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Obtención de bacterias ácido lácticas mediante aislamiento en el kéfir de leche, para la optimización en la síntesis de ácido láctico por fermentación

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OBTENCIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS MEDIANTE AISLAMIENTO EN EL KÉFIR DE LECHE, PARA LA OPTIMIZACIÓN EN LA SÍNTESIS DE

ÁCIDO LÁCTICO POR FERMENTACIÓN

Proyecto de grado presentado Por

CINDY VANESSA VANEGAS MANTILLA

Presentado a Universidad de los Andes

En cumplimiento de los requisitos para obtener el título de

INGENIERA QUÍMICA

ASESOR

M.Sc, Ph.D ROCIO SIERRA

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BOGOTA D.C.

(2)

OBTENCIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS MEDIANTE AISLAMIENTO EN EL KÉFIR DE LECHE, PARA LA OPTIMIZACIÓN EN LA SÍNTESIS DE

ÁCIDO LÁCTICO POR FERMENTACIÓN

Proyecto de grado presentado

Por

CINDY VANESSA VANEGAS MANTILLA

ROCÍO SIERRA RAMÍREZ, M.Sc., Ph.D Asesor

NCIOLAS RIOS RATKOVICH, M.Sc., Ph.D Miembro del comité

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BOGOTA D.C.

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RESUMEN

Obtención de bacterias ácido lácticas mediante aislamiento en el kéfir de leche, para la optimización en la síntesis de ácido láctico por fermentación

Cindy Vanessa Vanegas Mantilla, Universidad de los Andes, Colombia

Asesor: Rocío Sierra Ramírez, Ph.D

La producción de ácido láctico siempre ha sido de gran interés en la industria, debido a la

amplia gama de aplicaciones que este tiene, principalmente en comida, químicos,

cosméticos e industrias farmacéuticas. En los últimos años la producción de ácido láctico

mediante un proceso de fermentación ha cobrado un mayor interés debido a los problemas

ambientales que han llevado a la búsqueda de producción de compuestos mediante métodos

verdes. A pesar de la amplia gama de aplicaciones que este compuesto tiene, aún no se ha

encontrado un proceso de síntesis que sea lo suficientemente efectivo, debido a la baja

producción de ácido láctico mediante procesos fermentativos y los altos costos que este

proceso implica. Debido a esto, es necesaria la búsqueda de un proceso que además de ser

amigable con el medio ambiente, permita una producción alta y económicamente viable. El

presente estudio tiene como objeto establecer condiciones óptimas para la fermentación de

ácido láctico, partiendo de bacterias ácido lácticas aisladas de granos de Kéfir de leche. En

este estudio se evaluó el efecto de la fuente de nitrógeno (peptona, extracto de levadura,

extracto de carne) en el medio de adaptación, así como el porcentaje del mismo en el medio

de fermentación, con el fin de determinar las condiciones más favorables para la

producción de ácido láctico y mediante la técnica de cromatografía líquida se pretendió

(4)

aislamiento satisfactorio de las bacterias del ácido láctico en los granos de Kéfir, sin

embargo las condiciones a las que dichas bacterias fueron sometidas no lograron una mayor

producción de ácido láctico por lo que este no pudo ser cuantificado mediante la técnica de

cromatografía de líquidos.

(5)

ABSTRACT

Obtención de bacterias ácido lácticas mediante aislamiento en el kéfir de leche, para la optimización en la síntesis de ácido láctico por fermentación

Cindy Vanessa Vanegas Mantilla, Universidad de los Andes, Colombia

Asesor: Rocío Sierra Ramírez, Ph.D

The lactic acid production has always been of great interest in the industry, due to the wide

range of applications that it has, mainly in food, chemical, cosmetic and pharmaceutical

industries. In recent years, the production of lactic acid by a fermentation process has

gained greater interest because of the environmental problems that have led to the search

for compounds using green production methods. Despite the wide range of applications that

this compound, still it has not been found a synthesis process which is sufficiently

effective, because of the low productivity of lactic acid by a fermentative method and the

high costs implied by this process. Because of this, it is necessary to search for a process as

well as being friendly to the environment, enables a high production of lactic acid and also

economically viable. The present study objective is to establish optimal conditions for

lactic acid fermentation, based on lactic acid bacteria isolated from milk kefir grains. In this

study the effect of the nitrogen source (peptone, yeast extract, meat extract) in the

adaptation medium and the percentage as well in the fermentation medium, were evaluated

in order to determine the most favorable conditions for the production of lactic acid and a

liquid chromatography technique was intended to quantify the amount of lactic acid

(6)

kefir grains, however, the conditions to which the bacteria were subjected not achieve a

higher production of lactic acid so that this could not be quantified by the technique of

liquid chromatography.

(7)

AGRADECIMIENTOS

Quiero dar mi más sincero agradecimiento a mis padres, Luis Alejandro Vanegas Soto

y Marlene Mantilla, y a mis hermanos, Nicolás Dario Vanegas Mantilla y Christian Camilo

Vanegas Mantilla, por todo el apoyo que me brindaron durante esta etapa tan importante de

mi vida. También quiero agradecer a todas las personas que estuvieron involucradas en la

realización de este proyecto, por la ayuda que me brindaron en el laboratorio, ya que sin

(8)

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN………. III

ABSTRACT……… V

AGRADECIMIENTOS………... VII

TABLA DE CONTENIDO……….. VIII

LISTA DE FIGURAS……….. XII

LISTA DE TABLAS………...

INTRODUCCION……….

XIII

1

OBJETIVOS……… 2

Objetivo general………

Objetivo específico………

2. MARCO TEÓRICO………. 3

2.1Ácido láctico………...

Propiedades.……….. 3

3

2.2Aplicaciones ácido láctico…...………...

Industria alimentaria…...……….…….…. 4 4 Repostería……….…..…... Bebidas…..……….….……….. Industria Cosmética…..………….……….….…... Industria química.………..……….….…... Industria farmacéutica...……….….…... Industria polimérica…………...……….………. 4 4 5 5 5 5

(9)

2.3 Producción ácido láctico………..

Síntesis química………

Fermentación………...……….

Microorganismos para la producción de ácido láctico………...

2.4 Bacteria ácido lácticas………..

Metabolismo……….

Aplicaciones de las bacterias lácticas……….………..

2.5 Aislamiento e identificación de las bacterias ácido lácticas…..……...

Fisiología de las bacterias ácido lácticas…….…….………

Caracterización fenotípica……...……….

Caracterización bioquímica……….…….…….………...

Caracterización genotípica.…...………

2.6 Nutrientes requeridos en la fermentación de ácido láctico.…..……..

Fuentes de carbono………..…….…….………...

Fuentes de nitrógeno………...…….…….………

2.7 Fermentación láctica………...……….…..……...

Fermentación batch………...…..…….…….………

Fermentación batch con alimentación...…….…….………..

Fermentación continúa………...…….…….………

2.8 Factores que afectan la fermentación ácido láctica….…….…..……..

Efecto de la temperatura…………...…..…….…….………

Efecto del pH………...…….…….………

Efecto del periodo de incubación…...…….…….……… 6 6 8 8 9 10 12 14 14 15 16 17 17 17 18 18 19 20 21 21 21 21 22

(10)

Efecto de la agitación…………..…...…….…….………

2.9 Inhibición de la fermentación ácido láctica….…….…..…………....

Inhibición por substrato.…………...…..…….…….………

Inhibición por producto final………...…….…….………

2.10 Extracción fermentativa………...

2.11 Purificación del ácido láctico………..

Adsorción……….

Extracción por disolvente……….

Procesos de separación de membrana...…….…….……….

