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Inducción de morfogénesis a partir de tejido calloso de frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris) tolerante a estrés hídrico

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INDUCCIÓN DE MORFOGÉNESIS A PARTIR DE TEJIDO CALLOSO DE FRIJOL

ARBUSTIVO (Phaseolus vulgaris) TOLERANTE A ESTRÉS HÍDRICO.

KATRIN VALERIA CAMPUZANO SOTO

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

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INDUCCIÓN DE MORFOGÉNESIS A PARTIR DE TEJIDO CALLOSO DE FRIJOL ARBUSTIVO (Phaseolus vulgaris) TOLERANTE A ESTRÉS HÍDRICO.

KATRIN VALERIA CAMPUZANO SOTO

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito para optar al título de MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

Director

CHRISTIAN ANDREI CHACIN ZAMBRANO Ing. MSc en Biotecnología Microbiana

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

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DEDICATORIA

A mis padres quienes con su amor, paciencia y esfuerzo me permitieron llegar a cumplir hoy un

sueño más, por sus sabias palabras, por inculcar en mi ejemplo de valentía, y de no temer a las

adversidades. A mi hermano por su cariño y apoyo incondicional, durante todo este proceso, por

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AGRADECIMIENTOS

A Dios todo poderoso por darme la vida y la oportunidad de realizar este trabajo.

A mis padres por brindarme la oportunidad de estudiar, por su apoyo y amor incondicional.

A mi hermano que con sus palabras me hacían sentir orgulloso de lo que soy.

A mi familia que me ayudaron de una manera desinteresada, gracias infinitas por toda su ayuda y

buena voluntad.

A mi tutor Christian Chacín y María Cañas por su dedicación, paciencia, por toda la enseñanza

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TABLA DE CONTENIDO

INDUCCIÓN DE MORFOGÉNESIS A PARTIR DE TEJIDO CALLOSO DE FRIJOL

ARBUSTIVO (Phaseolus vulgaris) TOLERANTE A ESTRÉS HÍDRICO. ...1

1. INTRODUCCIÓN ...14

2. PLANTEAMIENTO PROBLEMA ...16

3. JUSTIFICACIÓN ...18

4. HIPÓTESIS ...19

5. OBJETIVOS ...20

6. MARCO TEÓRICO ...21

7. MARCO REFERENCIAL ...32

8. METODOLOGÍA ...34

10. CONCLUSIONES ...44

11. RECOMENDACIONES ...45

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7

LISTA DE FIGURAS

Figura1.Sistema de raiz inicial ………20

Figura 2. Formación de raices completamente desarrolladas .. ………21

Figura 3. Etapas tipos de habitos de crecimiento. .... ………22

Figura 4. Explantes de frijol arbustivo Phaseolus vulgaris. (A) Explantes de callos maduro luego de 8 meses de siembra, (B) Explantes de callos friables con un tiempo de siembra de 2 semanas. ... 34

Figura 5. Porcentaje de oxidación de los explantes de Phaseolus vulgaris ... 36

Figura 6. Porcentaje de formación de brotes de explantes de Phaseolus vulgaris. ... 37

Figura 7. Porcentaje de formación de raíces de explantes de Phaseolus vulgaris. ... 38

Figura 8. Formación de número de hojas a partir de callos reactivados. ... 39

(8)

8

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Tabla de formulación de medios de cultivo. ... 56

Anexo 2. Análisis de varianza de la variable oxidación. ... 57

Anexo 3. Análisis de varianza de la variable formación de brotes. ... 57

Anexo 4. Análisis de varianza de la variable formación de raíces. ... 58

Anexo 5. Análisis de varianza de la variable número de raíces. ... 58

Anexo 6. Análisis de varianza de la variable número de hojas. ... 59

Anexo 7. Formación de nuevos brotes a partir de tallos de Phaseolus vulgaris por medio de proceso de morfogénesis. ... 59

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LISTA DE TABLAS

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10 RESUMEN

Título: Inducción de morfogénesis a partir de tejido calloso de frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris) tolerante a estrés hídrico.

Autores: Campuzano Soto, Katrin Valeria

Palabras claves: Phaseolus vulgaris, callos, morfogénesis, estrés hídrico, frijol. Descripción:

El frijol es un alimento muy versátil e importante, debido a su aporte nutricional. El cultivo de

tejidos y la regeneración de plantas de frijol se ha reportado con cierto grado de éxito en los últimos

años y representan una alternativa de cultivo para las especies del genero Phaseolus, (Fenalce, 2011).

En este trabajo de investigación se realizó con el fin de inducir el proceso de morfogénesis para la

regeneración de plantas a partir de tejidos callogénico de frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris) tolerante a estrés hídrico. Para el desarrollo de este, se seleccionaron callos de explantes de frijol

arbustivo de 2 meses de crecimiento, se formularon seis medios de cultivos a diferentes

concentraciones hormonales para la regeneración del tejido vegetal.

Los resultados mostraron que el tratamiento T1, T3 y T5, que contenía ANA 0,75 mg/l, acido

nicotínico 0,5 mg/l, manitol al 2g/l y glicina 2mg/l respectivamente; tuvieron una mejor actividad

controladora de los radicales libres causantes de la oxidación, eliminándolos en su totalidad. Para

las variables de formación de hojas y raíces, el medio de cultivo T1, logrando inducir una mayor

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12 ABSTRACT

Title: Induction of morphogenesis from callus of bush bean (Phaseolus vulgaris) tolerant to water stress.

Authors: Campuzano Soto, Katrin Valeria

Key words:Phaseolus vulgaris, callus, morphogenesis, water stress, bean.

Description:

The bean is a very versatile and important food, due to its nutritional contribution. The cultivation

of tissues and the regeneration of bean plants has been reported with some degree of success in

recent years and represent a growing alternative for the species of the genus Phaseolus. (Fenalce, 2011).

