiado por el Ministerio
de Industria, Turismo y Comercio, programa PROFIT Centros Tecnológicos. - Proyecto “Desarrollo y validación de metodologías integradas para la
evaluación de la calidad ambiental de zonas portuarias” 2007-2010, dentro del proyecto “SEDIPORT: Evaluación Integral de la Contaminación en Sedimentos Portuarios del Litoral Norte Español Mediante Herramientas Químicas, Bioquímicas y Ecotoxicológicas)” financiado por el Ministerio de Educación y Ciencia en la convocatoria de proyectos del. Plan Nacional de I+D.
En primer lugar, me gustaría dar las gracias a la Fundación Centros Tecnológicos, y especialmente a Azti- Tecnalia, por la oportunidad que me dieron hace ya más de 4 años, cuando comencé esta tesis.
En segundo lugar quiero dar las gracias a mis dos directores, Javi y Joxemi: Eskerrik asko en mayúsculas. Esta tesis es el reflejo de un trabajo realizado en equipo, un fantástico equipo. Gracias por vuestro apoyo, dedicación y confianza. Quiero también agradecer al equipo de ecotoxicología de la Universidad de Vigo, especialmente a Liliana y Ricardo Beiras, que me abrieran sus puertas y compartieran conmigo su experiencia y conocimientos. “Graciñas” de verdad.
También me siento profundamente agradecida a todas aquellas personas que de forma directa o indirecta me han ayudado en estos años:
Gracias Maripeich, Irene, Furgen y Puri por vuestro cariño y cuidados en todo momento, dentro y fuera del centro (cuando alguien trabaja a gusto, rinde el doble). Gracias Jou, por acercarme al mundo de la química analítica, y gracias también por tus consejos, ¡han sido fundamentales! Gracias Mariaje, por tu cercanía y apoyo, desde el comienzo de este trabajo. Gracias Marta, por enseñarme la diferencia entre organizarse y organizarse bien. Gracias Ángel, sin duda, hay un antes y un después en este trabajo, después de tus comentarios y correcciones. Además, es un auténtico privilegio poder trabajar a tu lado. Gracias Víctor, por compartir tus infinitos conocimientos, enriqueciendo así el contenido final de este trabajo. Gracias Germán, por tu pa-cien-cia, por mostrarme la diferencia entre publicar y redactar una tesis. En definitiva, por contribuir a mejorar la calidad de esta tesis. Gracias Iñigo, por estar siempre ahí, por enseñarme la importancia del detalle y por hacer que lo complicado parezca sencillo.
Un gracias especial a Esti, mi hermana mayor en el mundo de la investigación. Gracias por tus constantes muestras de afecto y por guiarme en cada decisión importante.
Albaina (por alegrarme cada día), Naroa (por compartir tu experiencia), Maialen (por tus clases express de estadística, ¡imprescindibles!), Nere, Caballero, Astoreka, Ganix, Izaro, Ainhoa, Agur, Eneko, María, Nicolás, Josean, Marta, Katerine, Iker, Maitane, Mireia, Jon, Iñaki, Nekane, por crear un fantástico ambiente dentro y fuera de la sala, hacen todo más llevadero. Especialmente, agradecer a mi compi de isla, la mujer informática, Flo y su e-Rabbit, nuestros momentos de risas y complicidad. También, agradecer a mi tocaya barakaldesa Natalia, tu absoluta generosidad y tu contagioso entusiasmo, sin duda, han hecho todo mucho más fácil. Gracias a mi cuadrilla y a mis amigas donostiarras, por comprender mis ausencias y por vuestro cariño incondicional.
Gracias a toda mi familia (directa y política), porque sois mi mayor tesoro. Eukeni, gracias por abrirme camino y por ayudarme con la maquetación.
Gracias a mis aitas, por ser mi mejor ejemplo y porque sin duda, quien siembra en tierra buena, recoge sus frutos.
Y por último y más importante, gracias a Rubén, el verdadero impulso y motor de esta tesis. A lo largo de estos años me has animado cuando las cosas no han salido según lo esperado, enseñándome a dar a las situaciones la importancia que de verdad tienen. Gracias por mimarme y cuidarme, este éxito es compartido.
CAPÍTULO 1.INTRODUCCIÓN GENERAL... 1
1.1. Introducción ... 3
1.2. Términos y definiciones ... 10
1.3. Objetivos y estructura de la Tesis... 13
CAPÍTULO 2.EL CICLO BIOLÓGICO DEL ERIZO DE MAR PARACENTROTUS LIVIDUS (LAMARCK,1816) EN LA COSTA DEL PAÍS VASCO... 15
2.1. Introducción ... 17
2.2. Material y métodos ... 20
2.2.1. Zona de muestreo... 20
2.2.2. Método de muestreo de erizos y datos de variables ambientales. 22 2.2.3. Trabajos en laboratorio ... 22
2.2.4. Cálculo de los índices gonadales ... 23
2.2.5. Análisis estadístico ... 24
2.3. Resultados ... 24
2.3.1. Estudio del ciclo gonadal en la población intermareal de Donostia ... 24
2.3.2. Comparación del ciclo gonadal en dos poblaciones: intermareal de Donostia y Zumaia... 32
2.4. Discusión ... 35
2.4.1. Estudio del ciclo gonadal en la población intermareal de Donostia ... 35
2.4.2. Comparación del ciclo gonadal en dos poblaciones: intermareal de Donostia y Zumaia... 38
2.5. Conclusiones... 39
CAPÍTULO 3. CONTROL DE LA SENSIBILIDAD DE LA ESPECIE-TEST PARACENTROTUS LIVIDUS MEDIANTE TEST DE TOXICIDAD AGUDA CON TÓXICOS DE REFERENCIA... 41
3.1. Introducción ... 43
3.2. Material y métodos ... 44
3.2.1. Obtención de gametos... 44
3.2.2. Preparación de las diluciones... 44
3.2.3. Comprobación analítica de la estabilidad de las disoluciones... 45
3.2.4. Incubación y respuestas biológicas ... 45
3.3.1. Comprobación analítica de las soluciones ... 47 3.3.2. Comparación de la sensibilidad entre poblaciones ... 48 3.3.3. Evolución de la sensibilidad a lo largo del periodo de estudio ... 51 3.4. Discusión ... 54 3.5. Conclusiones... 57 CAPÍTULO 4.INDUCCIÓN A LA MADURACIÓN DEL ERIZO DE MAR PARACENTROTUS
LIVIDUS (LAMARCK,1816) BAJO CONDICIONES DE LABORATORIO... 59
4.1. Introducción ... 61 4.2. Material y métodos ... 62 4.3. Resultados ... 64 4.4. Discusión ... 68 4.5. Conclusiones... 70 CAPÍTULO 5. CULTIVO DEL ANFÍPODO COROPHIUM MULTISETOSUM (STOCK, 1952) EN CONDICIONES DE LABORATORIO... 83 5.1. Introducción ... 85 5.2. Material y métodos ... 88 5.2.1. Cultivos ... 88 5.2.2. Test con tóxicos de referencia ... 89 5.2.3. Bioensayos con sedimentos ... 91 5.3. Resultados ... 92 5.3.1. Mantenimiento de los cultivos ... 92 5.3.2. Test con tóxicos de referencia ... 94 5.3.3. Bioensayos con sedimentos ... 96 5.4. Discusión ... 98 5.4.1. Mantenimiento de los cultivos ... 98 5.4.2. Sensibilidad de los anfípodos cultivados frente a los de campo ... 98 5.5. Conclusiones y recomendaciones... 100 CAPÍTULO 6. CÁLCULO DE LOS SEDIMENT QUALITY GUIDELINES (SQG) REGIONALES PARA METALES, DENTRO DE LA DIRECTIVA MARCO DEL AGUA...101 6.1. Introducción ... 103 6.2. Material y métodos ... 106 6.2.1. Área de estudio y muestreo de sedimentos ... 106 6.2.2. Recopilación y análisis de los datos ... 107 6.2.3. Cálculo de los SQG ... 109
6.3. Resultados ... 110 6.4. Discusión ... 112 6.4.1. Comparación entre las metodologías de cálculo de los SQG ... 112 6.4.2. SQG normalizados vs. no-normalizados ... 118 6.4.3. Comparación con los valores de fondo ... 118 6.4.4. Comparación con otros SQG... 120 6.4.5. Uso de los SQG regionales para la implementación de la DMA 120 6.5. Conclusiones... 122 CAPÍTULO 7. EVALUACIÓN INTEGRADA DE LA CALIDAD DE SEDIMENTOS MEDIANTE EL MÉTODO TRIAD: UN CASO DE ESTUDIO...123
7.1. Introducción ... 125 7.2. Descripción de la zona de estudio ... 128 7.3. Material y métodos ... 130 7.3.1. Muestreo de los sedimentos ... 130 7.3.2. Análisis físico-químicos de los sedimentos ... 132 7.3.3. Análisis de las comunidades bentónicas... 132 7.3.4. Evaluación ecotoxicológica de los sedimentos ... 132 7.3.5. Integración de las líneas de evidencia ... 133 7.4. Resultados ... 136 7.4.1. Análisis físico-químicos de los sedimentos ... 136 7.4.2. Toxicidad ... 138 7.4.3. Parámetros estructurales del bentos... 142 7.4.4. Integración ... 144 7.5. Discusión ... 149 7.6. Conclusiones... 154 CAPÍTULO 8. SENSIBILIDAD DEL ERIZO DE MAR PARACENTROTUS LIVIDUS (LAMARCK, 1816) A DOS CLASES DISTINTAS DE BIOCIDAS APLICADOS EN CIRCUITOS DE REFRIGERACIÓN DE INSTALACIONES INDUSTRIALES EN ENTORNOS PORTUARIOS...157 8.1. Introducción ... 159 8.2. Material y métodos ... 161 8.3. Resultados ... 162 8.4. Discusión ... 163 8.5. Conclusiones... 167 CAPÍTULO 9.RESUMEN Y CONCLUSIONES GENERALES...169
Paracentrotus lividus... 172
9.2. Alternativas a la no disponibilidad continúa de material biológico utilizado en los test de toxicidad a lo largo de todo el año... 173 9.3. Casos de estudio en los que se ha incluido el bioensayo embrionario del erizo de mar Paracentrotus lividus, como herramienta toxicológica para la evaluación de la calidad del agua y sedimentos marinos ... 174 BIBLIOGRAFÍA...177
1.1. Introducción
A lo largo del último siglo el medio marino costero se ha visto sometido a una gran presión antropogénica derivada del crecimiento de la población en la franja costera y de la intensificación de las actividades portuaria e industrial en este entorno (Halpern et al., 2008). Una de las consecuencias de este proceso de urbanización e industrialización ha sido el aumento de contaminantes presentes en las masas de agua, particularmente en los estuarios, ya que estos sistemas suelen recibir abundantes y variados vertidos (Morillo y Usero, 2008), lo que ha contribuido a un importante impacto ecológico de las comunidades biológicas que albergan (Adams et al., 1992).
