INFECCIÓN POR BONAMIA OSTREAE

C A P Í T U L O 2 . 2 . 1 .

I N F E C C I Ó N P O R B O N A M I A O S T R E A E

1. D

A efectos de este capítulo, la infección por Bonamia ostreae se considera como bonamiosis.

2. I

a) Factores del agente

• Agente etiológico: Bonamia ostreae, no se han identificado cepas. • Supervivencia fuera del hospedador: se desconoce en la actualidad.

• Estabilidad del agente: se ha demostrado que el ácido peracético (0,001% y 0,005%) reduce la

contaminación de las ostras con B. ostreae (32).

• Ciclo biológico: se desconoce el ciclo biológico fuera del hospedador, pero es posible la

transmisión del parásito directamente de hospedador a hospedador por cohabitación o por inoculación de parásitos purificados. (1, 35, 51).

b) Factores del hospedador

• Especies hospedadoras susceptibles:

• Hospedador natural: las ostras planas europeas, Ostrea edulis.

• Especies de ostras que se infectan al transportarse a zonas endémicas: Ostrea puelchana, O. angasi, O. chilensis (=Tiostrea chilensis, T. lutaria) (7, 10, 33, 49).

• Se sospecha que Ostrea conchaphila (=O. lurida), Crassostrea angulata y C. ariakensis (= C. rivularis) pueden ser infectadas por B. ostreae (19, 29, 37), pero esto no ha sido

confirmado.

• Fases susceptibles del hospedador: las huevas y sobre todo las ostras adultas; aparentemente

los individuos de más de 2 años de edad son más susceptibles a la enfermedad (3, 26, 32, 52).

• Especies y subpoblaciones más susceptibles: Ostrea edulis es la única especie natural susceptible

que se conoce, la infección y la mortalidad aumentan con la edad y/o el tamaño de las ostras (12, 26, 32).

• Órganos y tejidos infectados: Bonamia ostreae es un protozoo intrahemocítico (21, 50) aunque

puede ubicarse extracelularmente entre células epiteliales o intersticiales de las branquias y el estómago, o en áreas de tejido conjuntivo necrótico (3). Se ha informado de la localización intraepitelial en las branquias (46). En una descripción polémica se mencionó la presencia del parásito en el tejido ovárico (56). La infección avanzada se convierte en sistémica (20).

• Infección persistente y portadores asintomáticos: a menudo, la infección es letal dependiendo

de las condiciones medioambientales del hospedador.

• Vectores: no se requieren. c) Patrón de la enfermedad

• Mecanismo de transmisión: es posible la transmisión directa de hospedador a hospedador (1,

51). La forma de infección así como el ingreso y la eliminación del agente aún no se han determinados. Generalmente se observa un período de al menos 3 meses antes de la detección del parásito en lotes libres de infección trasladados a zonas infectadas (45, 54).

• Prevalencia: variable (de 0% a 80%). La prevalencia es mayor en los individuos de más de dos

años de edad. La enfermedad ocurre y puede transmitirse a lo largo del año, pero existe variación estacional de la infección por B. ostreae: la prevalencia y la intensidad de la infección tienden a aumentar durante la estación templada con picos en otoño (26, 32, 44, 57).

• Distribución geográfica: Europa (Francia, Irlanda, Italia, Holanda, España y el Reino Unido,

excepto Escocia) (11, 21, 41, 44, 50, 55), Canadá (British Columbia) y los Estados Unidos de América (los estados de California, Maine y Washington) (4, 28, 30, 31, 37).

• Mortalidad y morbilidad: la infección es frecuentemente letal, y la muerte normalmente ocurre

cuando la infección es más aguda (9).

• Impacto económico y/o productivo de la enfermedad: Bonamia ostreae, en combinación con

epizootias anteriores causadas por Marteilia refringens, produjo una drástica caída en la producción francesa de Ostrea edulis desde 20.000 toneladas/año en los setenta hasta 1.800 toneladas/año en 1995 (33, 42). Bonamia ostreae también ha tenido un significativo impacto negativo en la producción de O. edulis en toda su zona de distribución en Europa.

d) Control y prevención • Vacunación: ninguna.

• Quimioterapia: ninguna. • Inmunoestimulación: ninguna.

• Producción de resistentes: Se ha demostrado que la cría selectiva es efectiva en la reducción de

la susceptibilidad y la mortalidad causada por B. ostreae (5, 6, 23, 25, 40, 47, 48).

• Repoblación con especies resistentes: inexistente. • Agentes bloqueadores: ninguno.

