Variación espacial en la polinización y el éxito reproductivo de una herbácea endémica: implicaciones para su conservación

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(2) VARIACIÓN ESPACIAL EN LA POLINIZACIÓN Y EL ÉXITO REPRODUCTIVO DE UNA HERBÁCEA ENDÉMICA: IMPLICACIONES PARA SU CONSERVACIÓN. Juande D. Fernández Carmona TESIS DOCTORAL Bellaterra, Julio 2014. Programa de Doctorado en Ecología Terrestre Centre de Recerca Ecològica i Aplicacions Forestals (CREAF) Universitat Autònoma de Barcelona.

(3) VARIACIÓN ESPACIAL EN LA POLINIZACIÓN Y EL ÉXITO REPRODUCTIVO DE UNA HERBÁCEA ENDÉMICA: IMPLICACIONES PARA SU CONSERVACIÓN Memoria que el Licenciado Juan de Dios Fernández Carmona presenta para aspirar al Grado de Doctor por la Universidad Autónoma de Barcelona. Esta memoria ha sido realizada bajo la dirección y con la aprobación de:. Dr. José María Gómez Reyes Catedrático de Ecología Universidad de Granada. Dr. Jordi Bosch Gras Investigador CREAF. Programa de Doctorado en Ecología Terrestre Centre de Recerca Ecològica i Aplicacions Forestals (CREAF) Universitat Autònoma de Barcelon.

(4) Durante el tiempo de realización de esta Tesis Doctoral el doctorando ha disfrutado de una Beca del Programa Nacional de Formación de Profesorado Universitario del Ministerio de Educación y Ciencia Ref. (AP2006-01142). Este trabajo estuvo financiado por los proyectos 078/2007 del Organismo Autónomo de Parques Nacionales (MMARM), CSD2008-00040 del programa Consolider-Ingenio Montes (MICINN) y P07-RNM-02869 de la Junta de Andalucía. La investigación presentada en esta Tesis Doctoral ha sido realizada en el Departamento de Ecología de la Universidad de Granada, en el Departamento de Biología Animal, Biología Vegetal y Ecología de la Universitat Autònoma de Barcelona y en el Centre de Recerca Ecològica i Aplicacions Forestals (CREAF). Además se ha contado con la implicación de la Estación Experimental de Zonas Áridas (EEZA) del CSIC..

(5) A mi madre y a mi padre, por su cariño, dedicación y paciencia..

(6) “Lo único necesario para que el mal triunfe es que las buenas personas no hagan nada” Edmund Burke. “Que sea difícil no implica que sea imposible, que sea imposible no implica que vaya a rendirme” El Chojin. 6.

(7) ÍNDICE AGRADECIMIENTOS…………………………………..……11 RESUMEN……………………………………………….…….15 SUMMARY……………………………………………….…….17 INTRODUCCIÓN GENERAL………………………………19 CAPÍTULO 1: Geographical variation, pollinator community and habitat composition effects on Erysimum popovii reproduction.…………………..………..…..31. CAPÍTULO 2: Pollen limitation in a narrow endemic plant: geographical variation and driving factors…..……..….65 CAPÍTULO 3: Geographic variation in recruitment limitation of a narrow endemic herb…..……..……….……….93 CAPÍTULO 4: Advantages and drawbacks of living in protected areas: the case of the threatened Erysimum popovii (brassicaceae) in SE Iberian peninsula…………...….121. DISCUSIÓN GENERAL……………………………….……151 CONCLUSIONES……………………………………………165. 7.

(8) Agradecimientos. AGRADECIMIENTOS Quiero aprovechar este apartado para nombrar y agradecer a las numerosas personas que durante estos años han colaborado y ayudado en la realización de esta tesis doctoral de forma directa e indirecta. En primer lugar agradezco a mis directores de tesis sus enseñanzas, dedicación e ilusión, sin duda las dos personas más importantes para que esta tesis haya llegado a buen puerto. Ambos han formado un equilibrio, un yin y un yang, que ha permitido organizar las ideas, planificar y desarrollar el trabajo de campo, gestionar y analizar los datos y finalmente publicar los artículos y escribir la tesis sin que haya perecido en el camino. A José María Gómez, Rocka, alguien excepcional en lo científico y en lo personal, con una mente privilegiada y una capacidad de trabajo infinita, agradecer su implicación, los consejos y haberme brindado la oportunidad de vivir la ciencia desde que me aceptó como alumno interno en 2003 y trasmitirme su pasión. Gracias a Jordi Bosch, para mi San Jordi, por guiarme en el difícil mundo de la taxonomía entomológica, revisar la redacción y ortografía inglesa, identificación de los insectos, acogerme en Barcelona… y sobre todo por aportar tranquilidad, sabiduría y sensatez en los momentos más complicados. Gracias a Ángela M. Cano, mi “punto de apoyo” para poder mover el mundo. Durante estos años, su implicación en la tesis ha sido imprescindible tanto por la ayuda en el trabajo de campo, como por el apoyo moral, el ánimo y por aguantarme. Mi agradecimiento a Juan Lorite, siempre dispuesto ayudar con la identificación de las plantas, trabajo de campo, redacción de artículos… con la mejor de las sonrisas. A Francisco Perfectti, gracias por aportar su intelecto y una visión externa en complejos diseños experimentales y en los 8.

(9) Agradecimientos. trascendentes y eternos debates. Agradecer la inestimable ayuda en el tedioso trabajo de laboratorio a Belén Herrador, Helena Barril y Eulogio Corral. Y la ayuda en el duro trabajo de campo a Modesto Berbel y Octavio Jiménez, así como aguantar que siempre pusiese rap en la furgoneta. A Beatriz Nieto-Ariza, por su ayuda en el campo, el laboratorio y los análisis de conectividad, por la ilusión que ha puesto en cada trabajo que ha realizado, por la energía positiva que desprende y porque mientras existan personas como ella, habrá esperanza para la humanidad. Gracias a Helena Carballo por su ayuda en el trabajo de campo del último experimento y compartir los quebraderos de cabeza con la compleja estadística del capítulo 3. A mis compañeros de tesis y grupo de investigación Mohamed Abdelaziz y Jesús Muñoz, gracias por su ayuda y complicidad, llegaréis lejos. A Elena Amat, Ayub Oduor y Sara Marañón, por la compañía y las buenas conversaciones, habéis hecho que las becarías de la planta baja y del sótano sean más acogedoras, “¿Os apetece un té?”. A Carolina Puerta gracias por haber abierto el camino que he seguido. Gracias a Fran Bullejos por su compañerismo, apoyo y asesoramiento en el difícil camino del becario investigador. Agradecer a mis compañeros de Departamento tantas risas en el laboratorio, los consejos, la ayuda, etc: Javier Valverde, Luis Matías, Asier Herrero, Ramón Ruiz, Susana Hitos, Karim Senhadji, Ana Mellado, Ángela Sánchez… Gracias también a mis compañeras de los cursos de doctorado de la UAB: Clara Primante, Montse del Cacho, Virginia García, Lucía Hortal, Marta Coll… por los buenos ratos y hacerme sentir como en familia. Una mención especial para todas las personas que han participado en el trabajo de campo, de laboratorio o de “ordenador”, o que simplemente han estado ahí cuando han hecho falta: Margarita Fernández, Ana Belén Romero, Beatriz Almagro, Beatriz Sánchez, Miguel Ballesteros, Eva Cañadas, Blas Benito, 9.

(10) Agradecimientos. Marcos Méndez, Gabriel Blanca, Raúl León, Eva Saldaña, Olaya Orozco, Andrea Calvet, Javier Ares, Ángel Ortigosa, Andrés Criado, Eladia Nuño, Ismael Casotti, Yedra García, Antonio García, Tatí Benjumea, Carmen Soya, Manu Soto, Leticia Ayllón, Alicia Calero, Jonathan Masegosa, etc. A Juan Antonio por dejarme el cortijo en la zona de La Peza siempre que tenía que quedarme a muestrear, con barbacoa incluida. A Javier López, mi hermano de otra madre, gracias por haber ayudado con el trabajo de campo y por haber estado ahí, “a muerte”. A Philippe Cazanave, mi coach y mi hermano francés, por ayudarme durante los censos de 2008, por abrirme los ojos de tantas cosas en la vida y por el coaching durante el difícil último tramo de la tesis. También quiero aprovechar para agradecer a las personas que han hecho posible la realización de esta tesis doctoral de forma indirecta. A mi madre y mi padre, Mª Ángeles Carmona y Juan de Dios Fernández, por haber creído siempre en mí. Por su paciencia y dedicación incondicional. Sin su educación, su cariño y su apoyo, nunca hubiese llegado a donde estoy. Gracias por haberme obligado a hacer la colección entera de cuadernillos Rubio y todos los que había de ortografía. A mi hermana, Ana B. Fernández, gracias por ensañarme que hay otras formas de ver y entender la vida. Gracias a Greenpeace y sus gentes (perdón por no nombraros una a una, pero necesitaría una tesis entera para agradecer tanto a tantas personas), por dejarme formar parte de la lucha por aquello en lo que creo, aportándome realidad y energía en los momentos más monótonos de la tesis. Gracias por haber cambiado el mundo y seguir haciéndolo. Gracias a las panaderías de Mancha Real, Jaén, Cambril, Granada, Alcalá, Priego, La Peza… por sus ricas tortas de chocolate y panes de aceite, que me aportaban la energía necesaria para muestrear las poblaciones, en especial los nochebuenos de la panadería 10.

