Ensayos predictivos de la radiosensibilidad individual en linfocitos humanos

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Ensayos predictivos de la

radiosensibilidad individual

en linfocitos humanos

Di Giorgio,

M.; Sardi, M.; Busto,

E.; Roth,

B. ; Menéndez,

P.;

Bonomi,

M.;

Vallerga, M.; Taja,

M. y Mairal,

L.

Presentado en: “VI Congreso Regional de Seguridad Radiológica y Nuclear”. Lima, Perú, 9-13 noviembre 2003

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ENSAYOS PREDICTIVOS DE LA RADIOSENSIBILIDAD INDIVIDUAL EN

LINFOCITOS HUMANOS

Di Giorgio, M.1_{; Sardi, M.}2,3_{; Busto,}_E.2_{; Roth,}_B.4_{; Menéndez,}_P.4_;_Bonomi,_M.4_;_{Vallerga, M.}1 Taja,M.1 y Mairal,L.3

1 _{Autoridad Regulatoria Nuclear} 2 _{Hospital Italiano}

3 _Mevaterapia

4 _{Instituto de Oncología “Ángel Roffo”}

Argentina

INTRODUCCIÓN

La radiosensibilidad individual es una característica inherente al sujeto individual, asociada con una reacción aumentada a las radiaciones ionizantes. Distintos endpoints biológicos tales como sobrevida clonogénica, formación de aberraciones cromosómicas y capacidad de reparación del daño radioinducido han sido aplicados en la evaluación de la radiosensibilidad in vitro. Los individuos muestran marcadas diferencias en cuanto a su radiosensibilidad lo cual tiene consecuencias tanto en el campo de la protección radiológica como en el de la radioterapia. El objetivo de la protección radiológica es prevenir los efectos deterministas de significación clínica y limitar los efectos estocásticos a niveles aceptables. Los límites de dosis vigentes se basan en la suposición que la población humana es uniforme en su radiosensibilidad. Sin em-bargo, la población humana no es homogénea, existiendo subgrupos radiosensibles que mani-fiestan una incidencia aumentada tanto de efectos deterministas como estocásticos.

Se ha observado que del 5 a 7% de los pacientes sometidos a protocolos de irradiación tera-péutica desarrollan efectos adversos en los tejidos sanos en el volumen de irradiación, denomi-nados “respuesta clínica” e incluye los efectos agudos y tardíos (con dosis inferiores a la dosis de tolerancia en tejidos sanos) e inducción de cáncer [1]. Se sugiere que la incidencia y severi-dad de estas reacciones está principalmente influenciada por la susceptibiliseveri-dad genética a la radiación [2], aunque también contribuirían otros factores. Adicionalmente, la naturaleza de los desórdenes genéticos asociados con hipersensibilidad a las radiaciones (mutaciones en los genes ATM y NBS, relacionados con Ataxia Telangectasia y Nijmegen breakage síndrome res-pectivamente) sugiere que los mecanismos de reparación del ADN se hallan involucrados. Consecuentemente, la caracterización de la reparación del ADN en los linfocitos mediante la aplicación del test de micronúcleos con bloqueo de la citocinesis (MN) y el ensayo de cometa (electroforesis en gel de células individuales) podrían ser aproximaciones apropiadas para eva-luar la radiosensibilidad in vitro. Los objetivos del presente trabajo fueron: 1) evaeva-luar la radio-sensibilidad in vitro en linfocitos de dos grupos de pacientes oncológicos (prospectivamente y retrospectivamente evaluados) utilizando el test de MN y ensayo de cometa y su correlación con la respuesta clínica observada y 2) evaluar el potencial predictivo de ambas técnicas en la identificación de subgrupos radiosensibles.

MATERIALES Y MÉTODOS

Fueron evaluados 38 pacientes con cánceres de cabeza-cuello (n = 25) y cervix (n = 13), some-tidos a esquemas de radioterapia.

19 pacientes fueron evaluados previamente, durante y al finalizar la terapia radiante (grupo prospectivo) y 19 pacientes fueron evaluados de 6-18 meses después del tratamiento (grupo retrospectivo).

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En el grupo prospectivo se evaluó, mediante el test de MN, la atenuación del efecto citogenéti-co, F(MN), como función del tiempo, di, entre una exposición y el muestreo, estimándose un factor de recuperación citogenético k y su correlación con la respuesta clínica.