• Prácticas generales de manejo: la mortalidad por bonamiosis puede reducirse utilizando cultivo

en suspensión (38), menor densidad de repoblación (34) o mediante el cultivo de Ostrea edulis con Crassostrea gigas, que no es naturalmente susceptible a la infección (39). La siembra de ostras procedentes de criaderos es preferible a la siembra con ostras procedentes de colonias naturales, que parecen tener una cantidad de parásitos significativamente mayor (22).

3. M

a) Métodos de diagnóstico de campo

• Síntomas clínicos: ostras muertas o boqueantes. Estos signos clínicos no son patognomónicos

de la infección por B. ostreae.

b) Métodos clínicos

• Síntomas generales: a veces decoloración amarillenta, lesiones extensas que incluyen úlceras

perforadas en los tejidos conjuntivos de las branquias, el manto y la glándula digestiva (21, 53). Estas lesiones no son patognomónicas de la infección por B. ostreae y la mayor parte de las ostras infectadas tienen un aspecto normal.

• Química clínica: ninguna. • Examen microscópico

• Preparaciones montadas: ninguna. • Frotis: no existe información.

• Cortes fijados: infiltraciones densas de hemocitos, algunos de ellos con parásitos, en el

tejido conjuntivo de la branquia y el manto, y en los senos vasculares alrededor del estómago y el intestino (21).

c) Métodos de detección e identificación del agente • Métodos de detección directa

i) Métodos microscópicos • Frotis tisulares

Muestras a tomar: material ovárico, ventrículo del corazón o branquias de hospedadores adultos vivos.

Procedimiento técnico: se secan los tejidos con papel absorbente y se hacen varias improntas en portaobjetos de vidrio. Luego se secan al aire y se fijan con metanol o etanol absoluto y se tiñen utilizando un kit comercial de tinción para tinción de sangre, siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de aclarar con agua corriente y secar, se cubren los portas con cubreobjetos usando una resina adecuada. Se observan los portas primero a 200 aumentos y luego a 1.000 aumentos con inmersión en aceite. Controles positivos: recomendados y disponibles en el laboratorio de referencia de la OIE.

Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: especificidad baja, mejor sensibilidad que la que se

obtiene con el examen histológico (2, 27); sin embargo parece que la técnica de impronta del corazón no es fiable para la detección de infecciones latentes (24).

• Prueba de referencia: sensibilidad superior a la de la histología, que es la prueba de

referencia aunque no sea específica para cada especie. Interpretación de los resultados:

• La presencia de pequeños organismos esféricos u ovoides (2–5 µm de diámetro)

dentro de los hemocitos es un resultado positivo. No obstante, el parásito también puede ubicarse extracelularmente. Estos organismos muestran un citoplasma basófilo y un núcleo eosinófilo (los colores pueden variar según la tinción usada). Como se extienden sobre el portaobjetos, pueden parecer más anchos que en el examen histológico. Se pueden observar células multinucleadas (9). La técnica no es específica para la especie.

Disponibilidad de las pruebas: existen kits de tinción rápida en el mercado (ej. Hemacolor®).

• Histopatología

Muestras a tomar: ostras vivas o recién muertas.

Procedimiento técnico: se fijan cortes de tejidos, de como branquias, glándula digestiva, manto y gónadas durante 24 horas con solución de Davidson. y se procesan normalmente para histología con parafina y para tinción con, por ejemplo, hematoxilina y eosina. Se realizan observaciones con aumentos progresivos de hasta ×1.000.

Controles positivos: recomendados y disponibles en el laboratorio de referencia de la OIE.

Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: especificidad baja; sensibilidad buena para infecciones

medias o agudas, pero baja para infecciones leves.

• Prueba de referencia: la histología es la prueba de referencia y el método de vigilancia

recomendado.

Interpretación de los resultados:

• Un resultado positivo consiste en la presencia del parásito en forma de pequeñas

células de 2–5 µm de diámetro dentro de los hemocitos o en forma libre en el tejido conjuntivo o en los senos de las branquias, intestino y epitelio del manto, a menudo acompañados de una reacción inflamatoria intensa. A fin de evitar dudas, el parásito

debe observarse dentro de los hemocitos para la emisión de un diagnóstico positivo. Esta técnica no específica para la especie.

Disponibilidad de las pruebas: no hay pruebas comerciales disponibles.

• Microscopia electrónica de transmisión

Muestras a tomar: ostras vivas o recién muertas.

Procedimiento técnico: descrito en el capítulo I.2 del presente Manual de animales

acuáticos.

