Evaluación de las propiedades antibacterianas de nanopartículas de cobre sintetizadas a partir de CuSO4 y extracto de Eucalipto

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(1)UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA DE MATERIALES. EVALUACIÓN DE LAS PROPIEDADES ANTIBACTERIANAS DE NANOPARTÍCULAS DE COBRE SINTETIZADAS A PARTIR DE CUSO4 Y EXTRACTO DE EUCALIPTO.. Tesis presentada por: Bach Norma Andrea Cedano Cuadros. Para optar el Título Profesional de: Ingeniera de Materiales. AREQUIPA-PERÚ 2018 0.

(2) PRESENTACIÓN Sr. Decano de la Facultad de Ingeniería de Procesos Sr. Director de la Escuela Profesional de Ingeniería de Materiales Señores miembros del Jurado. Pongo a disposición de ustedes el trabajo de tesis titulada Evaluación de las propiedades antibacterianas de nanopartículas de cobre sintetizadas a partir de CuSO4 y extracto de eucalipto a fin de que sea evaluado de acuerdo al reglamento y se me permita optar el título de Ingeniera de Materiales. El presente trabajo está desarrollado en cinco capítulos. En el primer capítulo se hablará de las generalidades como la formulación del problema, justificación e importancia de la investigación, objetivos, hipótesis y variables. El segundo capítulo consta en las bases teóricas de los materiales utilizados en este proyecto como las bacterias, el sulfato de cobre pentahidratado, el extracto de eucalipto, polivinilpirrolidona, entre otros. El capítulo tres se trata del procedimiento experimental en donde veremos la preparación del extracto de eucalipto, la biosíntesis de las nanopartículas, la caracterización y el proceso de incubación de bacterias así como también el diseño de la experimentación. En el capítulo cuatro obtendremos los resultados experimentales y por último en el capítulo cinco veremos las conclusiones y recomendaciones.. 1.

(3) Dedicatoria. A Dios. Por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado salud para lograr mis objetivos, además de su infinita bondad y amor.. A mi madre y hermanos. Por haberme apoyado en todo momento, por sus consejos, sus valores, por la motivación constante que me ha permitido ser una persona de bien.. 2.

(4) AGRADECIMIENTOS. . A mi asesor de Tesis, Ing. Edwin Urday Urday, por compartir su amplio conocimiento en el campo de las nanopartículas.. . Al BiólogoJosé Fernández Rodríguez por su colaboración y sus conocimientos en microbiología.. . A la Doctora Rita Nieto Montesinos por su apoyo en la caracterización de las nanopartículas.. . Al Laboratorio de Ingeniería de Materiales Cerámicos - UNSA.. En general quiero agradecer a todas y cada una de las personas que han sido parte de la realización de esta tesis ya que con sus conocimientos, sus experiencias y paciencia han logrado hacer realidad este proyecto.. 3.

(5) EVALUACIÓN DE LAS PROPIEDADES ANTIBACTERIANAS DE NANOPARTÍCULAS DE COBRE SINTETIZADAS A PARTIR DE CUSO4 Y EXTRACTO DE EUCALIPTO. RESUMEN En la actualidad las nanopartículas de cobre han atraído la atención de muchos investigadores por sus propiedades antibacterianas así como también por sus propiedades ópticas, su uso en sensores biológicos, dispositivos electrónicos y muchos otros. Además, a diferencia de otros metales con propiedades similares como son Au, Ag, Pt, el cobre nos ofrece una amplia ventaja económica. Asimismo para su síntesis se ha estudiado en los últimos años alternativas amigables con el medio ambiente ya que sus procesos físicos y químicos son caros y sus condiciones de reacción son drásticas. La primera parte de este trabajo consiste en desarrollar en laboratorio una solución de nanopartículas de cobre a base de extracto de eucalipto y sulfato de cobre pentahidratado. Luego se realizó la caracterización de las nanopartículas obtenidas para saber su diámetro ya que el efecto bactericida es mucho más efectivo si se obtienen nanopartículas de diámetro menor a 200 ƞm. Por último se prepararon cultivos de tres diferentes tipos de bacterias: Eschericia coli, Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus aureus; seguidamente se sumergieron tres placas (Acero 1020, acero inoxidable y acero galvanizado) en la solución líquida de nanopartículas de cobre, recubriendo así estas placas para luego colocarlas en las bacterias cultivadas.El tiempo de acción de las nanopartículas sobre las bacterias fue de 6 y 24 horas, debido a que los resultados obtenidos no variarán a mayor tiempo y las bacterias ya no se reproducirán más por falta de nutrientes en el medio. Los mejores resultados de inhibición de las bacterias fue la aplicación de nanopartículas en acero galvanizado tanto para la escherichia coli, la pseudomona aeruginosa y staphylococcus aureureus.. Palabras claves: nanopartículas, síntesis, eucalipto, bacterias, cobre. 4.