El borrador del Real Decreto sobre las Normas de Calidad Ambiental, en el ámbito de la política de aguas (2009), define la contaminación como “la introducción directa o indirecta, como consecuencia de la actividad humana, de sustancias o energía en la atmósfera, el agua o el suelo, que puedan ser perjudiciales para la salud humana o para la calidad de los ecosistemas acuáticos, o de los ecosistemas terrestres que dependen directamente de ecosistemas acuáticos, y que causen daños a los bienes materiales o deterioren o dificulten el disfrute y otros usos legítimos del medio ambiente”. Dichos contaminantes pueden proceder de vertidos de aguas residuales industriales y urbanas (Windom, 1992; French, 1993; Virkanen, 1998; Mestres et al., 2010), pueden estar asociados a vertidos procedentes de la agricultura y la ganadería (Bell, 1991; Goonetilleke et al., 2009) y, durante los últimos años, se pueden encontrar asociados a la actividad acuícola (Gowen y Bradbury, 1987; Kalantzi y Karakassis, 2006; Tomassetti et al., 2009).
Los sedimentos costeros y estuáricos almacenan partículas y restos biológicos y son sumideros de una gran variedad de sustancias químicas. El principal motivo de preocupación con respecto a la contaminación de los sedimentos radica en que muchas especies de interés comercial y otros organismos clave en las redes tróficas marinas pasan buena parte de su ciclo vital en contacto con los sedimentos. Esto supone una vía de paso de sustancias potencialmente tóxicas hacia niveles tróficos superiores, lo cual puede afectar, finalmente, a los seres humanos.
Hoy en día apenas existen estuarios “limpios” en las regiones relativamente pobladas del planeta, como las costas europeas. Casi todos exhiben un mayor o menor grado de contaminación. Sin embargo, sus efectos no suelen ser tan intensos
como cabría esperar por los numerosos vertidos que estos sistemas reciben. Ello es fundamentalmente debido a dos razones. Por un lado, gracias al continuo flujo y reflujo mareal, la tasa de renovación de las aguas en los estuarios es, por lo general, elevada. Esto reduce los efectos de los vertidos, si bien se traduce en un transporte de los contaminantes hacia el mar.
Por otro lado, en las zonas interiores de los estuarios, donde la salinidad es inferior a 5, se produce la floculación del material particulado (agregación de partículas de muy pequeño tamaño), proceso que provoca la sedimentación dicho material a lo largo del sistema. De esta forma, diversas sustancias contaminantes, normalmente asociadas a partículas, son atrapadas en el sedimento, lo cual puede ser considerado como un mecanismo reductor de la contaminación. De hecho, a menudo los estuarios son considerados “trampas” de sedimentos.
Una vez en el sedimento algunas sustancias pueden quedar atrapadas de forma casi definitiva, mientras que otras, bajo determinadas circunstancias (asociadas con las condiciones fisicoquímicas del medio y con actuaciones humanas), pueden ser liberadas a la columna de agua. Por eso, el análisis de diversos compuestos en los sedimentos ofrece una idea tanto del grado de contaminación acumulada a lo largo del tiempo en un punto determinado como de la potencialidad del sedimento como fuente de contaminación futura.
Los sedimentos estuáricos y costeros han sido ampliamente utilizados para evaluar la calidad de los sistemas acuáticos por diversas razones (diversos autores, en Calmano y Förstner, 1996):
- A diferencia de lo que ocurre en la fase acuosa, en los sedimentos muchos de los contaminantes de mayor interés se suelen hallar en concentraciones fácilmente cuantificables por los procedimientos analíticos habituales.
- A diferencia de la elevada variabilidad temporal en la fase acuosa, los sedimentos integran las concentraciones de sustancias a lo largo del tiempo.
- Las políticas a largo plazo en la gestión de sistemas acuáticos requieren “estrategias integradas”, entre las cuales se incluye el estudio de contaminantes asociados a los sedimentos.
- Los criterios de calidad basados en los sedimentos pueden suponer una medida simple y poco costosa para una primera estimación de las zonas más problemáticas, así como proporcionar una información rápida a los gestores.
- Los criterios de calidad de los sedimentos pueden ser incorporados en normativas, ya que se pueden establecer criterios específicos para cada sustancia y compararlos con medidas de campo para determinar el grado de concordancia con efectos adversos significativos.
- Los planes de gestión de sistemas acuáticos se basan cada vez más en la capacidad de asimilación de las áreas receptoras, lo cual requiere un conocimiento de las propiedades de los materiales sedimentarios como medio sumidero de sustancias tóxicas.
- Hay una amplia variedad de problemas relacionados con sedimentos de dragado. Las autorizaciones para este tipo de actuaciones y para el vertido del material deben estar basadas en protocolos estandarizados y procedimientos de ensayo.
Debido a las peculiares características hidrodinámicas de los estuarios, con grandes diferencias entre zonas en las tasas de deposición y en las tasas de renovación del agua, en los estuarios abundan las zonas con sedimentos de tipo limoso con altas concentraciones de materia orgánica, lo que favorece de forma directa la absorción de contaminantes (Warren, 1981; Davies-Colley et al., 1984; Horowitz, 1985; Lara et al., 1985). De esta manera, los sedimentos reflejan de una manera muy eficaz el grado de contaminación de un determinado área (Salomons et
al. 1987) y por lo tanto, son considerados buenos indicadores de los impactos
antropogénicos en ambientes estuarinos (Ridgway y Shimmield, 2002).
