Producción de ácido láctico por una bacteria ácido láctica homofermentativa utilizando como sustrato suero de leche

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(1)

Agudela Fernández Eddy Nazaret

Producción de ácido láctico por una bacteria ácido láctica homofermentativa utilizando como sustrato suero de leche

Universidad de Los Andes-Facultad de Ciencias-Postgrado en Biotecnología de Microorganismos. 1996. p. 117

Venezuela Disponible en:

http://bdigital.ula.ve/RediCiencia/busquedas/DocumentoRedi.jsp?file=33814&type=ArchivoDocumento &view=pdf&docu=27026&col=5

(2)
(3)

AQRADECIMIENTOS

• A Dios, por acompaltarme siempre.

• Al Labonrtorio

de

Fermentaciones por darme la opurtunldad

de

lograr

esta meta.

• Al Profesor

JosiJ

A. Sanchez Crispln por su invalorable colaboración.

• A todo el personal docente que labora en el Laboratorio

de

Fermentaciones, por su constante asesoramiento

y

apoyo.

• Al personal Técnico

y

de mantenimiento por su valiosa ayuda.

• A todos mis compafleros del Laboratorio por brindarme su

amistad.

• A la planta piloto .. Lacteos Santa Rosa .. de la Universidad de los Andes.

• Al CEP-ULA subsidio PC-07-93

y

al CDCHT subsidio C· 751-95-02

(4)

RESUMEN

El vertido en los sistemas acuáticos del suero de leche

proveniente de la industria láctea representa un gran problema de

contaminación ambiental debido a la elevada carga orgánica que

contiene. La utilización del suero como sustrato para la producción de

ácido láctico podrla contribuir a solucionar este problema. Tres

bacterias ácido lácticas homofermentativas fueron estudiadas:

Lactobacillus casei ATCC 1143, Lactobacillus delbrueckii ATCC

9649, Lactobacillus helveticus ATCC 8018. Se encontró en L. delbrueckii ATCC 9649 la mejor actividad acidificante cuando crece

sobre el suero de leche tratado por termocoagulación ácida. Se

anadieron a este medio diferentes tipos de macro y micronutrientes y se estudió la producción del ácido láctico. Se encontró que ninguno de

los suplementos convencionales estudiados, como fosfato de amonio

(0.5 %), sulfato de amonio (0.1 %), urea (0.5 %)

y

no convencionales como extracto de cutlcula de arroz (30 %)

y fosforita (0.1

%) superan la producción de ácido láctico alcanzada con el suero de leche

suplementado con extracto de levadura (0.5 %). Se incrementaron los

niveles de fermentación hasta 1, 1 O y 1 00 Litros y se optimizaron los parámetros de crecimiento y producción del ácido. Se obtuvieron rendimientos de 1.02, 0.97

y

0.70 (% peso de ácido láctico/peso de lactosa consumida), un consumo de azúcar de 88, 94 y 48 o/o y concentraciones de ácido Láctico de 43, 41

y 20 gr/1. respectivamente,

(5)

CAPITULO/

INTRODUCCIÓN

IN DICE

Caracteristicas del Acido Láctico 1

Resena historica 7

Caracteristicas generales de las bacterias Acido Lácticas 8

El suero de leche 17

Producción de Acido Láctico por fermentación 28

Problemas Hipotesis Objetivos

CAPITULO//

CAPITULO 111

MATERIALES Y lfiETODOS

Microorganismos estudiados

Medios para el mantenimiento y cultivo

Caracterización de los componentes del suero prueba Determinación del crecimiento bacteriano

Determinación del Acido Láctico

35

36

36

38

38

43 48 48

(6)

Método seguido para el mantenimiento de los microorganismos

Selección de la cepa de lactobacilos mejor productora de Acido láctico

Procesos fermentativos a nivel de fiolas para la producción de Acido Láctico

Determinación a nivel de fiolas del efecto de varios parámetros sobre el crecimiento

Estudio del crecimiento y producción de Acido Láctico a nivel de fermentadores de 1, 1 O

y

1 00 L.

Diseno experimental para la producción de Acido Láctico Recuperación del Acido Láctico

CAPITULO/V

RESULTADOS Y DISCUSION

Pretratamiento

y

caracterización del suero de leche

Selección de una cepa de lactobacilo mejor productora de Acido Láctico

Efecto de macro

y

micronutrientes sobre el crecimiento

y producción de acido Láctico

Estudio para la obtención de un buen preinóculo para la producción de Acido láctico

Determinación del efecto de varios parámetros a nivel de fiolas

Estudio del crecimiento

y

producción de acido Láctico en fermentadores de 1 , 1 O y 1 00 L.

50

51

53 56 58 61 61

66

70

72

76 77 81

(7)

Comparación de fermentaciones por carga (Batch) de suero de leche para la producción de Acido Láctico

Recuperación del Lactato de calcio

CAPITULO V

CONCLUSIONES Y PROYECCIONES FUTURAS

Conclusiones y proyecciones futuras

CAPITULO VI

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Referencias bibliográficas

92

94

96

(8)

CAPITULO/

INTRODUCCIÓN

ACIDO LACTICO.

El ácido láctico es considerado un importante compuesto qufmico con aplicaciones en la industria farmacéutica, alimenticia y cosmética (DeBoer y col. 1990) así, como en las industrias textil, de curtidos, plásticos etc.

Este ácido se caracteriza por ser un jarabe higroscópico con un peso especifico de 1,294 a 25

oc.

Es conocido como ácido 2-hidroxipropanoico (CH3-CHOH-COOH). Por tener un átomo de carbono asimétrico existen dos formas isoméricas ópticamente activas de ácido láctico: Dextrorotatorio D(-)

y

levorotatorio L(+), producidos por distintos enzimas esteroespecfficas Lactato deshidrogenasa (LDHs), dependientes de Nicotin Adenin Dinucleotido. Enzima que interviene en la ruta metabólica del Ácido Láctico. (Garvie Ellen 1980 y Bhowmik y col. 1994 ). Los isómeros L(+)

y

O(-) presentan diferencias en cuanto a sus propiedades ffsicas, como cristalización y punto de fusión (Hitomi y Toshiomi 1993).

(9)

En cuanto a sus propiedades fisiológicas, el organismo humano

posee una capacidad limitada de metabolizar D(-) ácido láctico, siendo

la dosis máxima de consumo diario menor de 1 00 mg/Kg de peso

corporal. Esto demuestra que solo un extremo desbalance de la dieta

podrfa conducir a una acumulación de este compuesto en el organismo

(Krusch 1978, Renner y col 1981).

El ácido láctico L(+), se encuentra naturalmente en el

metabolismo humano, y es absorbido por el intestino con mayor

rápidez que su isomero D (-) (Chiarini

y

Tabachioni. 1992). Sin

embargo, el ácido láctico más empleado en el comercio es la mezcla

racémica (DL) ópticamente inactiva. De esta mezcla se producen al

año alrededor de 3x1 o6 Kg que se emplean en preparaciones

farmacéuticas, en las industrias textiles y de procesamiento del

cuero, en la producción de tintas, disolventes, lacas, plásticos y

también como conservador de alimentos (Enciclopedia Salvat de la

Ciencia y la Tecnologia, 1964).

Aunque el ácido láctico está ampliamente distribuido en la

naturaleza, se obtiene en muchas industrias como producto de

procesos fermentativos. En el mundo el volumen de producción

para 1990 creció hasta aproximadamente 40 X 1 03 toneladas al año.

Los dos mayores productores son C.C.A. Biochem b.v. de Holanda

(10)

U.S.A .. Musashimo en Japon,C.C.A. Biochem utiliza técnicas de

fermentación mientras que Sterling

y

Musashimo una industria

pequef\a japonesa emplean tecnologfa qufmica.(Datta

y

Col1995)

Para 1991 el consumo anual de ácido láctico en Estados

Unidos, fue estimado en 18.500 toneladas métricas, con una

producción de aproximadamente 8.600 toneladas por Sterling Chemical

y

el resto importado de Europa

y

Brasil. El consumo

mundial fue de aproximadamente 40.000 toneladas al ano .( Datta

y

Col. 1995)

El ácido láctico, en general, se emplea en una gran variedad

de aplicaciones industriales. Aproximadamente, el 50% de la

producción mundial es de origen fermentativo. (Enciclopedia Salvat

de la Ciencia

y

la Tecnologfa 1964).Se emplean bacterias ácido

lácticas. Puede tambien ser sintetizado qufmicamente, con la

desventaja de que se obtiene sólo la mezcla racémica del ácido,

{DL) láctico (Chiarini y Tabachioni. 1992).