In this research work was carried out in order to induce the process of morphogenesis for the

regeneration of plants from callogenic tissues of bush beans (Phaseolus vulgaris) tolerant to water stress. For the development of this, callus from explants of shrubby beans of 2 months of growth

were selected, six culture media were formulated at different hormonal concentrations for the

regeneration of the vegetal tissue.

The results showed that the treatment T1, T3 and T5, which contained ANA 0.75 mg / l, nicotinic

acid 0.5 mg / l, mannitol at 2 g / l and glycine 2 mg / l respectively; they had a better controlling

activity of the free radicals causing the oxidation, eliminating them in their entirety. For the

variables of formation of leaves and roots, the culture medium T1, managing to induce a greater

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14

1. INTRODUCCIÓN

Entre los géneros de Phaseolus (Frijol) se encuentra Phaseolus vulgaris con mayor frecuencia en el continente americano, según estudios Phaseolus tiene origen en países como Estados Unidos, México y Perú. el frijol aporta a la población mundial un alto nivel nutrientes debido su diversidad

de fuentes de alimentación como proteína, aminoácidos entre otros; complementando valiosos

aportes a la dieta de millones de personas pertenecientes a estos continentes (Lourdes, y otros,

2009).

En Colombia, esta actividad agrícola la desarrollan alrededor de 120.000 productores en el año

2011 (Fenalce, 2011). Actualmente, en el primer periodo del 2018, ha teniendo una producción de

57.982 toneladas; disminuyendo hasta un 50% de su rendimiento, las cuales no alcanzan a

abastecer la demanda interna del país. El departamento de Santander es uno de los productores

en Colombia con un (18,19%) de producción; seguido del Tolima (10.45%); Nariño (6,27%); y

Huila (5,02%); entre otros (FENALCE, Federación nacional de cultivadores de cereales y

leguminosas, 2017-2018).

En conjunto los municipios pertenecientes a Santander, con el 54% en la producción de frijol

pertenece a la provincia de Guanentá, seguido por la provincia de García Rovira aporta el 29.7%

y un 16.3% la Provincia de Soto, entre los municipios más destacados se encuentran San Gil,

Barichara, Socorro, Curiti, Mogotes, entre otros (Cárdenas Mateus, 2016).

Los principales problemas que afectan la producción de frijol van relacionados desde

enfermedades por plagas hasta la baja regeneración de brotes con el fin de micropropargar planta

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tenido un gran auge y una de las técnicas en el cultivo in vitro es la regeneración de brotes a partir

de la morfogénesis, la cual ayuda a muchos explantes a la formación de nuevas estructuras.

La regeneración de plantas a partir de células diferenciadas in vitro es una clara demostración

de la plasticidad de las células vegetales en respuesta a señales ambientales específicas; donde las

células adquieren competencias para cambiar el destino que llevan mediante el proceso de

desdiferenciación seguido por la aplicación de una nueva vía de desarrollo. (Gamarra Reinoso L.

, 2014).

La morfogénesis comprende la formación de órganos y la diferenciación celular. En las células

o tejidos cultivado in vitro el proceso morfogenético puede inducirse ya que, las células vegetales

son capaces bajo determinados estímulos desdiferenciarse y diferenciarse de nuevo, a esa

plasticidad se le conoce como totipotencia celular. (Gisbert Doménech, 2010).

El presente trabajo está estructurado en tres partes, en la primera sección se exponen los

aspectos generales del cultivo de frijol, su problemática, se describe las técnicas de la regeneración

de cultivos en biotecnología de tejidos vegetales y antecedentes los métodos utilizados en los

últimos años. En la siguiente sección se establecen los objetivos, la descripción de la metodología,

resultados y análisis, así mismo las conclusiones y recomendaciones basadas en la experiencia y

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2. PLANTEAMIENTO PROBLEMA

El cultivo de tejidos y la regeneración de plantas de frijol se ha reportado con cierto grado de

éxito en los últimos años y representan una alternativa de cultivo para las especies del genero

Phaseolus, sin embargo, el desarrollo de un sistema optimo en la regeneración in vitro ha tenido serias dificultades desde los primeros estudios realizados por Hildebrandt en 1963 y 1975

(Cárdenas Mateus, 2016). Hasta la fecha no se ha logrado tener un protocolo eficiente para la

regeneración de este cultivo, lo que representa un gran desafío por lo recalcitrante de esta planta.

(Lázaro Ponciano, 2013)

Actualmente, se han reportado estudios de propagación in vitro de frijol empleando técnicas

tales como la embriogénesis somática y organogénesis directa a partir de diferentes explantes como

embriones, embriones inmaduros, cotiledón, epicótilos, hojas y tallos, obteniendo excelentes

resultados en cuanto a la capacidad de multiplicación, saneamiento y selección de especímenes

transformados (Collado, y otros, 2011). Sin embargo, el desarrollo de morfogénesis a partir de

tejido callogénico ha sido uno de las técnicas menos empleadas debido a la complejidad que se

puede presentar al momento de buscar un balance hormonal adecuado para la formación de brotes

y raíces, sumado a la limitada información que se encuentra referente a las condiciones de cultivo

e incubación. (Martínez, 2014).

Es de gran importancia mencionar que en los estudios desarrollados anteriormente para la

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17

indicando la necesidad de optimización en el balance de contenidos hormonales de los medios de

cultivo hacia los explantes para el aumento de respuestas en el material vegetal desarrollados.

Pregunta Problema

¿Es posible generar y encontrar un balance hormonal adecuado para producir plantas de frijol

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3. JUSTIFICACIÓN

Observando esta problemática, se realizó este trabajo de investigación con el fin de obtener un

protocolo que permita mejorar la inducción de plantas a partir de callos de frijol arbustivo

(Phaseolus vulgaris) mediante el método de morfogénesis, el cual permitirá aprovechar la alta tasa de multiplicación que se puede generar mediante la utilización de los callos para la formación de

plantas completas.