En el caso concreto de los estuarios del País Vasco, a partir de la década de los 80 se produjo una importante recesión en la actividad industrial, y por lo tanto, la introducción de contaminantes al medio se vio reducida (Arias et al., 2008). Sin embargo, en los sedimentos aún siguen atrapados gran cantidad de metales y contaminantes orgánicos. Belzunce et al. (2001a; 2004b; Solaun et al., 2009) citan concentraciones muy elevadas de contaminantes orgánicos en los sedimentos de los estuarios del Nervión, Oiartzun, Lea, Deba, Urola y Bidasoa, así como de metales pesados en los del Oiartzun, Deba y Urumea. Los contaminantes orgánicos más frecuentes en los sedimentos del País Vasco (PAHs, DDTs, PCBs, HCB, HCH) derivan fundamentalmente de industrias químicas, astilleros y papeleras. En cuanto a los metales pesados con mayor índice de contaminación (Cd, Hg, Cu, Pb, Zn), las fuentes principales son las industrias minero-metalúrgicas, químicas y astilleros. En años recientes sus aportes y concentraciones en los estuarios vascos
han ido en descenso, debido a la implementación de sistemas de saneamiento en buena parte de las cuencas (Franco et al., 2004; Tueros et al., 2009). Sin embargo, cuando algunas condiciones ambientales cambian (pH, Eh,…), bien como consecuencia de actividades antropogénicas (Nieto et al., 2007; Bocchetti et al., 2008), bien debido a la hidrodinámica dominante en el sistema (Chapman y Wang, 2001), dichas sustancias contaminantes pueden removilizarse, reincorporarse a la columna de agua, y provocar efectos adversos en la biota (Li et al., 2001; Horsfall y Spiff, 2002).
Debido al aumento de la sensibilización social por la conservación del medio marino, en las últimas décadas (a partir del siglo XX) se han venido desarrollando políticas dirigidas a la protección integral de los mares y el uso sostenible de los recursos naturales (Parsons, 2005). Esto se ha visto reflejado en directivas y convenios aprobados para controlar las fuentes de alteración y contaminación y para conservar hábitats de especial interés. Una revisión de la situación mundial actual de estas iniciativas de protección y estudio integrado del medio se recoge en Borja et al. (2008a).
Por un lado, con respecto a los diferentes acuerdos firmados para la protección integral de los mares, la Unión Europea ha promovido diversas políticas sectoriales, como son las Directivas sobre Hábitats o Aves, la Política Pesquera Común, o la resolución sobre la Gestión Integrada de Zonas Costeras. Entre las diferentes directivas, una de las que mayor avance ha supuesto en la integración y en la investigación es la Directiva Europea Marco del Agua (Directiva, 2000/60/CE) (Tueros, 2009). Esta directiva establece un marco para la protección de las aguas subterráneas y las aguas superficiales continentales, estuáricas y costeras de los estados miembros. Su principal objetivo es que todas las masas de agua de la Unión Europea alcancen la clasificación de “Buen Estado Ecológico” para el año 2015, por medio de la eliminación de sustancias prioritarias y la reducción, hasta las concentraciones próximas a los valores de fondo, de las sustancias que se encuentran en el medio de forma natural (Borja et al., 2004a). La evaluación del estado ecológico se basa en elementos biológicos, hidromorfológicos y físico-químicos (Borja, 2005).
En el caso de los sedimentos, los estándares de calidad están vagamente desarrollados y, por lo tanto, aún no son ampliamente reconocidos, o carecen de un marco legal, de ahí que se utilicen simplemente como un soporte en la toma de
decisiones (Canadian Council of Ministers of the Environment, CCME 2001 en Gray y Elliot, 2009). De esta manera, en dicha Directiva se hace patente la necesidad de definir el papel que desempeñan los sedimentos y la biota como matrices para la evaluación de la contaminación (Borja et al., 2004b), es decir, resulta conveniente incluir estudios de interacción entre el agua y el sedimento, así como la influencia de los efectos de resuspensión de contaminantes en la columna de agua y su biodisponibilidad e impacto sobre las comunidades. Con objeto de definir ese papel, el 16 de diciembre de 2008, se publicó la Directiva 2008/105/EC, del Parlamento Europeo y del Consejo, relativa a las normas de calidad ambiental en el ámbito de la política de aguas, por la que se modifican y derogan ulteriormente las Directivas 82/176/CEE, 83/513/CEE, 84/156/CEE, 84/491/CEE, 86/280/CEE del Consejo, y por la que se modifica la Directiva 2000/60/CE. En base a esta nueva Directiva, que define los Estándares de Calidad Ambiental (EQS, por sus siglas en inglés), los Estados miembros deben poder establecer EQS para los sedimentos o la biota a escala nacional y aplicar estos EQS en lugar de los EQS para el agua establecidos en esta Directiva. Tales EQS deben establecerse mediante un procedimiento transparente, que implica notificaciones a la Comisión y otros Estados miembros, para así asegurar un grado de protección equivalente a los EQS comunitarios.
En un intento de desarrollar guías de calidad en los sedimentos, Long et al. (1995) calcularon los denominados Sediment Quality Guidelines (SQG) para el Norte de América, es decir, concentraciones límite para contaminantes orgánicos e inorgánicos, por encima de las cuales se esperarían efectos adversos en la biota. Sin embargo, según Chapman y Mann (1999), los SQG deberían ser utilizados en la región donde fueron calculados, ya que dichos valores SQG se asociarían mejor con la probabilidad de toxicidad en dicha región (Choueri et al., 2009).
Por otro lado, existen diversos convenios internacionales que protegen el Atlántico Nordeste (Convenio de Oslo-Paris, OSPAR), el Mediterráneo (Convenio de Barcelona), el Báltico (Convenio de Helsinki, HELCOM) o la contaminación de los océanos (MARPOL). En la práctica, estos convenios obligan a la inclusión de políticas más protectoras con el medio ambiente en los países firmantes. De esta manera, se establece un control legislativo de las actividades que puedan suponer un riesgo para el medio (Casado, 2006). Así, por ejemplo, el vertido de materiales de dragado y otros residuos al mar está regulado en el ámbito internacional por el
Convenio de Londres (1972), por el Convenio OSPAR, por el Convenio de Barcelona (1976) o el Convenio de Helsinki (1992).
Aunque en España no existen instrumentos legislativos al respecto, la gestión de los sedimentos de dragado de puertos y su vertido en zonas costeras y estuaricas se basa en las “Recomendaciones para la gestión de los materiales de
dragado en los puertos españoles,” (CEDEX, 1994). Según estas recomendaciones y
los estudios llevados a cabo para su revisión y actualización (Casado-Martínez, 2006), la evaluación de la contaminación de sedimentos marinos y estuáricos exige considerar tanto sus características físico-químicas generales como el contenido en sustancias contaminantes y los efectos biológicos asociados a la presencia de tales sustancias. Así lo consideraron Long y Chapman (1985) al definir por primera vez el concepto de metodología integrada (“Sediment Quality Triad”) y que incluía tres medidas o “líneas de evidencia”: (1) medida de la concentración de contaminantes en los sedimentos; (2) medida de la toxicidad de dichos sedimentos en el laboratorio; (3) medida de la alteración de las comunidades bentónicas establecidas en el lugar implicado. Por un lado, los análisis físico-químicos del sedimento informan sobre las sustancias contaminantes, su granulometría y su contenido en materia orgánica. Por otro lado, el estudio de la alteración de las comunidades bentónicas in situ permite observar los efectos a medio-largo plazo de los contaminantes de forma directa. La metodología se basa en el cálculo de los parámetros estructurales como la abundancia, riqueza de especies, biomasa, diversidad, y en el uso de índices bióticos (Chapman, 2007a).
Por último, para evaluar el riesgo biológico de los compuestos presentes en dichos sedimentos se ha recomendado a nivel internacional el uso de los denominados bioensayos. Aunque estas herramientas comenzaron a utilizarse al final de los años 70 (Burton, 1991), no fue hasta la década de los 90 cuando comenzaron a estandarizarse (Burton y Scout, 1992). Dichas técnicas permiten obtener una aproximación a la biodisponibildad de dichos compuestos, así como determinar aquellas concentraciones a partir de las cuales comienzan a registrarse efectos tóxicos sobre determinados organismos, una vez que estos han sido expuestos a sedimentos sospechosos de contaminación (Beiras et al., 2001). La clasificación de la toxicidad se calcula a partir de la comparación de las respuestas biológicas de muestras de sedimentos contaminados y muestras de sedimentos referencia o control, es decir, carentes de contaminación (Stronkhorst et al., 2003). Por todo ello, debido a que los organismos responden a la contaminación total, los
bioensayos proporcionan una respuesta integrada en cuanto a los contaminantes presentes, teniendo en cuenta posibles casos de sinergia, antagonismo o aditividad (Ni Suilleabhain et al., 2003).
Continuando con el análisis toxicológico de los contaminantes en sedimentos, Chapman (1990) recomienda el uso de baterías de bioensayos incluyendo especies de diferentes niveles tróficos, cubriendo todas las vías de exposición al sedimento (contacto directo con el sedimento, contacto en fase acuosa o a través de la ingestión de partículas). Por otro lado, es recomendable utilizar especies con la suficiente relevancia ecológica como para representar a la comunidad de la zona geográfica de estudio. Además, estos análisis toxicológicos deberían cumplir una serie de requisitos como son el fácil manejo, el coste moderado de la técnica, el amplio reconocimiento y la correcta regulación por parte del comité científico (Wells, 1999).