2.12 Medición del ácido láctico….…….…..………..

2.13 Kéfir de leche……….…….…..……..

3. METODOLOGÍA...……….

3.1 Cultivo de granos de Kéfir……….

3.2 Aislamiento de las bacterias del ácido láctico……….…………..

3.3 Caracterización e identificación de las cepas………..…………..

3.4 Fermentación…………..………...…….…….…………..

3.5 Cuantificación del ácido láctico………….…….…….…………..

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……….

4.1 Cultivo de granos de Kéfir……….

4.2 Cultivo, caracterización e identificación de las cepas…...……….

4.3 Fermentación……….……….

5. CONCLUSIONES Y TRABAJO FUTURO………

REFERENCIAS……… 22 22 23 23 23 24 24 24 25 25 25 28 29 29 30 30 30 32 32 32 36 38 40

(11)

ANEXO A………...

ANEXO B………...

ANEXO C………...

ANEXO D………...

ANEXO E………...

ANEXO F………...

ANEXO G………... 44

46

48

50

52

53

(12)

LISTA DE FIGURAS

Pág. Figura 1. Estructuras del ácido láctico……….…..

3

Figura 2. Ruta de producción química……… 7

Figura 3. Reacción del proceso de fermentación del ácido láctico…….………... 8

Figura 4. Fermentación homoláctica……….. 11

Figura 5. Curva de crecimiento bacteriano………... 19

Figura 6. Granos de Kéfir……….. 26

Figura 7. Esquema metodología………. 28

(13)

LISTA DE TABLAS

Pag

Tabla 1. Propiedades del ácido láctico……… 3

Tabla 2.Productos que se obtienen a partir del ácido láctico……….. 6

Tabla 3. Bacterias ácido lácticas homofermentativas y heterofermentativas…………. 12

Tabla 4. Bacterias lácticas empleadas como cultivos iniciadores……….. 13

Tabla 5. Producción de ácido láctico a partir de recursos agricolas………... 20

Tabla 6. Microbiota de los granos de Kéfir……… 27

Tabla 7. Volumen de leche para 5 gramos de kéfir……… 29

Tabla 8. Seguimiento del crecimiento en peso (g) de los granos de Kéfir……… 32

Tabla 9. Seguimiento del crecimiento en peso (g) de los granos de Kéfir……… 32

Tabla 10. Características cepas aisladas………. 34

Tabla 11. Características primera réplica cepas aisladas……… 34

Tabla 12. Características segunda réplica cepas aisladas………... 34

Tabla 13. Prueba bioquímica……….. 35

Tabla 14. Prueba fisiológica……….. 35

Tabla 15. Prueba fisiológica primera réplica………. 36

Tabla 16. Prueba fisiológica segunda réplica………. 36

(14)

INTRODUCCIÓN

La producción de ácido láctico ha sido de gran interés debido a la amplia gama de aplicaciones que dicho compuesto presenta, principalmente en comida, químicos, cosméticos e industrias farmacéuticas. En los últimos años el interés de producción de ácido láctico mediante un proceso de fermentación ha cobrado mayor interés debido a los problemas ambientales que han llevado a la búsqueda de producción de compuestos mediante métodos verdes. Por otro lado, el incremento acelerado en la fabricación de materiales de ácido polilático y las alternativas ecológicas a los plásticos derivados del petróleo, ha aumentado de gran manera el interés por la producción del ácido láctico. El ácido poliláctico es un polímero biodegradable que puede ser un buen sustituyente del plástico sintético, además de su aplicación en la medicina. Sin embargo, aún no se cuentan con procesos de síntesis que sean lo suficientemente efectivos, pues los procesos de fermentación tienen como desventaja la baja producción de ácido láctico (Ali et al., 2013).

El ácido láctico es producido comercialmente mediante síntesis química por hidrolisis del lactronitrilo o por fermentación microbiana. El 90% de la producción comercial se realiza mediante el proceso de fermentación (Kadam et al., 2006). Lo anterior se debe a que la síntesis química lleva a la formación de una mezcla racémica de ácido láctico, lo cual es una gran desventaja, mientras que la fermentación permite la formación de enantiómeros D(-) y L(+), ópticamente activos, los cual permite la aplicación de este compuesto en la industria alimenticia, química, farmacéutica y cosmética, entre otras. Además las propiedades físicas del ácido poliláctico dependen sustancialmente de la conformación del ácido láctico (Ali et al., 2013).

Existen diversos microrganismos empleados a nivel industrial en el proceso de producción de ácido láctico. Los más empleados son las Bacterias Ácido Lácticas (BAL) y los hongos del género Rhizopus. Entre éstas bacterias las más empleadas son las Lactobacillus

delbrueckii ya que esta tiene como ventaja la producción única de isómeros L (+), el consumo eficiente de glucosa y la característica de ser un microorganismo termófilo (Garcia et at., 2010).

A pesar de la alta demanda de ácido láctico actualmente, la producción de esta no ha podido satisfacer dicha demanda, puesto que aún no existen procesos de fermentación que produzcan una gran cantidad del mismo. Por tal motivo, este trabajo está enfocado a la determinación de las condiciones más favorables durante la fermentación, con el fin de obtener la mayor cantidad del producto deseado.

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OBJETIVOS

Objetivo General:

Obtención de bacterias ácido lácticas y optimización en el proceso de fermentación de las mismas para la producción de ácido láctico

Objetivos Específicos:

1. Aislar las bacterias ácido lácticas del kéfir de leche verificar mediante observación microscópica, coloración diferencial de Gram e identificación bioquímica la presencia de dichas bacterias

2. Variar la fuente de nitrógeno en el proceso de fermentación, así como la concentración del mismo y determinar la concentración de ácido láctico obtenida.

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CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO

2.1Ácido láctico

El ácido láctico, también conocido como ácido 2-hidroxi-propanoico, es un ácido carboxílico que juega un papel importante en diversos procesos bioquímicos con una formula química de Fue descubierto por primera vez por Scheele en la leche cortada en el año 1780, quién en un principio lo considero como un componente de la leche. En 1789, Lavousier nombro este componente de la leche como “acide lactique”, considerado como el posible origen de la actual terminología de ácido láctico. Sin embargo, en 1857, Louis Pasteur descubrió que este era un metabolito de fermentación generado por microorganismo y no un componente de la leche. Existe como dos isómeros ópticos, ácido L-(+)-láctico y ácido D-(-).láctico, los cuales se muestran en la Figura 1 (Wee et al., 2006).

Figura 1. Estructuras del ácido láctico

Propiedades

El ácido láctico es soluble en agua y solamente en disolvente orgánicos solubles en agua. Este presenta una baja volatilidad. El comportamiento químico del ácido láctico se debe a tres propiedades físico-químicas que este presenta. La primera. Es el carácter ácido en medio acuoso. La segunda, es la reactividad bifuncional que está asociada con la presencia de un grupo carboxilo y un grupo hidroxilo en su estructura. La última, es la actividad óptica asimétrica del carbono (Narayanan et al., 2004).

Tabla 1. Propiedades ácido láctico

Propiedades Valor

Peso molecular 90.08 g/mol

Punto de ebullición 122 °C a 14 mmHg

Punto de fundición 16.8 °C

Constante de disociación, Ka a 25°C 1.37x10-4

Calor de combustión, DHc 1361 KJ/mole

Calor especifico, Cp a 20°C 190 J/mol °C

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2.2Aplicaciones del ácido láctico

Industria alimentaria

El ácido láctico es usado en casi todos los segmentos de la industria alimentaria por gran variedad de aspectos y ha sido usado a través de los años para la fermentación y preservación de alimentos para consumo humano. El mayor uso del ácido láctico es en alimentos y aplicaciones relacionadas con el alimentos, en donde aproximadamente el 85% del ácido láctico es empleado en este sector y el 15 % restantes es utilizado en aplicaciones industriales no alimentarias (Vijayakumar et al., 2008).