(11) Agradecimientos. de Pedro Martínez. Gracias a mis maestros de Aikido Luis Mochón y Javier Herrera, por mostrarme el camino de las artes marciales y haber sacado todo mi potencial. Creo que no hubiese sido capaz de terminar la tesis sin esta válvula de escape. Gracias a los maestros que en mi vida académica me han guiado, en especial a Don Miguel Ballesta, Juan Cañadas, Juan Pedro M. Camacho y Regino Zamora. Gracias a Félix Rodríguez de la Fuente y a David el Gnomo, por haber introducido en mí la semilla del ecologismo. Finalmente quiero agradecer y pedir disculpas a todos los insectos que de forma anónima y desinteresada han dado su vida por la ciencia y cuyos cuerpos. se. encuentran. atravesados. por. un. alfiler. entomológico.. 11.

(12) Resumem. RESUMEN Estudiar la dinámica poblacional de las especies vegetales y el efecto de los distintos factores bióticos y abióticos en su reproducción es esencial para conocer y entender la biología reproductiva de las plantas. Este conocimiento tiene especial relevancia desde el punto de vista de la conservación cuando se centra en especies endémicas y/o amenazadas. En esta tesis doctoral hemos estudiado en profundidad la reproducción de Erysimum popovii, una herbácea endémica del sureste de la Península Ibérica y catalogada como “Casi Amenazada”. Se seleccionaron 28 poblaciones a lo largo de todo el área de distribución de la especie, en las que se midieron las distintas variables relacionadas con polinizadores, hábitat y clima. El hecho de abarcar todo el rango de distribución de la especie, ha permitido hacer análisis espaciales a escala poblacional y regional, determinando el estado de la especie y su reproducción a nivel de especie. En el Capítulo 1 se analiza cómo el conjunto de los polinizadores, así como otras variables bióticas y abióticas afectan a la reproducción de E. popovii. Para ello se realiza un estudio demográfico de la planta analizando los distintos estadios de su ciclo de vida. En el Capítulo 2 se profundiza en la limitación de polen en Erysimum popovii, realizando un experimento de adición de polen y analizando las variables que afectan a dicha limitación, así como su distribución espacial. Además de la limitación por polen, las poblaciones de plantas pueden verse limitadas por el reclutamiento. Este aspecto se aborda en el Capítulo 3 gracias a un experimento de adición de semillas. Por último, el Capítulo 4 indaga en el estado de conservación de las poblaciones de E. popovii, estudiando las diferencias en la viabilidad de las poblaciones dentro y fuera de las áreas protegidas.. 12.

(13) Resumem. E. popovii mostró diferencias espaciales en las variables reproductivas estimadas a lo largo de su área de distribución. Estas diferencias van acompañadas por diferencias en hábitat, polinizadores, etc. De esta forma, la especie se encuentra con condiciones distintas en las distintas localidades que habita lo que genera un mosaico geográfico en las poblaciones de E. popovii. Esto podría indicarnos un comportamiento metapoblacional de la especie. Una de las variables que más favorece la reproducción de E. popovii ha sido la presencia de Bombílidos. Este resultado sugiere que estos dípteros son un grupo de polinizadores altamente eficaces como vectores polínicos de esta planta. Por el contrario, la densidad de especies florales acompañantes afecta de forma negativa a la fructificación de E. popovii, lo que indicaría una posible competencia interespecífica. La producción de semillas de la mayoría de las poblaciones está limitada por polen. Además, algunas poblaciones están limitadas por la disponibilidad de micrositios, la producción de semillas o su dispersión. Se detecta un cuello de botella muy importante en el paso de plántula a adulto. En general, existe una gran variación espacial en estos tipos de limitación, como queda patente y esta variación no muestra un patrón geográfico claro. Finalmente se hacen algunas recomendaciones para mejorar la conservación de la especie. La principal recomendación es el establecimiento de zonas de exclusión de herbivoría, que actúen como fuentes de propágulos que favorezcan la dinámica metapoblacional de la especie. Además se aconsejan otras medidas como búsqueda de nuevas poblaciones, la dispersión manual de semillas. y. el. estudio. filogeográfico. de. la. especie.. 13.

(14) Summary. SUMMARY The study of plant population dynamics and the effects of biotic and abiotic factors on reproductive success is essential to understand plant reproductive biology. This is especially relevant from the standpoint of conservation of endemic and/or endangered species. In this PhD thesis we have studied the reproductive success of Erysimum popovii, a "near-threatened" endemic herb from SE Spain. We selected 28 study sites throughout the entire distribution area of the species. At each site we measured several Erysimum popovii populational variables, as well as variables related to pollinator composition, habitat and climate. Because our study encompasses the entire distribution range of the species, we have been able to analyze our results and establish the status of the species both at the local and regional levels. Chapter 1 addresses the effect of pollinator composition and other biotic and abiotic factors on the reproductive success of Erysimum popovii. To do this, we conducted a demographic study covering the different phases of the life cycle. In Chapter 2 we study pollen limitation. We conducted a pollen supplementation experiment and analyzed the spatial distribution and the factors affecting pollen limitation. In addition to pollen limitation, plant populations may be limited by their ability to recruit. We address this issue in Chapter 3, in which a seed supplementation experiment was conducted. Finally, Chapter 4 analyses the conservation status of Erysimum popovii populations in protected versus unprotected areas. Erysimum popovii shows dramatic differences across its distribution range in the reproductive variables measured. These differences are accompanied by 14.

(15) Summary. differences in pollinator composition and habitat factors. Therefore, different populations encounter different local conditions, thus generating a geographic mosaic and suggesting a metapopulation structure. One of the main variables associated to reproductive success in Erysimum popovii is visitation by Beeflies. This result suggests that these dipterans are highly effective pollinators of this species. On the other hand, high densities of co-flowering plants have a negative effect on Erysimum popovii fruit set, indicating possible interspecific competition effects. Seed production is pollen-limited in most of the Erysimum popovii populations. In addition, some populations are limited by the availability of microsites, seed production and/or seed dispersal. We found an important reproductive bottleneck in the seedling to adult transition. The spatial variability of these various types of limitation is very high and does not show any clear geographical pattern. The main recommendation to improve the conservation status of the species is the establishment of areas of exclusion of herbivores. These areas may act as sources of propagules enhancing the metapopulational dynamics of the species.. We also recommend the search of new populations, seed. supplementation of certain populations and the phylogeographic study of the species.. 15.

(16) Introducción General. INTRODUCCIÓN GENERAL. LA POLINIZACIÓN EN LAS INTERACCIONES ANIMAL-PLANTA Las interacciones entre animales y plantas juegan un papel clave en la estructura de las comunidades y determinan su distribución espacial (Boucher 1985; Begon 1999). Algunas de las interacciones que se dan entre plantas y animales pueden considerarse mutualistas, cuando plantas y animales se proporcionan beneficio mutuo. Esto produce un incremento en las tasas de natalidad, una disminución en las tasas de mortalidad y/o una mayor capacidad de carga (Begon 1999). Las dos formas más comunes de mutualismo animal-planta son la polinización y la dispersión de semillas, jugando ambas un papel fundamental en la reproducción y el establecimiento de las poblaciones de plantas y de los animales con los que interaccionan (Burd 1994; Jordano et al. 2003). La polinización mediada por insectos es el sistema de polinización más extendido, ya que casi un 70% de las especies de plantas se reproducen mediante este sistema (Kearns & Inouye 1997, Richards 1997). Por tanto, no es de extrañar que la biología de la polinización haya despertado el interés de muchos investigadores y hayan sido numerosas las investigaciones que han realizado en este campo. Además, la polinización es uno de los factores que más intensamente afecta a la distribución espacial de las especies vegetales con flores, ya que la variación espacial del conjunto de sus polinizadores puede determinar el éxito reproductivo de las plantas en distintas localizaciones. Según se ha estudiado, un elevado porcentaje de plantas presentan limitación por polen (Burd 1994; Ashman et al. 2004; Knight et al. 2005), es decir, su capacidad reproductiva se encuentra limitada por la cantidad y calidad de polen que reciben. Por tanto, la variación espacial y temporal de los polinizadores puede afectar a la dinámica y distribución de las plantas. De hecho, muchos estudios han mostrado variación espacial en la abundancia y composición de los polinizadores y el efecto que esto 16.