Así mismo, este trabajo contribuirá a la generación de nuevo conocimiento mediante la

estandarización de procedimientos en relación a las condiciones de incubación, segundo a las

formulaciones en medios de cultivos y balances hormonales en la producción de plantas a partir

de callos embriogénicos, tercero brindar una alternativa de producción agrícola que ayude a la

obtención de plantas libres de patógenos de frijol arbustivo tolerante a estrés hídrico. A su vez, la

formación de recurso humano en el área de la biotecnología vegetal en los procesos de inducción

de explantes por morfogénesis. Y por último me ayudará a la obtención del título como

Microbióloga Industrial.

Es importante resaltar que este proyecto será pionero en la aplicación de la técnica de

morfogénesis en frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris) en Santander, convirtiéndose en unreferente para el desarrollo de nuevas investigaciones en esta área del conocimiento a nivel nacional e

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4. HIPÓTESIS

4.1. Hipótesis nula

No habrá inducción de morfogénesis de callos de frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris) a partir de los diferentes balances hormonales establecidos.

4.2. Hipótesis alterna

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5. OBJETIVOS

5.1. Objetivo general

5.1.1. Inducir el proceso de morfogénesis para la regeneración de plantas a partir de tejidos

callogénico de frijol arbustivos (Phaseolus vulgaris) tolerante a estrés hídrico.

5.2. Objetivos específicos

5.2.1. Establecer las condiciones iniciales de los callos de Phaseolus vulgaris para la inducción del proceso de morfogénesis.

5.2.2. Determinar los diferentes medios de cultivos y formulaciones hormonales para la fase

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6. MARCO TEÓRICO

6.1. Generalidades del cultivo de frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris).

El cultivo del frijol se adapta de forma adecuada en temperaturas entre 15°C y 27°C, periodos

con altas temperaturas aceleran el crecimiento de las plantas y las bajas lo retardan. La maduración

del fruto coincide con las estaciones lluviosas, lo cual permite que el grano se manche y pierda su

calidad. Este grano se siembra preferiblemente en suelos aireados y no en suelos arcillosos. No

obstante, para aumentar la diversidad de la producción se pueden sembrar semilla de Phaseolus vulgaris en suelos secos con rotaciones con maíz en el periodo invernal. (Ruíz de León, Collado López, & Iglesias Rodríguez, 2017)

6.2. Taxonomía de Phaseolus vulgaris

El cultivo de frijol se considera uno de los más antiguos, debido a los primeros estudios

arqueológicos en México y Sudamérica, indican que se conocía hace algunos 5000 años A.C. El

frijol corresponde a la especie del género de Phaseolus. Su nombre es Phaseolus vulgaris L.,

asignado por Linneo en 1753. (Ulloa, Ulloa, Ramiréz Ramiréz, & Ulloa Rangel, 2011).

Reino: Plantae Subclase: Rosidae

Orden:Fabales Familia:Fabaceae Subfamilia: Faboideae

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Subtribu:Phaseolinae Género:Phaseolus

Especie:Phaseolus vulgaris.

Fuente: (Ruíz de León, Collado López, & Iglesias Rodríguez, 2017).

6.3. Morfología del frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris) 6.3.1 Raíz

La planta de frijol tiene raíces las cuales son de tipo fibrosa las cuales se puede evidenciar su

presencia desde los primeros días de germinación ubicándose en la parte inferior del tallo; las

raíces secundarias se pueden observar incluso desde el tercer día. (Ulloa, Ulloa, Ramiréz Ramiréz,

& Ulloa Rangel, 2011)

La primera etapa de desarrollo, el sistema radical está formado por la radícula de embrión, la cual

se convierte en la raíz primaria o principal. Al poco tiempo de la emergencia se pueden observar

las raíces secundarias, que se desarrollan en la parte superior o cuello de la raíz principal.

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Figura 2. Formación de raíces completamente desarrolladas.

6.3.2 Tallo y ramas

El tallo que constituye la planta de frijol es herbáceo con secciones cilíndricas por la conformación

de la epidermis. Su iniciación se da en la parte superior de la raíz, de forma ascendente se observa

las diferentes ramificaciones para la formación de los nudos de los cotiledones para la formación

de las hojas. Entre las coloraciones que esta estructura presenta se encuentra el verde, rosa o

morado, respecto a la variedad. La altura del tallo es aproximadamente de 80 cm para Phaseolus vulgaris (Arias Restrepo , Rengijo Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007). Los hábitos de crecimiento se clasifican con la utilización del tipo de yema terminal (vegetativa vs reproductiva),

la fuerza del tallo (débil frente a fuerte), capacidad trepadora y los patrones de llenado de las

vainas. Los hábitos de crecimiento son el determinado (Tipo I) que al entrar en la fase reproductora,

el tallo y las ramas terminan en una inflorescencia desarrollada, por lo que la planta cesa su

crecimiento y no produce más nudos ni entrenudos; indeterminado arbustivo con tallo y ramas

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pocas ramas cortas con respecto al tallo y continúa creciendo a un ritmo menor durante la etapa de

floración y pueden tener la habilidad para trepar; indeterminado postrado, con tallo y ramas débiles

y rastreros (Tipo lll), el desarrollo del tallo y el grado de ramificación origina variaciones en la

arquitectura como la aptitud trepadora, especialmente si las plantas cuentan con un soporte;

algunas plantas son postradas y otras son arbustivas hasta la prefloración y luego son postradas;

indeterminado trepador (Tipo lV): a partir de la primera hoja trifoliada, el tallo desarrolla la

capacidad de torción lo que le permite trepar, con dominancia apical; pueden alcanzar más de dos

metros de altura con un soporte adecuado (Valverde, 2015).

Figura 3. Etapas tipos de hábitos de crecimiento. (Arias Restrepo , Rengijo Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007)

6.3.3 Hojas

Las hojas de la planta de frijol, se clasifican en dos: sencillas y en complejas o trifoliadas (Tres

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planta cuando está totalmente desarrollada o madura. Las complejas son las hojas características

de la planta de frijol, las cuales tienen pecíolo y un raquis. En la inserción de las hojas trifoliadas

hay un par de estípulas de forma triangular que siempre son visibles(Arias Restrepo , Rengijo

Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007)

6.3.4 Semilla

Las semillas de la planta de frijol se pueden observar cilíndrica, ovalada, redonda y arriñonada.