Siguiendo éstas y otras recomendaciones internacionales (OSPAR, 1995; Schipper et al., 1999; Thain y Roddie, 2001), en el País Vasco, se han llevado a cabo diferentes trabajos para cuantificar el efecto tóxico de contaminantes en sedimentos de zonas generalmente degradadas (Saiz- Salinas, 1997; Saiz-Salinas y Francés-Zubillaga, 1997; González Oreja y Saiz-Salinas, 2003).
A partir del año 2003, en AZTI-Tecnalia se comenzaron a incorporar a los estudios medioambientales los tests de mortalidad de diez días de exposición con el anfípodo del género Corophium (Pérez, 2006).
De esta manera, el uso de este bioensayo como herramienta toxicológica, junto con los test de toxicidad de Microtox (mediante el protocolo “Solid Phase Test” de Microtox®; Azur Environmental, 1998) en la evaluación integrada de la calidad de los sedimentos de la costa vasca es relativamente reciente. Entre dichas aplicaciones destacan estudios de impacto ambiental llevados a cabo en puertos donde la actividad de dragados es frecuente, como el puerto de Ondárroa (Belzunce
et al., 2004a), el estuario del Nervión (Franco et. al., 2006a) y el estuario del
Oiartzun (p.e., Muxika et al., 2008). Así mismo, se han aplicado a sedimentos procedentes de regatas situadas en zonas muy industrializadas (Belzunce et al., 2006) y de zonas costeras donde han tenido lugar vertidos de escorias de fundición (Borja et al., 2008b). Además, los bioensayos de toxicidad realizados con anfípodos se vienen utilizando como una de las herramientas de evaluación de la calidad ambiental de los estuarios adscritos a la “Red de Seguimiento del Estado Ecológico
de las Aguas de Transición y Costeras de la Comunidad Autónoma del País Vasco” (Borja et al., 2008a).
Por otro lado, diferentes publicaciones, recomendaciones y protocolos internacionales (ASTM, 1995; Environment Canada, 1992a; USEPA, 1995, 2002; OSPAR, 2005) plantean la necesidad de incluir un tercer bioensayo para la estimación de la toxicidad aguda en estudios de evaluación de la calidad de los sedimentos, incluyendo un tercer organismo de distinto nivel evolutivo. Debido a las numerosas ventajas que presentan, los bioensayos en fases embrionarias del erizo de mar han sido ampliamente utilizados como herramienta toxicológica en diferentes estudios de toxicidad (Pagano et al., 1986; Dinnel et al., 1988; Kobayashi, 1991; Bay et al., 1993; His et al., 1998; Fernández y Beiras, 2001; Beiras, 2002; Fernández, 2002; Arizzi Novelli et al., 2003a; Bellas et al., 2005a,b; Marín Guirao et
al., 2005; Volpi Ghirardini et al., 2005a; Casado-Martínez et al., 2006). En dicho
bioensayo se mide como respuesta el éxito en la embriogénesis, definido como el porcentaje de larvas normales, tomando como larva normal a aquella con los cuatro brazos bien formados (ASTM, 1995). Entre sus múltiples ventajas destacan su amplia distribución geográfica, su alta densidad poblacional y su fácil manejo en condiciones de laboratorio. Además, la técnica de obtención de gametos y fecundación in vitro son sencillas, y el tiempo de obtención de larvas viables en condiciones de laboratorio es corto (Fernández, 2002). No obstante, supone una desventaja trabajar con etapas tempranas o adultas (como es el caso del bioensayo con anfípodos), ya que dichos trabajos dependen directamente del ciclo reproductivo anual de la especie test y, por tanto, de la época en que dicho material biológico está disponible en el campo.
De esta manera, se pone de manifiesto la importancia de desarrollar investigaciones orientadas al estudio del material biológico utilizado como herramienta toxicológica para la evaluación integrada de sedimentos de la costa vasca. Así mismo, sería necesario estudiar la viabilidad de diferentes alternativas a la no disponibilidad continua de material biológico utilizado en los test de toxicidad a lo largo de todo el año.
1.2. Términos y definiciones
A continuación se definen una serie de términos que son mencionados con frecuencia en distintos capítulos de la presente memoria:
Bioensayo: proceso experimental mediante el cual se determina la toxicidad potencial de uno o varios contaminantes presentes en el medio, a través del estudio de sus efectos sobre organismos estratégicamente escogidos y bajo condiciones específicas de laboratorio.
Control: tratamiento en una investigación o estudio que reproduce todas las condiciones y factores que podrían afectar a los resultados de la investigación, excepto la condición específica que se está analizando. En un bioensayo, el control debe reproducir exactamente todas las condiciones de la exposición, pero sin contener la sustancia a analizar. El control se utiliza para comprobar la ausencia de efectos debidos a condiciones básicas de la prueba (p.e. calidad del agua de dilución, salud de los organismos utilizados, o efectos debidos a su manipulación). Normalmente, los resultados de los tests se refieren al control.
CEx ó ECx: Concentración Efectiva del tóxico o Effective Concentration,
corresponde a aquella concentración que provoca un efecto (generalmente adverso) sobre el X% de la población del organismo utilizado, en un periodo específico de tiempo y en condiciones de laboratorio controladas. Generalmente se calcula el valor EC50 o concentración efectiva mediana, es
decir, la concentración del tóxico que causa un efecto negativo del 50%. En ocasiones, para determinar un umbral de toxicidad es adecuado calcular concentraciones efectivas a un bajo nivel, como la EC10 , debido a que este
cálculo depende del ajuste de la curva de toxicidad, y no del diseño experimental, como puede ser el caso del cálculo del NOEC y LOEC (Chapman et al., 1996; Peter y Heder, 1998).
Effect Range-Low (ERL) y Effect Range-Median (ERM): concentraciones de los diferentes contaminantes a partir de la cuales se podrían esperar efectos biológicos adversos. Los valores ERL y ERM se calculan, respectivamente, como el percentil 10 y 50 de la concentración de las muestras “con efecto”. A partir de estos valores se definieron tres rangos de concentración para un tóxico ([X]): si [X] < ERL, los efectos adversos rara vez ocurren; si ERL < [X] < ERM los efectos adversos ocurren ocasionalmente; si [X] > ERM los efectos adversos ocurren frecuentemente (Long et al., 1995).
Elutriado: solución acuosa obtenida tras la adición de agua a una sustancia sólida (p.e., sedimento) y agitación durante al menos treinta minutos. Tras 12 horas de decantación, se extrae la fase líquida.
Endpoint (variable objetivo): variable o criterio preestablecido para determinar el resultado del bioensayo y que indica la finalización de un test; o las medidas o valores derivados que caracterizan los resultados de un test (mortalidad, crecimiento, EC50...).
Environment Quality Standards (EQS): concentración de un contaminante o grupo de contaminantes en el agua, sedimento o biota que no debería encontrarse en exceso, con el fin de proteger la salud humana y el medio ambiente. Es un valor legal.
Exposición: contacto de los organismos utilizados en un bioensayo con los tóxicos de referencia o muestras de estudio.
LOEC o concentración mínima con efectos observables: es la menor concentración del tóxico que presenta diferencias significativas con respecto al control. NOEC o concentración máxima sin efectos observables: es la mayor concentración
del tóxico que no presenta diferencias significativas con respecto al control. Muestra: sustancia (disolución o sedimento) objetivo del análisis.
Test de toxicidad: determinación del efecto de una(s) sustancia(s) sobre un grupo de organismos, tejidos celulares u otro material vivo, bajo condiciones definidas. Un test de toxicidad en fase líquida puede medir bien las proporciones de organismos afectados o bien el grado del efecto observado tras la exposición de estos organismos a concentraciones específicas de sustancias químicas, a vertidos, efluentes, elutriados o agua intersticial de un sedimento muestra.
Threshold Effect Level (TEL) y Probable Effect Level (PEL): concentraciones de los diferentes metales a partir de la cuales se esperarían efectos biológicos adversos. El valor TEL se calcula como la media geométrica entre el percentil 15 de la concentración de las muestras “con efecto” y la mediana de la concentración de las muestras “sin efecto”. El valor PEL se calcula como la media geométrica entre el percentil 50 de la concentración de las muestras “con efecto” y el percentil 85 de la concentración de las muestras “sin efecto”.
Toxicidad: propiedad inherente de una sustancia o combinado de sustancias de provocar efectos adversos a organismos vivos. El efecto puede ser letal o subletal.