(17) Introducción General. ejerce sobre las poblaciones de plantas a las que polinizan (Price et al. 2005; Gómez & Zamora 2006; Ollerton et al. 2006; Gómez et. al. 2007). Esta variabilidad espacial puede generar mosaicos de composición de polinizadores en una región (Gómez et al. 2009). Son numerosos los factores que pueden determinar las diferencias en dicha estructura en mosaico, afectando a la abundancia, diversidad y composición de la comunidad de polinizadores en un área determinada. Entre los factores abióticos destacan la temperatura y la altitud (Arroyo et al. 1985, Blionis & Vokou 2001; Rahbek 2005), la litología del terreno (Potts et al. 2005), la pendiente y la disponibilidad de substratos de nidificación (Cane 1991, Potts et al. 2005, Grundel et al. 2010). Entre los factores bióticos destacan la diversidad de la flora (Tepedino & Stanton 1981; Gathman et al. 1994; Croxton et al. 2005), la densidad de plantas entomófilas (Banaszak 1996, Roulston y Goodell 2011), la presencia de parásitos (Roulston & Goodell 2011) y la abundancia de hábitat naturales (Steffan-Dewender et al.2002). Por tanto, saber la identidad y la efectividad de los polinizadores de una determinada planta, la diversidad del conjunto de éstos y la tasa con la que los polinizadores contactan con la planta de forma efectiva, se hace imprescindible para conocer de forma precisa el éxito reproductivo de una especie, así como comprender su distribución y predecir su comportamiento ante determinados escenarios (Klein et al. 2003; Gómez et al. 2007).. IMPORTANCIA DE LA POLINIZACIÓN PARA LA CONSERVACIÓN DE ESPECIES VEGETALES Los planes de conservación para una especie que se encuentra en peligro, generalmente, requieren la conservación de la mayor cantidad posible de individuos en un área determinada (Curry-Lindahl 1982). Siempre ha de mantenerse por encima de la Población Mínima Viable, que según Shaffer (1981) es la población más pequeña de una especie, que estando aislada, tiene una posibilidad de sobrevivir del 99% durante 1000 años. En el caso de especies 17.

(18) Introducción General. vegetales polinizadas por animales, la PMV puede depender de forma directa de los polinizadores de la especie y de forma indirecta de las variables bióticas y abióticas que afecten a dicha interacción. En la medida en que estas variables pueden variar de unas zonas a otras, también habrán de hacerlo los planes y medidas que se tomen para la conservación de dichas especies vegetales. En el caso de las especies endémicas y en peligro, los análisis demográficos son de especial importancia, puesto que en muchos casos se trata de poblaciones pequeñas y aisladas (Primack & Ros 2002; Groom et al. 2006). Las poblaciones pequeñas están más expuestas a pérdidas de la variabilidad genética, relacionada con depresiones endogámicas y pérdida de la flexibilidad evolutiva. Además, dado su pequeño tamaño pueden sufrir fluctuaciones poblacionales relacionadas con sus propias dinámicas poblacionales o con variaciones ambientales o catástrofes que generen vórtices de extinción que llevarían a la desaparición de la población. Además, pequeñas alteraciones en las relaciones de estas plantas con sus polinizadores pueden dificultar la recepción del polen, con consecuencias dramáticas para su conservación (Tepedino et al. 1997). Actualmente se esta observando una disminución en las poblaciones de polinizadores, fenómeno que se conoce como crisis de polinización (Kearns et al 1998; Ghazoul 2005; Beisjmier et al 2006). Esto podría poner en riesgo las interacciones plantapolinizador (Kearns et al 1998; Kremen C & Ricketts T. 2000), lo que a su vez podría poner en riesgo a las especies florales, especialmente las endémicas y en peligro, como se ha mencionado anteriormente. Además, el cambio climático podría empeorar esta situación, alterando los periodos de floración, los ciclos de vida de los insectos, etc. (Memmott et al. 2007, Hegland et al. 2009). Por lo tanto, para el establecimiento de eficaces planes de recuperación o conservación de especies florales se hace imprescindible el estudio del conjunto de sus polinizadores y la comprensión de las interacciones que se producen. Además es importante tener en cuenta que en muchas ocasiones, las poblaciones de plantas no se comportan como poblaciones cerradas y estables, 18.

(19) Introducción General. sino que responden a un mosaico cambiante de poblaciones temporales conectadas por migración, lo que se conoce como metapoblaciones (Bonet et al. 2005; Rozenfeld et al. 2008). En estos casos, numerosas poblaciones son pasajeras, pudiendo cambiar drásticamente de unas generaciones a otras, estableciendo áreas satélite con poblaciones fluctuantes. Estas áreas satélite se mantienen y generan gracias a núcleos estables que proporcionan individuos que migran a nuevas zonas o recolonizan zonas donde la especie se ha extinguido localmente (Hanski & Simberloff 1997; Primack & Ros 2002). Cuando una especie responde a un modelo de metapoblaciones, la fragmentación de su área de campeo suele tener unos efectos dramáticos para su conservación al disminuir la conectividad y reducir la probabilidad de recolonización por migración. Por lo tanto, es imprescindible conocer la dinámica de las poblaciones con la que se trabaja así como la conectividad entre ellas, si queremos llevar a cabo una gestión adecuada y eficaz.. ESPECIE DE ESTUDIO, DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y ESTATUS DE CONSERVACIÓN Los estudios que se desarrollan en los sucesivos capítulos de la presente tesis fueron realizados utilizando como sistema de estudio la crucífera Erysimum popovii Rothm. Esta planta de la familia Brassicaceae es perenne de vida corta. Se reproduce a partir del segundo año, aunque en algunas excepciones se han observado individuos capaces de reproducirse al año de vida (observaciones en el invernadero). Presenta un número variable de tallos floríferos (1-8) erectos, simples, esparcidos o densamente poblados (Blanca et al. 1992, Blanca et al. 2009). La altura de los tallos floríferos puede variar entre los 10 y 50 cm. aunque excepcionalmente pueden verse ejemplares de mayor altura (observaciones en el campo). La floración ocurre entre los meses de abril y mayo, la planta produce flores violáceas cuya cantidad puede variar entre menos de una decena y más de un centenar. Las flores se presentan en racimos terminales simples. Los frutos maduran en el mes de agosto y se dispersan de octubre a diciembre mediante 19.

(20) Introducción General. mecanismos de barocoria. Como ocurre con otras especies del género Erysimum (Gómez 2007), sus tallos, racimos florales y frutos son consumidas por ganado vacuno, ovino y caprino además de otros ungulados. De forma excepcional se han observado frutos de E. popovii parasitados por larvas de curculiónidos (posiblemente Ceutorhynchus chlorophanus). Erysimum popovii se distribuye por las Sierras Béticas de Andalucía Oriental, en zonas montañosas de las provincias de Granada (Sierra Nevada, Sierra Arana, Sierra de Loja, Sierra de Cogollos, Sierra de Alhama, Sierra de Tejeda, Sierra de la Peza y El Mencal), Jaén (Sierra Mágina y Sierra de Jabalcuz) y Córdoba (Sierra Horconera). Las zonas muestreadas presentan un clima Mediterráneo continental, caracterizado por inviernos fríos y veranos calurosos, con una marcada sequía estival. La mayoría de las precipitaciones se producen en primavera y otoño. La temperatura media anual varía entre 9,2 y 14,2ºC, encontrándose las mínimas de invierno por debajo de los 0ºC y las máximas de verano próximas a los 40º C. Algunas de las zonas de estudio se encuentran dentro de parques naturales, en concreto el Parque Natural de Sierra Nevada (Granada), Parque Natural de Sierra Mágina (Jaén) y Parque Natural de las Sierras Subbéticas (Córdoba). Durante 2007 y 2008 se revisaron las zonas donde había citas de la presencia de la especie, para localizar un conjunto suficiente de poblaciones para llevar a cabo las investigaciones. Se encontraron 31 poblaciones de E. popovii a lo largo de su área de distribución: 2 en Sierra Nevada, 7 en la Sierra de la Peza, 6 en Sierra Arana, 4 en la Sierra del Mencal, en la provincia de Granada; 7 en la Sierra de Jabalcuz, 4 en Sierra Mágina, en la provincia de Jaén; y 1 en la Sierra de la Horconera, en la provincia de Córdoba (Figura 1). De las 31 poblaciones encontradas, 29 fueron seleccionadas para las investigaciones, ya que una población se perdió como consecuencia de trabajos silvícolas llevados a cabo en la Sierra de Jabalcuz, y otra población fue desestimada por encontrarse en un lugar de difícil acceso. También desestimamos el usar poblaciones de la Sierra de Cazorla y la Sierra del Pozo, al estar muy solapadas con poblaciones de E. cazorlense y E. baeticum, lo que podría haber afectado a nuestros resultados, ya que las especies son muy difíciles de distinguir. No pudimos encontrar 20.

