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DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN MIELES MEDIANTE EL MÉTODO DE DECOLORACIÓN DEL β-caroteno

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Academic year: 2021

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DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN MIELES MEDIANTE EL MÉTODO DE DECOLORACIÓN DEL β-CAROTENO

María B. Álvarez, Maia Burgués, Julieta Colosito, Valeria Galetti. Tutor: María C. Ciappini

Centro de Investigación y Desarrollo en Tecnología de Alimentos – U.T.N. – FRRo E. Zeballos 1341 (S2000BQA) Rosario, Santa Fe, Argentina.

valeria_galetti@hotmail.com Palabras claves: Miel, β -caroteno, capacidad antioxidante. Resumen

Entre otras propiedades, la miel tiene el potencial de ejercer una acción antioxidante por la inhibición de la formación de radicales libres, gracias a la acción de los flavonoides y de otros polifenoles presentes en su composición. El objetivo de este trabajo fue determinar la capacidad antioxidante en mieles, aplicando el método de decoloración del β-caroteno - ácido linoleico. En las condiciones de trabajo seleccionadas, se ensayaron 22 muestras, provenientes del Delta Medio y Bajo Delta del río Paraná. Todas las mieles mostraron resultados positivos, corroborando la capacidad antioxidante de este producto natural. Los resultados fueron coincidentes con otros antecedentes publicados. El método mostró menor sensibilidad que otras técnicas analíticas, tales como las de captura de radicales libres, para discriminar la capacidad antioxidante de las diferentes mieles; su aplicación demandó un tiempo relativamente prolongado para una determinación analítica y se requirieron cuidados extremos para garantizar la reproducibilidad de los resultados. Se concluye que las mieles manifestaron capacidad antioxidante cuando se estudiaron mediante el método de decoloración del β-caroteno - ácido linoleico. Sin embargo, este no parece ser el método de ensayo más apropiado para determinar esta propiedad biológica en la miel.

Introducción

En el inicio del nuevo milenio, se han revalorizado muchos productos naturales. Se incorporaron conductas que tienden a reemplazar lo sintético por lo natural, recuperando así la importancia de la ingesta de uno de los néctares más antiguos y nobles: la miel.

Entre otras propiedades, la miel tiene el potencial de ejercer una acción antioxidante por la inhibición de la formación de radicales libres, gracias a la acción de los flavonoides y de otros polifenoles presentes en su composición [1]. El término antioxidante se aplica generalmente a cualquier sustancia que en bajas concentraciones, comparadas a las de un sustrato oxidable, puede retrasar o prevenir la oxidación de ese sustrato, incluyendo varios tipos de moléculas encontradas en los seres vivos [2]. En este sentido, el interés por la capacidad antioxidante de un alimento se basa en la posibilidad de incorporarlo a la dieta, para prevenir enfermedades de variada naturaleza.

Existen dos grupos fundamentales de técnicas analíticas para determinar la capacidad antioxidante: unas se basan en reacciones que involucran la transferencia de átomos de hidrógeno y las otras, en reacciones de transferencias de electrones. En el primer grupo se encuentran la Capacidad de Absorbancia de Radicales Oxígeno (ORAC), el Poder Antioxidante Total de Captura de Radicales (TRAP) y la inhibición de la oxidación del ácido linoleico; mientras que en el segundo, se incluyen: la Capacidad Antioxidante Equivalente de Trolox (TEAC), la Capacidad Antioxidante de Reducción del ión Férrico (FRAC), la Captura del radical difenil-1-picril hidracilo (DPPH), la captura del radical oxhidrilo (OH), Cu(I-II) y la determinación de compuestos fenólicos totales o reacción de Folin Ciocalteau [3]. Algunas de estas técnicas ya han sido utilizadas para estudiar el comportamiento de las mieles, entre las que se pueden citar FRAC

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[4], DPPH [5, 6], OH [2], TEAC [5 - 8] y compuestos fenólicos totales [3,9], sin embargo, se han realizado muy pocos estudios aplicando el método de inhibición de la oxidación del ácido linoleico.