El mayor uso del ácido láctico es en alimentos y/o aplicaciones

relacionadas con alimentos, lo que constituye alrededor del 85% de

la demanda. El resto (15°/o) es empleado en la industria no

alimentaria.

(11)

Como acidulante alimentario el ácido láctico tiene una

moderada acidez al paladar en comparación con otros alimentos. Es

no volatil, inodoro y clasificado como GRAS ( generally recognized

as safe}, para ser utilizado como aditivo en alimentos, por el FDA

(Food and Drugs Advisorial) y otras agencias reguladoras de los

Estados unidos.(Datta y Col. 1995)

El ácido láctico es utilizado en la preparación de encurtidos de

vegetales, aceitunas y condimentos. Como saborificante y agente

tampón o inhibidor bacteria!, en una amplia variedad de procesos.

Entre ellos; la elaboración de dulces, pan y otros productos

horneados, bebidas dulces, sorbetes, cerveza, compotas y jaleas,

mayonesa y huevos procesados. Todos ellos casi siempre en

combinación con otros acidulantes. (Lindgren y Col.1990)

Otro nuevo uso para el ácido láctico

y

sus sales es en la desinfección y empaquetamiento de carnes, especialmente de pescados

y aves de corral. La adición de soluciones acuosas de ácido

láctico o sus sales durante el proceso, inhibe el crecimiento de

organismos anaerobios, tales como Clostridium botulini. (Hammes y Col. 1990)

Mas del 50 % del ácido láctico (DL) empleado en alimentos,

particularmente en productos de panaderías, sirve para producir

(12)

agentes emulsificantes. Estos agentes son ésteres de sales de

lactato con ácidos grasos de cadena larga. Entre estos importantes

productos tenemos sales de calcio y sodio, compuestos como

estearoil-2-lactilactato, glicerol lactoesterato y glicerol lactopalmitato.

El estearoil lactilato y el lactato de calcio son muy buenos

acondicionadores de masas de panaderías y lactato de sodio es

tanto buen acondicionador como emulsificador de los productos de

panadería que necesitan fermentos de levadura. Los gliceratos y

palmitatos son utilizados en la preparación de tortas y otros

productos de panaderia. La manufactura de estos emulsificantes

requieren de ácido láctico sintético. ( rácemico DL). (Datta y Col.

1995)

El ácido láctico es corrientemente empleado en una gran~

variedad de aplicaciones en industrias especializadas. Algunos

ejemplos son: el ajuste de pH de los barios de endurecimiento para

el celofan que es usado en el empaquetamiento de los alimentos;

como agente de terminación para las resinas de fenol-formaldehido,

en la impresión textil

y

litográfica, en galvanoplastia, etc.(Datta

y

Col. 1995}. El alto costo

y

los bajos volúmenes de producción de estas aplicaciones por estas industrias especializadas hace que el consumo de ácido láctico sea de 5-1 O % (McKay

y

Baldwin.1990,

(13)

El ácido láctico y el etil lactato es utilizado ampliamente en la

industria farmacéutica y cosmética, particularmente en lociones, ungoentos tópicos, soluciones parenterales y en polfmeros biodegradables para aplicaciones medicas tales como suturas

quirúrgicas y prótesis. Una parte sustancial del ácido láctico

farmacéutico se encuentra en forma ·de sales de sodio para

aplicaciones parenterales y diálisis. Las sales de calcio son

ampliamente utilizadas en las terapias por deficiencia de calcio y

como un efectivo agente anticaries. Tambien como humectante en la

industria cosmética, son superiores a otros productos naturales y más efectivos que los polioles. El etillactato es el ingrediente activo

en muchas preparaciones anti acné. El uso del ácido láctico

racémico para sfntesis de drogas y agroqufmicos es una oportunidad

para nuevas aplicaciones de este compuesto y sus ésteres. (Datta

y

Col. 1995)

El polilactato es un nuevo plástico biodegradable de gran

interés público. Su fabricación requiere de una alta pureza óptica del

L(+)-ácido láctico con el fin de mantener en perfectas condiciones

las propiedades ffsicas del plástico. La producción de este ácido

mediante sfntesis qufmica es desventajosa debido a que

normalmente por esta vfa se produce (DL)-ácido láctico, el cual

difiere en sus propiedades de cristalización y punto de fusión. Soluciones de alta pureza de L -ácido láctico puede ser empleado

para producir cristallfquido (Hitomi y Col. 1993).

(14)

RESEÑA HISTORICA.

Este ácido fue descubierto por Sheele en 1780, en la leche

agria

y

luego Blondeau en 184 7, demostró que se produce en ciertas fermentaciones. Diez años después, Pasteur, estudiando la flora

microbiana de los vinos, descubre que es producido por una bacteria

(Garassini 1961). En 1878 Lister, en Inglaterra aisla por primera vez el

Streptococcus lactis de la leche agria, pero le denominó Bacterium lactis. En 1903 Buchner, demuestra que la fermentación táctica es

debida a un proceso enzimático y posteriormente Neuberg, pone en claro el mecanismo de esta fermentación. En 1919 Orlan - Jensen

demostró que las bacterias ácido tácticas, llamadas asf por su

capacidad de producir ácido láctico como resultado de la fermentación

de la lactosa, podfan clasificarse bioquimicamente en dos subgrupos:

según los productos formados a partir de la glucosa (Chacón. 1992):

Las Homofermentativas que convierten la glucosa en ácido

láctico.

Las Heterofermentativas que producen equimolécularmente una

mezcla de ácido láctico, etanol y C02.

(15)

CARACTERISTICAS GENERALES DE LAS BACTERIAS

ACIDO LACTICAS.

La clasificación dada por Prevot en la octava edición del Manual

de Bergey's, además de determinar el tipo de metabolismo

fermentativo, incluye caracteres morfológicos más

(Tabla 1).

completos

Los caracteres esenciales de las bacterias lácticas son:

bacterias esféricas o alargadas inmóviles, Gram (+), catalasa (-), microaerófilas. Todas tienen exigencias complejas para el

crecimiento. Requieren vitaminas del grupo 8 y un considerable

número de aminoácidos. Los lactobacilos especrficamente se

encuentran en el umbral de la vida aerobio - anaerobia. Las vias de

fermentación de carbohidratos se encuentran acopladas a una

fosforilación a nivel de sustrato, como las fermentadoras

tfpicas.(Krieg, N. Y Holt,J. 1984)

Los lactobacilos no poseen sistemas de citocromos para llevar

a cabo la fosforilación oxidativa. Sin embargo, poseen oxidasas

flavfnicas

y

peroxidasas para realizar la oxidación del NADH2 • siendo

el oxfgeno el receptor externo de electrones. Tampoco poseen super

óxido dismutasas ni catalasas. (Marsshal Valerie 1987)

(16)

TABLA 1

ClASIFICACION DEL MANUAL BERGEY,

ava

EDICION. (Parte correspondiente a las bacterias léctlcas)

Parte 14: cocos Gram positivos.

FAMILIA M/crococcaceae ( catalasa positiva )

GENERO 1: Mlcrococcus. Aerobio estricto, pocas exigencias nutrlclonales, tolera 5 % de

cloruro de sodio, habita en suelos y aguas. No patógeno.

GENERO 2: Staphi/Ococcus. ABro-anaerobio, fuertes exigencias nutrlclonales, tolera 15% de

cloruro de sodio, habita la piel y las mucosas de animales. Patógenos, Intoxicaciones alimenticias. FAMILIA 2: Streptococcaceae. ( catalasa negativo )

GENERO 1: Streptococcus. Anaerobios facultativos, homofermentativos, productores de acldo

(O) léctlco,cultlvo a 37 o e, fUertes exigencias nutrlclonales, ( algunas especies parecen restringidas a vMr

unlcamente en los productos lácteos ), Una parte de las especies es patógena, habltat muy variable. GENERO 2: Leuconostoc. Anaerobios facultativos, heterofermentatlvos, productores de écido

(O) léctlco y otros productos, fuertes exigencias nutrlclonales, habita en productos azucarados y productos lécteos. No patógenos.