(21) Introducción General. poblaciones ni en la Sierra de Loja ni en la Sierra de Tejeda, después de una intensa búsqueda. Esto puede deberse a que en estas zonas, la especie haya sufrido un proceso de extinción local, ya que las citas consultadas eran muy antiguas. Sin embargo, hemos encontrado poblaciones en zonas donde no se tenía registrada la presencia de la especie, como Sierra Nevada.. Figura 1. Distribución de los grupos de poblaciones de Erysimum popovii utilizadas en las investigaciones de la tesis.. En estas 29 poblaciones se caracterizaron aquellas variables que pudiesen afectar a la relación entre los polinizadores y la planta, en base a investigaciones previas realizadas y a la bibliografía consultada. Se determinó el tamaño y densidad de las poblaciones, la estructura del hábitat, composición de la comunidad floral, el conjunto de los polinizadores de E. popovii, tipos de hábitats colindantes y diversas variables topográficas y climatológicas.. 21.

(22) Introducción General. Es importante señalar que la región mediterránea, donde se ha desarrollado esta tesis doctoral, posee unas excelentes condiciones para la realización de investigaciones sobre las interacciones polinizador-planta y sus dinámicas temporales. Esto se debe a que, en dicha región, la floración está muy restringida temporalmente, así como el periodo de actividad de los polinizadores, produciéndose entre la primavera y los primeros meses de verano. La floración y las interacciones polinizador-planta suelen estar muy afectada por factores abióticos que fluctúan y varían entre zonas y años (Herrera 1986, Arroyo 1990). Los ecosistemas mediterráneos presentan una enorme diversidad de especies, encontrándose entre los sistemas más diversos del mundo (Mittermeier et al. 1998; Blondel & Aronson 1999). Además, las zonas mediterráneas se caracterizan por una fuerte heterogeneidad espacial, como consecuencia de una acentuada estacionalidad que genera fuertes contrastes de humedad y temperatura. La sequía estival es uno de los factores más limitantes y determinantes para las comunidades vegetales. A esto hay que sumarle la complejidad orográfica, lo que sin duda, mejora sus cualidades para la realización de este tipo de investigaciones, ya que permiten encontrar distintos escenarios en zonas próximas, así como cambio de condiciones hídricas y climatológicas entre años para una misma zona, pudiendo por tanto realizar complejos estudios comparativos. OBJETIVOS Y ESTRUCTURA EN CAPÍTULOS El objetivo principal de esta tesis es estudiar el éxito reproductivo y las interacciones entre Erysimum popovii y sus polinizadores y determinar sus implicaciones para la conservación de la especie. Aunque los resultados son solo referentes a E. popovii el planteamiento del estudio y la metodología pueden aplicarse a otras especies en estatus de conservación similares. El objetivo principal se descompone en distintos objetivos parciales que son abordados en los distintos capítulos. 22.

(23) Introducción General. En el Capítulo 1, se analiza cómo el conjunto de los polinizadores y sus componentes de abundancia, diversidad y composición afectan a la reproducción de E. popovii. Para ello se realiza un estudio demográfico de la planta analizando los distintos estadios de su ciclo de vida. Además se analiza cómo la composición del hábitat y otras variables poblacionales pueden afectar a la reproducción de la planta. Todo esto nos permite desarrollar un amplio conocimiento sobre la reproducción de E. popovii y estudiar su variabilidad entre las distintas poblaciones y regiones donde la especie está presente. En el Capítulo 2 se lleva a cabo un estudio sobre la limitación de polen en Erysimum popovii, realizando. un experimento de adición. de polen.. Específicamente se analiza la variación geográfica de la limitación de polen a lo largo de toda el área de distribución de la especie y su relación con varios factores ambientales y con la composición de polinizadores. También se analiza si los efectos de la limitación por polen son más intensos a nivel pre o postdispersivo. La existencia de limitación por polen permite justificar la posible relación existente entre la presencia de determinados polinizadores en una zona y el éxito reproductivo a nivel local. En el Capítulo 3 se exponen y analizan los resultados de un experimento de adición de semillas, cuyo objetivo era estudiar si las poblaciones están limitadas por la producción de semillas, por la dispersión de las mismas o por la disponibilidad de micrositios para su germinación. Ello nos permite conocer qué factores limitan la tasa de reclutamiento en cada estadio a lo largo del ciclo de vida completo. Finalmente, en el Capítulo 4, se indaga en el estado de conservación de las poblaciones de E. popovii. Además se estudian las diferencias en la viabilidad de las poblaciones dentro y fuera de las áreas protegidas, se analiza el efecto del daño por ungulados a la conservación de la planta y se sugieren medidas concretas para la mejora de la conservación de la especie.. 23.

(24) Introducción General. REFERENCIAS Arroyo J. 1990. Ritmos climáticos y de floración en matorrales del SW de España. Lagascalia, 16: 25-50. Arroyo MTK, Armesto JJ, Primack RB. 1985. Community Studies in Pollination Ecology in the High Temperate Andes of Central Chile II. Effect of Temperature on Visitation Rates and Pollination Possibilities. Pl. Syst. Evol. 149: 187-203. Ashman TL, Knight TM, Steets JA, Amarasekare P, Burd M, Campbell D, Dudash M, Johnston M, Mazer SJ, Mitchell R, et al. 2004. Pollen limitation of plant reproduction. Ecological and evolutionary causes and consequences. Ecology. 85: 2408–2421. Banaszak J. 1996. Ecological bases of conservation of wild bees. In: Matheson A, Buchmann SL, O’Toole C, Westrich P, Williams IH (eds). The Conservation of Bees. Academic Press, London. UK, pp 55-62. Begon M, Harper JL , Townsenn CR. 1999. Ecologia. Ediciones Omega. Barcelona. Biesmeijer JC, Roberts SPM, Reemer M, Ohlemuller R, Edwards M, Peeters T, Schaffers AP, Potts SG, Kleukers R, Thomas CD, Settele J, Kunin WE. 2006. Parallel declines in pollinators and insect-pollinated plants in Britain and the Netherlands. Science 313:351-54. Blanca G, Morales C, Ruíz Rejón M. 1992. El género Erysimum L. (Cruciferae) en Andalucía (España). Annales del Jardín Botánico de Madrid. 49: 201–214. Blanca G, Cabezudo B, Cueto M, Fernández C, Morales C. 2009. Flora Vascular de Andalucía Oriental. Consejería de Medio Ambiente, Junta de Andalucía, Sevilla, Spain. Blionis GJ, Vokou D. 2001. Pollination ecology of Campanula species on Mt Olympos, Greece. Ecography. 24: 287–297. Bonet A, Gras MJ , Raventós J. 2005. Análisis de los patrones espaciales de distribución. de Vella lucentina MB Crespo para la selección de áreas de la Red de Microrreservas de Flora de la Comunidad Valenciana. Mediterranea: Serie de Estudios Biológicos. II. Nº 18. Boucher DH. 1985. The biology of mutualism. Oxford Univ. Press. Nueva York. Burd M. 1994. Bateman’s principle and reproduction: the role of pollinator limitation in fruit and seed set. Botanical Review 60: 83-139. Cane JH. 1991. Soils of ground-nesting bees (Hymenoptera: Apoidea): texture, moisture, cell depth and climate. J. Kansas Entomol. Soc. 64, 406–413. Croxton PJ, Hann JP, Greatorex-Davies JN, Sparks TH. 2005. Linear hotspots? The floral and butterfly diversity of green lanes. Biol. Cons. 121: 579-584. Curry-Lindahl K. 1982. Principios ecológicos para la conservación de los animales. In: Sioli H (ed). Ecologia y protección de la naturaleza. Conclusiones internacionales. Blume. Barcelona, pp 192-243. 24.