Controles positivos: no. Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: mejor especificidad que los frotis y la histología. La

microscopía electrónica de transmisión puede ayudar a distinguir B. ostreae de otras microcélulas estrechamente relacionadas, como B. exitiosa.

Interpretación de los resultados:

• Un resultado positivo consiste en la presencia del parásito dentro de los hemocitos.

Se ha informado de diferentes estadios que incluyen los uninucleados/ mononucleados, diplocarióticos y los plasmodios (9, 46, 50). Las estructuras intracelulares incluyen las mitocondrias, los haplosporosomas, el aparato de Golgi y los microtúbulos intranucleares persistentes.

• Las formas densas de B. ostreae son más densas, de tamaño ligeramente menor (un

diámetro medio de 2.4 ± 0,5 µm, n = 64 en comparación con B. exitiosa que tiene un diámetro medio de 3 ± 0.3 µm, n =61), tienen menos haplosporosomas, perfiles mitocondriales y cuerpos grasos por cada sección de ultraestructura, y tienen mayores mitocondrias túbulo-vesiculares que B. exitiosa. Además, las formas densas de B. ostreae carecen de Golgi unido a la membrana nuclear del apicomplejo y una fase vacuolizada (36).

Disponibilidad de las pruebas: no hay pruebas disponibles.

ii) Aislamiento e identificación del agente • Cultivo celular /medios artificiales: ninguno. • Métodos de detección del antígeno basados en anticuerpos

Se elaboró una técnica de inmunofluorescencia basada en anticuerpos monoclonales que tenía una sensibilidad similar a la del frotis tisular (8). No obstante, esa técnica produjo resultados dudosos cuando se probó extensamente con ostras de Main, EE.UU. (58). Aunque se elaboró un inmunoensayo directo de anticuerpos monoclonales en sandwich para la detección de B. ostreae en muestras de hemolinfa de O. edulis (16) y se comercializó unos pocos años a mitad de los noventa, ya no se encuentra en el mercado. La especificidad y sensibilidad de esta última prueba comparada con la histología fueron del 76,7% y 106%, respectivamente (16).

• Técnicas moleculares: reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Muestras a tomar: ostras vivas o recién muertas.

Procedimientos técnicos: se colocan muestras de tejidos en etanol al 95% o se congelan a –80°C hasta que se extraiga el ADN. La extracción de ADN se realiza por digestión con proteinasa K durante toda la noche a 50–55°C y la extracción con fenol-cloroformo y la precipitación en etanol (13, 17) o mediante el método de la columna de centrifugación utilizando kits disponibles en el mercado (ej. QIAGEN) (13).

Se han elaborado para Bonamia ostreae dos protocolos de PCR con dos pares de cebadores distintos orientados a SSU rADN:

El primer par es 5’-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3’ y 5’-GGG-GGA-TCG-AAG-ACG-ATC-AG-3’, denominados Bo y Boas respectivamente, y amplifica un producto de 300 pb (17). Las mezclas para PCR contienen tampón (500 mM de KCl, 100 mM de Tris/HCl [pH 9,0 a 25°C] y 1% Triton® _{X-100), 2,5 mM de MgCl}

2, 0,2 mM

de mezcla dNTP, 1 µM de los cebadores directo e inverso, 0,02 unidades/µl ADN polimerasa Taq, y 0,2 ng/µl de ADN molde en un volumen total de 50 µl. Se desnaturalizan las muestras con un termociclador durante 5 minutos a 94°C antes de someterlas a 30 ciclos (94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto, 72°C durante 1 minuto) y a continuación, una extensión final de 10 minutos a 72°C.

El segundo par de cebadores es CGG-GGG-CAT-AAT-TCA-GGA-AC-3’ y 5’-CCA-TCT-GCT-GGA-GAC-ACA-G-3’, denominados C_F y C_R respectivamente, y amplifica un producto de 760 pares de bases (13). Las mezclas de reacción PCR contienen tampón (200 mM de Tris/HCl [pH 8,4], 500 mM de KCl), 1,5 mM de MgCl₂, 0,2 mM de mezcla dNTP, 0,05 µM de los cebadores directo e inverso, 0,05 unidades/µl de ADN polimerasa Taq, y 1 ng/µlde ADN molde en un volumen total de 50 µl. Se someten las muestras a 35 ciclos (94°C un 1 minuto, 55°C 1 minuto, 72°C 1 minuto) siguiendo una extensión final de 10 minutos a 72°C.