El ácido láctico ocurre naturalmente en muchos productos alimenticios. Este ha sido empleado como conservante, acidulantes y como regulador de pH. Existe una gran cantidad de propiedades del ácido láctico que hacen de este un ingrediente muy versátil en la industria de alimentos. Este tiene una acción como conservante muy pronunciada y ayuda a regular la microflora. Ha sido descubierta una gran efectividad en contra de cierto tipo de microorganismos (Vijayakumar et al., 2008).

La sal de calcio de ácido láctico (lactato de calcio) tiene una mayor solubilidad que la sal del ácido cítrico. Es por eso, que en aquellos productos en los que la turbidez causada por la sal del ácido cítrico es un problema, se emplea ácido láctico para obtener productos claros. El ácido L-(+)-láctico es el ácido natural que se encuentra en los sistemas biológicos y por tanto es usado como acidulante y no introduce al cuerpo elementos extraños. Por otro lado, el ácido láctico también es empleado comercialmente en industria de carne procesada, para proveer productor con mayor tiempo de conservación, mejor el sabor y un mejorar el control de patógenos (Vijayakumar et al., 2008).

Repostería

El ácido láctico es empleado como acidulante en la industria de la repostería. Este es un mejor acidulante que el ácido cítrico ya que la inversión del azúcar es menor cuando se utiliza para caramelos duros, además imparte a estos una acidez más suave y duradera y realza más el sabor. Este no es únicamente empleado en la repostería por el sabor, también este permite traer el pH de la mezcla cocida al punto deseado (Vijayakumar et al., 2008).

Bebidas

El ácido láctico es empleado como acidulante en refrescos de sabor delicado y jugos de frutas. Este hace las bebidas más sabrosas y además deja una sabor persistente. Este también es empleado en la elaboración de bebidas alcohólicas como la cerveza para ajustar

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el pH y el uso de este mejora la estabilidad microbiana y a su vez mejora el sabor de la cerveza durante el proceso de fabricación (Vijayakumar et al., 2008).

Industria cosmética

El ácido láctico ofrece productor naturales para industria cosmética. A pesar de que es empleado principalmente como crema hidratante y regulador de pH, este tiene múltiples propiedades como la actividad antimicrobiana, para aclarar la piel y la hidratación de esta. El efecto hidratante se debe a la capacidad de retención del agua del lactato y la acción de aclarador en el piel es producida por la supresión de la formación de la tirosinasa. Debido a que son ingredientes naturales del cuerpo humano, el ácido láctico y la sal de este permiten formulaciones más naturales y seguras. Este es ampliamente utilizado actualmente como producto químico contra el envejecimiento, pues este suaviza las líneas, reduce el daño por la luz solar, mejor la textura de la piel y la apariencia en general (Vijayakumar et al., 2008).

Industria química

Actualmente el ácido láctico es considera como el monómero de mayor potencial para ser empleado como materia prima para conversiones química debido a sus dos grupos funcionales, el grupo carboxilo y el grupo hidroxilo. El ácido láctico puede ser sometido a diversas conversiones químicas para la síntesis de productos químicos, tales como el óxido de propileno a través de un proceso de hidrogenación, el ácido propanoico a través de la reducción, el 2,3-pentanodiona a través de la condensación, y dilactida a través de la auto-esterificación. En la industria química el ácido láctico es utilizado en el teñido de sedas y de otros productos textiles, como mordiente en la impresión de tejidos de lana, en el curtido vegetal, entre otros usos. El ácido láctico es empleado principalmente como producto descalcificador, regulador de pH, neutralizador, agente complejante de metales, agente antimicrobiano y humectante (Vijayakumar et al., 2008).

Industria farmacéutica

El ácido láctico es empleado en una amplia variedad de preparaciones de minerales, como las prótesis, suturas quirúrgicas y sistemas de administración de fármacos controlados. Este también tiene muchas formulaciones farmacéuticas, particularmente en lociones, soluciones contra el acné, humectantes y aplicaciones de diálisis (Vijayakumar et al., 2008).

Industria polimérica

Recientemente el ácido láctico ha recibido una mayor atención, pues este es empleado para la producción de ácido poliláctico, PLA, por sus siglas en inglés. Este polímero ha sido de gran importancia pues este pretende remplazar el plástico por un plástico biodegradable, amigable con el medio ambiente. Dicho polímero tiene una amplia gama de aplicaciones, como en la ropa de protección, envasado de alimentos, bolsas de basura, recipientes rígidos, bandejas de vida útil corta, entre otras. La polimerización del ácido láctico se puede llevar a

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cabo a través de reacciones en serie de policondensación, de despolimerización y la polimerización de apertura de anillo (Vijayakumar et al., 2008).

Tabla 2. Productos que se obtiene a partir del ácido láctico y sus usos

2.3Producción de ácido láctico

Existen dos rutas principales para la producción de ácido láctico, síntesis química o mediante un proceso de fermentación. El proceso comercial para la producción sintética se basa en la hidrólisis del lactonitrilo y ha sido descrito por Datta (1995). Este método produce una mezcla de ácido láctico racémico.

Síntesis química

El proceso comercial para la síntesis química del ácido láctico se basa en lactonitrilo y se lleva a cabo de acuerdo a la Figura 2, en donde materia prima fósil es convertida a etileno, el cual es posteriormente oxidado para formar acetaldehído. Posteriormente, se añade cianuro de hidrógeno al acetaldehído en presencia de una base para producir lactonitrilo. Esta reacción se lleva a cabo en fase líquidos a presiones atmosféricas elevadas. El lactonitrilo crudo se recupera y se purifica mediante destilación. Luego, se hidroliza a ácido láctico, ya sea empleado concentrado o para producir la correspondiente sal de amonio y ácido láctico. Finalmente, el ácido láctico se esterifica con metano para producir lactato de metilo antes de que este sea purificado por medio de destilación y se hidroliza

Producto Usos

Plásticos degradables Empaquetado, películas

Propilenglicol Polímeros, anticongelantes, humectantes

Acrilatos Polímeros, películas de plástico,

revestimientos

Oxido de propileno Polímeros, plásticos

Solventes “verdes” Plastificantes, procesamiento de comida

Ésteres y derivados de

ésteres Empaquetado

Poli-L-Lactatos Cubierta orgánica para vegetales y cultivos

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con agua bajo un catalizador ácido para producir así el ácido láctico y metanol (Narayanan

et al., 2004). Las reacciones que se llevan a cabo se muestran a continuación:

1) Adición cianuro de hidrógeno

2) Hidrolisis por

3) Esterificación

4) Hidrolisis por agua

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Fermentación

La producción comercial de ácido láctico se realiza por lo general mediante un proceso de fermentación de la glucosa usando lactobacilos homofermentativos. Lo anterior se debe a las diferentes ventajas que este proceso ofrece sobre la síntesis química. El sustrato para la fermentación puede ser elegido entre una variedad de diferentes fuentes de carbono, lo cual da la oportunidad de seleccionar el material de alimentación dependiendo del precio y su disponibilidad. Por otro lado, es posible también obtener el ácido L- o D-láctico puro mediante la selección de cepas específicas de bacterias. La configuración de la molécula de ácido láctico juega un papel muy importante en la producción de ácido poliláctico (Garde, 2002). Dicho proceso ha recibido una gran importancia recientemente, debido a que este ofrece una alternativa que previene la polución del medio ambiente causada por la industria petroquímica y el limitado suministro de recursos petroquímicos (Han and Pan, 2009).

