Proteasas
Bioquímica de Proteínas
2017
Reacción no catalizada
• La reacción no catalizada consiste en un ataque nucleofílico por el átomo de O del H2O sobre el carbono carbonílico del enlace peptídico formando un intermediario tetraédrico.
• El carácter parcial de doble enlace del enlace peptídico hace que el carbono carbonílico sea mucho menos reactivo que los carbonos carbonílicos en los ésteres.
• La tarea catalítica de las proteasas consiste en transformar al carbono carbonílico, normalmente no reactivo, en mucho más susceptible al ataque nucleofílico por el agua.
FUNCIONES DE LAS PROTEINASAS.
1) Función digestiva.
a) Extracelular.
b) Intracelular.
2) Turnover proteico.
3) Procesamiento post-traduccional de proteínas.
a) Proteasas del péptido señal.
b) Proteasas de procesamiento de pro-Hormonas
y otras proteínas.
c) Dominio pro- en muchas proteinasas.
Proteasas: Endo y exo
•Las
endopeptidasas
hidrolizan
uniones
peptídicas
internas
en
una
cadena
polipeptídica, tendiendo a actuar lejos del
N-terminal o del C-N-terminal.
•Las
exopeptidasas
requieren
un
amino
terminal, un carboxilo terminal, o ambos, libres,
e hidrolizan una unión peptídica a no mas de
tres residuos desde el N terminal o del C
terminal.
Según el extremo que cortan, serán
aminopeptidasas o carboxipeptidasas.
Clasificación de Proteasas
• Por la reacción catalizada: son pocos los casos en
que se conoce exactamente la reacción catalizada,
en términos de qué unión es hidrolizada en el
substrato. Se aplica sobre todo a exopeptidasas.
• Por el mecanismo catalítico: es la más usada,
desde su propuesta por Brian Hartley hace más de
50 años. Se basa en cuáles son los grupos que
intervienen en la catálisis y en cómo actúan.
• Por su secuencia y estructura: es la clasificación
más moderna, propuesta por Alan Barrett, y
complementa a la anterior.
Exopeptidasas: clasificación por el tipo
de reacción catalizada
• Aminopeptidase: liberates a single aa residue from
the unblocked N-t of its substrate
• Dipeptidyl-peptidase: hydrolyses an N-t dipeptide
from its substrate
• Tripeptidyl-peptidase: hydrolyses a tripeptide from
the N-t of its substrate
• Carboxypeptidase: hydrolyses a single residue from
the unblocked C-t of its substrate
• Peptidyl-dipeptidase: hydrolyses a dipeptide from the
C-t of its substrate
• Dipeptidase: hydrolyses a dipeptide, and typically
requires that both termini be free
• Omega-peptidases: have no requirement for a free N-t
or C-t in the substrate. They often act close to one terminus or the other. Some hydrolyse peptide bonds that are not alpha-bonds. Examples: ub hydrolases, pyroglutamyl peptidases and gamma-glutamyl
Exopeptidasas: clasificación por el tipo
de reacción catalizada
Endopeptidasas: clasificación por el tipo
de reacción catalizada
• Pueden ser denominadas en base a la preferencia
por un determinado residuo en P1 o en P1´ (por
ejemplo,
glicil-endopeptidasa;
peptidil-lisil
endopeptidasa). Si hay varias enzimas con igual
especificidad,
hay
que
distinguirlas
(glutamil
endopeptidasas I y II).
• En la gran mayoría de los casos, la especificidad es
demasiado compleja, y se usan nombres triviales
(pepsina,
tripsina,
quimotripsina,
papaína,
termolisina)
Proteasas: Clases mecanísticas
9Aspartil proteasas
Cisteín proteasas
Serín Proteasas
Metaloproteasas
Treonin proteasas
Asn proteasas
Asp/AsnGlu proteasas
Glu/GlnProteasas: Clasificación por
relación evolutiva
• Propuesta en 1993 por Alan J. Barrett y N.D. Rawlings (Cambridge, UK). Comparación de secuencias proteicas y clasificación en:
• Familias, cuyos miembros derivarían de una misma proteína ancestral por evolución divergente. Tienen homología estadísticamente significativa, al menos en el dominio catalítico (es decir, en el que tiene actividad de proteasa).
• Clanes, grupos de familias con una proteína ancestral común. La homología de secuencia entre ellas es mucho más baja, pero se conservan el orden lineal de los residuos del sitio activo y los pequeños grupos de residuos que los rodean; además, tienen una estructura terciaria similar.
• La información, que se mantiene actualizada, está contenida en la base de datos MEROPS (merops.sanger.ac.uk). Se complementa con la nomenclatura de enzimas de la IUBMB (peptidasas, EC 3.4; la cruzipaína es EC 3.4.22.51 y C01.075 en MEROPS).