La inhibición de la decoloración del β-caroteno en una oxidación conjunta con el ácido linoleico; es una metodología bien conocida para la evaluación de la capacidad antioxidante en productos naturales, ya que los carotenoides son extremadamente susceptibles a la oxidación por especies radicales libres. Esta técnica se basa en la medición espectrofotométrica de la decoloración de los carotenoides causada por su interacción con radicales peroxilo (LOO●), producidos durante la oxidación del ácido linoleico. La reacción que tiene lugar es una adición del radical peroxilo al sistema poliénico de los carotenoides, produciendo un radical estabilizado por resonancia. Este radical centrado en el carbono, es capaz de reaccionar con otros radicales, dando productos no radicales (etapa de terminación). De no ocurrir esto, el nuevo radical estabilizado añadirá oxígeno molecular en una etapa de propagación de una reacción en cadena, produciendo un radical caroteno-peroxilo [10]. Si existen antioxidantes en la sustancia analizada, los radicales libres reaccionarán con dichos compuestos, en lugar de atacar al β-caroteno, evitando que se decolore. En consecuencia, cuanto mayor sea la actividad antioxidante en la sustancia de interés, menor será la decoloración del β-caroteno.

Esta técnica ha sido usada en la evaluación del poder antioxidante de sustancias diversas, tales como alcaloides [11], jugos vegetales [12], guayaba [13], chocolate [14], plantas medicinales [15], mieles [16], polen apícola y propóleos [10].

El objetivo del presente trabajo fue determinar la capacidad antioxidante en mieles, aplicando el método de decoloración del β-caroteno - ácido linoleico, para determinar esta propiedad biológica en este alimento y para evaluar la factibilidad de la aplicación de este método sobre el sustrato mencionado.

Materiales y Métodos

Se ensayaron 22 muestras de miel, provenientes del Delta Medio y Bajo Delta del Río Paraná. El Delta del Río Paraná constituye una llanura sujeta a inundaciones de variada magnitud y recurrencia, que abarca aproximadamente 17.000 km2. La región ofrece recursos florísticos heterogéneos, que permiten desarrollar diversas alternativas de producción apícola. Presenta especies altamente nectaríferas como Polygonum, Eichhornia y Sagitaria, entre otras.

Las muestras se conservaron en ausencia de luz a 4 ºC y se analizaron en el transcurso de los cuatro meses posteriores a su recolección. Los ensayos se hicieron por duplicado para cada muestra y se informó el promedio.

Previo al ensayo de decoloración y para garantizar que las mieles no estuvieran deterioradas, se determinaron humedad, acidez y contenido de hidroximetil furfural (HMF). La determinación de humedad se realizó por refractometría de acuerdo al Método AOAC 969.38 [17], utilizando un refractómetro manual a 20ºC (Atago, Japan Model REF 106c). La acidez se cuantificó según el Método AOAC 862.19 [17], mediante titulación ácido base, empleando una solución de hidróxido de sodio 0.1M (Titrisol) hasta pH 8.3. El HMF se determinó por cromatografía líquida (Método AOAC 980.23, [17]), utilizando un HPLC Varian Pro Star (Agilent Technologies, California, USA), equipado con un detector UV y horno para columnas, provisto de columna con material de fase invertida C18 y empleando como fase móvil: agua: metanol (90:10 en volumen).

El método de inhibición de la oxidación del β-caroteno requiere de la preparación de una emulsión β-caroteno-ácido linoleico [11 - 15]. Para ello, se solubilizaron 3 mg de β-caroteno en 10 mL de cloroformo; 1 mL de esta solución se emulsionó con 40 mg de ácido linoleico, en presencia de 200 mg Tween 40. Finalmente, se evaporó el solvente durante 3 minutos con corriente de nitrógeno y se llevó a 100 mL con agua destilada. A 3 mL de este reactivo, se le adicionaron 50 µL de la

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solución acuosa de la muestra de miel de 0,1 mg/mL y se incubó en un baño con agitación a 50ºC. Transcurridas 5 horas en esas condiciones, se leyó la absorbancia a 470 nm frente al blanco. En forma paralela, se preparó una muestra control, en la que se reemplazó la solución de miel por 50 µL de agua [18].