Tóxico de referencia: sustancia utilizada para evaluar la sensibilidad de los organismos utilizados en los tests. Se establece un rango para cada población de organismo utilizado, que informa sobre las condiciones de dicho organismo.
Sediment Quality Guidelines (SQG): valores de contaminantes por encima de los cuales se pudieran dar efectos biológicos adversos. Son valores guía, sin fuerza legal.
1.3. Objetivos y estructura de la Tesis
El objetivo global de esta Tesis es contribuir al desarrollo y aplicación de de metodologías y herramientas que permitan llevar a cabo una evaluación integral de la calidad ambiental de los sedimentos marinos; entre dichas metodologías, y considerado el hilo conductor de la Tesis, destaca la aplicación del test de toxicidad embrionario con el erizo de mar Paracentrotus lividus, como respuesta a la necesidad de completar la información de posibles efectos biológicos adversos en estudios de evaluación de la calidad de aguas y sedimentos estuáricos y costeros del País Vasco.
El presente trabajo se ha divido en tres partes diferenciadas, respondiendo a los siguientes objetivos específicos:
1ª Parte: El objetivo de esta primera parte es contribuir al conocimiento del material biológico utilizado para evaluar la toxicidad de sedimentos de la costa vasca. Se compone de los siguientes capítulos:
Capítulo 2, se estudia el ciclo biológico del erizo de mar Paracentrotus
lividus a partir de la evolución del estado gonadal en dos poblaciones del País
Vasco, con el objetivo de establecer el periodo de actividad reproductiva natural, conociendo así la disponibilidad de gametos a lo largo del año.
Capítulo 3, se estudia la sensibilidad embrionaria del P. lividus a diferentes sustancias de referencia, como son el amonio, el cadmio y el Sodio Dodecil Sulfato (SDS), con el objetivo de comprobar si su sensibilidad permanece constante a lo largo del año.
2ª Parte: El objetivo de esta segunda parte es desarrollar diferentes alternativas a la no disponibilidad continua de material biológico utilizado en los test de toxicidad a lo largo de todo el año. Se compone de los siguientes capítulos:
Capítulo 4, se desarrolla un experimento de inducción al desarrollo gonadal del P. lividus, con el objetivo de disponer de gametos maduros para la realización de tests de toxicidad en cualquier época del año.
Capítulo 5, se desarrollan varios cultivos del anfípodo marino Corophium
multisetosum, con el objetivo de conseguir poblaciones para su utilización en los
test de toxicidad en cualquier época del año. Además, con el fin de cuantificar la sensibilidad de los individuos de laboratorio frente a los de campo, se han realizado test de toxicidad con sustancias de referencia y muestras naturales de sedimentos.
3ª Parte: El objetivo de esta tercera parte es mejorar e implementar las herramientas existentes para la evaluación de la calidad del agua y sedimentos marinos en la costa vasca, especialmente mediante la inclusion del bioensayo embrionario del erizo de mar P. lividus. Se compone de los siguientes capítulos:
Capítulo 6, se calculan los Sediment Quality Guidelines regionales para la costa del País Vasco, a partir de análisis químicos, toxicológicos y biológicos de muestras de sedimentos, con el fin de ser utilizados en la evaluación del estado químico y físico-químico, dentro de la Directiva Marco del Agua.
Capítulo 7, se lleva a cabo un estudio integrado para la evaluación de la calidad de los sedimentos en el estuario del Oiartzun, a partir de las tres líneas de evidencia (contaminación, toxicidad y composición de las comunidades del bentos), con dos claros objetivos: por un lado, validar los SQG regionales, calculados en el Capítulo 6, a partir de una matriz tabular de decisión y, por otro, establecer las relaciones entre los contaminantes presentes en los sedimentos, la toxicidad y la alteración del bentos, mediante un análisis multivariante de redundancia.
Capítulo 8, se estudia la sensibilidad embrionaria del P. lividus a dos clases distintas de biocidas no oxidantes de uso emergente en los tanques de refrigeración de estaciones hidroeléctricas: sales de amonio cuaternario y poliaminas del tipo n-tallow alquiltrimetilendiamina. Se trata de establecer una concentración límite de vertido al medio, a partir del cálculo de los valores NOEC y LOEC.
Finalmente, en el Capítulo 9 se presentan las principales conclusiones globales de este trabajo.
Capítulo 2. El ciclo biológico del erizo de mar
Paracentrotus lividus (Lamarck, 1816)
en la costa del País Vasco
Parte del trabajo desarrollado en el presente capítulo ha dado lugar a la publicación del siguiente artículo:
GARMENDIA, J.M., MENCHACA, I., BELZUNCE, M.J., FRANCO, J., & REVILLA, M. 2010. “Seasonal variability in gonad development in the sea urchin (Paracentrotus lividus) on the Basque coast (Southeastern Bay of Biscay)”. Marine Pollution Bulletin 61: 259-266.
2.1. Introducción
El erizo de mar Paracentrotus. lividus (Echinodermata: Echinoidea) es una especie muy abundante a lo largo del suroeste del Atlántico (desde Escocia hasta Marruecos), mar Mediterráneo y mar Adriático (Reboreda, 1994; Turón et al., 1995; Barnes et al., 2001; Guettaf et al., 2000; Sellem et al., 2000; Gago et al., 2003; Bayed et al., 2005; Lustres, 2006), en aguas de temperatura entre los 10-15 ºC en invierno y hasta los 18-25 ºC en verano. Es una especie que habita en el intermareal y sublitoral somero hasta los 30 m de profundidad (Figura 2.1), que se adhiere fuertemente a la roca y vive en agujeros que ellos mismos excavan, situación que dificulta enormemente su captura (Fauna y Flora de España y de Europa, 1998). Esta especie alcanza la madurez sexual a partir de los 3 años, edad que se corresponde con un tamaño de unos 2 cm de diámetro (sin tener en cuenta las espinas). Es una especia dioica y no presenta dimorfismo sexual (Figura 2.1). Tras la fecundación externa se forma una larva plúteus (Figura 2.2). Pasado el primer mes sufre la metamorfosis, llegando al estado de juvenil al alcanzar un diámetro de 0,5-1 mm. La tasa de crecimiento es alta durante los primeros años de vida y disminuye sensiblemente con la edad, siendo su máximo de crecimiento entre los 2 y los 4 años. La longevidad se sitúa entre los 7 y los 11 años (Turón et
al., 1995; Urgorri et al., 1994). Su dieta es básicamente herbívora, y su principal
fuente de alimento son las macroalgas (Fernández, 2002).
Figura 2.1. Población submareal de Paracentrotus lividus (Zumaia, País Vasco); Dos ejemplares de P. lividus, un macho a la izquierda y una hembra a la derecha.
Su importancia ecológica y comercial es bien conocida. Por un lado, su actividad ramoneadora controla la estructura y biomasa de macrófitos, de tal manera que es considerada especie clave en el mantenimiento del equilibrio de las comunidades sublitorales (Sala et al., 1998). Además, algunos estudios revelan la
importancia de su larva plúteus en la composición y biomasa de las comunidades del zooplancton, al jugar un papel relevante en las cadenas tróficas pelágicas (Luis
et al., 2005). Desde el punto de vista económico, sus gónadas son tan apreciadas
(Barnes et al., 2001) que su descontrolada y abusiva extracción ha llegado a colapsar sus capturas en algunos países (Andrew et al., 2002; Berkes et al., 2006; Gianguzza et al., 2006; Pais et al., 2007).
Figura 2.2. Izda.: óvulo fecundado (diámetro 100 µm); Dcha.: larva plúteus (longitud 450 µm).
Por otro lado, como ya se ha comentado en el capítulo anterior, los bioensayos en fases embrionarias del erizo de mar han sido ampliamente utilizados como herramienta toxicológica en diferentes estudios de toxicidad bien en la columna de agua o bien con muestras de sedimento (Kobayashi, 1991; His et al., 1999; Fernández y Beiras, 2001; Geffard et al., 2001; Radenac et al., 2001; Volpi Ghirardini y Arizzi Novelli, 2001; Beiras, 2002; Cesar et al., 2002, 2004; Fernández, 2002; Beiras et al., 2003a, 2003b; Losso et al., 2004; Bellas et al., 2005a,b; Marín Guirao et al., 2005; Volpi Ghirardini et al., 2005a, 2005b; Arizzi Novelli et al., 2006; Beiras y Saco-Álvarez, 2006; Bellas, 2006; Casado-Martínez et al., 2006c). Entre las ventajas que presenta esta especie se encuentran su amplia distribución geográfica, su abundancia, su fácil recolección y su fácil manejo en condiciones de laboratorio, la relativa sencillez en la obtención de gametos y fecundación in vitro y su alta sensibilidad a la contaminación (Fernández, 2002).