Parte 16: Bacilos Gran positivos.

FAMILIA UNICA: Lactobaclllaceae. (catalasa negativa)

GENERO UNICO: Lactobacll/us. Anaerobios facultativos, horno o heterofermentatlvos, ácido

tactlco variable, exigencias nutrlclonales compleJas, habita en productos animales y vegetales en fermentación y ciertas partes de los animales de sangre caliente no patógenos. El genero se subdMde en

dos grupos según que óptimo de temperatura sea 35 ó 45

oc

Tomado de Chacón

:z..

y Col.1992.

(17)

En relación con su ecología y habitat, los lactobacilos crecen

bajo condiciones anaerobias o en tensiones de oxigeno reducidas,

siendo su temperatura más favorable la de un mesófilo. Un aspecto

interesante a resaltar en este Género es que tanto las cepas hetera

como las homofermentativas, son productoras de bacteriocinas.

El medio de cultivo habitual para el crecimiento de estos

microorganismos es el Man Rogosa y Sharpe (M.R.S.) o el de Agar

solo para lactobacilos (A.S.L.). Sin embargo, hay que tener en

cuenta, que estos medios no son totalmente selectivos, ya que

pueden soportar el crecimiento de pediococos, enterococos,

bifidobacterias e incluso algunas levaduras. (Rocabayera X. 1991)

Como consecuencia de su metabolismo, el pH del medio

disminuye, y en los alimentos este fenómeno es utilizado para la

conservación. El efecto conservador de estas bacterias no es solo

debido al descenso del pH en el medio sino que, al igual que

algunas otras bacterias del grupo láctico, los lactobacilos son

capaces de producir sustancias inhibidoras diferentes a los ácidos

orgánicos. Estas sustancias se producen en muy poca cantidad e

incluyen peróxido de hidrógeno, diacetilo, bacteriocinas y sustancias

de acción antibiótica. (Rocabayera X. 1991)

(18)

La fermentación táctica es la fermentación de la lactosa, único

~D galactósico que se encuentra en la naturaleza

y

en la leche de

todos los mamfferos. A los fines de la fermentación táctica, la

industria quesera hace uso de un abundante número de bacterias

ácido-fácticas, las Lactobacterias de interés en la industria láctea,

conforman dos familias: Lactobacillaceae

y

Streptococcaceae. La primera con un solo género, Lactobacillus, y la segunda con tres,

Lactococcus, Leuconostoc y Pediococcus. Cada género se

compone, a su vez, de distintas especies, de acuerdo con diferentes

criterios taxonómicos. Sin embargo, atendiendo a su funcionalidad

en la tecnologia láctea, se pueden clasificar del modo indicado en la

Figura 1.

El tipo de fermentación láctica viene condicionado inicialmente

por el mecanismo mediante el cual la lactosa del medio pasa al

citoplasma celular. Las lactobacterias homofermentativas se sirven del

denominado sistema Fosfoenol-piruvato-Fosfotransferasa, mediante el

cual la lactosa es fosforilada a medida que atraviesa la pared celular.

La fermentación transcurre entonces por la ruta del difosfato de

hexosa (HDP), donde la enzima principal es B-fosfogalactósido

galactohidrolasa o B-fosfogalactosidasa (B-Pgal), que hidroliza la

lactosa-fosfato en glucosa

y

galactosa 6-P. (Figura 2) La glucosa posteriormente sufre glucólisis según la ruta Embded-Meyerhof siendo

(19)

Homofermentativas

Heterofermentativas

FIGURA 1. BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS.

Lactobacllos Lactococcus Leuconostoc Ped/ococos

Termófilas lactls bulgarlcus acidophilus helvetlcus delbrueckll

Mesó filas lcasel plantarun

Termomesófilas

Tennófilas

1

brevis fermentum reuterl

Mesó filas

thermofllus

1

ectls diacetllactls

¡-~

faecalls

faeclum

1

cremorls lactls

pentosaceun

acldllactls

Las bacterias termófilas funcionan con óptimos de temperatura de 45

oc.

(20)

FIGURA 2. RUTA DE DEGRADACION DE LA LACTOSA. BAL-HOMO ( RUTA HEXOSA DIFOSFATO)

(Aiais. 1970, Fernández y Martln. 1992 y Rolssart y Luquet 1994).

GLUCOSA

l

AIP

HEXOQUINASA

C

itDI'

GLUCOSA - 6 - P

ISOMERASA

l

FRUCTOSA -8- P

l

<::,

FRUCTOSA.1.6 • diP

HDP-ALDOLASA

1

LACTOSA ....

-t

.... ....,. "'"'

~

EXTERIOR

( PEP: PTS)

~---- PARED CElULAR

LAC+QSA _

p

.,.. ....

CITOPLASMA

,.,

GALACTOSA -6 • P

liSOMERASA

TAGATOSA-6 -P T.!UiAID!i\A

1

¡ATP

RlSFATO ~ADI'

OUftASA

TAGATOSA -1.6- diP

TAGATOSA diP ALDOLASA

1

TRIOSA -P-ISOMERASA

2 OLICERALOEHIDO ·3 • P

2

GLICEIW.rHIDO -3- P

l

4

FOSFOENOLPIRUVA. TO •

PIRUVATOQUINASA

1

<::DP

4 PIRUVATO LACTATO

l

HADH +

Ht-DESHIDROGEt4ASA

C.:

NAO

4LACTATO

(21)

La glucosa-6-P se isomeriza a furanosa y la fructosa-6-P

resultante vuelve a fosforilarse en posición 1 dando fructosa-1 ,6

difosfato (FDP). Esta, mediante la aldolasa correspondiente

(FDP-aldolasa), se transforma en gliceraldehido-3-P, el cual a través de

diferentes intermediarios, entre ellos fosfoenolpiruvato (PEP}, se transforma en piruvato. Este intermediario es substrato de la lactato

deshidrogenasa (LDH) que lo transforma en lactato.

La galactosa-6-P, por su parte, tambien se transforma en

lactato por la ruta Tagatosa. Se isomeriza a tagatosa-6-P, que se

vuelve a fosforilar en posición 1 , dando el difosfato correspondiente,

tagatosa-1 ,6-diP (TDP). Este se transforma en gliceraldehido-3-P

mediante la TDP-aldolasa, convergiendo asf en la ruta

Embded-Meyerhof.

La reacción estequiométrica global para la producción de ácido

láctico por un proceso homofermentativo seria:

---•4

CH3- CHOH- COOH.

En el caso de la heteroconversión (Figura 3), la lactosa es

transportada a través de la membrana plasmática de la bacteria

mediante una permeasa (PER) que no modifica el carbohidrato.

(22)

FIGURA 3. RUTA DE DEGRADACION DE LA LACTOSA. BAL-HETERO ( RUTA HEXOSA MONOFOSFATO)

( Aials.1970, Femández y Martin.1992 y Rolssart y Luquet 1994 ).

LACTOSA ... - ....

~ - ... ..., EXTERIOR

/

( PERMEASA) / - - -

_PARED CELULAR

-J

LACTOSA ,e

.,.

.,.,.

,.

6 -GALACTOSIDASA

OTOPLASMA

GLUCOSA

( VIA lELOIR)

GALACTOSA

l

f'ATPADP

HEXOQUINASA '

-GlUCOSA-6-P

G - 6 - PDH

l

f NAO

'-t. NADH + H + 6-fOSfOGLUCONATO

...___1

NAD

COa~

<.:tiADH+u• RIBUl OSA • 6 • P

EPIMERIZACION

l

ENC:~

XllUlOSA • 6 = P

l

fATAPDP GALACTOQUINASA '-t.

GAI.ACTOSA-1-P

EPBMERIZAOON

l

GLUCOSA-1-P TRAHSPOSICION

l

GLUCOSA-6-P

( EW)

1

LACTATO

FOSFOCffO~

GliCERALDEHIDO =

~

: P " " ACETIL p

A+:!!ADP

1

(NAD (tU} ~=

lATP:> 1 """""tUIDH + HT CoA

+

PI+ADP

LACTATO

ACE31

l CoA "=.:, ATP ACETATO

, HADH-t-H"'

Col\ (..,. MD

ACETA DEHiDO

1

<.~+H+

ET.&ot

(23)

La enzima principal es la B-galactósido galactohidrolasa o

B-galactosidasa (f!-gal), que hidroliza la molécula de lactosa a una molécula de cada uno de los monosacáridos epfmeros (C4) que la componen: Glucosa y galactosa.