(6) ÍNDICE RESUMEN ÍNDICE DE CUADROS ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE GRÁFICOS CAPÍTULO I GENERALIDADES 1.1 INTRODUCCIÓN. 17. 1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA. 18. 1.3 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACIÓN. 18. 1.4 OBJETIVOS. 18. 1.4.1 OBJETIVO GENERAL. 18. 1.4.2 OBJETIVO ESPECÍFICO. 19. 1.5 HIPÓTESIS. 19. 1.6 VARIABLES. 19. 1.6.1 VARIABLES DEPENDIENTES. 19. 1.6.2 VARIABLES INDEPENDIENTES. 19. CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO. 2.1 NANOTECNOLOGÍA. 21. 2.1.1 DEFINICIÓN. 21. 2.2 NANOPARTÍCULAS. 21. 2.2.1 DEFINICIÓN. 21. 2.2.2 PROPIEDADES. 22. 2.2.3 CLASIFICACIÓN DE LAS NANOPARTÍCULAS. 23. 2.2.4 METODOLOGÍAS PARA LA SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS. 23. 2.2.5 CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS. 25. 2.2.6 APLICACIONES. 26 5.

(7) 2.3 EUCALYPTUS GLOBULUS. 27. 2.3.1 GENERALIDADES. 27. 2.3.2 CARACTERÍSTICAS. 29. 2.3.3 PROPIEDADES. 30. 2.3.4 COMPOSICIÓN QUÍMICA. 31. 2.4 BACTERIAS 2.4.1 ESCHERICHIA COLI. 33 33. 2.4.1.1 CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS. 33. 2.4.1.2 HÁBITAT. 34. 2.4.1.3 PODER PATÓGENO. 34. 2.4.1.4 FACTORES DE VIRULENCIA. 35. 2.4.1.5 SENSIBILIDAD A LOS ANTIBACTERIANOS. 35. 2.4.2 PSEUDOMONA AERUGINOSA. 36. 2.4.2.1 CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS. 36. 2.4.2.2 HÁBITAT. 37. 2.4.2.3 PODER PATÓGENO. 37. 2.4.2.4 FACTORES DE VIRULENCIA. 37. 2.4.2.5 SENSIBILIDAD A LOS ANTIBACTERIANOS. 37. 2.4.3 ESTAPHYLOCOCCUS AUREUS. 38. 2.4.3.1 CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS. 38. 2.4.3.2 HÁBITAT. 39. 2.4.3.3 PODER PATÓGENO. 39. 2.4.3.4 FACTORES DE VIRULENCIA. 40. 2.4.3.5 SENSIBILIDAD A LOS ANTIBACTERIANOS. 40. 2.5 SULFATO DE COBRE PENTAHIDRATADO. 40. 2.5.1 OBTENCIÓN. 41. 2.5.2 PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS. 42. 2.5.3 APLICACIONES. 42. 2.6 POLIVINILPIRROLIDONA (PVP). 43. 6.