11 Al 4/5/2017: 5 clanes A, 10 C, 2 G, 15 M, 5 N, 5 P y 12 S. 16 familias A, 71 C, 2 G, 72 M, 7 N, 44 P (incluyen 4 familias T), 36 S y desconocidas 10.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA.
1.SUSTRATOS PROTEICOS.
1) Proteínas naturales como sustratos generales (hemoglobina, caseína) a) Precipitación de proteína no digerida y determinación de A280 nm
en el sobrenadante.
b) Precipitación y reacción de Folin en el sobrenadante.
2) Derivados cromogénicos de proteínas naturales (azocaseína, azoalbúmina) Precipitación y lectura de la A440 nm de los azopéptidos.
3) Derivados fluorogénicos de proteínas naturales: Caseína ligada a isotiocianato de fluoresceína (FITC-caseína). Excitación a 490 nm y emisión a 525 nm.
4) Proteínas específicas.
a)Colágenos para colagenasas.
b) Pre-proteínas radioactivas (sintetizadas por traducción in vitro de su mRNA), para las proteinasas del péptido señal.
5) Proteínas naturales marcadas con radioisótopos (125I en Tyr).
Precipitación y determinación de radioactividad en el sobrenadante.
6) Separación de fragmentos grandes después de proteólisis limitada. a) HPLC en fase reversa.
b) SDS-PAGE.
c) Filtración por gel.
7) Determinaciónes en fase sólida (proteinasa, o sustrato, o ambos, inmovilizados).
a) Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Actividad determinada in situ después de la electroforesis. - Métodos histoquímicos: b-naftilamidas y Fast Garnet.
- Proteína copolimerizada: Gelatina, fibrinógeno. Gel lavado para eliminar el SDS, incubado al pH adecuado, teñido con Coomassie Blue. Actividad detectada como zonas incoloras sobre fondo azul.
b) Ensayos de ELISA
Determinación de colagenasa. Ab anti-colágeno, revelado con Ab contra la IgG usada conteniendo un cromóforo adecuado.
2. SUSTRATOS SINTETICOS:
Péptidos cromogénicos o fluorogénicos.
a)
Sustratos de endopeptidasas (sin amino ni
carboxilo libres). Bz-L-Arg-NHNan, 400 nm.
b) Sustratos de aminopeptidasas (sólo el carboxilo
bloqueado). L-Arg-NHNan, 400 nm.
c)
Sustratos de carboxipeptidasas (sólo el amino
bloqueado).
{N-(3-[2-furyl]acryloyl)}-Ala-Lys
(FA-Ala-Lys), 340 nm.
Grupos bloqueantes del amino:
Benzoil (Bz);
Benzoiloxicarbonil (Z);
O-Aminobenzoil
(Abz); Acetil (Ac); Succinil (Suc); Furil-acrilol (FA).
Ensayos espectrofotométricos:
a) 4-nitroanilidas (NH-Nan):
Derivados N-acilados de la 4-nitroanilina. La A
400 nmdifiere en
aprox.10.000 M
-1cm
-1entre las 4-nitroanilidas y la 4-nitroanilina
a pH 8.0.
Utilizables en determinaciones espectrofotométricas continuas.
b) 2-naftilamidas (NH-Nap):
La 2-naftilamina tiene su máximo de absorción a 340 nm, y difiere
de las 2-naftilamidas en aprox. 1.700 M
-1cm
-1. Esto depende del
pH: por debajo de 5.5 no hay diferencia.
Se puede aumentar la sensibilidad por diazotación de la naftilamina
libre con N(1-naftil) etilendiamina diclorhidrato, o por reacción con
una sal de diazonio estable, el Fast Garnet, que da un producto
insoluble (requiere un detergente para mantenerse en solución).
c) Amidas y ésteres:
La hidrólisis de amidas puede seguirse a 230 nm, o siguiendo
la liberación de aminoácidos con ninhidrina. Baja sensibilidad.
Ensayos fluorimétricos:
a) 2-naftilamidas:
3 ordenes de magnitud más sensible que la diazotación.
Sensible al pH. Excitación a 335 nm y emisión de 410 nm.
b) 7-amino-4-metil cumarilamidas (NH-Mec):
Fluoróforo libre, 500 a 700 veces más fluorescente que el
conjugado. Excitación a 380 nm, emisión a 460 nm.
c) Sustratos fluorogénicos
“apagados“ intramolecularmente
(“quenching”):
Abz-gly-Phe(NO
2)-Pro (sustrato de ACE).
La proteólisis
libera Abz-Gly, fluorescente. Excitación a 310 nm, emisión a
410 nm.
Nomenclatura de Schechter y Berger (1967)
La tríada catalítica
20
Mecanismo de reacción
Uniones que intervienen en la estabilización del intermediario
tetraédrico.