La reacción que se lleva a cabo en el proceso de fermentación es la siguiente:

Figura 3. Reacción del proceso de fermentación de ácido láctico

Microorganismos para la producción de ácido láctico

Los microorganismos que tienen la capacidad de producir ácido láctico se pueden dividir en dos grupos, bacterias y hongos (Litchfield, 1996). La mayor parte de la producción de ácido láctico se lleva a cabo con bacterias de ácido láctico y en algunos casos con hongos filamentos. La fermentación fúngica tiene algunas ventajas, pues requiere medios de fermentación sencillos y produce ácido L (+)-láctico. Algunas especies convierten el almidón directamente a ácido L(+)-láctico. Sin embargo, la fermentación de hongos conlleva a una baja tasa de producción, por debajo de 3 g/h, lo cual se debe probablemente a la baja velocidad de reacción causado por la limitación de transferencia de masa de sustrato, además conlleva a un bajo rendimiento lo cual se atribuye a la formación parcial de subproductor como el ácido fumárico y etanol. Debido a los problemas que presentan las fementaciones de hongos, las bacterias del ácido láctico son empleadas comúnmente para el proceso fermentativo (Wee et al., 2006).

(22)

2.4Bacterias ácido lácticas

Las bacterias del ácido láctico, LAB, por sus siglas en inglés, son bacterias Gram positivas microaerofílicos y catalasa negativa. Dichas bacterias se caracterizan por no formar esporas, no presentar motilidad y forma de cocos. Son cocos y bacilos de longitud variable y de un grosor de 0.5-0.8 . Carecen de actividad respiratoria ya que les falta la enzima citocromo catalasa. A pesar de su metabolismo anaerobio, son anaerobios tolerantes, por lo que en cultivos sólidos pueden formar colonias en presencia de aire (Parra, 2010). Obtiene energía únicamente por fermentación de azucares y producen ácido láctico como su mayor producto final debido a la fermentación de carbohidratos. Estas bacterias son las más importantes en la fermentación de alimentos, siendo estas las responsable de la fermentación del pan de masa agria, de todas las leches fermentadas, yuca y de la mayor parte de los vegetales fermentados.

Las bacterias del ácido láctico tiene una gran especificidad fisiológica y los requerimiento nutricionales de estas son complejos, motivo por el cual en la naturaleza se encuentran asociadas a hábitats ricos en nutrientes, como en algunos alimentos ( leche, vino, carnes y vegetales), la boca, el intestino, entre otros, en los cuales son considerados como inquilino habituales. Por esto, en el laboratorio, el cultivo de dichas bacterias requiere de medios complejos que contengas diversos factores que permitan el crecimiento de estas, como lo son las vitaminas del grupo B, los aminoácidos, péptidos y bases púricas y pirimidínicas. Además, en estos medios se deben incorporar moléculas capaces de liberar la energía necesaria para el metabolismos de estas bacterias (Ribéreraruu-Gayon et al., 2003) y además se debe incorporar azúcares, a partir de cuya oxidación obtendrán energía. Los medios más empleados con el MRS (Man et al., 1960), el agar Rogosa (Rogosa et al., 1951), el MLO (medio para Leuconostoc oeni) o el agar sangre.

La mayoría de las especies de este género tienen una alta tolerancia a pH por debajo de 5, sin embargo, aunque toleran bien los pHs ácidos, a medida que el medio se va acidificando como consecuencia de su crecimiento, así mismo disminuye el número de especies que son capaces de sobrevivir. La mayoría crecen e incluso prefieren pHs comprendiendo en un intervalo entre 4,0 y 4,5, aunque existen especies con capacidad de crecer a un pH de 3,9, como Lactobacillus (L.)plantarum o L. brevis y otros que lo hacen a pHs comprendidos entre 9,2 y 9,6 como las especies Streptococcus (S.) lactis y S. thermophilus o aquellas del género Carnobacterium (Samelis et al., 1994).

De acuerdo a la temperatura óptima de crecimiento, la bacterias láctica pueden ser divididas en dos grupos; Las primeras son las especies mesófilas, en las cuales se incluyen las mayoría de las especies de todos los géneros, cuya temperatura óptima comprende un intervalo de 22 a 34 °C. Las segundas son las especies termófilas, cuya temperatura comprende un intervalo entre 37 y 45 °C, en éste se incluyen algunas especies del género

Lactobacillus, como L. bavaricus, que se utiliza en la fabricación del yogurt, y algunas del género Streptococcus como S. thermophilus (Pérez, 2009).

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En cuanto a la tolerancia de oxígeno, a pesar de que estas son especies microaerófilas, es decir que únicamente crecen a bajas presiones parciales de oxígeno, están son generalmente aerotolerantes y la mayoría crecer mejor en atmósferas que contengan entre un 5 y 10% de CO2.

El género más grande y diverso de las bacterias del ácido láctico son los Lactobacilos, las cuales incluyen especies con propiedades bioquímicas y fisiológicas muy diferentes, además de su característica que les permite la resistencia contra ambientes ácidos. Las propiedades de estas bacterias conllevan tanto a una tasa de crecimiento alta como a una alta productividad, razones por las cuales los Lactobacilos son empleados en importantes producciones industriales. La mayoría de Lactobacillus producen una única forma isomérica del ácido láctico. Sin embargo, algunos de ellos producen formas racémicas en donde el isómero predominante depende de los cambios en la aireación, la cantidad de NaCl, el tipo de fermentación, el incremento del pH y la concentración del sustrato (Garcia et al., 2010).

Metabolismo de las bacterias del ácido láctico

Las bacterias del ácido láctico usan principalmente dos rutas para fermentar la glucosa; La fermentación homoláctica y la fermentación heteroláctica. La fermentación homoláctica consta de dos pasos. El primero es de formación, etapa llamada Embden-Meyerhoff-Parnas, en la que la glucosa es transformada en ácido pirúvico y en el último paso este es reducido a ácido láctico por el poder reductor producido anteriormente en la forma de NADH (Figura 4). El ácido láctico se obtiene a partir de la glucosa como único producto como se muestra en la ecuación 1(Castillo et al., 2013).

Los microorganismos que únicamente emplean esta ruta para el consumo de carbohidratos, son llamados homofermentativas, en las cuales están incluidas, entre otras, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylophilus, L. bulgaricus, Lactobacillus helveticus y L. salivarius (Castillo, et al., 2013).

La fermentación homoláctica teóricamente se convierte un mol de glucosa en 2 moles de ácido láctico, con una producción teórica de 1 gramo de producto por gramo de substrato. Sin embargo, el rendimiento experimental usualmente es menor, entre , debido a que una porción de la fuente de carbono es empleada en la producción de la biomasa, la cual varía entre . Bajo ciertas condiciones, como limitación de fuente de carbono, la presencia de diferentes fuentes de carbono diferentes a la glucosa, pH elevado o una temperatura baja, algunos microorganismos homofermentativos pueden producir ácido fórmico mediante fermentación de ácido mixto (Castillo, et al., 2013).

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Figura 4. Fermentación homoláctica

La fermentación heteroláctica sólo produce un 50 % de ácido láctico, debido a la formación de co-productos como dióxido de carbono, etanol y/o ácido acético. En este proceso se producen cantidad equimolares de lactato, dióxido de carbono y etanol a partir de la glucosa, por lo cual se genera la mitad de la energía producida mediante fermentación homoláctica. La etapa de la degradación de la glucosa de la fermentación heteroláctica es llamada vía del fosfato de pentosa, conlleva a la formación de gliceraldehído 3 - fosfato, acetil-fosfato y dióxido de carbono. El gliceraldehído 3- fosfato entra en la glucolisis, en dónde se transforma en ácido láctico y el acetilfosfato es convertido en ácido acético y/o etanol de acuerdo a las ecuaciones 6, 7 y 8 (Castillo, et al., 2013).