En el océano Atlántico y en el mar Mediterráneo, la reproducción del erizo P.
lividus tiene lugar en primavera y principios de verano (Byrne, 1990; Spirlet et al.,
1998a; Barnes et al., 2001; Sellem y Guillou, 2007). En el golfo de Bizkaia (noroeste del océano Atlántico) la información sobre el ciclo reproductivo de esta especie
procede de estudios realizados en diferentes localidades de Galicia (Reboreda, 1994; Lustres, 2006), costa de Cantabria (González-Irusta et al., 2009) y Bretaña (Spirlet
et al., 1998a; Quiniou et al., 1999). Sin embargo, a pesar de su abundante y amplia
distribución en las costas del País Vasco, muchos aspectos de su reproducción en esta zona apenas se conocen. En los últimos años se ha producido un creciente interés gastronómico por esta especie; esto se ha traducido en algunas propuestas para su explotación comercial, si bien de momento no han llegado a concretarse. Además, según la legislación vigente (Ley 6/1998, de 13 de marzo y Decreto 198/2000 de 3 de octubre, anexo II) la extracción de erizos queda prohibida a lo largo de toda la costa del País Vasco.
El análisis de los cambios temporales en el peso gonadal es utilizado con frecuencia en estudios del ciclo reproductivo (Lozano et al., 1995; Guettaf et al., 2000; Sánchez-España et al., 2004; Sellem y Guillou, 2007). En este sentido, la disponibilidad y calidad de nutrientes (Lozano et al., 1995), la profundidad (Himmelman et al., 1986), el hidrodinamismo (Guettaf et al., 2000), los blooms fitolanctónicos (Himmelman, 1986; González-Irusta et al., 2009), la temperatura del agua y el fotoperiodo (Kawamata, 1997; Spirlet et al., 1998a) son algunos de los factores ambientales más importantes en el ciclo gonadal.
El conocimiento del ciclo gonadal de esta especie, empleada en estudios de toxicidad, resulta fundamental para conocer la disponibilidad y viabilidad de los gametos en diferentes épocas del año. De esta manera, un conocimiento apropiado permitiría llevar a cabo muestreos más eficientes en cuanto al esfuerzo de extracción y, en consecuencia, un menor número de erizos a sacrificar. Así mismo, dicho estudio permitiría planificar los bioensayos en función de la disponibilidad y viabilidad de los gametos, con el fin de llevar a cabo el mejor mantenimiento y conservación de las muestras a analizar.
Los objetivos principales de este capítulo son:
• Estudiar el ciclo gonadal del erizo de mar P. lividus en una población localizada en una zona intermareal de Donostia (País Vasco), durante dos años, para conocer la disponibilidad y viabilidad de gametos.
• Identificar una población idónea para el abastecimiento de gametos del erizo P. lividus, a partir de la comparación del ciclo gonadal en dos poblaciones situadas en dos zonas diferentes del País Vasco.
2.2. Material y métodos 2.2.1. Zona de muestreo
El muestreo de erizos en el intermareal de Donostia (43º 32’ N; 2º 02’ W) (Figura 2.3), se llevó a cabo cada quince días durante el primer año (2006-2007), y mensualmente durante el segundo año (2007-2008). Además, durante el segundo año, de forma simultánea al muestreo de Donostia, se recogieron mensualmente individuos del intermareal de Zumaia (43º 18, 2’ N; 2º 15’ W) (Tabla 2.1).
Ambas localidades (Figura 2.3) se encuentran en la zona costera noreste del País Vasco, en la parte más interna del golfo de Bizkaia. La zona intermareal de muestreo de Donostia es una zona rocosa, poco profunda (0,2-2 m de profundidad), donde las algas principales son Lithophyllum incrustans, Corallina elongata y
Gelidium corneum. Se trata de una zona con baja actividad hidrodinámica [0-10
kw/m de energía de ola (Borja et al., 2006)]. Por el contrario, la zona intermareal de muestreo de Zumaia está formada por charcas poco profundas, ocupadas por
Lithophyllum incrustans, Corallina elongata, Cystoseira tamariscifolia, Plocamium cartilagineum y Stypocaulon scoparium. Se trata de una zona muy expuesta al
oleaje, donde la energía hidrodinámica es alta [20-30 kw/m (Borja et al., 2006)]. En ambas áreas, la temperatura del agua varió entre unos 12 ºC y 23 ºC entre invierno y verano, respectivamente, y la salinidad varió entre 32 y 36. Ninguna de las dos localidades recibe descargas directas de ríos o efluentes; por lo tanto, se puede decir que los ejemplares de ambas poblaciones provienen de ambientes no contaminados de manera significativa.
Figura 2.3. Zonas de muestreo en el intermareal de Donostia (izquierda) y Zumaia (derecha).
Tabla 2.1. Fechas de muestreos, altura de la marea, temperatura (ºC) y salinidad (S) del agua en las poblaciones de Donostia y Zumaia (País Vasco).
Donostia Zumaia
Año Fecha Altura marea (m) T (ºC) S Fecha Altura marea (m) T (ºC) S
2006 02-feb 0,66 12,5 35,2 - - - - 14-feb 0,79 12,2 35,6 - - - - 27-feb 0,39 10,1 34,5 - - - - 14-mar 0,79 12 34,5 - - - - 29-mar 0,13 12,9 35,5 - - - - 10-abr 1,18 12,6 34 - - - - 26-abr 0,48 13,8 34,2 - - - - 15-may 0,96 18,2 34,6 - - - - 31-may 1,32 18,5 34,7 - - - - 14-jun 1,01 21,2 34,1 - - - - 28-jun 1,11 20,5 34,1 - - - - 12-jul 0,86 21,8 34,1 - - - - 26-jul 1 26,1 34,1 - - - - 09-ago 0,81 24,7 34,6 - - - - 28-ago 1,09 22,4 35,1 - - - - 11-sep 0,48 23,8 34,5 - - - - 27-sep 1,23 21,3 - - - - 11-oct 0,93 19,8 35,4 - - - - 24-oct 1,01 18,7 36 - - - - 08-nov 0,78 17,5 35,5 07-nov 0,58 16,7 36 21-nov 1,07 16,3 35,7 - - - - 04-dic 0,8 15,7 35,7 - - - - 19-dic 1,24 13,7 34,8 20-dic 1,10 13,2 35,7 2007 03-ene 0,89 13,7 35,7 22-ene 0,51 13,6 35,8 23-ene 0,62 13,5 33,4 20-feb 0,20 13,4 35,4 06-feb 0,95 12,9 34,5 20-mar 0,05 - - 26-mar 1,61 12,6 33,8 26-mar 1,84 - - 17-abr 0,21 14,4 32,8 18-abr 0,19 15,5 34,9 15-may 0,58 16 34,6 16-may 0,48 15,9 35 30-may 1,18 16,3 34,4 - - - - 12-jun 1,02 19,2 32,2 13-jun 0,90 19,4 33,2 17-jul 0,88 21,8 35 16-jul 0,85 21,1 35,2 14-ago 0,76 23,4 34,6 13-ago 0,83 23 35,4 11-sep 0,83 20,4 34,9 12-sep 0,76 20,1 35,2 11-oct 0,89 18 33,7 25-oct 0,68 15,3 34,8 12-nov 1,16 13,6 35,4 26-nov 0,29 12,8 34,8 13-dic 1,18 12,7 35,2 12-dic 1,14 12,3 35,1 2008 22-ene 0,64 12,1 34,6 - - - - 19-feb 0,84 11,6 35,6 - - - -
2.2.2. Método de muestreo de erizos y datos de variables ambientales
En cada campaña de muestreo, durante la marea baja, se recogieron aleatoriamente, con una espátula de madera, 16 individuos de diámetro superior a los 40 mm (sin incluir las espinas), y se transportaron vivos, en una nevera de campo, para ser inmediatamente procesados en el laboratorio. Además, se tomaron
in situ los valores de temperatura y salinidad en la zona de muestreo. Los valores
del fotoperiodo fueron consultados en el calendario náutico del Ministerio de Defensa (RIOA, 2006).
2.2.3. Trabajos en laboratorio
Una vez en el laboratorio se midió el diámetro (sin incluir las espinas) y la altura de cada individuo. Después de dejarlos secar durante unos 5 minutos en papel de filtro, se midió el peso húmedo. Durante el primer año (2006-2007), para calcular el porcentaje de madurez, a cada erizo se le inyectó 1 ml de KCl a través de la membrana peristomática. Pasados entre 5 y 15 minutos se anotaron los individuos que habían desovado, es decir, aquellos que habían expulsado gametos a través del gonoporo.