Sus colores son diversos de acuerdo a la variedad; la gama de colores varía entre blanco, crema,

amarillo, rojo café y morado. También se pueden encontrar semillas con combinaciones de colores

en forma de manchas. Se compone de plúmula, cotiledón, hojas primarias, hipocotilo, radícula

hilum y rafe (Arias Restrepo , Rengijo Martínez, & Jaramillo Carmona, 2007) 6.3.5 Flor

Se pueden presentar dos tipos de estadios durante su proceso de desarrollo: el botón floral y la flor

completamente abierta. Los días a la floración dependen de la variedad, altura sobre el nivel del

mar y de las horas de luz que reciban las plantas. La morfología floral favorece la autopolinización.

Las anteras están al mismo nivel que el estigma y ambos órganos están envueltos completamente

por la quilla. Cuando se produce la dehiscencia de las anteras, el polen cae directamente sobre el

estigma. (Valverde, 2015)

6.4. Cultivo in vitro

El cultivo in vitro es una técnica biotecnológica que utiliza el término de totipotencia celular,

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del material genético de la planta a la que pertenece, independientemente de su función. La

respuesta de totipotencia celular, de morfogénesis in vitro y de regeneración de plantas ocurre en

presencia de niveles de citoquininas y auxinas apropiados para el cultivo que se esté utilizando.

(Criollo, Insuasti, & Delgado, 2016)

6.5. Micropropagación

Consiste en generar plantas en condiciones controladas. Primero se inicia con el cultivo de

tejidos in vitro, en el cual, el material vegetal que se utiliza es una célula, tejido u órgano de una planta.Estos materiales pueden provenir de tejidos como tallo, raíz, hojas, meristemos, embriones,

etc. (Narváez, 2009).

6.6. Regeneración y morfogénesis

La regeneración de plantas, es la restauración del tejido a partir de una o de varias células. La

morfogénesis engloba el desarrollo de las formas y estructuras de un organismo o de parte del

mismo.

La embriogénesis somática y la organogénesis son dos procesos morfo genéticos muy

frecuentes en el cultivo de tejidos vegetales. La embriogénesis somática es el proceso por el cual

se obtiene una estructura similar al embrión sin que exista la fertilización de los gametos, mientras

que en la organogénesis se pueden obtener tallos, raíces o flores mediante la inducción de una

célula o un grupo de células que tienen la propiedad de mantenerse en activa división. (Levitus,

Echenique, Rubinstein, Hopp, & Mroginski, 2004).

6.7. Embriogénesis somática

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La embriogénesis ocurre en dos etapas, la primera etapa consta de células competentes aisladas

de medios ricos en auxinas formando grupos de células embriogénicas; la segunda etapa consiste

en luego de realizar un repique de los embriones se pasan a un medio sin auxinas, esto con el fin

de que proliferen de forma lenta e indiferenciadamente. Seguidamente se produce una serie de

divisiones celulares en distintas zonas del embrión y conforman embriones globulares, que al

momento de crecer pasan por los estados de corazón, torpedo, una fase de maduración y

germinación que dan lugar a una planta completa. (Narváez, 2009)

6.7.2. Factores que afectan la embriogénesis

Los factores de la embriogénesis son el explante, medio de cultivo y ventajas y desventajas

descritas a continuación.

6.7.2.1. El explante

Los tejidos tienen la capacidad de formar callos in vitro, pero pocos tienen la habilidad para

producir callos embriogénicos. Actualmente se han usado con éxito explantes como cotiledones,

hipocótilos y embriones, tallos, hojas y raíces.

La respuesta del callo embriogénico, depende del genotipo de la planta. Algunos cultivos

pueden regenerarse fácilmente en un medio específico, en cambio que otros cultivos no tienen

ninguna respuesta en el mismo medio de cultivo. (Narváez, 2009)

6.7.2.2 Ventajas y Desventajas

Una de las ventajas que se presenta en la propagación de plantas a partir de la embriogénesis es

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obtener en un solo proceso estructuras completas con ápice y raíz, las cuales pueden ser

almacenadas y encapsuladas.

La embriogénesis no se puede aplicar a gran escala, se producen anormalidades morfológicas,

fisiológicas y genéticas en los cultivares, fenómenos de poliembrionía indeseables, falta de

maduración y dormancia o germinación prematura de los embriones en los cultivos.

6.8. Organogénesis

La organogénesis es una técnica de la biotecnología vegetal, la cual permite la formación de

tallo, yemas y raíces a partir de diferentes explantes como las hojas, tallos, flores, callos,

meristemos o células en suspensión. Estos órganos son inducidos a partir de una o más células

según sea las condiciones del cultivo, cuenta con la propiedad de mantenerse en activa división.

Esta técnica normalmente se da en dos etapas, la primera consta de la producción y crecimiento

de tallos a partir de callos, hojas, cotiledones, hipocótilos, etc. En la segunda etapa se realiza el

enraizamiento. Existen dos tipos de organogénesis, directa e indirecta; la directa consiste en que

a partir de una siembra de diferentes explantes y con sus condiciones respectivamente adecuadas,

se puede inducir la regeneración de brotes, raíces o flores de una parte de la planta sin necesidad

de tener la formación del callo. (Narváez, 2009)

En cambio, la forma indirecta, se realiza a partir de la siembra de un explante en donde se

observa el crecimiento de una aglomeración de células en forma desordenada y sin ningún

funcionamiento. Seguidamente se inicia con la producción de callos. La organogénesis indirecta

ha tenido mucha importancia debido a la micropropagación clonal ya que es generador de nuevas

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6.8.1. Factores que afectan la organogénesis

Los factores de la organogénesis son el tipo explante, medio de cultivo y ventajas descritas a

continuación.