F(MN)=∑( MNi . e –di.k ) [3]

En el grupo retrospectivo, las muestras de sangre fueron irradiadas in vitro con 0 (control) y 2 Gy utilizando una fuente de Co-60 y analizadas mediante el test de MN. Los datos citogenéti-cos fueron analizados comparando las frecuencias esperadas de micronúcleos (curva de cali-bración de individuos sanos) con los valores observados después de la irradiación in vitro. Un paciente que manifestó toxicidad tardía (osteonecrosis) y pacientes que no desarrollaron efectos tardíos adversos fueron adicionalmente evaluados mediante el ensayo de cometa apli-cando un software de análisis de imágenes, CASP [4]. Las células fueron irradiadas in vitro con 2 Gy. Se evaluó la capacidad de reparación del ADN después de intervalos de tiempos de re-paración de 0 – 80 minutos.

El daño inducido en el ADN y la capacidad de reparación fueron cuantificados mediante el mo-mento de la cola del cometa [5], cuya distribución fue ajustada a una distribución de Weibull [6] y se utilizó el parámetro alfa (valor característico) para describir los perfiles de reparación del ADN del paciente analizado y los donantes sanos control, utilizados como muestra de referencia. Las reacciones tardías en los tejidos sanos, incluidos en el volumen de irradiación, fueron eva-luadas y correlacionadas con la respuesta citogenética individual proveniente de los test de radiosensibilidad in vitro aplicados (MN y ensayo de cometa).

Las integrales de dosis en el volumen de irradiación fueron derivadas de las curvas de isodosis del paciente, obtenidas de la evaluación por tomografía. Para este fin, el volumen de tejido que recibió cada dosis fue calculado y multiplicado por el valor de dosis. La integral de dosis en la región irradiada (kg.Gy) fue obtenida sumando todos los productos dosis-volumen para todas las dosis. La dosis equivalente a todo el cuerpo fue calculada dividiendo la integral de dosis por el peso corporal individual.

Test de MN: Se incubaron 0,8 ml a 1 ml de sangre entera,

extraída por venopunción, en 8,5 ml de medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco) suplementado con suero fetal bovino (Gibco) al 25% (v/v) a 37ºC durante 72 a 74 horas. Los linfocitos fueron estimulados a dividirse con fitohemagluti-nina M 3% (Gibco). A las 44 h de cultivo se agregó citoca-lasina B (6 _{µg/ml concentración final, Sigma) a fin de} blo-quear la citocinesis. A las 72-74 horas de incubación las células fueron colectadas por centrifugación y tratadas con solución hipotónica, según método de Iskandar (NaCl 0,9% / kCl 0,075 M, 9:1), para lograr la preservación del citoplasma. La fija-ción se realizó con metanol / acético (3:1) y se coloreó con Giemsa al 5% (pH 6,8). Se estable-ció la frecuencia de MN evaluando 500 a 1000 células binucleadas por muestra y por dosis, aplicando los criterios de Fenech, M. [7] para la identificación de células binucleadas y MN.

Ensayo de Cometa Alcalino: Se realizó de acuerdo a las

técnicas de Singh [8] y Tice [9] con modificaciones. Se preparó una fina capa de agarosa de punto de fusión nor-mal al 1,5% sobre portaobjetos. Después de la irradiación, ≈25 000 células en 50 µl fueron mezcladas con 120 µl de agarosa de bajo punto de fusión al 0,5% y colocadas sobre los vidrios. Los vidrios fueron sumergidos en solución de lisis fría a pH 10 (NaCl 2,5 M; Na2EDTA 100 mM, Tris 10 mM pH 10; Tritón X-100 1%; DMSO 10%) y mantenidos a 4 °C du-rante 60 min. A fin de permitir la desnaturalización del ADN y la difusión del buffer de lisis fuera

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del gel, los vidrios fueron mantenidos en buffer de electroforesis alcalino a pH 13 (Na2EDTA 1 mM /NaOH 300 mM) durante 25 min. Subsecuentemente, los vidrios fueron transferidos a una cuba de electroforesis con buffer fresco y la corrida se realizó a 1,33 V/cm durante 25 min a 4°C (20 V-125 mA). Los vidrios se neutralizaron en Tris 0,4 M pH 7,5 durante 5 min, se tiñeron con bromuro de etidio 20 µg/ml. Todo el proceso fue realizado en oscuridad y a 4 °C para im-pedir daño adicional del ADN.