Análogamente al caso anterior, la glucosa se transforma en glucosa-6-p (GMP) en presencia de hexoquinasa, pero ahora por la ruta del monofosfato (HMP). Este producto se oxida con apertura del anillo piranósico, mediante la enzima glucosa-6-P-deshidrogenasa (G-6PDH), dando 6-fosfo-gluconato. A su vez, éste se descarboxila liberando C02

y

originando un cetoalcohol, la ribulosa-5-P que, por epimerización, produce xilulosa-5-P. En presencia de fosfocetolasa, este fosfocetoalcohol se desdobla en gliceraldehldo- 3-P

y

acetii-P. A través del primer intermediario, gliceraldehfdo-3-P, se ingresa en la ruta glicolttica EM que rinde lactato. La via del acetii-P va a producir acetato y etanol. (Femández y Martin 1992) La galactosa toma la via de Leloir, siendo fosforilada en presencia de la enzima galactoquinasa. Ocurre luego una epimerización transformandose en glucosa-1-P

y

el grupo fosfato sufre una transposición formando la glucosa-6-P que sigue luego la via de EM obteniéndose Lactato.

La ecuación estequiométrica generalizada que se adopta para el proceso heterofermentativo seria:

2 C6H12

o

6 - 4 2 CH3-CHOHQCOOH + 2 CH3=CH20H + 2

co

2 + 2 ATP

Lactosa Lactato Etanol

(24)

Estos diagramas y ecuaciones son simplificaciones extremas

pues los productos finales de la fermentación pueden verse

modificados en virtud de las condiciones del medio intracelular. No

sólo por las caracterfsticas enzimáticas propias del microorganismo,

su fisiologla, sino tambien por la acumulación de metabolitos

intermedios. Como se ve en la figura 3 bajo condiciones especificas

tambien se podria producir acetato a partir del Acetil- p.

Teóricamente, siguiendo la ruta homofermentativa se

producen, por cada mol de lactosa, 4 moles de ácido láctico y 4 de

ATP; mientras que por la vfa heterofermentativa resultan 2 moles de

lactato, 2 moles de C02 y otros 2 de etanol, asf como 2 moles de

ATP por cada mol de lactosa fermentada (Fernández y Martín. 1992).

Asf, es mas apropiada la utilización de bacterias ácido tácticas

homofermentativas para la producción de ácido láctico ya que se

produce un mayor rendimiento de este ácido.

EL SUERO DE LECHE

Es posible llevar a cabo procesos fermentativos para obtener los

esteroisómeros deseados de ácido láctico. Existen procesos de

producción comercial en tos que se utilizan organismos homolácticos,

tales como Lactobacillus delbrueckii, L. bulgaricus, L. lelchmanii,

(Datta

y

Col. 1995)

y

L. casel, Streptococcus lactls (Garassini 1961).

(25)

Una amplia variedad de fuentes de carbono pueden ser empleadas; melazas, suero de leche, dextrosa, azucar de cana o de remolacha, jarabe de mafz etc. El uso de un carbohidrato especifico

como sustrato depende del precio, la disponibilidad y la pureza que se

desee para el ácido. (Datta y Col. 1995).

Venezuela produce una gran variedad de desechos lfquidos (Tabla 2) y sólidos (Tabla 3), derivados de la agricultura, la agroindustria y la industria de alimentos y de fermentación. Que podrian ser utilizados, una vez tratados, como medio de cultivo par la producción de metabolitos y enzimas.

A nivel mundial se producen unos 7 4 millones de toneladas

anuales de suero que contienen unas 100.000 toneladas de protefnas. Esta cantidad equivale a 2 millones de toneladas de soya. La mayor parte de esta protefna se pierde. El suero contiene tambien

unas 3.7 millones de toneladas de lactosa de la cual una gran parte se aprovecha . La producción de suero en Venezuela está en el orden de

25x1 oB litros anuales. Una pequena parte se utiliza en la crfa de animales monogástricos y en la industria de alimentos, pero la gran mayorla es desechado (Primer simposio Nacional Sobre Desechos Agroindustriales, 1981).

(26)

TABLA 2. DESECHOS LÍQUIDOS PRODUCIDOS EN VENEZUELA Y POSIBILIDADES DE APROVECHAMIENTO.

INDUSTRIA Lactea Cervecerla Destileria Beneficiadora de café Pesqueria

Pulpa y papel Central yuquero

Mataderos Cochineras Procesadoras de

frutas

PRODUCTO DESECHO

Queso Suero

Cerveza Licor de cebada

Etanol Vinazas

Café Pulpa, aguas de lavado Harina, productos Aguas, aceites

Pulpa y bagazo Licor negro Harina de yuca Aguas amilaceas

Carne Sangre

Carne Aguas negras Jugos y Aguas negras mermeladas

P.U.C.: Protelnas Unicelulares. Tomado de Ramlrez. 1989.

USO POTENCIAL

Acido láctico P.U.C, miel de licor

de cebada P.U.C., miel de

vinazas Biofertilizantes Alimentos para animales P.U.C., metano P.U.C., Etanol Alimentación animal Metano P. U. C.

(27)

TABLA 3. ESTIMACIÓN DE LOS RESIDUOS AGRICOLAS LIGNOCELULOSICOS PARA EL PERIODO 1984-1987.

Toneladas métricas de materia seca

1984 1985 1986 1987

Paja de maiz 263.277 378.024 526.577 554.874

Paja de sorgo 954.352 998.364 1.523.040 1.560.844

Tusa demalz 51.618 77.005 107.266 113.030

paja de arroz 694.885 831.537 571.053 627.762

Pajademani 6.219 3.628 6.012 6.924

Parte aérea del 110.556 183.012 195.232 199.972

algodón

Hoja de yuca 148.637 142.049 144.735 145.343 Parte aérea de 1.651.520 1.578.320 1.608.280 1.614.920

lvuca

Hoja musácea 275.380 275.543 270.998 278.418

Hoja de piña 95.170 11.116 119.102 117.428

Hoja de caña de 520.855 523.674 639.360 704.580

azOcar

Bagacillo de cana 356.806 425.485 552.007 602.689

de azúcar

Cáscara de arroz 77.495 89.643 61.090 70.917

Cáscara de caña 1.970 1.034 1.884 2.034

Tomado de Ramirez. 1989.

(28)

Ha sido costumbre generalizada descargar en los sistemas

acuáticos (rios, lagunas, mares), esos desechos e incluso

subproductos con un alto contenido de componentes orgánicos. Ello

contribuye enormemente a la contaminación ambiental (Ramirez.

1989), originando graves problemas ecológicos pues la materia

orgánica es biodegradada, principalmente por organismos aerobios

que requieren grandes cantidades de oxfgeno. Cuando la demanda

biológica de oxigeno es excesiva, se produce en el medio acuático un

agotamiento del oxigeno lo que ocasiona la asfixia de los peces y la

destrucción de sus fuentes naturales de alimentos. La consecuencia es

un grave desequilibrio ecológico (Primer Simposio Nacional sobre

Desechos Agroindustriales 1981).

El suero de leche se obtiene de la fabricación del queso. Tras la

adición del cuajo, la leche se coagula, separándose en dos fases; la

cuajada, que posteriormente se escurre y prensa, dando lugar finalmente al queso y un Jfquido amarillento denominado suero. El

suero representa el 83% del volumen total de la leche tratada. El

código alimentario engloba, en su definición de lactosueros, a sueros

de diferente procedencia (caseinerfas, mantequerfas, queserfas etc.)

representados por los lfquidos resultantes tras la separación de gran

parte de la casefna

y

la grasa durante la elaboración de diferentes

productos lácteos.

(29)

La composición del suero varra de acuerdo con los procesos

tecnológicos utilizados en la elaboración del queso y con la leche de

partiqa. Dependiendo del proceso fermentativo se producen dos tipos

de suero: dulce y ácido, según que su acidez titulable, sea menor o

mayor de 18

oo

respectivamente. (Un grado Domic (0

0) equivale a O, 1

gramos de ácido láctico en un litro de leche o suero.)

El suero dulce es el más ampliamente utilizado por la industria.