La relación entre las cantidades de ácido acético y etanol, lo cual reduce el rendimiento teórico de , depende de la capacidad del microorganismo para oxidar el NADH generado en las primeras etapas del proceso, junto con sus requisitos de energía. Los microorganismos que utilizan sólo esta vía metabólica para el consumo de carbohidratos se denominan heterofermentativas, entre los que se encuentran Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum, L. parabuchneri and L. reuteri

En la Tabla 3 se muestran las bacterias ácido lácticas homofermentativas y heterofermentativas con su correspondiente configuración de ácido láctico.

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Tabla 3. Bacterias ácido lácticas homofermentativas y hetereofermentativas y su configuración

Tomado de: (García et al., 2010)

Aplicaciones de las bacterias lácticas

Las innumerables investigaciones que se han llevado a cabo sobre la fisiología y la genética de las bacterias lácticas han hecho posible el conocimiento profundo de las mismas y esto ha permitido mejorar e innovar sus aplicaciones en el campo de las fermentaciones industriales, de la agricultura, del bioprocesado, la alimentación y la nutrición, y más recientemente, en el campo de la medicina (Pérez, 2009).

En la industria, su aplicación más importante sigue siendo como cultivos iniciadores en la elaboración de alimentos. Actualmente, son estos los microorganismos más utilizados en fermentaciones alimentarias. En este campo, una de las aplicaciones más novedosas consiste en la fermentación de cereales, debido a la capacidad que estas tiene para hidrolizar el gluten (principal proteína de los cereales panificables, y los fitatos (principal factor antinutricional presente en cereales y vegetales), lo que evita que se produzcan reacciones alérgicas (Leroy et al., 2004).

En la siguiente tabla se muestran algunos ejemplos de los alimentos obtenidos mediante las bacterias lácticas y las especies que participan el dicho proceso:

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Tabla 4. Bacterias lácticas empleadas como cultivos iniciadores en la industria de alimentos (Leroy et al., 2004)

Alimento Fermentado Especie utilizada como cultivo iniciador

Queso Lc. Lactis subsp. Lactis, Lc. Lactis subsp. Cremoris,

Lc. Lactis subsp. Lactis var.diacetylactis, L. delbrueckii subso. Lactis, L. heleticus, S.

thermophilus

Mantequilla Lc. Lactis subso. Lactis, Lc. Lactis subsp. Lactis var. diacetylactis, Lc. Lactis subsp. Cremoris,

Ln. Mesenteroides subso. Cremoris

Yogurt S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. Bularicus

Leches fermentadas L. casei, L. acidophilus,L. rhmnous, L. johnsonnii, Bifidobacterium (B.) lacts, B. bifidum, B. breve

Kéfir L. kefir, L. kefiranofacies,L. brevis

Embutidos europeos L. sakei, L. curvatus

Embutidos americanos P. acidilactici, P. pentosaceus

Pescados fermentados L. alimentarius, C. piscícola

Saurkraut Ln. Mesenteroides, L. plantarum, P. acidilactici

Aceitunas Ln. Mesenteroides, L. pentousus, L. platarum

Encurtidos Ln. Mesenteroides, P. cerisiae, L. brevis, L. planrarum

Cereales fermentados

L. sanfraciscensis, L. farciminis, L. ferementum, L. brevis, L. platarum, L. amylovorus, L. reuteri, L. pontis, L. panis, L. alimentarius, Weissella cibaria

Vino O. oeni

Otro uso de gran importancia en la actualidad de las bacterias lácticas es como probióticos. Los probióticos son microorganismos vivos, no patógenos que, ingeridos en determinado número, ejercen efectos saludables, más allá de los inherentes a la nutrición básica”. Dichas bacterias son huéspedes habituales del tracto gastrointestinal de los humanos y los animales, en donde contribuyen en las interacciones entre la microbiota intestinal y el hospedador, mejorando el balance nutricional y microbiano en el tracto y su vez actúa como tratamiento y prevención de diarrea (Pérez, 2010).

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Otra aplicación de dichas bacterias radica en la producción industrial de diferentes compuestos como, el ácido láctico, el etanol, biopolímeros como los dextranos, o las bacteriocinas. Una de las aplicaciones de mayor innovación es la utilización de las bacterias lácticas como vehículo oral para vacunas. Estas bacterias son ideales para liberar antígenos y/o proteínas terapéuticas debidos a su carácter amigable con la flora de la mucosa gastrointestinal y vaginal, su carácter no invasivo, su capacidad de permanencia en el organismo (Pérez, 2010).

2.5 Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas

Las bacterias ácido lácticas son aisladas de hábitats vegetales, lácteos y animales, lo cual implica que dichas bacterias una amplia distribución y a su vez una adaptación especializada a diferentes ambientes. La identificación y clasificación de estas bacterias siempre ha sido una tarea compleja. La clasificación de estas consiste en agrupar las bacterias aisladas en grupos taxonómicos en base a similitudes y relaciones de las mismas (Boontawan, 2010).

La identificación de las bacterias ácido lácticas se puede realizar mediante métodos clásicos de microbiología, los cuales son relativamente simples de ejecutar, sin embargo dicho métodos usualmente carecen de poder discriminatorio. Dichos métodos se basan en el estudio de características fenotípicas, como la morfología celular y colonial, propiedades fisiológicas, bioquímica e inmunológicas y en el estudio de la composición de ciertos constituyentes celulares. En ocasiones, algunas de estas pruebas son muy laboriosas y en algunos casos también son económicamente costosas, y aunque son empleadas no son establecidas como único criterio de identificación de cepas (Ehrmann et al., 2005). El término bacterias ácido lácticas no se limita a un grupo de microorganismos estrictamente taxonómico, pero comprende una amplia gama de géneros filogenéticamente relacionados con bacterias Gram positivas con un gran número de características bioquímicas y ecológicas en común (Boontawan, 2010).

Fisiología de las bacterias ácido lácticas

La bacteria ácido láctica comprende una amplia gama de géneros incluyendo un número considerable de especies. Pertenece a la rama de clostridios de las bacterias Gram positivas y hacen parte del filo de bacterias Gram positivas con un bajo G+C, es decir un bajo contenido de guanina y cotosina, niveles que se utilizan para predecir la temperatura de recocido, lo cual implica una temperatura de fusión más alta.

Entre las características fisiológicas más importantes para consideraciones taxonómicas se encuentran, la composición de la pared celular, los ácidos grasos celular, otras características de las células, los patrones de fermentación de hidratos de carbono, la resistencia a diferentes concentraciones de NaCl, el crecimiento en medios con diferentes fuentes de nutrientes, el crecimiento a diferentes temperatura y la resistencia contra

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antibióticos (Klein et al., 1998). Algunas de estas características son las que permiten el uso de estas bacterias como probióticos, en dónde la resistencia a pH bajo y sus rangos de temperatura de crecimiento permiten la supervivencia de estos en el tracto gastrointestinal (Fuller, 1989).

Caracterización fenotípica

La identificación fenotípica de un microorganismo consiste en la asignación a un taxón determinado mediante un proceso comparativo de sus características morfológicas, bioquímicas o fisiológicas, con aquellas características los diferentes taxones. Las características a determinar y el número de estas depende del tipo de microorganismo y a su vez del conocimiento del mismo. Un análisis individual de estas no permite establecer relaciones filogenéticas entre los microorganismos, pero si proporciona una información descriptiva de gran interés y son la base de la descripción forma de los taxa (Boontawan, 2010).

Este tipo de caracterización presenta como desventaja que no son expresados de forma estable bajo diferentes condiciones ambientales o de cultivo, que esta no puede ser utilizada en bacterias no cultivables, su escasa reproducibilidad debido a que algunos de estos caracteres se pueden ver afectado por diferentes factores y su bajo poder discriminante. Estos inconvenientes limitan su uso en estudios de tipificación de cepas.