Especificidad de sustrato: el subsitio S1
Subtilisina:
una proteasa bacteriana
• No apparent evolutionary relationshipto mammalian chymotrypsin/trypsin family (no primary structure or tertiary structural resemblance)
• Same catalytic mechanism as mammalian serine proteases: a catalytic Ser assisted by a His and an Asp residue (catalytic triad), in same orientation, and an oxyanion hole to stabilize oxyanion intermediates (transition states)
• Example of convergent evolution: independent evolution of same catalytic strategy
• Chymotrypsin mechanism must be a
very effective hydrolytic mechanism!)
Activación del tripsinógeno
• A variety of digestive proteases are synthesized in the pancreas as inactive
proenzymes, so that they don’t start to attack the cells that make them. Digestive proenzymes are stored in the pancreatic cells as secretory granules, and empty into the duodenum via the pancreatic duct.
• Trypsinogen is activated by proteolytic cleavage (hydrolysis) of the peptide bond
between Lys 6 and Ile 7. The oligopeptide with the first 6 amino acids is lost and Ile 7 becomes the new N-terminal. The positive charge associated with the N-terminal is now in a new position -> correct organization of the catalytic site
• The reaction that activates trypsinogen is induced by the protease enteropeptidase, which is a membrane protein exposed on the external surface of the mucosal cells that line the duodenum. Enteropeptidase is specific for the sequence Lys-Ile found in trypsinogen. The quantity of enteropeptidase present is very small, and may only activate a small fraction of the total trypsinogen.
La tripsina es el activador común de las
proenzimas pancreáticas
31R
I
I
K
Inhibidores de emergencia
• Trauma to the internal organs that damages the pancreas can cause pancreatitis,
an unpleasant and painful condition in which traces of trypsin leak out and attack cells, activating their stored zymogen granules. The result is an escalating tendency of the pancreas to digest itself and surrounding organs.
• To prevent premature activation of trypsinogen, pancreas also produces small
amounts of secretory pancreatic trypsin inhibitor. This is a small protein that exposes a substrate-like loop that is attacked by trypsin. However,the inhibitor is designed to bind trypsin extremely tightly(Ki=10–13 M),so the reaction product is not released easily and continues to occupy the catalytic site. There is enough inhibitor to control any traces of trypsin that might develop accidentally, and prevent it from triggering the activation of the remaining trypsinogen while still in the pancreas. Once the trypsinogen is secreted into the duodenum, enteropeptidase can make enough trypsin to overcome the trace of inhibitor, and self activation can proceed.
SERPINAS
• SERPINS: Serine proteinase inhibitors.
• Representan la familia de inhibidores más grande y funcionalmente
más diversa (aprox. 1500 secuencias de serpinas se han identificado en los 5 reinos, 36 genes en humanos, 60 en ratones).
• Proteínas en general monoméricas, MW 40-100 kDa. Incluyen
proteínas como: α1-antitripsina, α1-antiquimotripsina, antitrombina
III, cofactor II de la heparina, inhibidor de C1, α2-antiplasmina,
inhibidores I y II del activador del plasminógeno, inhibidor de la proteína C, y proteasa nexina-1.
• Tienen una estructura secundaria conservada con un loop reactivo
(RCL) que interacciona con el sitio activo de la proteasa inhibiéndola.
• En muchos casos se forma un complejo tetraédrico con el inhibidor, que es clivado por la proteinasa y se forman complejos covalentes. Las serpinas clivadas tienen estructuras conformacionalmente mas estables que las
nativas. El clivaje induce un cambio conformacional mayor, y los dos residuos que formaban la unión reactiva quedan en
Serpinas asociadas con enfermedades
en humanos
• La Alfa 1-antitripsina protege a los tejidos de las
proteasas presentes principalmente en las células
inflamatorias, en especial la elastasa. La deficiencia
de alfa-1 antitripsina (trastorno hereditario) lleva a
una degradación tisular durante la inflamación. Esto
causa enfisema pulmonar y lleva a la cirrosis
hepática en casos severos.
• La deficiencia de antitrombina es una enfermedad
genética rara que generalmente sale a la luz cuando
el paciente sufre trombosis venosas recurrentes y
embolismo pulmonar
Ovomucoide:
Inhibidor tipo
Kazal
Inhibidores de serín peptidasas
• Diisopropyl fluorophosphate (DIPF).
• Mimic tetrahedral intermediate/transition
state.
It combines with the amino acid serine at the active site of the enzyme acetylcholinesterase, an enzyme that deactivates the neurotransmitter acetylcholine. If the enzyme is inhibited, acetylcholine accumulates and nerve impulses cannot be stopped, causing prolonged muscle contraction. Paralysis occurs and death may result since the respiratory muscles are affected.
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