Procede de la elaboración de la mayor parte de los quesos. Mientras

que el suero ácido proviene del quark, de los quesos tipo ··cottage·· y de

la casefna ácida.(Morales Navas y col, 1992)

La diferente composición de los distintos tipos de suero y su comparación con la composición de la leche de vaca se muestran en

las tablas 4, 5 y 6. Cuando el suero es centrifugado el contenido de

grasa disminuye hasta el O, 03 - O, 05 % lo que hace que la concentración de vitaminas liposolubles (A, O y E) sea muy baja.

El lactosuero es un producto de gran interés debido a su ~Ita

contenido en lactosa y en protefnas solubles (P.rlactoglobulinas y

a..-lactoalbúminas) ricas en aminoácidos indispensables (lisina,

triptófano), asf como por la presencia de ácido ascórbico y de numerosas vitaminas del grupo 8 (tiamina, ácido pantotenico,

(30)

TABLA 4. COMPOSICIÓN PORCENTUAL DE LECHE DE VACA Y SUS SUEROS.

1

COMPONENTE

1

LECHE DE VACA

1

SUERO DULCE

1

SUERO ACIDO

1

1

Grasa 3.7 0.07

-Caserna 2.8

--

-Seroproterna 0.7 0.8 0.4

Lactosa 4.9 5.1 4.3

Minerales 0.7 0.7 0.5

Extracto seco 9.1 6.6 5.2

Tomado de Morales Navas y Col. 1992.

TABLA 5. COMPOSICIÓN PORCENTUAL DE SUEROS DULCES Y ÁCIDOS.

COMPONENTES

1

SUERO DULCE 1 SUEROACIDO

Humedad 93-94 94-95

Grasa 0.3-0.5 0.3-0.6

Protefnas

0.8=1.0

0.8=1.0

Minerales 0.4-0.5 0.38-0.42

Acldo láctico

y

otros. 0.1 0.1-0.8

Tomado de Morales Navas

y

Col. 1992

(31)

TABLA 6. COMPARACIÓN DE LA COMPOSICIÓN PORCENTUAL DE DIFERENTES TIPOS DE SUERO.

TIPO DE SUERO SUERO DULCE SUERO ÁCIDO

Composición Cheddar Gouda Acido Láctico H2S04

Proterna total 0.80 0.68 0.80 0.80

Nitrogeno protéico 0.20 0.17 0.20 0.20

Lactosa 4.49 4.18 3.63 4.50

Acido láctico 0.15 0.14 0.85 0.15

Minerales 0.50 0.45 0.67 0.80

Grasa 0.06 0.05 0.05 0.05

Sólidos totales 6.00 5.50 6.00 6.30

pH 6.0-6.3 6.0-6.3 4.50 4.50

Tomado de Morales Navas

y

Col. 1992

11

(32)

alto contenido en sales minerales limita en algunos casos su consumo

en bruto (Rico

y

col. 1989). Estos componentes, permiten pensar que el

aprovechamiento industrial del suero puede resultar beneficioso para

obtener gran cantidad de productos, algunos de los cuales se muestran

en la Figura 4.

Es un derroche la eliminación de un producto que contiene de 6 a

8 % de materia sólida, lo que representa más de la mitad de la materia contenida originalmente en la leche. El lactosuero es uno de los

alimentos que cumplen con la base ··Máximo valor biológico, mfnimo en

calorias"

En algunos paises, como Venezuela, el suero simplemente se

desecha eliminándolo en las aguas de lavado de la central lechera.

Lo que representa una alta contaminación orgánica diffcilmente

biodegradable debido al alto contenido en lactosa y protefnas.

Se ha comprobado que una concentración de suero superior al

1-2 % en el agua de los rfos produce rápidamente fermentaciones aerobias ácidas (Morales Navas

y

col.1979) poco controlables que pueden impedir por completo la actividad biológica normal por su

alta demanda de oxigeno (entre 70000 a 40000 mg/ml) (Primer

(33)

Figura 4. PROCESOS Y PRODUCTOS RELACIONADOS

CON LA UTILIZACION DEL SUERO. (Rico Y Col, 1989) ..

Crema suero Mantequilla

Bebidas Suero pasteriz. dulce

,.e::-·~ Sopas

{¿

Proteínas suero

.ty

§

./!!

13

Suero seco

Q.:

Suero condensado

Suero condensado Piensos

dulce

Panadería

Concentración

Bombones o

Lactosa Alimentacion infantil

Jarabes hidrolizados

Píldoras Penicilina

"'1'\

~ Riboflavina

%

Riboflavina concentrada

-a.

Alcohol butrtico,

~

acetona

0' Alcohol etflico Acido

'::)

acético Acido lactico Acidulantes alimentarios

Resinas, Recubrimientos,

Goma xantano Curtidos, Plásticos

(34)

Es posible depurar las aguas residuales antes de su eliminación

mediante una digestión aerobia no controlada en lagunas de oxidación

o en plantas de tratamiento de desechos. Pero este proceso es costoso

y su empleo, al menos en Venezuela, no está muy generalizado. Hoy

en día, para evitar todos estos problemas de contaminación, se plantea

la posibilidad de utilizar los componentes del lactosuero, mediante

procesos biotecnológicos controlados con el fin de obtener nuevos

productos, entre ellos el ácido láctico.

El suero puede ser sometido a ciertos tratamientos

tecnológicos de separación de sus componentes, de forma que se

logre un concentrado de los elementos de interés. Se eliminan de

esta forma los que podrfan ocasionar problemas o los que no poseen

las caracterfsticas requeridas.

Se retiran, asf, del suero, en una primera etapa, las prote(nas que

una vez concentradas se denominan en la literatura anglosajona WPC

(whey protein concentrate). Tienen excelentes propiedades

funcionales y alto valor nutritivo con lo cual pueden entrar a formar parte de diversos productos alimenticios. (Morales Navas y Col. 1992)

Ellfquido resultante contiene lactosa y sales principalmente, que puede

ser utilizado directamente o bien se concentra y seca para obtener

suero en polvo o, finalmente, se aprovecha para procesos

fermentativos como precisaremos en este trabajo.

(35)

PRODUCCIÓN DE ACIDO LACTICO POR FERMENTACIÓN.

En la producción de ácido láctico por fermentación de glucosa,

la especie más utilizada es Lactobacillus delbrueckii. Este bacilo

se desarrolla óptimamente a 45-50

oc,

lo que es una gran ventaja

para evitar contaminaciones. Cuando se emplea suero de leche o

leche con agregados de suero, se utilizan las especies

Lactobacillus bulgaricus, L.casei y Streptococcus lactis.

(Garassini 1961) Entre otros (Tabla 7)

En procesos industriales, el Lactobacillus delbrueeckii es

trasladado progresivamente desde el tubo de ensayo a fiolas de

mayor volumen, y de aquí a los tanques de inoculación y, por último,

a los fermentadores. En todos los casos se mantiene un nivel de

inóculo del 10%. Cada traslado se hace después de 16-20 horas de

crecimiento anaerobico con temperatura y pH controlados. La

fermentación requiere de 4 a 6 dfas

y

termina cuando la concentración de azúcar se reduce al O, 1% o menos y el

rendimiento alcanza el 90-95% de ácido láctico.(Enciclopedia Salvat

de la Ciencia y la Tecnologfa, 1964)

Desafortunadamente las bacterias ácido lácticas, según

algunos autores (Chiarini y Tabachioni. 1992), producen bajas

(36)

TABLA 7. CARACTERISTICAS DE LOS MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ÁCIDO LÁCTICO.