A pesar de los problemas que estos métodos conllevan, estos métodos son ampliamente empleados en la industria para la identificación de las bacterias ácido lácticas en tecnologías de fermentación. Estas se realizan con el objetivo principal de controlar la calidad de los alimentos, la conservación de los alimentos, la eficiencia de los cultivos iniciadores y el seguimos de especies. El nivel taxonómico de la discriminación microbiana depende de la sensibilidad de la técnica empleada y su vez de la gama de género (Guarneri et al., 2001). Por lo general, es necesario emplear más de un método para la obtención de la identificación y tipificación de cepas desconocidas. Pero aun así, no son suficientes para la caracterización de sub-especies y cepas de un género.

Las pruebas fenotípicas mayormente empleadas se muestran a continuación:

 Carácter Gram.

 Determinación de la morfología celular y colonial.

 Determinación de la actividad metabólica y bioquímica frente a diferentes sustrato, producción de enzimas, fermentación de azúcares, entre otros.

 Estudio de características fisiológicas, los cuales se realizan mediante la medición del crecimiento de las bacterias a diferentes condiciones de temperatura, pH y concentraciones de NaCl.

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 Determinación del perfil de gafos a los que es sensible la cepa de estudio, sin embargo esta técnica tiene una utilización limitada debido a la falta de estandarización metodológica.

 Estudio de las propiedades antigénicas de las cepas mediante serotipificación, pero su uso también es limitado debido a problemas metodológicos, además de que no todas las cepas pueden ser tipificadas serológicamente.

 Estudio de los patrones de susceptibilidad a los antibióticos, mediante antibiotipificación. En este caso, su uso se ve limitado debido a la capacidad que tiene los microorganismos de modificar dichos patrones.

Debido a los inconvenientes de estos métodos mencionados anteriormente, además de que algunos requieren un amplio trabajo y mucho tiempo para llevarlos a cabo y aun así no siempre dan resultados inequívocos, se han desarrollado nuevos métodos recientemente basadas en las características genotípicas de las bacterias (Germond et al., 2003).

Caracterización bioquímica

La caracterización bioquímica se realiza mediante la incorporación de un sustrato en un medio de cultivo y mirar como este afecta o no a la bacteria, para así determinar la actividad de la vía metabólica de estas. Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas relativamente simples, las cuales aunque determinan la actividad de la vía metabólica, no implica que estas conlleven a un estudio profundo del metabolismo bacteriano.

Para llevar a cabo estas pruebas se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo, como el medio de cultivo, un indicador, un revelador, etc., que puede ser diferentes aún para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Dicha identificación puede hacerse mediante sistemas ya sean manuales o comerciales.

Los sistemas comerciales emplean modificaciones de las pruebas bioquímicas convencionales, ya sea mediante la implementación de sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeños compartimientos con medios listos para sembrar.

Existen también una gran cantidad de pruebas bioquímicas que permiten la identificación de bacterias. A continuación se presentan las pruebas empleadas con mayor frecuencia, agrupadas según el tipo de ensayo:

 Enzimas vinculadas con la respiración: 1) Oxidasa

2) Catalasa

 Descomposición de azúcares simples, ácidos grasos y otros:

1) Requerimiento de oxigeno: Oxido fermentación y crecimiento de caldo tioglicolato.

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2) Producción de ácido: Fermentación de carbohidratos

3) Detección de enzimas y vías metabólicas: RM-VP (rojo de metilo- Voges Proskauer), gluconato, esculina y hipurato.

- Fuente única de carbono: Citrato, malonato, hipurato para coliformes.

Caracterización genotípica

Las interrelaciones genéticas de los miembros de las bacterias del ácido láctico han sido estudiadas ampliamente en secuencias de 16S ADN y mediante experimentos de hibridación DNA-DNA. En estos métodos se utiliza en algunos casos el genoma entero, como ocurre en experimentos DNA-DNA, o tan sólo una parte del mismo, como ocurre en las secuenciación de los ARNs ribosomales (Boontawan, 2010).

Estos métodos muestran grandes ventajas en comparación con los métodos descritos anteriormente. Entre estas, la universalidad, la sensibilidad, la resolución y el poder discriminante de estos métodos son las más destacadas.

2.6Nutrientes requeridos en la fermentación de ácido láctico

Todas las bacterias ácido lácticas requieren una fuente determinada de nutrientes para el metabolismo. La bacteria fermentativa requiere en primer lugar carbohidratos, ya sea azúcar simple como la glucosa y la fructosa o carbohidratos complejos como lo es la celulosa y el almidón. Los requerimientos de energía para dichas bacterias es muy alta, y una cantidad limitante de sustrato puede detener su crecimiento. Por esto, es necesario complementar los medios de fermentación con cantidades suficientes de nutrientes para la producción rápida de ácido láctico (Boontawan, 2010).

Fuentes de carbono

Recientemente, debido a la alta demanda de ácido láctico para la obtención de polímeros y uso de este en otros sectores de la industria, ha sido necesaria la producción de ácido láctico a un bajo costo. Lo anterior ha llevado a la necesidad de buscar materias primas baratas que permitan la producción biotecnológica de ácido láctico. Las materias primas empleadas para la producción de ácido láctico deben cumplir las siguientes características: Bajo costos, bajos niveles de contaminantes, tasa de producción alta, alto rendimiento, baja cantidad de formación de subproductos, capacidad de fermentar sin necesidad de un gran pre-tratamiento y deben estar disponibles durante todo el año. Los carbohidratos refinados tienen precios muy elevados, lo que conlleva a costos de producción muy altos, haciendo dicho proceso económicamente desfavorable. Por esto, se ha intentado seleccionar materias primas baratas como lo son el almidón de trigo, materiales celulósicos, suero de leche y la melaza. Entre estos materiales, el almidón y la celulosa son las materias primas que están recibiendo una mayor atención ya que además de su bajo costo, son abundantes y renovables (Wee et al., 2006).

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Fuentes de nitrógeno

La producción biotecnológica del ácido láctico requiere de suplementos, como lo es extracto de levadura, ya sea en un medio basado en glucosa o lactosa. La suplementación con extracto de levadura ha mostrado tener un efecto significativo sobre la concentración de ácido láctico, la producción volumétrica, y la conversión del sustrato. De acuerdo a estudios previos, se ha establecido que el suplemento con mayor efectividad es de 10 g/L de extracto de levadura (Aeschimann et al., 1990).

Cuando una célula de levadura es desactivada, se da inicio a un proceso de digestión natural denominado “autolisis”. Durante este proceso, las enzimas de la levadura rompen proteínas y otras partes de la célula, provocando así la liberación de péptidos, aminoácidos, vitaminas y otros componentes de la célula de levadura y una vez cuando los componente insolubles son eliminados, se denomina extracto de levadura. La composición típica de extracto de levadura es de 8-12 % de contenido de nitrógeno total (compuesto orgánico e inorgánico), 50 75% de contenido de proteína, 3-5,2% de contenido de nitrógeno fermentable, 4-13% de contenido total de hidratos de carbono, y muy poco de contenido de lípidos (Boontawan, 2010).

El extracto de levadura es rico en nitrógeno, vitaminas y otros compuestos estimulantes en el crecimiento, razón por la que este es usado como ingrediente en los medios para el cultivo de microorganismos. Por otro lado, todos los estudios realizados sobre el efecto de este en los procesos fermentativos, han demostrado un aumento en la producción de ácido láctico (Lund et al., 1992).

En fermentaciones microbiana, se estima que aproximadamente el medio de fermentación corresponde a aproximadamente un 30 % del costo total (Rivas et al., 2004). La mayoría de estudios realizados de proceso fermentativos emplean nutrientes caros en los medios de fermentación, como el extracto de levadura y peptona. Debido a su alto precio, se han buscado otras alternativas para emplear como fuente de nitrógeno en el proceso de fermentación que permita la reducción en los costos de producción. Por esto, se han probado varias cantidades de vitamina B para remplazar el extracto de levadura, sin

embargo, no ha sido posible ya que el extracto de levadura es que componente que muestra un efecto más significativo en la producción de ácido láctico, especialmente en el inicio del crecimiento, en el que el ácido láctico incrementa linealmente con el incremento del nivel de extracto de levadura (Hujanen et al., 1994).