Para la visualización del daño, las observaciones se realizaron con objetivo de 20x utilizando un microscopio de epifluorescencia con filtro de excitación: 510-560 y filtro barrera de 590. Se evaluaron 50 a 100 cometas por muestra. El daño inducido en el ADN y la capacidad de repa-ración fueron cuantificados mediante el momento de la cola del cometa de Olive [5].

RESULTADOS Evaluación prospectiva: y = 0.0242 + 0.038 D R2_{= 0.9093} 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0 1 2 3 4 5

Dosis equivalente [Gy]

∆∆∆∆ Frecuencia de MN (observada - espontánea) ΠΠ πρ ε πρ ε πρ ε πρ ε τα ρδ α τα ρδ α τα ρδ α τα ρδ α Frecuencia de MN esperada

Figura 1. Correlación entre la frecuencia de MN y la dosis equivalente a todo el cuerpo, en los

19 pacientes evaluados prospectivamente

La Figura 1. muestra que la frecuencia de MN aumenta linealmente con la dosis equivalente a todo el cuerpo (R2 = 0,9; P = 0,015). Sin embargo, con el aumento de la dosis física la frecuen-cia de MN en los pacientes fue menor que la esperada, determinada a partir de la curva de calibración del laboratorio (irradiación aguda in vitro), realizada con individuos sanos.

Este fenómeno puede ser atribuido al fraccionamiento de la dosis más que a la condición de irra-diación inhomogénea. Para el tratamiento fraccionado en partes del cuerpo que tienen gran vo-lumen y flujo sanguíneo se sugiere que la recirculación de los linfocitos contribuye a la homoge-neización final de la dosis total absorbida. Por lo tanto, se puede suponer que con irradiaciones fraccionadas existe una recuperación citogenética parcial respecto del efecto inducido por una única exposición, como función del tiempo entre la exposición y la toma de la muestra.

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La distribución de MN en los linfocitos binucleados se desvió significativamente de la distribu-ción de Poisson (varianza relativa media σ2_{/y = 1,14), aumentando la sobredispersión a mayor} dosis equivalente.

La frecuencia espontánea de los 19 pacientes con cáncer evaluados previamente a su trata-miento radiante fue 0,0285 ± 0,0047 (intervalo de confianza del 95%). Se observa una diferen-cia significativa (p<0,01) entre este valor y la frecuendiferen-cia espontánea de MN, obtenida a partir de una base de datos de alrededor de 7000 individuos realizada por 25 laboratorios, incluyendo nuestro laboratorio, (Human MicroNucleus Project-International Database Comparison, 2001) [10], donde la mediana de la frecuencia de MN en individuos sanos no expuestos fue 0,0065 con una variación en el intercuartilo del 75 % entre 0,003 y 0,012.

En la evaluación prospectiva, el factor k correlacionó con la radiosensibilidad individual (Figura 2.). Dos pacientes con baja capacidad de recuperación del efecto citogenético desarrollaron toxicidad tardía (fibrosis y rectitis actínica).

Radiosensibilidad individual

+

–

Pacientes con respuesta clínica normal

Pacientes con toxicidad tardía 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 k ∆∆∆∆ F re cue nc ia de M N Radiosensibilidad individual

+

–

Pacientes con toxicidad tardía

+

–

+

–

Pacientes con toxicidad tardía

Pacientes con toxicidad tardía 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 k ∆∆∆∆ F re cue nc ia de M N

Figura 2. ∆Frecuencia de MN vs. factor de recuperación citogenético k

Un bajo valor de k (k→0) demuestra alta radiosensibilidad del pool de linfocitos, es decir, un sujeto con dificultades en la reparación del daño radioinducido en el ADN.

Evaluación retrospectiva:

En la evaluación retrospectiva, la respuesta citogenética individual sugiere una correlación con el grado máximo de toxicidad tardía (osteonecrosis, fibrosis y trismus).