Inmediatamente después de la inducción (únicamente en el caso de los ejemplares del primer año), los erizos fueron diseccionados con precaución, y las 5 gónadas fueron extraídas. Una de las gónadas fue introducida en una probeta para medir el volumen (considerando el volumen gonadal igual al volumen de agua desplazado). En otra de las gónadas se midió el peso fresco y, junto con el resto del cuerpo, fue secada a 60º C durante 48 horas, para medir el peso seco.
El volumen y el peso gonadal (de un individuo) fueron estimados multiplicando por 5 los valores obtenidos a partir de una única gónada. El resto de las gónadas fueron utilizadas para establecer el sexo del individuo, para obtener los gametos y para llevar a cabo la fecundación. En el caso de que el desove fuese satisfactorio se tomaban dichos gametos directamente del gonoporo, a partir de un macho y una hembra, para llevar a cabo la fecundación y confirmar la capacidad reproductiva. Sin embargo, para evitar contaminar el material gamético con microorganismos de la cubierta del erizo, durante el segundo año (2007-2008), se evitó la práctica de la inducción con KCl. De esta manera, un individuo era considerado maduro cuando se encontraban gametos en la gónada (Lozano et al., 1995) y los gametos fueron tomados directamente de las gónadas para la fecundación.
Siguiendo la metodología descrita por Fernández y Beiras (2001) y Garmendia et al. (2009a), a partir de un macho y una hembra, la calidad y viabilidad de los gametos fue confirmada una vez estos eran observados al microscopio (esperma móvil y óvulos esféricos de 100 µm). Los óvulos fueron transferidos a un vaso de precipitados de 100 ml con agua de mar filtrada (0,2 µm). Posteriormente, se añadió una gota de esperma, consiguiendo un ratio esperma/óvulos de aproximadamente 20000:1 (estimaciones realizadas en experimentos en el laboratorio). Después de 5 ó 10 minutos se hizo el recuento de huevos fecundados (presencia de la membrana de fecundación). La fecundación sólo era considerada exitosa si el 90% de los huevos había sido fecundado. Por último, para continuar con el desarrollo embrionario, aproximadamente 500 huevos fecundados fueron transferidos a 10 viales de 20 ml con agua de mar filtrada (0,2 µm) e incubados a 20 ºC en oscuridad. Después de 48 horas, los viales fueron fijados con formol (40%), para el recuento de larvas y el cálculo del éxito embrionario. El desarrollo sólo era considerado exitoso en aquellos casos en los que el 90% de las larvas estaban bien formadas (presencia de los 4 brazos).
2.2.4. Cálculo de los índices gonadales
Como ya se ha explicado anteriormente, durante el primer año los diferentes índices gonadales, basados en el peso (seco y húmedo) de la gónada y de todo el organismo, fueron calculados inmediatamente después de la inducción al desove. Para asegurar que la inducción al desove no interfiriese en el cálculo de dichos índices, de los 16 individuos 4 no fueron inducidos, de tal manera que los índices gonadales de ambos grupos de erizos (inducidos y no inducidos) fueron comparados estadísticamente (véase apartado 2.2.5).
Los índices gonadales (IG) y humedad gonadal (HG), utilizados en trabajos similares (Lozano et al., 1995; Spirlet et al., 1998a, 2000), fueron calculados a partir de las siguientes formulas:
IG1= [Peso húmedo gonadal (g)/Peso húmedo corporal (g)] x 100 IG2= [Peso seco gonadal (g)/Peso seco corporal (g)] x 100
IG3= [Peso seco gonadal (g)/Peso húmedo corporal (g)] x 100 IG4= (Peso seco gonadal (g)/D3) donde D es el diámetro (mm) HG= [1- (Peso húmedo gonadal (g)/Peso húmedo corporal)] x100
2.2.5. Análisis estadístico
La normalidad de los datos fue comprobada mediante el test de Shapiro-Wilks W, y la homogeneidad de las varianzas mediante el test F. Siguiendo la metodología descrita por Zar (1999), se utilizó el test de la t de Student (test paramétrico, para aquellos datos con distribución normal) o el test U de Mann Whitney (test no paramétrico, para aquellos datos que, aun siendo transformados, no presentaban una distribución normal), para determinar las diferencias significativas (α: 0,05) de los diferentes índices gonadales: (i) entre individuos inducidos y no inducidos; (ii) entre machos y hembras. Para determinar las diferencias significativas intra-anuales e interanuales del conjunto de datos se llevó a cabo un análisis de la varianza (ANOVA) de un factor (fecha de muestreo) y test de Tukey (para aquellos datos con distribución normal) o un test de Kruskal-Wallis (para aquellos datos que, aun siendo transformados, no presentaban una distribución normal). Para determinar las diferencias significativas (α: 0,05) entre ambas poblaciones se llevó a cabo un ANOVA de dos factores (localidad y fecha), en el caso de que los datos fueran normales, o un test de Kruskal-Wallis en el caso de ausencia de normalidad.
El test de X2 fue utilizado para comparar el periodo de madurez entre machos y hembras, así como entre meses y localidades. Por último, para verificar la posible correlación entre cada par de variables, así como la correlación con factores ambientales como la temperatura y el fotoperiodo, se llevó a cabo una correlación de Pearson (distribución normal) o de Spearman (distribución no normal). Para todos estos análisis estadísticos se utilizó el paquete estadístico Statgraphics® Plus 5.0.
2.3. Resultados
2.3.1. Estudio del ciclo gonadal en la población intermareal de Donostia Durante los años 2006-2008 han sido muestreados un total de 595 individuos (357 durante el 2006; 206 en el 2007 y 32 en el 2008), de los cuales 311 fueron hembras, 278 machos y 6 ejemplares de sexo indeterminado (debido al escaso desarrollo de las gónadas). El sex ratio (hembra/macho) es cercano a 1, aunque ligeramente desplazado hacia las hembras. Los resultados del tamaño y de los diferentes índices gonadales se han representado como medias mensuales, con el objeto de reducir el error estocástico (Lozano et al., 1995; Turón et al., 1995) (Figuras 2.4-2.9). Todos los erizos muestreados presentaron un diámetro superior a
40 mm (sin espinas) (diámetro mínimo del cuerpo establecido en el apartado 2 del presente capítulo), con un valor medio de 54 mm de diámetro (máx. 76 mm; mín. 40 mm) y una altura media de 29 mm (máx. 53 mm; mín. 19 mm). Tal y como muestra la Figura 2.4, en general no hay diferencias de tamaño entre ambos sexos.
A B 40 45 50 55 60 65 70 F-06 M A M J J A S O N D E-07 D iá m et ro (mm) Total M H 15 25 35 45 F-06 M A M J J A S O N D E-07 A ltu ra (mm) Total M H 40 45 50 55 60 65 70 F-07 M A M J J A S O N D E-08 F D iá m et ro (mm) Total M H 15 25 35 45 F-07 M A M J J A S O N D E-08 F A ltu ra (mm) Total M H
Figura 2.4. Valores medios y desviación estándar del diámetro (mm) y la altura (mm) (excluyendo las espinas) de los erizos recogidos en Donostia. (A) Año 2006-2007 (muestreo quincenal); (B) Año 2007-2008 (muestreo mensual). Total=erizos totales; M=macho; H=hembra.
Se llevaron a cabo análisis estadísticos para evaluar la existencia o no de diferencias significativas en los índices gonadales, el porcentaje de humedad y el volumen gonadal en función de dos factores: la inducción al desove y el sexo. No se encontraron diferencias significativas (α = 0,05) y, por lo tanto, para posteriores análisis se consideraron todos los datos conjuntamente. Las variaciones intraanuales en los valores de los diferentes índices gonadales indican una clara tendencia temporal (Figura 2.5): en ambos años se observa una tendencia decreciente hasta mayo-junio (mínimo) y un ascenso, más o menos progresivo, hasta alcanzarse los valores más altos en diciembre-enero.