(25) Introducción General Gathmann A, Greiler HJ, Tscharntke T. 1994. Trap-nesting bees and wasps colonizing set-aside fields: succession and body size, management by cutting and sowing. Oecologia 98: 8–14. Ghazoul J. 2005. Buzziness as usual? Questioning the global pollination crisis. Trends in Ecology and Evolution 20: 367-373. Gómez JM. 2005. Non-additive effects of pollinators and herbivores on Erysimum mediohispanicum (Cruciferae) fitness. Oecologia 143:412-418. Gómez JM, Zamora R. 2006. Ecological factors that promote the evolution of generalization in pollination systems. In: Waser NM, Ollerton J (eds). Plant–pollinator interactions, from specialization to generalization. University of Chicago Press, Chicago, Ill., pp 145–165. Gómez JM, Bosch J, Perfectti P, Fernandez JD, Abdelaziz M. 2007. Pollinator diversity affects plant reproduction and recruitment: the tradeoffs of generalization. Oecologia. 153: 597– 605. Gómez JM, Perfectti F, Bosch J, Camacho JPM. 2009. A geographic selection mosaic in a generalized plant-pollinator-herbivore system. Ecological Monographs 79:245-263. Groom MJ, Meffe G, Carroll CR. 2006. Principles of conservation biology. 3rd version. Sinauer Associates. Sunderland, USA. Grundel R, Jean RP, Frohnapple KJ, Glowacki GA, Scott PE, Pavlovic NB. 2010. Floral and nesting resources, habitat structure, and fire influence bee distribution across an open-forest gradient. Ecol. Appl. 2:1678–1692. Hanski I, Simberloff D. 1997. The metapopulation approach, its history, conceptual domain, and application to conservation. In: Hanski IA, Gilpin ME (eds). Metapopulation biology: ecology, genetics, and evolution, 5–26. Academic Press, San Diego, California, USA. Hegland SJ, Nielsen A, Lázaro A, Bjerknes A , Totland Ø. 2009. How does climate warming affect plant-pollinator interactions? Ecology Letters, 12:184-195. Herrera J. 1986. Flowering and fruiting phenology in the coastal shrublands of Doñana, south Spain. Vegetatio, 68: 91-98. Jordano P, Bascompte J , Olensen J. 2003. Invariant properties in coevolutionary networks of plant-animal interactions. Ecology Letters 6: 69-81. Kearns CA , Inouye DW. 1993. Techniques for Pollination Biologists. University Press of Colorado. Kearns CA, Inouye DW , Waser NM. 1998. Endangered mutualisms: The conservation of planpollinator interactions. Annual Review of Ecology and Systematics 29: 83:112. Klein AM, Steffan-Dewenter I, Tscharntke T. 2003. Fruit set of highland coffee increases with the diversity of pollinating bees. Proc R Soc Lond Ser B. 270: 955–961. Knight TM, Steets JA, Vamosi JC, Mazer SJ, Burd M, et al. 2005. Pollen limitation of plant reproduction: pattern and process. Annu Rev Ecol Evol Syst. 36: 467–97.. 25.

(26) Introducción General Kremen C, Ricketts T. 2000. Global perspectives on pollination disruption. Conservation Biology 14: 1226:1228. Memmott J, Craze PG, Waser NM , Price MV. 2007. Global warming and the disruption of plant-pollinator interactions. Ecology Letters 10: 710-717. Ollerton J, Johnson SD, Hingston AB. 2006. Geographical variation in diversity and specificity of pollination systems. In: Waser NM, Ollerton J (eds) Plant–pollinator interactions, from specialization to generalization. University of Chicago Press. Chicago. pp 283–308. Potts SG, Vulliamy B, Roberts S, O’Toole C, Dafni A, Ne’eman G, Willmer P. 2005. Role of nesting resources in organizing diverse bee communities in a Mediterranean landscape. Ecological Entomology. 30: 78-85. Price MV, Waser NM, Irwin RE, Campbell DR, Brody K. 2005. Temporal and spatial variation in pollination of a montane herb: a seven-year study. Ecology 86: 2106–2116. Primack RB, Ros J. 2002. Introdución Barcelona.. a la biología de la conservación. Ariel Ciencia.. Rahbek C. 2005. The role of spatial scale and the perception of large-scale species-richness patterns. Ecology Letters, 8: 224-239. Richard AJ. 1997. Plant breeding systems. Chapman , Hall. Londres. Roulston TH, Goodell K. 2011. The role of resources and risks in regulating wild bee populations. Annual review of entomology 56:293-312. Rozenfelda AF, Arnaud-Haondb S, Hernández-García E, Eguíluzd VM, Serrãob EA , Duartea CM. 2008. Network analysis identifies weak and strong links in a metapopulation system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105:18824–18829. Shaffer ML. 1981. Minimum population size for species conservation. BioScience. 31:131-134. Steffan-Dewenter I, Münzenberg U, Bürger C, Thies C, Tscharntke T. 2002. Scaledependent effects of landscape structure on three pollinator guilds. Ecology. 83: 1421–32. Tepedino VJ , Stanton NL. 1981. Diversity and competition in bee–plant communities on shortgrass prairie. Oikos. 36: 35–44. Tepedino VJ, Sipes SD, Barnes JL, Hickerson LL. 1997. The need for “extended care” in conservation: examples from studies of rare plants in the western united states. ISHS Acta Horticulturae 437: VII International Symposium on Pollination.. 26.

(27) CAPÍTULO 1. REPRODUCTIVE SUCCESS OF THE NARROW ENDEMIC ERYSIMUM POPOVII: GEOGRAPHICAL VARIATION AND THE EFFECTS OF POLLINATOR COMPOSITION AND ABIOTIC CONDITIONS. Juande D. Fernández, Juan Lorite, Jordi Bosch, y José M. Gómez. Artículo bajo revisión en: Basic and Applied Ecology 27.

(28) Capítulo 1. Reproductive success of the narrow endemic Erysimum popovii: Geographical variation and the effects of pollinator composition and abiotic conditions.. ABSTRACT Geographic variation in reproductive outcome determines plant distribution. In this study, we investigate the geographic structure and the factors affecting reproductive success throughout the life cycle of the near threatened crucifer Erysimum popovii across its entire distribution range. We worked in 21 populations, in which we measured fruit set, seed set, seed weight, seed germination in the laboratory, germination time, seedling emergence in the field, seedling survival and fecundity. We also sampled the pollinator assemblages visiting Erysimum popovii in each site, as well as some populational characteristics (population size and density, flower density of E. popovii and of other co-occurring species, and rainfall). Germination success in the laboratory was very high (range: 0.56-0.98), but seedling emergence in the field was low (0.005-0.32). Beefly visitation rates were positively related to seedling emergence, whereas visitation rates by low-quality pollinators were associated to decreased fruit set and germination time. Populations in sites with high density of co-occurring flowers produced fewer fruits. Most variables related to reproductive outcome varied widely across populations, but this variation did not show a defined regional structure. The low seedling survival may constitute a bottleneck for the recruitment of this species. Overall, less than 0.2 % of the ovules produced turned into reproductive individuals. Our results suggest a metapopulation structure for Erysimum popovii.. KEYWORDS: Reproduction · Erysimum popovii · Fitness · Seed set · Fruit set · Seed weight · Germination time · Germination · Seedling. 28.

(29) Plant reproduction. INTRODUCTION The study of factors determining plant reproduction is crucial to understand species distribution. Most studies addressing this issue focus on demographic analyses, and include various phases of the plant’s life cycle such as fruit set, seed production and seed germination (e.g. Menges 1991; Lamont et al. 1993; Widén 1993; Menges & Gordon 1996; Roll et al. 1997; Colas et al. 2001; Rebollo et al. 2001; Spligerand Chang 2008; Fayolle et al. 2009; Metz et al. 2010; Wirth et al. 2011). Overall, limitation of reproduction in pre-dispersal phases (fruit set and seed production) may be determined by different factors such as the genetic constitution of the mother plant (Anderson 1993), pollen limitation (Ashman et al. 2004; Knight et al. 2005; Aizen & Harder 2007; Fernández et al. 2012), ovule abortion (Stephenson 1981; Stephenson & Winsor 1986), resource limitation (Bloom et al. 1985), and predation (Grieg 1993). Fruit set has often been found to be low in many plants (Collins & Rebelo 1987; Ayre & Whelan 1989; James et al. 1994; Guitián et al. 1996), supporting the view that flowers represent a reservoir of ovules that can be used when resources are plentiful, thus providing an adaptive response to stochastic environments. Instead, under sub-optimal conditions, plants may save resources by discarding flowers or fruits at the beginning of their development (Ayre & Whelan 1989). In addition to fruit set, final seed yield, may also be limited by low seed set within fruits (ratio of ripe seeds to ovules). Limitation of reproduction in the postdispersal phase (seed germination) has commonly been linked to plant population size (Menges 1991), density of conspecific and heterospecific plants (Fenner & Kitajima 1999), abiotic conditions such as precipitation regime (Philippi 1993; Clauss & Venable 2000; Venable 2007), and seed quality (Winn 1985; Burke & Grime 1996). Two of the most widely used estimators of seed quality are seed weight and germination time. Seed weight affects many processes of the reproductive cycle, including seed germination (Schall 1980; Hendrix 1984; Naylor 1993), dormancy period (Stamp 1990; Fenner & Thompson 2004), resistance to competition (Houssard & Escarre 1991; Turnbull et al. 2004), seed dispersal (Augspurger & Franson 1986; Fenner & Thompson 2004) and seedling 29.