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Dosis = 0Gy Dosis = 2Gy χχχχ² Test 36.15 3.52 1.05 1.15 0.97 0.70 29.26 1.71 2.91 0.79 1.45 3.27 0.42 5.00 0.80 2.15 0.88 5.71 7.51 χχχχ² Test 134.06 1.17 1.11 1.59 2.44 19.60 140.62 2.18 12.67 3.15 0.20 0.34 3.15 7.15 14.82 13.30 12.10 0.14 111.23 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Paciente 0.0423 0.0095 0.0216 0.0128 0.0132 0.0138 0.0398 0.0119 0.0102 0.0136 0.0123 0.0098 0.0200 0.0080 0.0136 0.0112 0.0134 0.0272 0.0287 Frecuencia Observada 0.3412 0.1694 0.1984 0.2012 0.2053 0.1240 0.3450 0.2041 0.1358 0.1600 0.1780 0.1920 0.2082 0.1478 0.1319 0.1346 0.1369 0.1790 0.3272 Frecuencia Observada

Dosis = 0Gy Dosis = 2Gy

χχχχ² Test 36.15 3.52 1.05 1.15 0.97 0.70 29.26 1.71 2.91 0.79 1.45 3.27 0.42 5.00 0.80 2.15 0.88 5.71 7.51 χχχχ² Test 134.06 1.17 1.11 1.59 2.44 19.60 140.62 2.18 12.67 3.15 0.20 0.34 3.15 7.15 14.82 13.30 12.10 0.14 111.23 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Paciente 0.0423 0.0095 0.0216 0.0128 0.0132 0.0138 0.0398 0.0119 0.0102 0.0136 0.0123 0.0098 0.0200 0.0080 0.0136 0.0112 0.0134 0.0272 0.0287 Frecuencia Observada 0.3412 0.1694 0.1984 0.2012 0.2053 0.1240 0.3450 0.2041 0.1358 0.1600 0.1780 0.1920 0.2082 0.1478 0.1319 0.1346 0.1369 0.1790 0.3272 Frecuencia Observada

χχχχ² Test 36.15 3.52 1.05 1.15 0.97 0.70 29.26 1.71 2.91 0.79 1.45 3.27 0.42 5.00 0.80 2.15 0.88 5.71 7.51 χχχχ² Test 134.06 1.17 1.11 1.59 2.44 19.60 140.62 2.18 12.67 3.15 0.20 0.34 3.15 7.15 14.82 13.30 12.10 0.14 111.23 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Paciente 0.0423 0.0095 0.0216 0.0128 0.0132 0.0138 0.0398 0.0119 0.0102 0.0136 0.0123 0.0098 0.0200 0.0080 0.0136 0.0112 0.0134 0.0272 0.0287 Frecuencia Observada 0.3412 0.1694 0.1984 0.2012 0.2053 0.1240 0.3450 0.2041 0.1358 0.1600 0.1780 0.1920 0.2082 0.1478 0.1319 0.1346 0.1369 0.1790 0.3272 Frecuencia Observada χχχχ² Test 36.15 3.52 1.05 1.15 0.97 0.70 29.26 1.71 2.91 0.79 1.45 3.27 0.42 5.00 0.80 2.15 0.88 5.71 7.51 χχχχ² Test 36.15 3.52 1.05 1.15 0.97 0.70 29.26 1.71 2.91 0.79 1.45 3.27 0.42 5.00 0.80 2.15 0.88 5.71 7.51 χχχχ² Test 134.06 1.17 1.11 1.59 2.44 19.60 140.62 2.18 12.67 3.15 0.20 0.34 3.15 7.15 14.82 13.30 12.10 0.14 111.23 χχχχ² Test 134.06 1.17 1.11 1.59 2.44 19.60 140.62 2.18 12.67 3.15 0.20 0.34 3.15 7.15 14.82 13.30 12.10 0.14 111.23 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Paciente 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Paciente 0.0423 0.0095 0.0216 0.0128 0.0132 0.0138 0.0398 0.0119 0.0102 0.0136 0.0123 0.0098 0.0200 0.0080 0.0136 0.0112 0.0134 0.0272 0.0287 Frecuencia Observada 0.0423 0.0095 0.0216 0.0128 0.0132 0.0138 0.0398 0.0119 0.0102 0.0136 0.0123 0.0098 0.0200 0.0080 0.0136 0.0112 0.0134 0.0272 0.0287 Frecuencia Observada 0.3412 0.1694 0.1984 0.2012 0.2053 0.1240 0.3450 0.2041 0.1358 0.1600 0.1780 0.1920 0.2082 0.1478 0.1319 0.1346 0.1369 0.1790 0.3272 Frecuencia Observada 0.3412 0.1694 0.1984 0.2012 0.2053 0.1240 0.3450 0.2041 0.1358 0.1600 0.1780 0.1920 0.2082 0.1478 0.1319 0.1346 0.1369 0.1790 0.3272 Frecuencia Observada

Tabla 1. Frecuencias de MN espontáneas y radioinducidas (irradiación in vitro con 2 Gy de

Co-60) en los linfocitos de los pacientes evaluados retrospectivamente, analizadas mediante el test de χ2_.