Los explantes que se han utilizado con un alto éxito son ramas en floración, pedúnculos florales,

embriones inmaduros, meristemas, epicotilos, yemas florales, entre otros.

Los requerimientos de los reguladores de crecimiento para la organogénesis dependen del tipo

de explante usado, así como el tamaño del explantes, debido a que los explantes grandes poseen

un potencial regenerador mayor. Así mismo, el estado de planta madre y la estación durante el cual

el explante sea extraído, ya que puede afectar el potencial organogénico. (Narváez, 2009).

6.9. Ventajas

Una de las grandes ventajas de la organogénesis es la enorme capacidad de multiplicación a

escala industrial, permitiendo obtener en un solo proceso estructuras completas con ápice y raíz,

que pueden ser almacenadas y encapsuladas perfectamente con las condiciones ambientales

requeridas.

6.10. Medios de cultivo

Frecuentemente se ha utilizado el medio de cultivo desarrollado por Murashige & Skoog (1962);

compuesto por una alta concentración de sales lo que genera que este medio sea muy benéfico para

el crecimiento de embriones somático. (Narváez, 2009). La composición de los medios de cultivos

para la propagación in vitro depende exclusivamente del objetivo trazado y el tipo de planta se

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30

para su micropropagación, como es el ejemplo de las plantas tipo leñosas o maderables.

(Torrescano De Labra, 2014).

Ente los componentes que debe tener un medio de cultivo se encuentra los macronutrientes (C, H,

O, P, K, O, S, Ca y Mg); los micronutrientes (Zn, Cu, Mo); las vitaminas y los reguladores de

crecimiento. El medio de cultivo más utilizado es el medio basal MS (Murashige & Skoog), en el

cual se puede trabajar con la mayoría de explantes, modificándose según su necesidad. (Villamizar

Galvis, 2005).

6.11. Reguladores de crecimiento

Los reguladores de crecimiento se pueden presentar de dos formas, naturales o sintéticas. Las

auxinas son un grupo de hormonas que ayudan a la estimulación de la división celular. Las auxinas

más utilizadas son ANA, AIA, AIB, 2,4D. El AIA es el regulador con mayor utilización. En el

caso de las citoquinas promueven el desarrollo de brotes axilares, en el medio son utilizadas para

romper la dominancia apical y estimular la brotación de las yemas que se encuentran en las axilas

de las hojas, la primera citoquinina fue la Zeatina, Kinetina, 6-BAP. Las giberelinas es el grupo

más numeroso de las hormonas vegetales, encontradas de forma natural en las plantas, el ácido

giberélico es producido por el hongo Giberella fujikuroi. Por su parte son utilizadas para la estimulación fisiológica, algunas de ellas ayudan al alargamiento celular de una forma que

normalmente no se observaría en un crecimiento de la planta tratada. (Villamizar Galvis, 2005)

6.12. Estrés hídrico

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31

Las afectaciones del déficit hídrico son visibles en las hojas, aparece una senescencia prematura,

seguido de cambios morfológicos y metabólicos en las raíces y tejidos primarios, esto debido a la

falta de agua. El estrés hídrico genera un incremento en la producción de especies reactivas del

oxígeno induciendo el cierre de las estomas eliminando la absorción de dióxido de carbono. Los

tejidos de las plantas con déficit hídrico aumentan las concentraciones de ácido abscisico,

favoreciendo así el incremento de la conducción hídrica en las raíces. (Ruíz de León, Collado

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7. MARCO REFERENCIAL

La regeneración in vitro de frijol se ha documentado como un proceso de baja eficiencia y

pobre repetibilidad. Hammatt et al. (1986) sugirieron que la recalcitrancia de las leguminosas

de semilla grande en la regeneración in vitro pudo haber resultado de su larga historia de

mejoramiento y selección de genotipos de alto rendimiento, que llevo a la reducción de la

variabilidad genética y a la perdida de totipotencia por vías que no sean la meristemática.

La regeneración en especies de Phaseolus ha tenido dificultades desde los primeros intentos realizados por Hildebrandt en 1963. Desde entonces, las referencias sobre la regeneración de

plantas a partir de callos en especies de Phaseolus son limitadas. La composición y concentración de los reguladores del crecimiento en el medio de cultivo, son factores

determinan para el normal crecimiento y desarrollo de las plantas en los sistemas de cultivo in

vitro. Las auxinas y citoquininas, han sido los reguladores del crecimiento más utilizados.

Peralta et al. (1987) regeneraron plantas completas a través del cultivo de meristemos

apicales en un medio de cultivo suplementado con agua de coco sin ningún tipo de reguladores

de crecimiento, y adicionalmente determinaron el papel crucial de la luz en el proceso de

regeneración. Crocomo et al. (1979) reportaron que la variación en la proporción de

kinetina/auxina puede controlar el desarrollo in vitro de los ejes embrionarios. (Martínez

Castillo, 2014)

Los investigadores Lourdes García, Raúl Collado, Idalmis Bermúez, Novisel Veitía,

Damaris Torres, Carlos Romero. En el Instituto de Biotecnología de las Plantas de la

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33

titulada como influencia del medio de cultivo en el crecimiento y desarrollo de brotes de

Phaseolus vulgaris regenerados in vitro, en donde lograron el crecimiento y elongación de

brotes regenerados a partir de yemas adventicias de esta especie y por lo tanto estudiaron varios

medios de cultivos propuestos en la literatura para las especies de Phaseolus.

En la Universidad De Costa Rica. El investigador Jenny Muños Valverde en 2015 realizó

regeneración in vitro de variedades de frijol costarricense (Phaseolus vulgaris) a partir de

tejidos morfogénicos: Inducción de callo de histología del proceso. Los protocolos de

regeneración in vitro en frijol común son la base para el mejoramiento genético no

convencional de esta especie. En el presente trabajo se logró la regeneración in vitro de tres

variedades (Brunca, Guaymí y Bribrí) a partir de los callos.