(30) Capítulo 1. growth and recruitment (Lloret et al. 1999; Walters & Reich 2000; Coomes & Grubb 2003). Germination time, on the other hand, may be specially determinant in annual and herbaceous plant species at the community level via competitive dominance of the early germinating individuals. Very short delays in emergence time can be magnified in the long term, with strong effects on final biomass and reproductive output (Kalisz 1986; Weiner & Thomas 1986). Therefore, different life cycle phases are affected by different extrinsic biotic and abiotic factors, which in addition, may vary spatially at different scales (Mc Geoch & Price 2005; Anderson & Johnson 2008; Nattero et al. 2011). That is, the relative contribution of the different phases of the life cycle to the plant’s reproductive output may vary spatially depending on the locally prevailing biotic interactions and abiotic conditions (Pavlik et al. 1993; Edwards and Crawley 1999; Schupp et al. 2002; Stevens et al. 2004; Rautio et al. 2005; Kim & Donohue 2011). Pollinator abundance, composition and diversity have often been related to plant reproductive success (Waser 1978; Motten et al. 1981; SteffanDewenter et al. 2001; Waites & Agren 2004; Cosacov et al. 2008; GonzálezVaro et al. 2009; Gómez et al. 2010). Pollen limitation is often associated to low pollinator abundance (Cosacov et al. 2008; González-Varo et al. 2009; Gómez et al. 2010), and different pollinator species usually differ in pollinating effectiveness and may thus have different effects on plant fitness (Klein et al. 2002; Gómez et al. 2007; Perfectti et al. 2009). Additionally, some habitat characteristics such as plant population size, habitat fragmentation, co-occurring flower composition, and altitude can influence plant reproduction either directly or indirectly via their effect on biotic interactions (Totland 2001; González-Varo et al. 2009; Jakobsson et al. 2009; Kim & Donohue 2011). Understanding how these biotic and abiotic variables affect different phases of the reproductive cycle is essential to interpret the reproduction dynamics, geographical structure and conservation status of a plant species (Menges 1990; Colas et al. 2001; Metz et al. 2010).. 30.

(31) Plant reproduction. In this study, we explore the geographic variation of reproductive success and recruitment, as well as their relationship with local pollinator assemblages and abiotic conditions in Erysimum popovii, a narrow endemic Brassicaceae. Our objectives are: 1) to study the different phases of the reproductive cycle and evaluate their relative contribution to recruitment; 2) to analyze the geographic structure of the reproductive output across the entire distribution range of the species; 3) to measure the effect of pollinator diversity, abundance and composition on the various phases of the reproductive cycle; and 4) to measure the effect of E. popovii population characteristics and habitat composition on the various phases of the reproductive cycle.. MATERIALS AND METHODS STUDY SYSTEM Erysimum popovii Rothm. (Brassicaceae) is a narrow endemic species from southeastern Spain, categorized as “Near Threatened” in the Red List of Andalusian Vascular Flora (Cabezudo et al. 2005). The species shows a scattered distribution across the Baetic mountain ranges from 900 to 2000 m. a.s.l., inhabiting rocky areas and shrubland gaps. It is a biennial to perennial monocarpic herb, producing from a few to several hundred flowers on a variable number of reproductive stalks. Flowers are hermaphroditic, slightly protandrous, with four bright purple petals and a tetradynamous androecium (four long and two short stamens) (Blanca et al. 1992; Blanca et al. 2009). Like other Erysimum species (Gómez 2005b), E. popovii is partially self-compatible, but requires pollen vectors for full seed set (Author's unpublished data). The study was conducted in 21 Erysimum popovii populations located in the Granada and Jaén provinces, spanning the entire geographic range of the species (Table 1). These populations are distributed accross 6 regions (Mencal, Sierra Arana, Sierra Nevada, La Peza, Sierra de Jabalcuz, Sierra Mágina). Once field work was completed, two populations from the Mencal region (Ep01 and 31.

(32) Capítulo 1. Ep19, Table 1) were provisionally reassigned by taxonomists to the related taxon E. baeticum bastetanum. However, and because taxonomic relationships are far from being resolved in Erysimum species from SE Spain, we decided to keep these two populations in our study. Geological substrates are mainly limestone and dolomites (Vera 2004). The overall area has a characteristic Mediterranean climate type, with cool wet winters and warm dry summers. The annual average rainfall ranges between ca. 500 and 1000 mm, annual mean temperatures between 9.2 and 14.2ºC.. REPRODUCTIVE OUTPUT We measured several variables related to reproductive success: 1) Fruit set. The proportion of flowers that produced fruits, estimated in the field in 2008 and 2009 in 30 randomly-selected plants per population. 2) Seed set. The number of ripe seeds per ovule. Four ripe fruits in each of the 30 above-mentioned plants were taken to the laboratory and the number of seeds was counted under a magnifying lens. We were able to distinguish aborted seeds from unfertilized ovules because, as in many other crucifers, Erysimum aborted seeds are dark brown, with shriveled cotyledons and embryo (Gómez et al. 2010), whereas virgin ovules are creamy white, lanceolate in shape and of a far smaller size. 3) Seed weight (in mg). We weighted three samples of ten seeds per population and averaged the three weights. Reported values express weight per 100 seeds in each population. 4) Seed germination. We recorded the germination of 125 randomlyselected ripe seeds per population under laboratory conditions. Seeds were distributed in 5 pasteurized 90-mm Petri dishes (25 seeds per dish) containing a layer of small glass balls (ca. 3 mm diameter) with a filter paper disk on top. Afterwards, we added 10 ml of distilled water. To avoid mold propagation, all seeds were previously disinfected with 5% sodium hypochlorite solution for 3 minutes. Dishes were placed in a germination chamber (day/night cycle 16h/8h; temperature 16ºC/24ºC ± 2ºC). Seeds that produced a radicle protruding 1 mm or more were scored as germinating. Germination checks were conducted three 32.

(33) Plant reproduction. times per week, during 60 days. After each check, dishes were randomly shuffled within the chamber to avoid potential position effects. 5) Germination time. The time needed to reach 50% of total germination (T50, in days) (Kos & Poschlod 2010). We averaged the germination times in each of the five above-mentioned Petri dishes. Low T50 values denote high germinating speeds. 6) Seedling emergence. This parameter was determined experimentally under field conditions. At the end of winter 2009, 200 randomly selected seeds were sown per population distributed in 10 replicates of 20 seeds each. Once a month we counted the number of emerged seedlings. 7) Seedling survival. This parameter was also determined under field conditions. In November of 2009 we conducted a seed supplementation experiment. Seeds were sown in 0.25 m2 permanent quadrats, replicated 10 times across each population. The number of seeds used per replicate was 10 times the estimated seed density of each population (obtained from data on population size, fruit set and seed set in each population). We used such a high seed density to ensure a sufficient number of juveniles in spite of the low rate of seedling emergence, and to account for the aggregated seed distribution observed in natural populations of E. popovii. From December 2010 to May 2011 we counted the juveniles (pre-adult rosettes) growing in the quadrats. 8) Fecundity. We quantified fecundity as the production of juveniles per reproductive adult (n=30), and used the average as an inclusive estimate of the plant reproductive output in each population. The transition from juvenile to adult is near 1, as almost all juveniles become adults (field and greenhouse observations).. 33.

(34) Coordinates (UTM). Elevation (m a.s.l.). Population Size (reproductive individuals). Plant Density (individuals/ m2). E. popovii flowers (flowers/po pulation). Density of E. popovii flowers (flowers/m2). Density of cooccurring flowers (flowers/m2). Mean annual rainfall (mm). Mencal (Granada). 30S 0487836/ 4155063. 982. 600. 0.015. 3320. 0.85. 15.63. 493.5. Ep02. S. Arana (Granada). 30S 0451977 /4128858. 1255. 340. 0.011. 3264. 0.33. 13.49. 579.6. Ep03. S. Nevada (Granada). 30S 0456751 /4109531. 1596. 280. 0.037. 784. 0.88. 23.34. 510.2. Ep04. La Peza (Granada). 30S 0467701 /4118300. 1503. 300. 0.073. 1340. 1.30. 25.99. 577.0. Ep05. S. Jabalcuz (Jaen). 30S 0425545 /4177799. 1321. 420. 0.197. 2502. 7.79. 17.33. 725.6. Ep07. S Mágina (Jaen). 30S 0453888 /4176684. 2000. 500. 0.135. 2517. 2.68. 31.81. 549.6. Ep08. S. Jabalcuz (Jaen). 30S 0425519 4177931. 1324. 400. 0.173. 1323. 4.31. 7.74. 726.7. Ep09. La Peza (Granada). 30S 0472834 4119460. 1693. 130. 0.085. 637. 2.18. 16.55. 609.1. Ep10. S. Jabalcuz (Jaen). 30S 0424122 4177754. 1060. 450. 0.064. 5430. 3.94. 19.28. 737.3. Ep13. S. Arana (Granada). 30S 0454337 4131901. 1738. 370. 0.087. 2676. 2.73. 228.36. 642.4. Ep14. S. Jabalcuz (Jaen). 30S 0426894 4180210. 970. 120. 0.025. 1436. 2.19. 8.82. 689.0. Ep15. S. Jabalcuz (Jaen). 30S 0425148 4179387. 1080. 650. 0.062. 8060. 4.51. 6.13. 648.0. Ep16. S. Jabalcuz (Jaen). 30S 0425152 4179487. 1060. 150. 0.038. 1965. 2.01. 1.97. 640.5. Ep19. Mencal (Granada). 30S 0483826 4151106. 1188. 420. 0.246. 1470. 6.84. 16.21. 496.7. Ep20. S. Arana (Granada). 30S 0451048 4130531. 1270. 350. 0.069. 1435. 2.26. 30.63. 640.6. Ep21. S. Arana (Granada). 30S 0452839 4131133. 1498. 280. 0.113. 1820. 4.35. 24.47. 675.5. Ep22. S. Arana (Granada). 30S 0453676 4128236. 1380. 620. 0.069. 3968. 2.32. 66.38. 569.7. Ep23. La Peza (Granada). 30S 0472949 4119278. 1720. 750. 0.556. 5650. 18.56. 28.23. 602.6. Ep27. S. Nevada (Granada). 30S 0457430 4109448. 1486. 340. 0.176. 1530. 3.22. 23.56. 540.6. Ep28. S Mágina (Jaen). 30S 0455789 4176686. 1661. 1650. 0.193. 5775. 5.42. 61.62. 559.4. Ep30. S Mágina (Jaen). 30S 0453436 4176812. 1898. 2050. 0.133. 13598. 2.03. 30.47. 582.7. Population Code. Region (Province). Ep01. TABLE 1. Location and characteristics of the 21 E. popovii study populations..