Aplicando el test de _χ2, valores > 3,84 (GL = 1; p < 0,05) indican diferencias estadísticamente significativas entre las frecuencias de MN observadas y esperadas, permitiendo la identificación de individuos radiosensibles (Tabla 1.).

Dosis [Gy] Fre cue n cia d e MN 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 1 2 3 Dosis [Gy] Fre cue n cia d e MN 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 1 2 3 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 1 2 3 D osis [G y] Frecuencia de M N 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 1 2 3 Dosis [Gy] Fre cue n cia d e MN 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 1 2 3 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 1 2 3

Figura 3. Comparación de las frecuencias de MN observadas con las esperadas

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Los linfocitos de 3 de los 4 pacientes que desarrollaron toxicidad tardía (osteonecrosis, fibrosis y trismus) resultaron significativamente más radiosensibles que los del resto de los pacientes y donantes sanos (Figura 3.).

El daño inducido en el ADN de los pacientes adicionalmente analizados mediante el ensayo de cometa fue medido hasta 80 minutos post-irradiación, en intervalos de 5, 10, 20, 30, 50 y 80 min. Se aplicó un programa de análisis de imagen CASP, de dominio público (Figura 4.).

Figura 4. Vista del programa para windows: en la ventana izquierda se observa la imagen de

un cometa con el marco de medición y la cabeza y cola marcadas. En la ventana derecha se muestran los perfiles de intensidad.

Para cada individuo, pacientes y donantes sanos control, los datos del momento de la cola del cometa fueron ajustados a una función mono-exponencial:

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donde,

TM = Momento de la cola del cometa TM0 = TM inicial reparable

TMR = TM residual no reparable T1/2 = tiempo medio de reparación

t = tiempo de incubación después de la exposición a 2 Gy in-vitro

Todos los pacientes evaluados mostraron reducción en la capacidad de reparación del ADN, respecto de los donantes sanos. Adicionalmente, se observaron diferencias significativas entre el paciente que manifestó osteonecrosis y los pacientes que no desarrollaron efectos tardíos adver-sos. Los tiempos medios de reparación, es decir, el tiempo medio requerido por los linfocitos para reparar el 50% del daño inicial, para el paciente con toxicidad tardía, pacientes que no mostraron efectos tardíos adversos y controles fueron 22,9 min., 5,9 – 6,1 min. y 1,2 min. respectivamente. El daño observado en los linfocitos del paciente con toxicidad tardía, a los 10 minutos post irra-diación in vitro, resultó 9,5 veces mayor que el de los controles sanos. (Figura 5).

( )

t TM e TMR TM t + ⋅ =         − Τ ⋅ 2 1 2 ln 0

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Pool de donantes sanos Pacientes sin toxicidad tardía Paciente con toxicidad tardía

(osteonecrosis) tiempo [min.] 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Mom ent o de la c o la de l c o m eta (alfa de Weibull)

Pool de donantes sanos Pacientes sin toxicidad tardía Paciente con toxicidad tardía

(osteonecrosis) tiempo [min.] 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Mom ent o de la c o la de l c o m eta (alfa de Weibull)

Figura 5. Perfiles de reparación evaluados mediante ensayo de cometa en linfocitos

de pacientes y muestras control

CONCLUSIONES

El principal objetivo del presente trabajo es proporcionar evidencias de que la caracterización de la reparación del ADN en los linfocitos mediante la aplicación del test de MN y el ensayo de cometa constituyen aproximaciones apropiadas para evaluar la radiosensibilidad individual in vitro, determinándose el potencial predictivo de ambas técnicas en la identificación de subgru-pos radiosensibles de importancia en protección radiológica y radioterapia.

Los datos citogenéticos muestran que el ensayo de MN resulta apropiado para mediciones biodosimétricas en personas sometidas a radioterapia en regiones corporales con alto flujo sanguíneo o que incluyen médula ósea.