2.7Fermentación ácido láctica

La fermentación se define como un proceso de producción de energía mediante el que las moléculas orgánicas sirven como donantes de electrones, tanto como aceptores de electrones. Las bacterias ácido lácticas son empleadas como un método de bajo costo para la preservación de la comida vía a través de un proceso de fermentación y generalmente poco o nada de calor es necesario durante el proceso. En la fermentación, las moléculas de ácido pirúvico se convierten en producto de desecho y tan sólo un poco de energía es producida por la vía homofermentativa. El extracto de levadura ha sido sin duda el que

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tiene un mayor efecto sobre la producción de ácido láctico, especialmente en el inicio del crecimiento. Sin embargo, si el medio contiene una cantidad suficiente de extracto de levadura de la fabricación de la cerveza como fuente de nitrógeno y otros factores de crecimiento, la cantidad de extracto de levadura podría reducirse de manera significativa e incluso reemplazarla sin que esto cause una disminución en la producción de ácido láctico.

La ruta fermentativa típica de ácido láctico se inicia con alguna tipo de pretratamiento del sustrato, el cual se realiza ya sea mediante la adición de los componentes esenciales de crecimiento, como los minerales y nutrientes adecuado, o también por tratamiento mecánico combinado con química enzimática de hidrolisis. El pretratamiento depende principalmente de la materia prima y en el tipo de bacterias del ácido láctico que se emplean. El objetivo del pretratamiento consiste en formar azúcares monoméricos mediante la hidrolisis de los componentes de hidratos de carbono. Con el fin de obtener una alta productividad de ácido láctico, la fermentación se lleva a cabo comúnmente en una cepa bacteriana elegida de entre el género Lactobacillus, en donde la especie depende del tipo de sustrato y la configuración deseada del lactato (Boontawan, 2010).

Fermentación batch

La fermentación batch es el proceso llevado a cabo en un sistema cerrado donde la materia prima inicia con cantidades limitadas. Después de la inoculación de los microorganismos, la composición del caldo de fermentación cambia durante todo el proceso, y se irá produciendo ácido láctico conforme se consuma el azúcar. (Garde, 2002) El crecimiento de las bacterias ocurre a través de diferentes fases, las cuales se muestran a continuación:

Figura 5. Curva de crecimiento bacteriano en condiciones batch.

La fermentación por lotes en la producción de ácido láctico se ha estudiado con la implementación de cepas bacterianas del género Lactobacillus. Las especies utilizadas para fermentar el azúcar dependen principalmente del tipo de hidratos de carbono que se emplean en el proceso. (Boontawan, 2010). Cuando la materia prima a utilizar es azúcar de

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maíz, la especie indicada es L. delbruecki; el inóculo se cultiva en lotes y se añaden directamente al fermentador que debe contener miles de galones de medio. Para la fermentación de suero de leche, las cepas de L. bulgaricus son necesarias debido a que esta especie es capaz de sintetizar la lactosa. (Brock et al., 1991).

A continuación se muestra la producción de ácido láctico por fermentación batch implementando diferentes hidratos de carbono como materia prima.

Tabla 5. Producción de ácido láctico a partir de recursos agrícolas por fermentación batch. (Wee et al., 2006).

Materia prima Organismo Ácido láctico (g/L)

Productividad (g/L/h) Papel residual Rhizopus oryzae NRRL 395 49.1 1.8

Melaza L. delbrueckii NCIMB 8130 90.0 3.8

Almidón de maíz L. amylophilus GV6 76.2 0.8

Trigo hidrolizado L. lactis ATCC 19435 106.0 3.3

La principal desventaja de la fermentacion batch radica en que al aumentar la concentración de sustrato se produce una inhibición en el crecimiento celular y la formación de producto, lo que provoca una disminución en la concentración de ácido láctico y en la productividad del proceso. (Boontawan, 2010).

Fermentación batch con alimentación

Una variación del proceso discontinuo es la fermentación de alimentación discontinua, donde se inicia en modo por lotes y luego se alimenta de forma continua o secuencialmente con el sustrato limitante, resultando en un aumento del volumen. Una ventaja de la alimentación por lotes es la posibilidad de mantener un nivel de sustrato baja, evitando así el efecto represivo de alta concentración de sustrato (Garde, 2002).

La producción de ácido láctico a partir de la fermentación de Lactobacillus casei ha sido objeto de estudio en la evaluación de diferentes estrategias de alimentación. A partir de resultados experimentales, la implementación de cultivos con alimentación batch exponencial ha resultado ser un método efectivo en la fermentación de Lactobacillus casei.

Teniendo una alimentación exponencial de glucosa (850 g/L), a 210 g/L se logra una concentración máxima de ácido láctico con un rendimiento de hasta 90.3%, un peso seco máximo de células de 4.3 g/L y una productividad de 2.14 g/L/h. Al comparar estos resultados con un proceso de fermentación batch sin alimentación, el cultivo con alimentación batch exponencial mostró una mejora de hasta el 56.5% en la producción de ácido láctico a partir de Lactobacillus casei. Ademas, de un aumento del 68.6% en peso seco y un 59.7% en la productividad. (Ding et al., 2006). Las fermentación batch sin y con alimentación logra concentraciones de ácido láctico más altos en comparación con la fermentación continua (Boontawan, 2010).

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Fermentación continua

La fermentación del ácido láctico continua es una conversión en estado estacionario de sustrato en ácido láctico. En este proceso no hay cambios en la composición biológica ni química del medio de reacción y el caudal de alimentación se equilibra con la tasa del flujo del efluente. La fermentación continua se compone de un recipiente que contiene los microorganismos, una entrada de alimentación, y una salida de producto.

2.8Factores que afectan la fermentación ácido láctica

Existen diversos factores que afectan la fermentación de ácido láctico. La optimización del proceso fermentativo requiere un profundo conocimiento de aquellos factores que determinan el metabolismo de los microbios y la influencia que los parámetros tienen en el proceso. Entre los factores que tiene una mayor repercusión en la producción de ácido láctico mediante fermentación son la temperatura y el pH en primera instancia, el periodo de incubación y la agitación, son otras variables de gran importancia en el proceso. Cada uno de estos parámetros se trata a continuación.

Efecto de la Temperatura

La temperatura es uno de los factores que más influye en la fermentación. Una baja temperatura ha resultado positivamente en el rendimiento de la producción de ácido láctico como consecuencia de proveer un ambiente favorable para los microorganismos (Neysens et al., 2005). Además, la más alta productividad se logra con una temperatura inferior a la temperatura en la que se obtiene la mayor concentración de masa de ácido láctico y el mayor rendimiento. Para Lactobacillus amylophilus, sabiendo que crece a 15°C pero no a 45°C, las temperaturas óptimas resultaron ser a 25°C y 35°C para una máxima productiviad y un máximo rendimiento respectivamente (Boontawan, 2010).

Efecto del pH

El pH juega un papel de gran importancia en el proceso de fermentación. Este puede ser establecido en un principio y dejado para que decrezca durante el proceso debido a la producción de ácido o puede ser controlada mediante la adición de soluciones alcalinas. El pH óptimo para la producción de ácido láctico varía en un rango de 5 a 7. Un pH por debajo de 5,7 es óptimo para las cepas de Lactobacilos, las cuales son conocidas por tolerar pH menores que las Lactococcus (Wee et al., 2004).