A B 0 2 4 6 8 10 F-06 M A M J J A S O N D E-07 In di ce G on ada l 2 (% ) Total M H 0 1 2 3 4 F-06 M A M J J A S O N D E-07 In di ce G on ad al 3 (% ) Total M H 0 20 40 60 80 100 120 140 F-06 M A M J J A S O N D E-07 In di ce G on ada l 4 ( m g. m m -3 ) Total M H 0 4 8 12 16 20 F-06 M A M J J A S O N D E-07 In di ce G on ad al 1 (% ) Total M H 0 4 8 12 16 20 F-07 M A M J J A S O N D E-08 F In di ce G on ad al 1 (% ) Total M H 0 2 4 6 8 10 F-07 M A M J J A S O N D E-08 F In di ce G on ada l 2 (% ) Total M H 0 1 2 3 4 F-07 M A M J J A S O N D E-08 F In di ce G on ad al 3 (% ) Total M H 0 20 40 60 80 100 120 140 F-07 M A M J J A S O N D E-08 F In di ce G on ada l 4 ( m g. m m -3 ) Total M H
Figura. 2.5. Valores medios y desviación estándar de los índices gonadales 1, 2, 3 y 4 de los erizos recogidos en Donostia. (A) Año 2006-2007 (muestreo quincenal); (B) Año 2007-2008 (muestreo mensual). Total=erizos totales; M=macho; H=hembra.
Por otro lado, la variación temporal de la humedad gonadal (Figura 2.6) muestra dos etapas diferentes. Desde enero-febrero a mayo-junio se produce un aumento suave y progresivo, con valores de 77-86% de humedad. Posteriormente se produce una disminución progresiva hasta alcanzarse los valores mínimos anuales (70% aproximadamente) en los meses de noviembre-enero.
A B 55 65 75 85 95 F-06 M A M J J A S O N D E-07 H u m eda d g on ada l (%) Total M H 55 65 75 85 95 F-07 M A M J J A S O N D E-08 F H u m eda d g on ada l ( % ) Total M H
Figura 2.6. Valores medios y desviación estándar de la humedad gonadal (%) de los erizos recogidos en Donostia. (A) Año 2006-2007 (muestreo quincenal); (B) Año 2007-2008 (muestreo mensual). Total=erizos totales; M=macho; H=hembra.
Con respecto al volumen gonadal (Figura 2.7), se aprecia una evolución temporal similar a la descrita en la Figura 2.5 para los índices gonadales. En este caso, los valores altos, cercanos a 5-6 ml, se observan entre febrero y abril; durante el segundo año (2007-2008) se produce el primer descenso importante en marzo, alcanzándose valores entorno a 2 ml; durante el primer año (2006-2007) se produce el primer descenso en mayo-junio, con valores por debajo de 3 ml. Posteriormente, en ambos años, se produce una recuperación hasta alcanzar los valores de febrero. A B 0 2 4 6 8 10 F-06 M A M J J A S O N D E-07 V olum en g ona da l ( m l) Total M H 0 2 4 6 8 10 F-07 M A M J J A S O N D E-08 F V ol um en g onad al ( m l) Total M H
Figura 2.7. Valores medios y desviación estándar del volumen gonadal (ml) de los erizos recogidos en Donostia. (A) Año 2006-2007 (muestreo quincenal); (B) Año 2007-2008 (muestreo mensual). Total=erizos totales; M=macho; H=hembra.
En la Figura 2.8 se representa el periodo de madurez a partir de la evolución en el porcentaje de desove. Durante el primer año (2006-2007) (Figura 2.8A), dicho porcentaje se calculó a partir del número de erizos desovados después de la inducción con KCl. Así, los machos muestran capacidad de desove durante casi todo el año, con valores máximos (100%) desde finales de invierno hasta mediados de verano, y con valores mínimos (alrededor de 30%) durante el otoño y el comienzo de invierno. En el caso de las hembras la capacidad de desove está algo más reducida en el tiempo, con valores máximos (100%) entre primavera y mediados de verano. En agosto los valores caen hasta el 50% y, al final de otoño, se produce otro descenso en la capacidad de desove, hasta que en diciembre se alcanzan valores de 0%. Esta situación contrasta significativamente (test X2; α = 0,05) con valores altos de porcentaje de desove en los machos (75%).
A B 0 25 50 75 100 F-06 M A M J J A S O N D E-07 De so ve (% ) Total M H 0 25 50 75 100 F-07 M A M J J A S O N D E-08 F De so ve (% ) Total M H
Figura. 2.8. Porcentaje de desove de los erizos recogidos en Donostia. (A) Año 2006-2007 (muestreo quincenal); (B) Año 2007-2008 (muestreo mensual). Total=erizos totales; M=macho; H=hembra.
Durante el segundo año (2007-2008) (Figura 2.8B), es importante recordar que el porcentaje de individuos con capacidad de desove se calculó a partir del recuento de erizos con gametos en el interior de las gónadas. Así, aunque en marzo se dan valores cercanos al 40%, la capacidad de desove de los machos se mantiene constante y con valores máximos (100%) desde principios de primavera hasta mediados de invierno. En el caso de las hembras, el porcentaje de desove en febrero de 2008 (50%) es significativamente inferior al de los machos (100%) (test X2), y los máximos valores de desove (80-100%) se producen desde principios de primavera hasta mediados de otoño.
Para el estudio de las variaciones interanuales, debido a que el muestreo durante el primer año (2006-2007) fue quincenal, y durante el segundo año
(2007-2008) mensual, las comparaciones para los diferentes parámetros gonadales se establecieron entre aquellas fechas próximas en ambos años (Figura 2.9).
2006-2007 2007-2008 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 F M A M J J A S O N D E F In dic e G on ada l 3 (% ) 0 4 8 12 16 20 F M A M J J A S O N D E F In di ce Go n ada l 1 (% ) * 0 2 4 6 8 10 F M A M J J A S O N D E F In di ce G on ada l 2 (% ) * * * * * * * * 0 40 80 120 160 F M A M J J A S O N D E F In di ce G on ada l 4 (mg .mm -3) * * * * 50 60 70 80 90 100 F M A M J J A S O N D E F Hu me da d g on ada l ( % ) * * * 0 2 4 6 8 10 12 F M A M J J A S O N D E F V olu m en (m l) * * * * *
Figura 2.9. Valores medios y desviación estándar de los diferentes parámetros gonadales de los erizos recogidos en Donostia durante 2006-2007 y 2007-2008. Indices gonadales 1, 2, 3 (%) y 4 (mg.mm-3); Volumen (ml); Humedad gonadal (%). * = Diferencias significativas (α
= 0,05).
El test de Tukey y el test de Kruskal-Wallis (según la distribución normal o no de los datos, respectivamente) revelaron diferencias significativas entre los meses de marzo y abril, coincidiendo con un primer descenso de los valores gonadales en el 2007, situación que no se dio en el 2006 hasta mayo. Posteriormente, durante la recuperación gonadal, los índices gonadales en junio (excepto el IG1) de 2007 y enero (IG2, IG3, IG4) y febrero (volumen gonadal) de 2008 fueron significativamente superiores a los registrados en el 2006 para esos mismos meses (p<0,05).
Por otro lado, la Tabla 2.2 muestra las correlaciones entre las diferentes variables: índices gonadales (IG1, IG2, IG3 e IG4), humedad gonadal, volumen gonadal, porcentaje de desove, temperatura del agua y fotoperiodo. Todos los índices gonadales se encuentran correlacionados entre ellos, así como con el volumen, la humedad gonadal, el porcentaje de desove, la temperatura y el fotoperiodo. Las correlaciones entre la temperatura y el fotoperiodo con los diferentes índices gonadales, así como la correlación de estos con el porcentaje de desove, son todas negativas. El fotoperiodo está positivamente correlacionado con el porcentaje de desove.
Tabla 2.2. Resultados de los análisis de correlación de Spearman, entre las diferentes variables ambientales y los índices gonadales de los erizos recogidos en Donostia durante 2006-2007 y 2007-2008. **= correlación altamente significativa (α = 0,01); *= correlación significativa (α = 0,05); - = correlación no significativa. Alt= altura; Diam=diámetro; Hum=humedad; Vol=volumen; Des= desove; T= temperatura; Fot= fotoperiodo.
Alt Diam IG1 IG2 IG3 IG4 Hum Vol Des T
Diam ** IG1 - - IG2 - - ** IG3 - - ** ** IG4 - - ** ** ** Hum - - - ** ** ** Vol - - ** ** ** ** - Des - - - * * * - - T - - ** * ** * - ** - Fot - - ** ** ** ** ** ** * **
A continuación se representa de forma conjunta la evolución temporal de los diferentes índices gonadales, la humedad y el volumen gonadal así como el fotoperiodo y la temperatura del agua, registrada durante los dos años de estudio de la población de Donostia (Figura 2.10). Tal y como se ha comentado anteriormente, la correlación resultó significativa entre los diferentes índices y las variables ambientales. De esta manera, la tendencia decreciente de los valores gonadales hasta mayo-junio coincide con un ascenso progresivo del fotoperiodo y la temperatura del agua.