Controles positivos/negativos: obligatorios. Los controles positivos consisten en el ADN purificado de células de B. ostreaes, o el ADN genómico de hospedadores con infección aguda. Los controles negativos consisten en el ADN de hospedadores sanos. Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: basándose en la similitud de las secuencias de ADN

diana, el primer ensayo debería amplificar todos los haplosporidianos de las microcélulas y el segundo al menos B. ostreae y B. exitiosa (15). La sensibilidad de ambos ensayos es más alta que la de los métodos histocitológicos.

• Prueba de referencia: no se ha validado formalmente ninguno de los dos ensayos

PCR en comparación con la histología para la detección de B. ostreae. Interpretación de los resultados:

• Un resultado positivo es un amplicón de tamaño adecuado, debiendo ser todos los

controles negativos realmente negativos y todos los controles positivos realmente positivos.

• Ninguno de los dos ensayos es específico de una especie. La secuencia del gen SSU

rADN de B. ostreae muestra polimorfismo con la de B. exitiosa o B. roughleyi por análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción, mediante digestión de los productos PCR Bo-Boas con Hae II y Bgl I. Los perfiles obtenidos varían según la especie del parásito. Bonamia ostreae y B. exitiosa presentan el mismo perfil (dos productos de 115 y 189 pares de bases) al digerirse con Hae II mientras que B. roughleyi no se digiere. El perfil de B. ostreae consiste en dos bandas de 120 y 180 pares de bases cuando se digiere con Bgl I, mientras que B. exitiosa y B. roughleyi no se digieren (18, 36).

Pruebas disponibles: no existen en el mercado.

• Técnicas moleculares: hibridación in-situ (ISH)

Muestras a tomar: ostras vivas o recién muertas.

Procedimiento técnico: se han elaborado dos protocolos de ISH. Según el primero (17), se utiliza una sonda de 300 pares de bases marcada con digoxigenina y, según el segundo, (14) se utilizan tres sondas de oligonucleótidos marcadas con fluoresceina. Todas estas sondas están orientadas al gen SSU rADN. Las muestras de tejidos se colocan en solución fijadora de Davidson durante 24 horas y luego se incluyen en parafina. Se preparan cortes de 5 µm de espesor, se colocan en portaobjetos recubiertos de silano y luego se cuecen toda la noche en un horno a 50–60°C. Una vez desparafinados, los portaobjetos se tratan con proteinasa K (100 µg/ml) en tampón TE (50 mM de Tris, 10 mM de EDTA [ácido etilendiaminotetracético]) a 37°C durante

30 minutos en el primer protocolo, o en PBS (solución salina tamponada con fosfato) (150 mM de NaCl, 12,5 mM de Na2HPO4, 3 mM de KH2PO4, pH 7,2) durante

15 minutos a 37°C en el segundo protocolo.

• En el primer protocolo, los portaobjetos se deshidratan por inmersión en una serie

de etanoles y se seca al aire. Luego se los cubre con tampón para hibridación (4 × SSC [citrato salino estándar; 60 mM de NaCi, 600 mM de NaCl, pH 7], 50% formamida, 1 × solución de Denhardt, 250 µg/ml de tARN de levadura, 10% sulfato de dextrano) que contenga 20 ng de la sonda marcada con digoxigenina. Después de 5 minutos de desnaturalización a 95°C, se efectúa la hibridación mediante incubación de los portaobjetos en una cámara húmeda durante toda la noche a 42°C. La sonda se produce por PCR usando el par de cebadores Bo y Boas descritos anteriormente con la incorporación de digoxigenina. La PCR se efectúa como se describió en la sección sobre la PCR, excepto que se añaden 25 mM de DIG dUTP a la mezcla para la reacción. La detección se efectúa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

• En el segundo protocolo, después del tratamiento con proteinasa K, los portaobjetos

se lavan en varios baños que incluyan PBS más 0,2% de glicina durante 5 minutos, se acetilan utilizando anhídrido acético al 5% en 0,1 M de trietanolamina/HCl (pH. 8) durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavan nuevamente en PBS durante 10 minutos, y, por último se equilibran en 5 × SET (750 mM de NaCl, 6,4 mM de EDTA, 100 mM de Tris Base) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se los cubre con 200 µl de tampón para prehibridación (5 × SET, 0,02% de albúmina de suero bovino, 0,025% de dodecil sulfato sódico [SDS]) durante 30 minutos a 45°C. Se reemplaza el tampón de prehibridación con 10 a 12 µl de tampón de prehibridación que contenga 2–10 ng/µlde oligonucleótidos y se incuban toda la noche en cámara húmeda a 45°C. A continuación se lavan tres veces en 0,2 × SET durante 5 minutos a 42°C, se secan al aire y se montan para su examen con microscopio de eipifluorescencia a 600–1.000 aumentos. Las sondas consisten en un cóctel de sondas marcadas con fluoresceína específico para B. ostreae: UME-BO-1 (5’-CGA-GGC-AGG-GTT-TGT-3’); UME-BO-2 (5’-GGG-TCA-AAC-TCG-TTG-AAC-3’) y UME-BO-3 (5’-CGC-TCT-TAT-CCA-CCT-AAT-3’).