(35) Plant reproduction. POLLINATOR ASSEMBLAGES In the springs of 2008 and 2009 we recorded the identity and abundance of pollinators visiting the flowers of E. popovii in each population. Surveys were carried out from 11:00 am to 17:00 pm (GMT +2) on several days throughout the flowering period. Observations were done on groups of plants comprising about 100 flowers. Total survey time per population ranged between 190 and 795 minutes, depending on pollinator abundance. We tried to reach a minimum of 200 pollinators per population, a sampling effort adequate to describe pollinator assemblages in other Erysimum species (Gómez et al. 2007, 2014). We only recorded those insects contacting the sexual parts of the flower, thus acting as legitimate pollinators. We observed a total of 5,169 insects, ranging from 193 to 331 per population. Specimens (n=486) of most morphospecies were captured for later identification in the laboratory. We estimated pollinator diversity using the Hurlbert's PIE index, which measures the probability that two randomly sampled individuals from the community belong to different species. This index was computed using EcoSim 7 (Gotelli & Entsminger 2009). In addition, we quantified the visitation rate, measured as the number of visits per hour of survey, of four pollinator functional groups (following Gómez et al. 2007, 2008): 1) Large bees: > 10 mm in body length; 2) Small bees: < 10 mm in body length; 3) Beeflies: long-tongued Bombyliidae; 4) Low Quality pollinators: including ants, beetles, hoverflies and other minor groups previously shown to have low pollinating efficiency on Erysimum (Fernández and Gómez 2012).. PLANT POPULATION CHARACTERISTICS We characterized each E. popovii population with the following variables: 1) Population size. Number of reproductive individuals; 2) Population density. Number of individuals per square meter; 3) E. popovii flowers. Estimated number of E. popovii flowers per population, based on 30 randomly-selected 35.

(36) Capítulo 1. plants per population; 4) Co-occurring flower density, measured along three transects of 10 x 2 meters in each population, in which we counted the number of flowers of all species blooming at the same time as E. popovii; and 5) Mean annual rainfall (in mm), obtained from the Digital Climatic Atlas of the Iberian Peninsula (Ninyerola et al. 2005).. DATA ANALYSIS We used Markov chain Monte Carlo Multivariate Generalised Linear Mixed Models to test for differences among populations and regions in plant reproductive output (MCMCglmm package, R Development Core Team 2008). We tested each variable related to reproductive output separately. Fruit set, seed set, germination and seedling emergence and survival were fitted to binomial distributions, whereas germination time and seed weight were fitted to Gaussian distributions. We built three models for each reproductive output variable: a first model including only Region as fixed factor, a second model including Population nested into Region as random factor, and a third model including both Population and Region as independent variables. Then, we compared the three models using the deviance information criterion (DIC), and selected the model with lowest DIC value (Hadfield 2010). DIC is a Bayesian analogue of AIC, with a similar justification but wider applicability (Spiegelhalter et al. 2002). Each model was iterated 50000 times. We tested for spatial structure in our dataset. We explored the spatial autocorrelation of the variables with Moran’s I coefficient. This coefficient measures whether the values of close populations are more similar than expected by chance (Rangel et al. 2010). The number of distance classes was established by the default function of the software SAM v. 4.0 (Rangel et al. 2010) and the significance test was based on 200 permutations. The relationship between E. popovii reproductive output, pollinator assemblage, and population characteristics was explored with a set of models 36.

(37) Plant reproduction. including all possible combinations of independent variables. Since some independent and dependent variables were spatially autocorrelated (Appendices A and B), all models were spatially-explicit. Prior to running these models, we checked for multicollinearity by performing pairwise Pearson correlations amongst variables. Since no strong correlation appeared between variables (Appendices C, D and E), we included all independent variables in the models. We ran two regression models for each reproductive output estimate, one including five pollinator variables (pollinator diversity, and visitation rate of the four above-mentioned pollinator functional groups), and the other including five population variables (population size, population density, abundance of E. popovii flowers, density of flowers of co-occurring species, and annual rainfall). All these analyses were performed with SAM v. 4.0 (Rangel et al. 2010).. RESULTS REPRODUCTIVE OUTPUT Most reproductive output variables varied widely among populations (Table 2; Appendix F). Number of flowers per individual ranged between 15.2 and 79.5 (mean±SD: 37.6±17.9) (Appendix F). In all populations, more than 50% of the flowers produced fruits (fruit set range: 0.50-0.74, mean±SD: 0.67±0.14) (Table 2). The number of ovules per flower ranged between 12 and 39 (Appendix F). Of these, 2.5% aborted, 23.5% were not fertilized, and the rest (74% seed set) produced seeds. Seed set ranged between 61 and 83% (Table 2). Seed weight per 100 seeds ranged between 0.29 and 0.73 gr (mean±SD: 0.5±0.1) (Table 2).. 37.

(38) Fruit set. Seed set. Germination success. Seedling emergence. Seedling survival. Seed weight (mg/100seeds). Germination time (T50). Fecundity. Ep01. 0.671±0.11. 0.781±0.13. 0.824±0.16. 0.170±0.22. 0. 0.333±0.042. 4.904±0.032. 0.00. Ep02. 0.642±0.14. 0.759±0.11. -. 0.050±0.06. -. -. -. -. Ep03. 0.711±0.08. 0.800±0.18. 0.840±0.07. 0.340±0.16. 0.011. 0.400±0.02. 4.920±0.07. 1.69. Ep04. 0.702±0.12. 0.831±0.09. 0.896±0.12. 0.315±0.13. 0.156. 0.403±0.02. 4.819±0.01. 9.38. Ep05. 0.692±0.11. 0.783±0.20. 0.779±0.16. 0.105±0.06. 0.007. 0.573±0.09. 5.744±0.40. 0.27. Ep07. 0.661±0.16. 0.625±0.18. 0.928±0.07. 0.100±0.1. 0.043. 0.733±0.07. 4.850±0.02. 0.23. Ep08. 0.649±0.14. 0.815±0.09. 0.576±0.19. 0.045±0.05. 0.052. 0.387±0.015. 5.962±0.39. 0.71. Ep09. 0.723±0.27. 0.808±0.07. 0.815±0.09. 0.045±0.05. 0.174. 0.481±0.07. 4.950±0.04. 2.22. Ep10. 0.684±0.09. 0.684±0.16. 0.824±0.10. 0.105±0.14. 0.028. 0.637±0.10. 5.161±0.08. 1.33. Ep13. 0.500±0.12. 0.725±0.19. 0.838±0.08. -. 0.338. 0.563±0.08. 9.303±0.41. -. Ep14. 0.720±0.11. 0.692±0.14. 0.960±0.05. 0.225±0.10. 0.007. 0.547±0.15. 5.931±0.88. 1.78. Ep15. 0.721±0.07. 0.819±0.10. 0.564±0.15. 0.130±0.10. 0.009. 0.487±0.18. 5.261±0.15. 1.24. Ep16. 0.687±0.10. 0.697±0.17. 0.687±0.08. 0.260±0.13. 0.042. 0.369±0.06. 5.453±0.42. 6.39. Ep19. 0.671±0.13. 0.701±0.13. 0.824±0.08. 0.105±0.10. 0.004. 0.360±0.05. 5.449±0.13. 0.13. Ep20. 0.739±0.09. 0.676±0.16. 0.904±0.09. 0.206±0.13. 0.037. 0.623±0.11. 5.614±0.44. 2.49. Ep21. 0.658±0.10. 0.766±0.13. 0.976±0.04. 0.115±0.10. 0.023. 0.523±0.01. 4.892±0.05. 1.02. Ep22. 0.550±0.19. 0.607±0.18. -. 0.110±0.09. -. -. -. -. Ep23. 0.632±0.12. 0.786±0.10. 0.666±0.12. 0.175±0.12. 0.005. 0.347±0.03. 5.123±0.17. 0.24. Ep27. 0.635±0.09. 0.731±0.13. 0.792±0.16. 0.255±0.14. 0.002. 0.290±0.06. 5.033±0.09. 0.13. Ep28. 0.742±0.09. 0.767±0.20. 0.792±0.10. 0.089±0.07. 0.018. 0.520±0.04. 5.911±0.22. 0.46. Ep30. 0.695±0.13. -. 0.952±0.02. 0.155±0.11. 0.030. 0.537±0.06. 4.851±0.03. 0.60. Total. 0.67±0.14. 0.74±0.16. 0.81±0.15. 0.15±0.14. 0.058±0.02. 0.480±0.13. 5.481±0.23. 1.68±0.57. Population. TABLE 2. Transition Probabilities of the reproductive output of the 21 Erysimum popovii study populations..