(8) CAPÍTULO III PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 3.1 PREPARACIÓN DEL EXTRACTO DE EUCALIPTO. 46. 3.2 CARACTERIZACIÓN DEL EXTRACTO DE EUCALIPTO. 47. 3.2.1 ESPECTROMETRÍA INFRARROJA POR TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR). 47. 3.3 BIOSÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS. 48. 3.4 CÁLCULOS. 49. 3.4.1 SULFATO DE COBRE PENTAHIDRATADO. 49. 3.5 REACCIÓN PARA LA FORMACIÓN DE NANOPARTÍCULAS. 49. 3.6 CARACTERIZACIÓN DE LAS NANOPARTÍCULAS DE COBRE. 51. 3.6.1 DISPERSIÓN DE LUZ DINÁMICA 3.7 INCUBACIÓN DE BACTERIAS. 51 53. 3.7.1 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO. 53. 3.7.2 PROCESO DE INOCULACIÓN. 54. 3.8 MECANISMO ANTIBACTERIAL DEL COBRE. 55. 3.9 DISEÑO DE LA EXPERIMENTACIÓN. 56. 3.9.1 VARIABLES. 56. 3.9.1.1. VARIABLES DEPENDIENTES. 56. 3.9.1.2. VARIABLES INDEPENDENTES. 56. 3.9.2 CONSTANTES. 56. 3.9.2.1. TIPOS DE PLACAS. 56. 3.9.2.2. TIPOS DE BACTERIAS. 56. 3.9.3 MATRIZ DE DISEÑO. 57. 3.9.3.1. PARA ESCHERICHIA COLI (A1). 57. 3.9.3.2. PARA PSUDOMONA AERUGINOSA (A2). 57. 3.9.3.3. PARA STAPHYLOCOCCUS AUREUS (A3). 57. 3.10 MATERIALES, HERRAMIENTAS Y EQUIPOS. 57. 3.10.1 MATERIALES. 57. 3.10.2 HERRAMIENTAS. 58. 3.10.3 EQUIPOS. 58 7.

(9) 3.11 PROCEDIMIENTO DEL TRABAJO 3.11.1 APLICACIÓN DE NANOPARTÍCULAS. 58 58. CAPÍTULO IV RESULTADOS EXPERIMENTALES Y ANÁLISIS 4.1 COMPARACIÓN DEL TAMAÑO DE NANOPARTÍCULAS. 62. 4.2 BACTERIAS APLICADAS A LAS PLACAS METÁLICAS SIN NANOPARTÍCULAS. 63. 4.2.1 ESCHERICHIA COLI. 63. 4.2.2 PSEUDOMONA AERUGINOSA. 64. 4.2.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS. 64. 4.3 ANÁLISIS DE CONTAMINACIÓN DE LAS NANOPARTÍCULAS DE COBRE. 65. 4.3.1 NANOPARTÍCULAS DE COBRE AL 100%. 65. 4.3.2 NANOPARTÍCULAS DE COBRE AL 10%. 66. 4.4 ZONA DE INHIBICIÓN DE POBLACIONES BACTERIANAS. 67. 4.4.1 ESCHERICHIA COLI (A1). 67. 4.4.2 PSEUDOMONA AERUGINOSA (A2). 77. 4.4.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS (A3). 87. CAPÍTULO V DISCUSIÓN. 5.1 INHIBICIÓN EN ESCHERICHIA COLI. 98. 5.1.1 ACERO 1020. 98. 5.1.2 ACERO INOXIDABLE. 98. 5.1.3 ACERO GALVANIZADO. 98. 5.2 INHIBICIÓN EN PSEUDOMONA AERUGINOSA. 99. 5.2.1 ACERO 1020. 99. 5.2.2 ACERO INOXIDABLE. 99. 5.2.3 ACERO GALVANIZADO. 99 8.