Los reactivos utilizados fueron: ácido linoleico (Calbiochem), β-caroteno, agua calidad HPLC, metanol (Fluka), Tween 40 (Merck), TROLOX® (ácido 6-hydroxi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-carboxílico) (Sigma) y cloroformo Pro-Análisis (Cicarelli).

Para la expresión de los resultados, se seleccionó al TROLOX® como sustancia de referencia. Este compuesto es un análogo de la vitamina E, pero soluble en agua. Se lo utiliza en aplicaciones biológicas o bioquímicas para reducir el estrés oxidativo y ha sido adoptado como referencia en las determinaciones de capacidad antioxidante de sustratos complejos, como los alimentos, bebidas y suplementos dietarios [19]. La curva de calibración respondió a la ecuación Y=2,549 Abs - 0,229 (R2=0,995), donde Y representa la concentración de TROLOX® en mM [18]. Los resultados se expresaron como mg de TROLOX equivalente (TE) en 100 mg de miel. Las mediciones espectrofotométricas se efectuaron en un equipo Jasco Modelo 7800 (Jasco International, Tokio, Japón).

Se utilizó Excel 2007 para el tratamiento de los resultados. Resultados y Discusión

La Tabla 1 muestra los resultados de los parámetros fisicoquímicos ensayados. Tabla 1. Valores de acidez, humedad e hidroximetil furfural (HMF) en

las muestras de miel.

Muestra Acidez Humedad HMF Capacidad antioxidante meq/kg g/100 g meq/kg mg TE / 100 mg miel

145 25 19 15 86,1 149 34 19 26 96,6 150 30 18 13 84,3 151 37 19,5 16 96,6 152 38 19 18 96,1 157 33 19 17 101,6 160 37 19 19 97,1 164 34 19,8 22 96,1 169 30 19 29 85,3 153 20 19 11 86,6 154 37 19 21 98,9 155 31 19 13 97,6 171 31 19,2 14 99,1 172 33 18,8 17 97,4 173 37 19,5 25 95,9 205 31 19 26 101,6 211 28 19 30 88,3 214 28 18 9,5 83,3 218 27 18 14,4 97,6 219 38 19 13,6 89,8 4 20 18 12 88,1 8 27 18 11 86,6

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Se puede observar que las mieles analizadas cumplían con los estándares de calidad que establece el Reglamento Mercosur de Calidad e Identidad de la Miel [20], respecto a la acidez (máximo 40 meq/kg), humedad (máximo 20g/100g) y HMF (máximo 40 meq/kg), indicando que las mieles eran frescas, estaban en condiciones de comercializarse y resultaban aptas para estos ensayos.

La actividad antioxidante estuvo comprendida entre 83,3 y 101,6 mg TE/100 mg miel, con un valor medio de 93,2 ± 6,0 mg TE/100 mg miel. Estos resultados coinciden con los antecedentes publicados por otros autores [16].

En comparación con otros métodos utilizados para ensayar la capacidad antioxidante [2 - 9], se aprecia que este método tiene menor sensibilidad para discriminar entre las diferentes mieles. Desde el punto de vista del trabajo analítico, el procedimiento requiere extremos cuidados en la preparación de la emulsión de β-caroteno-ácido linoleico, que es muy sensible a la oxidación y que puede decolorarse durante la evaporación del cloroformo. Este método demanda mucho tiempo: cada determinación implica 5 h de reacción a 50 °C, más los tiempos de preparación y mediciones. También se requiere un estricto control de las condiciones experimentales para lograr reproducibilidad en los resultados. La oxidación del β-caroteno inducida térmicamente es bastante inespecífica, produce la isomerización de los carotenoides en la primera etapa, generando así productos con diferentes reactividades [21], que resultan difíciles de controlar y que pueden incidir en la absorbancia de la solución final.

Conclusiones

Todas las mieles mostraron resultados positivos, corroborando la capacidad antioxidante de este producto natural, en coincidencia con los antecedentes publicados.

La menor sensibilidad de este método para discriminar la capacidad antioxidante de las diferentes mieles, la duración del ensayo y las posibles fuentes de error, hacen presumir que no sería este el método más indicado para determinar esta propiedad biológica en las mieles.

Referencias

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[20] Reglamento Técnico Mercosur de Calidad e Identidad de la Miel MERCOSUR/GMC/Res. Nº

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