En el 2015 en el Instituto De Biotecnología de las Plantas de la Universidad Central Marta

Abreu de Las Villas, en cuba. Los investigadores Lourdes García, Amanda Ramírez, Idalmis

Bermúdez, Raúl Collado, Damaris Torres, Carlos Romero. Determinaron el efecto del sulfato

de adenina en la formación de brotes de Phaseolus vulgaris. Cultivar ‘CIAP7247F’ vía organogénesis indirecta en donde obtuvieron como resultados que la adición del sulfato de

adenina estimula la formación y elongación de brotes a partir de callos organogénicos de frijol

(34)

34

8. METODOLOGÍA

8.1. Lugar de ejecución de la investigación

Esta investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Tejidos Vegetales de la Universidad

de Santander, Campus Lagos del Cacique - Bucaramanga, Colombia.

8.2. Tipo de investigación: Investigación experimental.

8.3. Fases de la investigación

Para el desarrollo del trabajo se establecieron 2 (dos) etapas de:

8.3.1. Establecimiento de las condiciones iníciales de los callos de Phaseolus vulgaris para la inducción del proceso de morfogénesis.

8.3.1.1. Reactivación de los callos embriogénicos

Para la reactivación de los callos se empleó la formulación estandarizada por (Angarita &

Chacin, 2017) (Ver anexo 1). Empleando el medio de cultivo compuesto por las sales MS

(Murashige & Skoog, 1962), 6-BAP 0,8mg/L; AIA 0,1 mg/L; tiamina 0,36 mg/L; kinetina 0,5

mg/L,con el fin de generar nuevo tejido callogénico que facilitará la obtención de material friable

para desarrollar la morfogénesis.

8.3.2. Estandarización de las formulaciones hormonales en el desarrollo de brotes y raíces a partir de callos de Phaseolus vulgaris.

(35)

35

Una vez reactivados los callos, se seleccionaron callos friables que presentaron una coloración

blanca verduzca, con un tiempo de crecimiento de dos semanas y callos con una coloración café

con un tiempo de crecimiento de ocho meses a los cuales se le realizaron cortes de 2 milímetros

en condiciones de asepsia en la cabina de flujo laminar con el fin de obtener un mejor desarrollo

callogénico en el medio de cultivo. (Rodriguez, Ramazini, Fuentes, Arévalo, & Figueroa, 2003)

8.4. Formulación de los tratamientos para inducir el proceso de morfogénesis

Para esta etapa, se establecieron seis (6) medios de cultivo (T1, T2, T3, T4, T5 y T6) a los cuales

se les proporcionaron diferentes concentraciones de soluciones, hormonas de crecimiento vegetal

y vitaminas. Los cuales se diferenciaban por contener diferentes hormonas a distintas

concentraciones, (75, 70 y 73 ul) de ANA, (30 ul) de 2,4-D, (10 y 800 ul) de 6-BAP, (60 ul) AIB

y (10 y 100 ul) AIA. Para determinar el mejor tratamiento y evaluar el porcentaje de inducción

brotes, porcentaje de inducción de raíces, número de hojas y el número de raíces. Los Estos medios

fueron formulados en el laboratorio de tejidos vegetales a partir de un medio de cultivo basal MS

(Murashiges & Skoog, 1962) (Ver anexo 1). La siembra de los callos se realizó bajo condiciones

de asepsia empleando una cabina de flujo laminar y fueron llevados al área de incubación en

condiciones de luz artificial proporcionada por lámparas fluorescentes con fotoperiodos de 16

horas luz y 8 horas de oscuridad a una temperatura de 20º C.

8.5. Análisis estadístico

Se realizó un análisis estadístico posterior a las variables medidas, a partir de un ANOVA para

determinar diferencias significativas y un test LSD Fisher para la comparación de medias en los

(36)

36

9. RESULTADOS

9.1. Establecimiento de las condiciones iníciales de los callos de Phaseolus vulgaris para la inducción del proceso de morfogénesis.

9.1.1 Obtención de material vegetal y reactivación de callos.

El material vegetal estudiado fue obtenido de callos entre dos semanas y 8 meses de crecimiento

en medio MS (Murashiges & Skoog, 1964) modificado, del laboratorio de tejidos vegetales de la

Universidad de Santander UDES.

Figura 4. Explantes de frijol arbustivo Phaseolus vulgaris. (A) Explantes de callos maduro luego de 8 meses de siembra, (B) Explantes de callos friables con un tiempo de siembra de 2 semanas.

A

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37

En la figura 4, se evidencia los callos en el medio de reactivación estandarizado por (Angarita

Guzmán & Chacín Zambrano, 2018). Los callos con un tiempo de 8 meses de siembra, se

transfirieron a un medio de cultivo con la suplementación de macro y micronutrientes necesarios

sin hormonas, por un tiempo de duración de 2 semanas; con el fin de eliminar trazas de sustancias

hormonales que podrían contener los callos, para facilitar el proceso de morfogénesis de estos.

Inicialmente estos callos no presentaron ninguna respuesta, (Ver figura 4 A), En la figura 4 (B) se

observa callos friables jóvenes, con una coloración verde claro, los cuales presentan mejor

viabilidad para la regeneración de brotes ya que un tiempo después de 2 semanas de transferirse al

medio de reactivación se observó la presencia de raíces iniciales. (Lindarte, 1997), manifestó en

su escrito de los principios básicos de la biotecnología vegetal, que en el momento que se

transfieren los callos a medios sin suplementos hormonales, disminuyen la carga actual de las

mismas estructuras, equilibrando las concentraciones y, por ende, permitir la evaluación de nuevos

medios de cultivo suplementados con reguladores de crecimiento vegetal.

9.2. Estandarización de las formu laciones hormonales en el desarrollo de brotes y raíces a partir de callos de Phaseolus vulgaris.

De acuerdo a las formulaciones establecidas se generaron los siguientes resultados.