Controles positivo y negativo: obligatorios. Los controles positivos son los cortes histológicos de hospedadores infectados. Los controles negativos son los cortes histológicos de hospedadores no infectados. En el segundo protocolo, un control positivo adicional consiste en el uso de un oligonucleótido que une a O. edulis y a

B. ostreae: UME-OE-385 (5’-TCA-TGC-TCC-CTC-TCC-GG-3’).

Niveles de validación:

• Especificidad y sensibilidad: la especificidad y sensibilidad son más altas que con los

análisis histológicos. Sin embargo, la sonda Bo-Boas es capaz de detectar

Haplosporidium nelsoni en Crassostrea virginica y Bonamia exitiosa en Ostrea chilensis,

pero no Mikrocytos mackini en C. gigas (17). Se ha ensayado y probado la especificidad del cóctel de oligosondas UME-BO-1, 2 y 3 frente a H. nelsoni (14), pero este ensayo de ISH probablemente detecta otras microcélulas, incluida B. exitiosa (15).

• Prueba de referencia: la ISH aún no se ha validado frente a la histología.

Interpretación de resultados:

• Un resultado positivo corresponde a los parásitos marcados dentro de los hemocitos,

siendo todos los controles negativos realmente negativos y todos los controles positivos realmente positivos. En el primer protocolo descrito, se presenta en forma de manchas oscuras, mientras que en el segundo corresponde a pequeños anillos verdes, puesto que la fluorescencia rodea a una región elíptica oscura.

Disponibilidad de las pruebas: existe un kit para la detección del ácido nucleico DIG,

Boehringer Mannheim, para el primer protocolo.

• Purificación del agente: Bonamia ostreae puede purificarse en ostras con infección aguda

• Métodos de detección indirecta

• Métodos serológicos: ninguno es aplicable.

4. V

En el cuadro 1 se ofrece una lista con los métodos de vigilancia, detección y diagnóstico de la infección por B. ostrae disponibles en la actualidad. Las denominaciones utilizadas en el cuadro indican: A = es el método recomendado por razones de disponibilidad, utilidad, así como por su especificidad y sensibilidad diagnóstica; B = es un método estándar con buena especificidad y sensibilidad diagnóstica; C = es un método aplicable en algunas situaciones, pero su coste, precisión y otros factores limitan seriamente su aplicación; D = es un método no recomendable en la actualidad. Estas denominaciones (A, B, C y D) son un tanto subjetivas puesto que están implicadan cuestiones de fiabilidad, sensibilidad, especificidad y utilidad.

Cuadro 1. Métodos de vigilancia, detección y diagnóstico de Bonamia ostreae

Vigilancia Presuntivo Método En hospedador y ámbito geográfico conocidos Fuera del hospedador y ámbito geográfico conocidos En hospedador y ámbito geográfico conocidos Fuera del hospedador y ámbito geográfico conocidos Confirmativo Síntomas generales D D D D D Frotis tisulares A B A B D Histopatología B A B A D PCR B B B B B PCR-RFLP D D D D A MET D D D D A Hibridación in-situ C C D D B

MET = microscopía eletrónica de transmisión; PCR = reacción en cadena de la polimerasa; RFLP = polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción.

5. C

a) Definición de un caso sospechoso

En especies susceptibles conocidas que se hallan dentro del ámbito geográfico conocido para

B. ostreae, un caso sospechoso de infección por B. ostreae es un resultado positivo tras la aplicación

de uno de los siguientes métodos: histopatología, frotis tisular, o PCR.

Para otras especies, o fuera de la distribución geográfica conocida de B. ostreae, un caso sospechoso es un resultado positivo por histopatología, frotis tisular, PCR., o hibridación in situ.

b) Definición de un caso confirmado

Un caso confirmado de infección por B. ostreae es un resultado positivo por frotis tisular, histología o hibridación in-situ combinado con un resultado positivo por PCR-RFLP.

6. M

/

Los métodos prescritos de vigilancia dirigida a declarar la ausencia de infección, indicados en el Código

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NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE especializado en infección por Bonamia ostreae (véase el

cuadro al final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página Web de la OIE : www.oie.int).