MICROORGANISMO MORFOLOGIA SUSTRATO TEMP. TIPO DE ÓPTIMA(°C) ÁCIDO

L. bulgaricus Bacilo Lactosa, 45-50 Racémico suero

L. delbrueckii Bacilo Glucosa, 45-50 L (+)

melaza

L. brevis Bacilo Pentosas,

30

Racémico

madera hidrolizadas

L. plantarum Bacilo Pentosas,

30

Racémico

lejias sulfiticas

S.lactis Coco Lactosa, 35 L (+)

suero

B. coagulans Bacilo Glucosa, 45-50 L (+)

formador de lactosa. esporas

R. orlzae Moho Glucosa. 30 L(+)

Tomado de Roissart y Luquet. 1994

(37)

cantidades de ácido láctico en sueros no suplementados. Por ello suelen af\adirse al suero compuestos como licor de mafz, extracto de levadura e hidrolizados de soya, por ejemplo, que aportan aminoácidos

y

otros nutrientes complejos requeridos por estos organismos (Amrane y Prigent. 1992)

En cuanto a los estudios realizados para la producción de ácido láctico, Roy y col. (1986), reportaron una productividad volumétrica de 2.7 g/l.h para un medio con suero ultrafiltrado suplementado con 1.5 % de extracto de levadura. Por otra parte, Aeschlimann y Van Stockar (1989} observaron una alta productividad (3.8 gll.h) en medio de suero ultrafiltrado suplementado con 0.4 % de extracto de levadura, 0.02 % de peptona, 1 o/o de leche desnatada en polvo, 0.02 % de MgS04

y

0.005 de MnS04. Considerando otros suplementos, aparte del extracto de levadura, Roy D.

y

Col. (1986} reportaron 1.43 g/l.h para suero ultrafiltrado suplementado con 0.5% de licor de mafz. Otros autores encontraron una máxima productividad volumétrica de 1. 7 4 g/l.h en suero ultrafiltrado suplementado con 0.5% de casefna hidrolizada. Como puede apreciarse las productividades difieren.

Tambien es necesario tener en cuenta el efecto de los diferentes medios de precultivo, usando el suero ultrafiltrado con 10% de melaza como medio de fermentación. Chiarini y Col. 1992 estudiaron la leche peptonizada

y

suero ultrafiltrado con 1% de

(38)

melaza de remolacha (WUM) como medios de precultivo. Asf,

células crecidas en leche peptonizada exhibieron una mayor

producción de ácido láctico (26.09 g/1)

y

consumo de lactosa

(94.09%) comparado con WUM con el que se obtiene (8.63 gil) y (29.63%) respectivamente.

La acidificación espontánea es el hecho más comunmente

observado en la leche conservada a temperatura ambiente. La

acidez se eleva muy lentamente al principio. Luego, tras algunas

horas (según la temperatura), muy rápidamente. En general,

disminuye cuando el contenido en ácido láctico llega al 1 %. En este

momento, solamente 25 % de la lactosa ha sido degradada. Esta

disminución se debe al efecto inhibidor del ácido sobre las bacterias

(Aiais 1970). Es conocido que la fermentación táctica es fuertemente

inhibida por la producción de ácido láctico (Gon~alves

y

col.1992).

No obstante, se puede conseguir la transformación de toda la

lactosa si se neutraliza el medio con carbonato de calcio. En este

principio se basa la producción industrial de ácido láctico a partir del

suero de queserfa (Aiais.1970}.

El caldo conteniendo lactato de calcio es filtrado para remover

las celulas, y se trata con carbon activado para clarificar y eliminar compuestos no deseados. Después se evapora de manera de

concentrarlo, y se acidifica con ácido sulfúrico para formar sulfato de calcio insoluble el cual es eliminado por filtración. (Garassini 1961) El

(39)

ácido láctico, es luego purificado en columnas de carbon y de intercambio iónico, y la solución es evaporada para producir ácido láctico de grado técnico o alimentario. Este es un producto estable al calor que es requerido para la elaboración de productos como el esteroil lactilactato, polímeros

y

otras aplicaciones. (Benthin

y

Villadsen. 1995}

Varios métodos son empleados para la purificación de ácido láctico, el método clásico se basan en la precipitación, extracción o destilación. Recientemente se estudian métodos basados en Intercambio iónico y Electrodialisis. (Benthin y Villadsen. 1995}

El ácido láctico grado técnico puede ser primero esterificado con metano! o etanol y el éster es recuperado por destilación, hidrolizado con agua

y

evaporado. El alcohol es reciclado. Mediante este proceso de separación se obtiene un producto de alta pureza, sumamente claro y transparente y estable al calor. Es similar al producto sintético obtenido por sfntesis qufmica. (Datta

y

Col. 1995)

El pH

y

temperatura óptimos determinados para el crecimiento de 20 cepas de bacterias ácido tácticas, varia de 6,0 a 7,5

y

de 30 a 45

oc,

(Venus,

J

y col. 1992}. El conocimiento de los valores de pH, temperatura óptima y lfmites de tolerancia al ácido de las bacterias

(40)

ácido tácticas, contribuye a seleccionar cepas apropiadas para la

producción de ácido láctico (Venus y Col. 1992).

El sistema fermentativo mas ampliamente reportado para la

producción de ácido láctico es del tipo sumergido por carga (Batch). No

obstante, recientemente se han reportado numerosos estudios, que

emplean procesos contfnuos en los que existe una elevada

concentración de células en el reactor (Gon~alves y Col. 1992).

El conocimiento existente sobre la producción de ácido láctico

es, en general, muy extenso. Sin embargo, los problemas que

existen en la producción por procesos fermentativos aún no parecen

haber sido resueltos. Esto se puede deducir de los datos mostrados

en la Tabla 8 donde se observa una gran variabilidad de un proceso

a otro en cuanto a los resultados. Ninguno de los procesos indicados

utiliza suero de leche. A esto hay que anadir el hecho de que se

encuentran en la bibliografia muy pocos procesos que hayan sido

escalados a volúmenes superiores a los de mesón. Esta carencia se

une a una notable falta de información sobre los procesos

industriales, normalmente protegidos por patentes.

En conjunto, los problemas planteados nos permiten

precisarlos y adelantar algunas hipotesis para buscar soluciones de

interés para nuestro medio industrial.

(41)

TABLA 8. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO POR UN SISTEMA DE ALTA DENSIDAD DE CÉLULAS.

BIORREACTOR IIIICROORGAMSMO SUBSTRATO CONCENTRACIÓN CONCEHTRACIÓN PROOUCTMDAD REFERENCIA DE PROCESO (Dril) DEÁCIJO DE CÉLULAS VOLUIIÉTRICA(gr de

l.i.CTJCO(Drll). (arde liOSO seco JI) k.lklko.llh). l"'k!'!> hiiDI'O

Batch lactobaclllus Glucosa 2.0 480.0 100.0 lllck Roy

delbrueckll y col.,

1982 ConHnúo l. bulgaricus lactosa (a) 13.0 100.0 2.6 Mehala y

col., 1987

a

Millmlli

~

Continúo Glucosa 35.0 54.0 76.0 \llckRoy

l. dalbluedcll y col.,

1982. Continúo l. delbrueckll Glucosa 60.0 130.0 66.0 Ollleyery

col. 1982 ConHnúo l. dalbrueckll lactosa 40.0 80.0 38.0 Ohlayery

col., 1985.a Continúo l. dalbrueckll Glucosa 60.0 140.0 150.0 Ohlayery

col., 1985.b Continúo l. bUigariCUS Lad:osa (a) (á) 14.0 43.0 85.0 Mahala y

Col., 1986 Continúo l. bulgarlcus lactosa (a) 117.0 63.0 84.0 Mehala y

col., 1987b Continúo l. casal lactosa (d) 40.0 49.0 ·b Tanlguchl

'¡/COl., 1987 Continúo S. cremorls Lactosa (d) 25.0 81.0 ·b Taniguclll

y col. 1987 Continúo l. delbrueckll Glucosa 40.0 8.0 12.0 Ml\lory

Bull 1989 Continúo l. delbrueckll Glucosa· 68.0 94.0 40.0 Xalllery

col. 1991

8

Continúo L. bulgaricus lactosa 53.9 4.8 d 5.1 stebiery col. 1991 Continúo L. delbruackll Glucosa 39.8 -b d3.3 stenroos

y col., 1982 ConHnúo L. delbruackll Glucosa '0.2 8.1 34.0 Buyukgun

gor y col., 1984 Batch l. casal Lactosa (a) 33.0 -b 0.5 Tullycol.,

19136 Continúo l. dl!lbrueckll Glucosa (d)o.e 9.6 3.3 Hartmeler

y col., 19137 Balell L. dl!lbrueckll Glucosa 70.1 ·b d5.3 Nomurn y

col. 1007 Batch L. bulgarlcus Lactosa (a) 10.0 -b d 1.7 Audety

col. 1988 Balell S. laclls Lactosa (a) a.o ·b d 1.3 Audety

col. 1988 Continúo l. calllli Lactosa (a) (d) 13.5 e 105.0 13.5 l<tlschka y col. 1991 Continúo L. delbrueckll Glucosa 5"1.4 34.4 20.1 GoncaiYIIS y

col. 1992 a: Suero filtrado b: No llfe5entado9 d: Estimado de datos reoortados e: gn gellh

e: Gramos da células secas por Kg de material soporte.