9.2.1. Oxidación

En la figura 5, se evidencia diferencias significativas entre los medios de cultivos, donde el T6,

presentó oxidación del 72% seguido por los medios T4 con 53% y el T2 con 40%; Mientras que

los T1, T3 y T5 que arrojaron valores de oxidación menores al 10% (Ver anexo 2). Estos

comportamientos se pueden dar como resultado a la asimilación del ácido cítrico presentes en los

(38)

38

los callos reactivados, (Angarita Guzmán & Chacín Zambrano, 2018). Así mismo, se observó que

los tratamientos T1, T3 y T5, presentaban concentraciones adecuadas de cisteína, el cual tiene la

capacidad de ayudar a disminuir la oxidación. Estudios realizados por (Lelurlys Napoles, Perez ,

Hernandez, Peralta, & Trujillo , 2005) encontraron que la aplicación de cisteína sobre yemas

auxiliares de guayaba, eliminaron los radicales en el tejido lesionado hasta un 60 %.

Figura 5. Porcentaje de oxidación de los explantes de Phaseolus vulgaris

En un estudio realizado por (Azofeita, 2009), evidenció que el proceso de oxidación se produce

en las primeras semanas de iniciación del proceso de morfogénesis, el cual provoca una gran

pérdida en los explantes por la formación de radicales libres, lo cual se ajusta a lo demostrado en

la evaluación, donde las dos primeras semanas se presentó la mayor oxidación de los tratamientos.

(39)

39 9.2.2. Formación de brotes

Figura 6. Porcentaje de formación de brotes de explantes de Phaseolus vulgaris.

Como se puede observar en la figura 6 el medio de cultivo que aportó el equilibrio óptimo

para el desarrollo de estructuras como brotes de hojas fue el medio T1 con un 72%, este

resultado coincide con lo que porcentaje de números de estructuras segundarias, en donde la

actividad de la hormona AIA, indujo también la formación de raíces. (Ver anexo 8).

Los reguladores y promotores de crecimiento vegetal como AIA, 6-BAP, Adenina, Glicerina y

Kinetina, jugaron un papel muy importante en la obtención de estos positivos resultados en cuanto

la reactivación de callos friables, la brotación de hojas y raíces. La síntesis de AIA ocurre

principalmente en meristemos apicales, hojas jóvenes y frutos en desarrollo, pueden sintetizar AIA

en hojas, cotiledones y raíces, siendo las hojas jóvenes las de mayor capacidad sintética. Debido a

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40

involucradas en muchos procesos del desarrollo, en algunos de ellos interactuando con otras

fitohormonas (Jordán & Casaretto, 2006).

9.2.3. Formación de raíces.

Mientras las auxinas estimulan el crecimiento de los tallos y coleoptilos, inhiben el crecimiento

de la raíz primaria, pero estimulan la formación de raíces secundarias, este comportamiento se

evidencia en la figura 7, donde luego de las 6 semanas, se observó la formación de una gran

cantidad de raíces secundarias (Jordán & Casaretto, 2006).

Figura 7. Porcentaje de formación de raíces de explantes de Phaseolus vulgaris.

La aplicación de citocininas estimula la progresión del ciclo celular. En primer lugar, a nivel de

la fase G1, citocininas más otras hormonas (auxinas) inducen la acumulación de ciclinas y por

tanto promueven un nuevo ciclo celular (Jordán & Casaretto, 2006), siendo los medios de cultivo

(T1) y (T3), los que le proporcionaron las concentraciones de reguladores de crecimiento, como

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41

seguido del T5 y T6, T4, T2 con 22% y 10% respectivamente, encontrándose diferencias

significativas entre estos cinco medios. (Ver anexo 4).

9.2.4. Número de hojas en las plántulas

Para la evaluación de la variable de número de brotación de hojas en las plántulas a partir de

los callos reactivados, se observó en la figura 8, que los medios tuvieron diferencias significativas

entre ellos (p<0,05), sin embargo es importante mencionar que el medio de cultivo T1, presentó

un mejor rendimiento en la formación de la variable número de hojas con un 26,5%, a su vez, en

comparación con los ensayos realizados por otros investigadores el porcentaje de rendimiento de

este medio en los explantes mejoró un 10% más. (Ver anexo 5). Este comportamiento se asemeja

al de (Gil Rivero, Lopez Medina, & Lopez Zavaleta, 2016), en el estudio de propagación in vitro

de papaya con 6-BAP.

Figura 8. Formación de número de hojas a partir de callos reactivados.

La elección del material vegetal, tiene un papel muy importante en la respuesta del

comportamiento del explante, respecto a las diferentes concentraciones hormonales, debido a que

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42

regeneración. Esto quiere decir que, dependiendo el explante, se puede dar un mayor o menor

resultado en la regeneración de estructuras (Soriano Vicente, 2012).

Las estructuras vegetales, que dieron como resultado de esta evaluación se pueden ver en el

anexo 7, en las cuales se puede apreciar la brotación de nuevas hojas verdes, raíces en el principio

verdes con un acabado de color beige, característico de esta especie de frijol. Este proceso de

morfogénesis en los explantes, dieron como resultado de la composición de los medios de cultivo,

con las hormonas suplementadas anteriormente descritas.

9.2.5. Número de raíces en las plántulas.

En cuanto la variable de numero de raíces secundarias en las plántulas de Phaseolus vulgaris,

como ya se había mencionado anteriormente, el efecto de las auxinas y citoquinas en la elongación

celular y proliferación de raíces, se debe tener en cuenta el balance de los reguladores hormonales,

teniendo claro que ambos reguladores mantienen y controlan mutuamente los niveles endógenos

de sí mismos (Pedraza Manrique & Tupaz Villacorte, 2008).