(10) 5.3 INHIBICIÓN EN STAPHYLOCOCCUS AUREUS. 99. 5.3.1 ACERO 1020. 99. 5.3.2 ACERO INOXIDABLE. 100. 5.3.3 ACERO GALVANIZADO. 100. 5.4 ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA. 101. 5.4.1 ESCHERICHIA COLI. 101. 5.4.2 PSEUDOMONA AERUGINOSA. 102. 5.4.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS. 103. 5.4.4 ACERO 1020. 104. 5.4.5 ACERO INOXIDABLE. 105. 5.4.6 ACERO GALVANIZADO. 106. CAPÍTULO VI CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. 6.1 CONCLUSIONES. 108. 6.2 RECOMENDACIONES. 109. BIBLIOGRAFÍA ANEXOS. 9.

(11) ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1.- Aplicaciones de las nanopartículas Cuadro 2.- Características del eucaliptus Cuadro 3.- Propiedades Físicas del eucalipto Cuadro 4.- Propiedades Mecánicas del eucalipto Cuadro 5.- Resistencia natural de P. Aeruginosa a los antibióticos Cuadro 6.- Propiedades Físicas y Químicas del sulfato de cobre Cuadro 7.- Diámetro de NPs al 100% Cuadro 8.- Diámetro de NPs al 10% Cuadro 9.- Síntesis de nanopartículas de cobre usando plantas Cuadro 10.- Zona de inhibición en Escherichia Coli Cuadro 11.- Efectos estimados para inhibición acero 1020 (mm) Escherichia Coli Cuadro 12.- Análisis de varianza para inhibición acero 1020 Escherichia Coli Cuadro 13.- Análisis de residuos acero 1020 Escherichia Coli Cuadro 14.- Efectos estimados para inhibición acero inoxidable (mm) Escherichia Coli Cuadro 15.- Análisis de varianza para inhibición acero inoxidable Escherichia Coli Cuadro 16.- Análisis de residuos acero inoxidable Escherichia Coli Cuadro 17.- Efectos estimados para inhibición acero galvanizado (mm) Escherichia Coli Cuadro 18.- Análisis de varianza para inhibición acero galvanizado Escherichia Coli Cuadro 19.- Análisis de residuos galvanizado Escherichia Coli Cuadro 20.- Zona de inhibición en Pseudomona Aeruginosa Cuadro 21.- Efectos estimados para inhibición acero 1020 (mm) Pseudomona Aeruginosa Cuadro 22.- Análisis de varianza para inhibición acero 1020 Pseudomona Aeruginosa. 10.

(12) Cuadro 23.- Análisis de residuos acero 1020 Pseudomona Aeruginosa Cuadro 24.- Efectos estimados para inhibición acero inoxidable (mm) Pseudomona Aeruginosa Cuadro 25.- Análisis de varianza para inhibición acero inoxidable Pseudomona Aeruginosa Cuadro 26.- Análisis de residuos acero inoxidable Pseudomona Aeruginosa Cuadro 27.- Efectos estimados para inhibición acero galvanizado (mm) Pseudomona Aeruginosa Cuadro 28.- Análisis de varianza para inhibición acero galvanizado Pseudomona Aeruginosa Cuadro 29.- Análisis de residuos galvanizado Pseudomona Aeruginosa Cuadro 30.- Zona de inhibición en Staphylococcus Aureus Cuadro 31.- Efectos estimados para inhibición acero 1020 (mm) Staphylococcus Aureus Cuadro 32.- Análisis de varianza para inhibición acero 1020 Staphylococcus Aureus Cuadro 33.- Análisis de residuos acero 1020 Staphylococcus Aureus Cuadro 34.- Efectos estimados para inhibición acero inoxidable (mm) Staphylococcus Aureus Cuadro 35.- Análisis de varianza para inhibición acero inoxidable Staphylococcus Aureus Cuadro 36.- Análisis de residuos acero inoxidable Staphylococcus Aureus Cuadro 37.- Efectos estimados para inhibición acero galvanizado (mm) Staphylococcus Aureus Cuadro 38.- Análisis de varianza para inhibición acero galvanizado Staphylococcus Aureus Cuadro 39.- Análisis de residuos galvanizado Staphylococcus Aureus. 11.