Tomado de Goncalves y col.. 1992

(42)

CAPITULO//

PROBLEMAS

Uno de los principales problemas que se plantea en la industria láctea es qué hacer con las grandes cantidades de suero que se producen. La práctica actual más seguida, basada en

considerar al suero como un desecho, consiste en mezclarlo con las aguas de lavado de las industrias

y

descargarlo en los sistemas acuáticos. Ello ocasiona graves problemas por el alto grado de contaminación orgánica diffcilmente biodegradable a corto plazo.

Por otra parte, Venezuela es un pafs enteramente dependiente en la producción de ácidos orgánicos. Entre estos ácidos se encuentra el ácido láctico totalmente importado por numerosas industrias que lo utilizan como materia prima base para el procesamiento industrial de productos manufacturados.

(43)

HIPO TESIS

Los dos problemas contaminación

y

dependencia podrían ser resueltos mediante conocimientos biotecnológicos que permitan implementar y mejorar procesos fermentativos, en principio a nivel de planta piloto.

Una posibilidad serfa utilizar el alto contenido de lactosa del suero de leche, como un sustrato para la producción de ácido láctico, por una bacteria ácido láctica homofermentativa. De ser esto posible, lograriamos, por una parte, resolver un problema de contaminaci9n

y

simultaneamente, aprender a producir un ácido orgánico ampliamente utilizado en la industria.

OBJETIVOS

De acuerdo con las hipotesis propuestas para resolver los problemas planteados, se pueden enumerar los objetivos.

(44)

Generales.

1. Disminuir la carga orgánica del suero.

2. Producir ácido láctico mediante microorganismos que utilicen

sueros de queserfa.

Especfficos.

1. Disminuir la carga organica del suero de leche.

2. Seleccionar una bacteria láctica homofermentativa capaz de crecer

y

producir ácido láctico en suero de leche.

3. Caracterizar, en cuanto a su composición, el suero de leche

proveniente de queserfa

y

uniformar su composición.

4. Determinar la capacidad de crecimiento en suero de leche de la

bacteria láctica seleccionada y obtener una producción óptima de ácido láctico estudiando diferentes condiciones experimentales a nivel

de fiolas.

5. Incrementar la escala de producción utilizando fermentadores de 1,

10, 100 litros, en proceso por carga.

6. Aislar y purificar el ácido láctico.

(45)

CAPITULO 111

MATERIALES Y METODOS

111.1- MICROORGANISMOS.

Se dispuso de cepas de Lactobacillus delbrueckii subspo delbrueckii ATCC 9649 (45°C), Lactobacillus helveticus ATCC 8018 (45°C)

y

Lactobacillus casei subspo rhamnosus ATCC 11443 (30°C)o Todas ellas, existentes en forma liofilizada en el cepario del Laboratorio de Fermentaciones, pertenecen al grupo de bacterias ácido lácticas homofermentativaso

111.2.- MEDIOS PARA El MANTENIMIENTO Y CULTIVO.

111.2.1.- Medio MRS modificado (Venus

y

col. 1992).

Peptona ... o. o... 1 O gr Extracto de ca me . o ... o. o. o... 1 O ··

Extracto de levadura . . .

5

·o

Lactosa .... o. o ... o ... o... 20 ·o Twen 80 ... 0... 1ml K2HP04 ... 2 gr

(46)

Acetato de sodio. 3 H20 .. Citrato de triamonio ... . MgS04.

7

H20 ... . MnS04. 4H20 ... . Agua destilada ... . pH 6.1

2

gr

2 ..

0.2

gr 0.2 .. 1 Litro

111.2.2.- Medio de mantenimiento del Lactobacilo. (F

airbrother

y

Col. 1991)

Leche descremada esteril... 2 mi. Glicerol

30

% estéril . . . 2 ·· Medio MRS... .. .. .. . . ... . .. .. ... ... . . .. 2 ··.

111.2.3.- Medio básico de producción (Suero Prueba 1 ).

El sustrato básico empleado fue suero de leche procedente de la Hacienda Santa Rosa de la U.LA. Se seleccionó este suero por ser muy variado y representar el que se puede producir normalmente en una quesería industrial.

Se ideó una manera de tratar el suero y obtenerlo libre de gran cantidad de proteinas y otras partlculas, que pudieran obstaculizar las determinaciones a las que se puede someter el suero utilizado como medio de cultivo.

(47)

La gran variabilidad existente en la composición de los diferentes

sueros está determinada por los diferentes tipos de quesos producidos.

Por ello se hace necesario aplicar tratamientos para eliminar proteinas

y asf lograr una relativa uniformidad en la composición de los sueros a ser utilizados como medios de cultivo.

El suero, tal como viene de la planta de quesos, es calentado a

ebullición durante 20-30 minutos. Se deja reposar y enfriar hasta que

parte de las lactoalbúminas se coagulan. El suero es entonces

recuperado por decantación o por filtración. El procedimiento se

muestra en el esquema 111.1 .

El proceso, para cada suero, se detuvo en cualquiera de los

pasos precisados en el esquema

111. 1 . Ello

dependió de la concentración de protelnas existentes en cada paso en relación con el

estándar tomado como referencia. El estándar se determinó

previamente y contiene la protefna necesaria para un crecimiento adecuado y una producción óptima de ácido láctico

(48)

Esquema 111.1.- PRETRA TAMIENTO DEL SUERO DE LECHE.

Suero de Leche

Calentamiento a temperatura de ebullición durante 20-30 min.

~

Reposo hasta enfriamiento

1

Decantación o Filtración

Protelnas

-1

Decantación o Filtración (si es necesario)

~Protelnas

Suero prueba para medio de cultivo

(SUERO PRUEBA 1)

(49)

111.2.4.- Suero Prueba 2.

Suero prueba 1... ... 100.00 mi Fosfato de amonio... 0.01% Sulfato de amonio... 0.01 ·· Extracto de levadura... 0.01 .. pH6.0

Esterilización 30 min. a 80

oc

111.2.5.-

Compuestos utilizados para suplementar el suero de

leche.

Suplemento gramos /100 mi de Suero Prueba 1

• Sulfato de amonio 0.5

• Ext. Cutícula de 30.0

Arroz

• Fosforita 0.1

• Fosfato de amonio 0.1

• Urea 0.5

• Ext. de levadura 0.5

pH6.0

Esterilización 30 min. 80

oc

(50)

111.2.6.- Medio de Producción.

Suero prueba 1 . .. . .. . . 1 00.00 mi Ext. de Levadura... 0.5 gr.

pH6.5

Esterilización 30 min. 80

oc.

111.3.- CARACTERIZACIÓN DE LOS COMPONENTES DEL

SUERO PRUEBA.

Se utilizaron los siguientes métodos para la caracterización de los componentes del suero prueba 1 .

111.3.1.- Determinación de Carbohidratos.

• Método de Antrona. (Scott y Melvin. 1953) Este método se fundamenta en la reacción de la antrona con todos los carbohidratos para dar origen a un color azul característico. Este reactivo, reacciona con mono, di y polisacáridos, dextrinas, destranos, almidón y gomas. Pero el color desarrollado no es el mismo para diferentes carbohidratos.

(51)

El reactivo se preparó mezclando 0.05 gr de Antrona por cada 25 mi de H2S04·concentrado. Antes de comenzar el procedimiento se

colocaron los tubos en un bano de agua fria, se agregaron 2.4 mi del

reactivo de Antrona, 1.0 mi de agua y se anadió lentamente 0.2 mi de

la muestra a analizar, se mezoló cuidadosamente manteniendo los

tubos dentro del agua fria. Inmediatamente después los tubos se

colocaron durante 20 minutos en un bano de agua hirviente y se leyó a 625 nm en un Espectronic 20 contra un blanco que contiene solo agua

y el reactivo. Siguiendo igual procedimiento se realizó una curva de

calibración con lactosa comercial a diferentes concentraciones.

111.3.2.- Determinación de Proteinas.