(39) Plant reproduction. Germination success in the laboratory was very high (mean±SD: 0.81±0.15), but again varied widely across populations (range: 0.56-0.98) (Table 2). Germination time (T50), was approximately 5-6 days in all populations except Ep13 (9 days, Table 2). Seedling emergence in the field was much lower, ranging between 0% and 34% (mean±SD: 14.7%±14.0%) (Table 2), so that seedling production per individual ranged between 5 and 240 (mean±SD: 68.2±72.2) (Appendix F). In addition, seedling survival was low (mean±SD: 0.06±0.02, range: 0-0.34), so that overall fecundity (number of surviving juveniles per reproductive adult was as low as 1.7±0.6) (Table 2). Importantly, fecundity ranged from 0 (no recruitment) to 9.4 (Table 2). On average, only 1.7 of the 839 ovules produced per individual plant resulted into a juvenile with chances of reproducing (Fig. 1).. FIGURE 1: Reproductive output (mean ±SE per individual plant) throughout the reproductive cycle of E. popovii.. 39.

(40) Capítulo 1. There were some significant correlations between reproductive output variables. Fruit set was negatively correlated with germination time in the laboratory (r=-0.663, p=0.003), and seed set was negatively correlated with seed weight (r=-0.513, p=0.029) (Appendix E). Seedling emergence was correlated positively with number of seedlings per plant (r=0.566, p=0.014), and negatively with germination time in the laboratory (r=-0.470, p=0.049) (Appendix E). Differences across populations were significant for all reproductive variables, but we found no differences among regions (Table 3). Four of the eight reproductive variables measured showed spatial autocorrelation at one scale or another (Appendix A). Model A (region fixed) Fruit set Seed set Seed weight Germination success Germination time (T50) Seedling emergence. 27267.61 13698.88 -87.61 2035.95 -426.38 3144.87. Model B (population random). 27233.89 13681.11 -106.94 2024.19 -489.87 3128.42. Model C (region fixed, population random). 27234.56 13680.85 -102.70 2023.97 -489.45 3127.24. TABLE 3. DIC values of models relating several variables of reproductive success to factors population and region. We ran 50000 replicates per model with Markov chain Monte Carlo Sampler.. EFFECT OF POLLINATORS We recorded 166 insect species visiting the flowers of Erysimum popovii in the 21 populations. This assemblage was taxonomically diverse, composed of insects belonging to different functional groups, although large bees and beeflies were the most frequent pollinators, representing 25.9% and 27.6% of the total flower visits, respectively. Pollinator composition varied widely across populations. The number of species recorded per population ranged between 11 and 32, and their diversity (Hurlbert’s PIE index), between 0.62 and 0.94 (Appendix G). Large bee visitation ranged between 0.8 and 44.7 visits/hr, and beefly visitation between 0 and 48.2 visits/hr.. 40.

(41) Fruit set Coeff ± SE. Seed set. t. p value. Coeff ± SE. t. Germination success p value. Coeff ± SE. t. Seedling emergence. p value. Coeff ± SE. t. Seedling suvival. p value. Coeff ± SE. t. p value. Pollinator variables Pollinator diversity (Hurlbert’s PIE). 0.017±0.28. 0.06. 0.953. 0.32±0.88. 0.36. 0.722. -0.54±1.35. -0.40. 0.694. 0.634±0.37. 1.68. 0.114. -0.166 ± 0.25. -0.661. 0.522. Large bee visitation rate (visits/hour). <0.001±0.001. 0.46. 0.654. 0.004±0.006. 0.62. 0.545. 0.005±0.01. 0.54. 0.593. 0.003 ± 0.003. 1.30. 0.214. 0.001 ±0.002. 0.715. 0.49. Small bee visitation rate (visits/hour). 0.002±0.003. 0.55. 0.588. -0.007±0.01. -0.67. 0.512. -0.008±0.01. -0.48. 0.637. -0.004±0.004. -0.92. 0.371. <0.001 ±0.003. -0.095. 0.926. Beefly visitation rate (visits/hour). <0.001±0.001. -0.81. 0.429. -0.004±0.004. -1.05. 0.308. 0.002±0.005. 0.41. 0.685. 0.004±0.002. 2.83. 0.013. -0.001 ±<.001. -1.119. 0.287. Low-quality pollinator visitation rate (visits/hour). -0.005±0.002. -2.17. 0.047. -0.011±0.01. -1.68. 0.114. 0.011±0.01. 1.08. 0.297. -0.001±0.003. -0.41. 0.685. <0.001 ±0.003. 0.035. 0.973. <0.001±<0.001. 7.02. 0.061. <0.001±<0.001. -0.79. 0.44. <0.001±<0.001. 0.908. 0.379. <0.001±<0.001. -0.40. 0.693. <0.001 ± <0.001. -0.217. 0.832. -0.11±0.083. -1.37. 0.193. 0.27 ± 0.26. 1.05. 0.308. 0.084± 0.58. 0.14. 0.888. -0.053 ± 0.17. -0.29. 0.769. -0.08 ±0.113. -0.706. 0.495. E. popovii flowers (flowers/population). <0.001±<0.001. -1.48. 0.16. <0.001 <0.001. -1.35. 0.196. <0.001±<0.001. -0.93. 0.368. <0.001±<0.001. 0.08. 0.938. <0.001 ±<0.001. -0.135. 0.895. Density of cooccurring flowers (flowers/m2). <0.001±<0.001. -4.61. <0.001. <0.001±<0.001. -0.06. 0.948. <0.001±<0.001. -0.06. 0.951. <0.001±<0.001. -1.63. 0.124. <0.001 ±0.002. 0.427. 0.678. Mean annual rainfall (l/m2). <0.001±<0.001. 0.98. 0.343. <0.001±<0.001. 0.215. 0.833. <0.001±<0.001. 0.61. 0.552. <0.001±<0.001. -1.37. 0.192. <0.001 ±<0.001. 0.202. 0.844. Population variables Population size (reproductive individuals) Population density (individuals /m2). TABLE 4: Coefficient, standard error, t and p values of spatially-explicit models relating several variables of reproductive success with pollinator and population variables separately..

(42) Capítulo 1. The abundance of low-quality pollinators was negatively related to fruit set and positively related to germination time (Tables 4 and 5). That is, populations with more low-quality pollinators produced fewer fruits and had slow germination rates. In addition, the abundance of beeflies was positively correlated with seedling emergence (Table 4). Most pollinator variables showed significant spatial autocorrelation at different scales (Appendix B).. EFFECT OF POPULATION CHARACTERISTICS Population variables also varied widely across populations. Population size ranged between 120 and 2050 plants and density of E. popovii between 0.01 and 0.56 individuals/m2 (Table 1). E. popovii flower density (3.84±3.88 flowers/m2, range: 0.33-18.6) was much lower than that of other, co-occurring plants (33.24±47.44 flowers/m2, range: 6.1-228.4) (Table 1). Annual rainfall ranged between 493 and 737 mm (Table 1). Only the density of co-occurring flowers showed a significant correlation with reproductive output. E. popovii plants growing in sites with high density of co-occurring flowers produced fewer fruits (Table 5). No significant effects on fecundity were found. As with pollinator variables, most populational variables showed significant spatial autocorrelation at different scales (Appendix B), thus creating a complex geographic mosaic of biotic interactions and abiotic conditions.. 42.