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Como se puede observar la figura 9, el medio de cultivo que presentó un mayor rendimiento

para la formación de brotes de fue el T1, con un 47,3%, seguido del medio T3 con un 34,9%, este

resultado se puede corroborar en el anexo 6, donde se muestran las diferencias significativas entre

los medios al tener un valor de P menor que 0,05; con un nivel de confianza del 95%., por el

análisis de varianza; así mismo, estos resultados coinciden con el comportamiento de las auxinas

y citoquinas para la brotación de hojas, estimulando también la formación y elongación de raíces

segundarias. De ello, se infiere que la interacción citoquinina – auxina regula la formación de

callos y la morfogénesis in vitro, y su efecto puede varía según la especie, tejido, entre otros. Esto

se debe a que existen interacciones sinérgicas o antagonistas entre dos o más hormonas vegetales

(Gil Rivero, Lopez Medina, & Lopez Zavaleta, 2016).

Según el estudio de (Muñoz F. L., 1989) dice que logró la regeneración de plantas completas

en frijol, mediante el uso de callos originados del nudo cotiledonar cultivados sobre la mitad de

las sales del medio Murashige & Skoog más ácido indolacético para inducir callos. Luego regeneró

sobre el medio Gamborg más ácido indolacético, ácido giberélico y bencil aminopurina. Esto

indica que la regeneración de plantas está influenciada por el genotipo, la clase de tejido usado

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44

10. CONCLUSIONES

Se estableció que el tratamiento T1 permitió obtener 72% de brotación de hojas desarrolladas

y 50% de brotes de raíces desarrolladas a partir de callos de Phaseolus vulgaris de 2 semanas de incubación, en comparación a otros estudios, mejorando un 40% en el rendimiento del desarrollo

de brotes.

Se determinó que el medio T1, T3 y T5 que contenía ANA 0,75 mg/l, acido nicotínico 0,5 mg/l,

manitol al 2% y glicina 2mg/l, generó una mayor respuesta en contender la formación de radicales

libres formados durante el desarrollo de los callos, sin evidencia de oxidación, respecto a los otros

tratamientos.

Se logró establecer el medio de cultivo T1, en su composición presentaba 2,4-D 0,3mg/l, 6BAP

0,1mg/l, caseína hidrolizada 1mg/l y tiamina 0,1mg/l., logrando inducir una mayor parte de

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11. RECOMENDACIONES

Para la regeneración de plantas de frijol arbustivo (Phaseolus vulgaris) se sugiere emplear callos jóvenes con una colocación verde.

Seguir implementando nuevos protocolos con el fin de mejorar la formación de brotes y hojas

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Tabla 1. Formulación de medios de cultivo para el desarrollo vegetal de explantes de Phaseolus vulgaris. Composición

FASE DE ESTABLECIMIENTO FASE DE MULTIPLICACIÓN

Oxidación Formación de brotes y raíces

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T1 T2 T3 T4 T5 T6

Solución A 2500 ul 2500 ul 2500 ul 2500 ul 2500 ul 2500 ul 10 ml 2500 ul 2500 ul 2500 ul 2500 ul 2500 ul

Solución B 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul 4 ml 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul

Solución C 2800 ul 2800 ul 2800 ul 2800 ul 2800 ul 2800 ul 1,12 ml 2800 ul 2800 ul 2800 ul 2800 ul 2800 ul

Solución D 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul 900 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul

Solución E 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul 4 ml 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul

Azúcar 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g 3 g

Mio-inositol 10 mg 10 mg 10 mg 10 mg 10 mg 10 mg 0,8 g 10 mg 10 mg 10 mg 10 mg 10 mg

Piridoxina 50 ul 100 ul 0,1 ml 100 ul 0,1 ml 0,1 ml 240 ul 50 ul 50 ul 50 ul 50 ul 50 ul

Glicina 0,2 ml 200 ml 0,2 ml 200 ml 0,2 ml 0,2 ml 100 ul 200 ml 0,2 ml 200 ml 300 ul 0,2 ml

Ácido cítrico 0,2 g --- 0,21 g --- 0,22 g 0,25 g 0,2 g --- --- --- --- ---

Manitol --- --- 2 g --- 2 g 2 g --- --- --- --- --- ---

Caseína

hidrolizada 0,1 ml 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul --- --- 0,1 ml --- --- ---

Cisteína 200 ul 100 ul 200 ul 100 ul 200 ul 100 ul --- --- --- 200 ul --- 0,2 ml

ANA --- 75 ul --- 70 ul --- 73 ul --- --- --- --- --- ---

Agar 0,8 g 0,8 g 0,8 g 0,8 g 0,8 g 0,8 g 0,8 g 0,8 g 0,8 g 0,8 g 0,8 g

Tiamina 0,1 ml 100 ul 10 ul 100 ul 1o ul 10 ul 360 ul 0,01 ml 0,1 ml 10 ml 10 ml ---

Ac. Nicotinico 0,005 ml 50 ul 50 ul 50 ul 50 ul 50 ul --- 0,05 ml 0,05 ml 50 ul 50 ul 0,5 ml

2,4-D 0,03 ml 30 ul 30 ul 30 ul 30 ul 30 ul --- --- 0,03 ml --- --- ---

6-BAP 0,01 ml 10 ul 10 ul 10 ul 10 ul 10 ul 800 ul --- 0,01 ml --- --- ---

AG3 --- --- --- --- --- --- --- --- --- 50 ul --- 0,05 ml AIB --- --- --- --- --- --- --- 0,06 ml --- --- 60 ul --- AIA --- --- --- --- --- --- 100 ul 0,01 ml --- 100 ul 10 ul 0,1 ml

Kinetina --- --- --- --- --- --- 500 ul 0,05 ml --- 50 ul 50 ul 0,05 ml

Antibiotico 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g

Orthocide 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g 0,008 g

pH 5,7 5,7 5,7 5,7 5,7 5,7 6.7 5,8 6,6 6,7 5,7 5,7

(57)

57

Anexo 2. Análisis de varianza de la variable oxidación.

(58)

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Anexo 4. Análisis de varianza de la variable formación de raíces.

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Anexo 6. Análisis de varianza de la variable número de hojas.

(60)

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Referencias

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