La comparación de la tendencia media de los datos citogenéticos de los pacientes evaluados prospectivamente con la curva de calibración muestra que para dosis equivalentes a todo el cuerpo superiores a 2 Gy, la frecuencia de MN observada resulta menor que la esperada. Este comportamiento se atribuye al fraccionamiento de la dosis. Se sugiere que con irradiaciones fraccionadas existe una recuperación citogenética parcial respecto del efecto inducido por una única exposición, como función del tiempo entre la exposición y la toma de la muestra. Si el valor de frecuencia de MN observado se aproxima a la curva de calibración, esto indicaría po-bre recuperación del efecto citogenético, k tiende a cero, y alta radiosensibilidad del pool de linfocitos y por lo tanto del paciente.

El ensayo de MN en la evaluación prospectiva presenta la limitación como ensayo predictivo de requerir la acumulación de una dosis equivalente superior a 1,8 – 2 Gy (más de 10 fracciones) para poner significativamente de manifiesto la capacidad de reparación del ADN, medida me-diante el parámetro k que representa el nivel de recuperación citogenética.

En la evaluación retrospectiva, tanto las frecuencias espontáneas de MN como las frecuencias radioinducidas (2 Gy in vitro) resultaron significativamente mayores, respecto de las esperadas a partir de la curva de calibración proveniente de individuos sanos, sólo en aquellos pacientes que desarrollaron toxicidad tardía.

La evaluación retrospectiva mediante la aplicación del ensayo de MN permitiría predecir la toxi-cidad tardía en pacientes que requirieran tratamientos de re-irradiación.

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El ensayo de cometa permitió determinar el daño inicial en el ADN, la velocidad de reparación (tiempo medio de reparación) y el daño residual después de un tiempo de reparación específico (80 min). El ensayo provee información de los valores medios (parámetro _{α de la distribución} de Weibull para el momento de la cola del cometa) y de la distribución (histogramas de fre-cuencia), a nivel de células individuales.

La aplicación del ensayo de cometa en la evaluación retrospectiva de un grupo de pacientes con y sin toxicidad tardía permitió confirmar la correlación entre dicho ensayo in vitro y la res-puesta clínica.

Estudios de nuestro laboratorio, aplicando el ensayo de cometa en pacientes heterocigotas y homocigotas con síndromes de hipersensibilidad a las radiaciones ionizantes confirman que este ensayo podría ser una herramienta apropiada para poner de manifiesto defectos en la capacidad de reparación del ADN.

La utilización del ensayo de cometa en estudios prospectivos permitiría identificar precozmente subgrupos más radiosensibles con los consecuentes beneficios en el campo de la protección radiológica y de la radioterapia. Uno de los posibles subgrupos radiosensibles son los indivi-duos heterocigotas AT (Ataxia Telangectasia), es decir, los indiviindivi-duos que portan una copia del gen mutado, ATM, que constituye el 1% de la población.

Los resultados obtenidos sugieren correlación entre los ensayos de radiosensibilidad in vitro, test de MN y ensayo de cometa, y la toxicidad tardía. Estos ensayos no proporcionan la infor-mación completa respecto de la radiosensibilidad individual ya que otros factores, independien-tes de la reparación del ADN, tales como: factores clínicos extrínsecos, pequeñas diferencias en la dosis física y factores que intervienen en la fibrosis, no asociados a la radiosensibilidad intrínseca, pueden ser responsables de una radiosensibilidad aumentada. Sin embargo, ambos ensayos podrían cumplir una función de señal de alerta cuando se detecta una marcada dismi-nución en la capacidad de reparación del ADN, dado que existiría una alta probabilidad de que el individuo sea radiosensible.

La extensión de estos estudios a un mayor número de pacientes y la aplicación de múltiples factores biológicos pronóstico, incluyendo mediciones de radiosensibilidad en células normales, proliferación tumoral y oxigenación tumoral permitirá obtener información más completa de la radiosensibilidad individual y de la aplicabilidad de ensayos rápidos y de fácil implementación en el laboratorio clínico que puedan ser predictivos de la respuesta del paciente a la radiotera-pia, permitiendo la elección de un protocolo de radioterapia personalizado para cada paciente, que pueda brindarle una mejor evolución. Estos resultados permitirán determinar la aplicabili-dad de los ensayos predictivos en la identificación de subgrupos radiosensibles, de importancia en protección radiológica.

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