• Método de lowry. (Bollag y col. 1991) La coloración se origina como consecuencia de la reacción de Biuret de las proteínas y el Cu +2

en medio alcalino y de la reducción del reactivo Folin Ciocalteau por la

tirosina y triptofano. Es posible, en consecuencia, obtener un cálculo

aproximado de la cantidad de proteínas presentes mediante la

comparación con un estándar de proteínas.

En la realización de este método se utilizaron varios reactivos. El

reactivo A formado con 0.5 gr de sulfato de cobre pentahidratado, 1 gr

de citrato de sodio dihidratado en 100 mi de agua destilada. El reactivo 8 formado con 20 gr de carbonato de sodio, 4 gr de hidroxido de sodio

(52)

en 1 litro de agua destilada. El reactivo

e

formado por la mezcla de 1 mi de reactivo A y 50 mi de reactivo B. Los reactivos fueron

mantenidos a temperatura ambiente y en frasco ambar. El reactivo D

se obtenfa mezclando 10 mi de reactivo Folin-Ciocalteu con 10 mi de

agua destilada.

El procedimiento consistió en llevar la muestra hasta 0.5 mi con

agua destilada, agregar 2.5 mi de reactivo C, mezclar y dejar en reposo

durante 10 minutos, a continuación se agregan 0.25 mi del reactivo D

se mezclan y se deja a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Luego se lee en el espectofotómetro a 750 nm. contra un blanco de

agua más reactivo. Los resultados se comparan con los valores de una

curva de calibración obtenida para concentraciones conocidas de

albumina de suero bovino.

111.3.3.- Determinación de Grasa Cruda.

• Método Volumétrico de Babcock. (González de M. 1993) Se

fundamenta en la extracción de la grasa con ácido sulfúrico y

separación mediante centrifugación en una botella especial que

permite medir directamente la grasa en porcentaje por peso. El ácido

primero disuelve, luego precipita las protelnas y demás constituyentes,

con excepción de la grasa y disminuye la tensión interfacial al mismo

(53)

tiempo que aumenta la temperatura de la mezcla. De esta manera los glóbulos de grasa se aglomeran primero y se separan.

El procedimiento es el siguiente: Se calentaron las muestras a una temperatura de 38°C y se mezclaron bien para lograr una buena homogenización. Luego se transfirieron 17.6 mi de la muestra al butirómetro, se adicionaron 12 mi de ácido sulfúrico de densidad 1.82 .. Se agitó hasta lograr la desaparición de la cuajada y se centrifugó durante 5 minutos. Después se agregó más agua caliente hasta la graduación más alta de la escala que corresponde al valor 8, se centrifugó de nuevo durante 1 minuto

y

se colocaron los Butirométros en un bano de agua a 60

oc

y se procedió a la lectura.

Este método se realizó con la colaboración de la Profesora lsbelia Gonzalez, en los laboratorios de la facultad de Farmacia.

111.3.4.-

Determinación de Peso Seco. (Bateman, 1970)

Las sustancias que tienen un alto porcentaje de azúcar pierden su agua muy lentamente y a menudo se descomponen a temperaturas superiores a los 70

oc.

Tomando en cuenta esto, 1 O mi de la muestra se colocaron en cápsulas de papel de aluminio

(54)

previamente pesadas. Después de secar en un horno a 70

oc

hasta peso constante, se pesaron nuevamente.

Cálculos:

Peso original de la muestra - peso final

% de Humedad

= ---

X 1 00 Peso original de la muestra

111.3.5.- Determinación de Cenizas. (Bateman, 1970)

Las cenizas son el residuo inorgánico de una muestra incinerada, obtenida después de colocar una cierta cantidad de muestra seca en una mufla durante 2 horas a 600 °C. El método se fundamenta en la eliminación de la materia orgánica, por combustión. Para el desarrollo del método se utilizaron crisoles de porcelana de 20 mi, se le agregaron

1 O

mi de la muestra y se llevaron a la mufla por

2

horas. Se colocaron los crisoles en un desecador, a temperatura ambiente

y

se pesaron.

Cálculos:

Peso de la ceniza X 100 %de Ceniza·

Peso de la muestra

(55)

111.4.- DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO.

Se midió el incremento de la biomasa tomando muestras cada dos horas. Estas muestras fueron tratadas como se indica en el esquema 111.2. Este tratamiento fue necesario para eliminar la turbidez producida por las protelnas residuales o por los nutrientes añadidos al suero.

111.5.- DETERMINACIÓN DEL ÁCIDO LÁCTICO.

111.5.1.- Estimación de Acidez Total por Titulación. (Pearson, 1974)

A 3 mi del material fermentado se le af\adió O .1 mi de fenolftalefna 0.5 %. La mezcla se tituló con hidróxido de sodio 0.1 N

y

se calculó la acidez como ácido láctico. Se dispuso, como patrón de referencia, de una solución estándar de concentración de ácido láctico conocida y otra de hidróxido de sodio O. 1 N necesaria para la titulación. En el caso del ácido neutralizado con CaCo3 se tituló con HCI 0.1 N

y

azul de timol como indicador.

(56)

Esquema 111.2.- DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO.

6 mi de muestra

1

Centrifugación

1500

x g. 15 min.

1

Células Sobrenadante

1

Lavado con 6 mi de agua destilada

1

Vortex 20-30 seg.

!

centrifugación

1500

x g.

15

min. (repetir 2 veces) descartando el

sobrenadante.

l

Se determinó D.O a 660 nm.

1

Determinación de:

-pH

- Ácido Láctico - Azúcar Residual

(57)

111.5.2.- Determinación por un método enzimático.

Se siguió el método cuantitativo de determinación enzimático del Lactato a 340 nm. (procedimiento no 826 - UV de SIGMA DIAGNOSTICS.) La reacción que ocurre se precisa a continuación y se lleva a cabo de izquierda a derecha con un exceso de NAO.

Lactato + NAO (D. O baja a 340 nm)

lactato Deshigrogenasa

Piruvato + NADH (D. O alta a 340 nm)

Puesto que la reacción es mol a mol, la cantidad de NADH producido es equivalente a la cantidad de lactato transformado que, a su vez, es una medida de la actividad de la enzima. Para obligar a que la reacción se complete en la dirección indicada, es necesario atrapar el piruvato con hidrazina. Se sigue el incremento de la absorbancia a 340 nm debida a la formación de NADH.

111.6.- MÉTODO SEGUIDO PARA EL MANTENIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS.

Los Lactobacilos que se encontraban inicialmente lioftlizados,fueron inoculados en medio M.R.S. e incubados a la temperatura apropiada para cada uno

y

mantenidos asi hasta observar un buen crecimiento (24-36 horas aproximadamente). Luego las

(58)

células fueron lavadas de manera de eliminar los productos de su

metabolismo. Este lavado se realizó 3 veces con cantidades de medio

M.R.S. iguales al volumen de medio de cultivo. Las células limpias,

obtenidas des pues de la centrifugación, se colocaron en el medio de

mantenimiento parB lt~otobaoilos {t~parte 111..2.2) en viales que se

almacenaron a 4

oc,

hasta 2 meses. El procedimiento se resume en el

esquema 111.3. A partir de estos iniciadores se prepararon los inóculos

para las pruebas siguientes.

111.7 ... SELECCIÓN DE LA CEPA DE LACTOBACILOS MEJOR PRODUCTORA DE ÁCIDO LÁCTICO.

Con la finalidad de escoger de entre los tres microorganismos

homofermentativos el de mejor actividad acidificante sobre el suero de

leche, se realizaron ensayos utilizando como sustrato el Suero Prueba

~ de la siguiente manera:

Se inocularon las cepas en tubos con 6 mi. de suero prueba 2,

cerrados con tapa de rosca e incubados sin agitación a las

temperaturas apropiadas.

A las 24, 48

y 72 horas el producto fue titulado según la técnica

explicada en el apartado 111.5.1. manteniendo un blanco para la acidez

(59)

Esquema 111.3.- MANTENIMIENTO DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS.

MICROORGANISMO

Medio

J.R.s.

¡

Incubados en anaerobiosis a las temperaturas apropiadas

L

delbrueckii

45

oc

L.helveticus

45

oc,

L.

casei

30

oc

24-36 horas.

Centrifugados 1 O min. 1500 x g.

1

Sobrenadante Células

+

+

Descartado Se repite el procedimiento

de lavado 2 veces más

+

Células limpias

Medio de mantenimiento

y

almacenado a 4

oc

hasta 2 meses.

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References