La influencia del pH sobre la fermentación del ácido láctico ha sido objeto de investigación en previos estudios utilizando diferentes materias primas. Cuando se tiene melaza como fuente de hidrato de carbono y el organismo Enterococcus faecalis RKY1, la fermentación

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del ácido láctico se completó en un menor tiempo a un pH 7.0 conociendo con anterioridad que el pH óptimo para el crecimiento celular de Enterococcus faecalis RKY1 es 8.0. El crecimiento de las células a pH 5.0 casi cesó después de 10 h de fermentación, la más alta concentración de masa de ácido láctico se obtuvo a pH 7.0 con un rendimiento comparable con un pH 6.0 (Wee et al., 2004).

Efecto del periodo de incubación

Estudios previos muestran que un incremento en la utilización de lactosa y la producción posterior de ácido láctico fue encontrado en un tiempo de incubación de 36 horas, pues después de este tiempo no se observó ninguna mejora en ninguna de las dos (Panesar et al.,

2010). Lo anterior se puede deber a que el crecimiento de la cultura alcanza después de este tiempo una fase estacionaria y como consecuencia los microorganismos cambian las características del medio y el ambiente. Por lo general, el tiempo empleado para la producción de ácido láctico mediante diferentes culturas de Lactobacilos es de 48 horas (Gandhi et al., 2000). Sin embargo, no hay un tiempo o condiciones óptimas reportadas para los Lactobacilos ya que las diferencias entre las cepas y la composición del medio hacen que dichas condiciones varíen.

Efecto de la agitación

Como se dijo anteriormente, las diferentes cepas de bacterias ácido lácticas requieren de condiciones diferentes para el crecimiento. The optimal condition for lactic acid is pH 5.0-6.8, temperature 30-45°C with continuously agitating at 100-200 rpm. Ha sido reportado para la cepa Lactobacilos rhmnosus una agitación de 1500 rpm, un pH de 6, una temperatura de 40 °C, para la obtención máxima de ácido láctico (Timbuntam et al., 2008).

2.9Inhibición de la fermentación láctica

Los mayores problemas que se presentan en la producción de ácido láctico se deben a la inhibición de sustrato, la inhibición del producto final (ácido láctico) y la formación de subproductos. Existen diferentes estrategias que permiten revisar la inhibición por el producto final, un ejemplo de estas estrategias es la neutralización del ácido láctico con álcali adecuado, pero existen muy pocos intento para determinar la inhibición causada por substrato (Porro et al., 1999).

Inhibición por substrato

A altas concentraciones algunos de los sustratos inhiben la actividad de la enzima. La inhibición no competitiva es una inhibición de substrato que ocurre a altas concentraciones de substrato. Esta inhibición ocurre cuando dos moléculas de substrato pueden unirse a la enzima y por tanto bloquea la actividad.

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Inhibición de producto final

Para los microorganismos, la limitación de su crecimiento y así mismo de la producción de ácido es comúnmente causada por el producto final. En este caso, el mecanismo de inhibición del ácido láctico puede deberse a la solubilidad del ácido láctico no disociado dentro de la membrana citoplasmática y la insolubilidad del lactato disociado, lo cual causa una acidificación del citoplasma y la pérdida de las fuerzas motrices de los protones. Lo cual eventualmente modifica el gradiente de pH y disminuye la cantidad de energía disponible para el crecimiento celular (Wee et al., 2006).

Aunque el mecanismo para la inhibición del crecimiento del ácido láctico no ha sido completamente comprendido, el mecanismo más aceptado para la inhibición de ácidos orgánicos débiles se relaciona con la solubilidad de la forma no disociada en la membrana del citoplasma y la insolubilidad de la forma ionizada del ácido. Ha sido sugerido que la capacidad de los Lactobacilos de tolerar pH más bajos que otras bacterias ácido lácticas, se debe a su más básico del citoplasma, permitiendo así mayores concentraciones de ácidos no disociados para ser tolerados (Gatje et al., 1991).

Con el fin de mitigar el efecto inhibidor del ácido láctico durante el proceso de fermentación, se han llevado a cabo recientemente intentos para eliminar el ácido láctico a medida que esté se va formando. Sin embargo, dicha medida no es fácil emplearla.

2.10 Extracción fermentativa

El medio de fermentación contiene ácido láctico o su sal o la mezcla de ambos. Un enfoque ventajoso en el procesamiento implica la eliminación de ácido láctico a partir del caldo de fermentación mientras se deja el lactato en condiciones alcalinas. La separación puede darse dentro del fermentador o cuando se retira la solución del fermentador. Debido a la formación de ácido láctico y consigo su acumulación, el pH del caldo continúa disminuyendo lo que afecta de manera directa la productividad del microorganismo; además, se genera una inhibición del producto causada por la alta concentración (Lund et al., 1992).

Para el control de pH, el método convencional es convertir el ácido láctico a lactato de calcio con la adición de cal. El procesamiento aguas abajo del caldo de fermentación incluye la precipitación y la acidificación de lactato de calcio a ácido láctico. Alternativamente, el ácido láctico se puede retirar continuamente del fermentador por adsorción, extracción o separación por membrana.

La extracción y purificación de ácido láctico a partir del medio fermentado es una operación que presenta problemas en la cristalización del ácido a partir de una solución acuosa debido a su bajo punto de fusión (53°C) (Gupta et al., 2007).

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Por otro lado, procesos que implican la formación de sales han resultado viables en la extracción del ácido láctico. Las sales con alquilaminas secundarias y terciarias son lo suficientemente estables para ser extraídas de soluciones acuosas utilizando disolventes orgánicos. El disolvente se evapora y la sal se descompone para dar ácido láctico libre. Para finalizar con la extracción se lleva a cabo una esterificación, lo que implica la preparación de un éster de ácido láctico, seguido por una destilación para eliminar impurezas e hidrólisis para la recuperación de ácido láctico y alcohol (Boontawan, 2010).

2.11 Purificación del ácido láctico

Un gran número de enfoques se pueden utilizar en la separación de la sal de lactato a partir del medio fermentado: la extracción mediante disolventes orgánicos, separación por intercambio de iones, destilación a vacío, adsorción y separación de membrana por citar algunos. La elección del proceso radica en la eficiencia y la economía que genere el agente de extracción. Los avances tecnológicos en la fermentación, purificación primaria y secundaria, la polimerización, la conversión química del ácido láctico y sus derivados permitirían bajo costo a un gran volumen en la producción de ácido láctico. (Narayanan et al., 2004).

Adsorción

La recuperación de ácidos carboxílicos a partir de caldos fermentados presenta dificultades en la separación debido a la naturaleza de los mismos. Las principales características de agentes de extracción y solidos de absorción son la alta selectividad para el ácido en lugar del agua y el sustrato, la regenerabilidad y la biocompatibilidad con microorganismos. Cabe mencionar que si un sólido de absorción puede utilizarse in situ se podrán generar mayores rendimientos globales (Frieling, 1999).

Extracción por disolvente

La extracción con disolventes se ha utilizado para la purificación de ácido carboxílico tal como ácido láctico y ácido succínico. Pero estos disolventes in-situ son tóxicos, ya que rompen la membrana celular causando la filtración del metabolito. Estudios han llevado a que se determinen alcoholes como tales como 1-octanol y 1-decanol como diluyentes menos tóxicos que reducen la toxicidad en las células. La principal desventaja de la extracción por disolventes es la bio-compatibilidad y el precio de los disolventes (Hong et al., 2001).

Procesos de separación de membrana

Un ácido láctico no disociado pasa a través de la membrana bacteriana y se disocia dentro de la célula. Con el tiempo influye en el gradiente de pH transmembranal y disminuye la cantidad de energía disponible para el crecimiento celular (Gonçalves et al., 1997). El proceso de separación de membrana ha sido ampliamente utilizado para la concentración de

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