(13) INDICE DE FIGURAS Figura 1. Tamaño de Nanoparticulas (0.1 y 100 ƞm) Figura 2. Algunas Propiedades de los Nanoparticulas Figura 3. Clasificación de las Nanoparticulas Figura 4. Eucalyptus: árbol, flores y fruto Figura 5. Constituyentes Generales del Eucalyptus globulus Figura 6. Estructura Química de la Lignina Figura 7. Estructura química del Epigalocatequin galato (EGCG) Figura 8. Tipos de Bacterias Figura 9. Bacilos de Escherichia Coli Figura 10. Pseudomona Aeuruginosa Figura 11. Bacilos de Staphylococcus Áureo Figura 12. Cristales de Sulfato de Cobre Pentahidratado Figura 13. Principales Usos del Sulfato de Cobre Pentahidratado Figura 14. Estructura del Polivinilpirrolidona Figura 15. FTIR – Extracto de eucalipto Figura 16. Reacción para la formación de nanopartículas Figura 17. Zetasizer – Tamaño de partículas de Cu al 100% Figura 18. Zetasizer – Tamaño de partículas de Cu al 10% Figura 19. Aplicación de las NPs a la placa metálica Figura 20. Placas metálicas colocadas en el medio de cultivo Figura 21. Placas de Petri en la estufa Figura 22. Placas metálicas en Escherichia Coli Figura 23. Placas metálicas en Pseudomona Aeruginosa 12.

(14) Figura 24. Placas metálicas en Staphylococcus Aureus Figura 25. Nanopartículas de Cu al 100% Figura 26. Nanopartículas de Cu al 10% Figura 27. Zona de inhibición E. Coli – 6 y 24Hrs. Figura 28. Zona de inhibición E. Coli – 24Hrs. Figura 29. Zona de inhibición Pseudomona – 6 y 24Hrs. Figura 30. Zona de inhibición Pseudomona – 24Hrs. Figura 31. Zona de inhibición Staphylo C. – 6 y 24Hrs. Figura 32. Zona de inhibición Staphylo C. – 24Hrs. INDICE DE GRÁFICOS Gráfico 1.- Porcentaje NPs según su tamaño (100%) Gráfico 2.- Porcentaje NPs según su tamaño (10%) Gráfico 3.- Diagrama de Pareto estandarizada para inhibición Acero 1020 Gráfico 4.- Gráfica de interacción para inhibición Acero 1020 Gráfico 5.- Gráfica de efectos principales para inhibición Acero 1020 Gráfico 6.- Superficie de respuesta estimada Gráfico 7.- Diagrama de Pareto estandarizada para acero inoxidable Gráfico 8.- Gráfica de interacción para acero inoxidable Gráfico 9.- Gráfica de efectos principales para acero inoxidable Gráfico 10.- Superficie de respuesta estimada Gráfico 11.- Diagrama de Pareto estandarizada para inhibición acero galvanizado. 13.

(15) Gráfico 12.- Gráfica de interacción para inhibición acero galvanizado Gráfico 13.- Gráfica de efectos principales para inhibición acero galvanizado Gráfico 14.- Superficie de respuesta estimada Gráfico 15.- Diagrama de Pareto estandarizada para inhibición Acero 1020 Gráfico 16.- Gráfica de interacción para inhibición Acero 1020 Gráfico 17.- Gráfica de efectos principales para inhibición Acero 1020 Gráfico 18.- Superficie de respuesta estimada Gráfico 19.- Diagrama de Pareto estandarizada para inhibición acero inoxidable Gráfico 20.- Gráfica de interacción para inhibición acero inoxidable Gráfico 21.- Gráfica de efectos principales para inhibición acero inoxidable Gráfico 22.- Superficie de respuesta estimada Gráfico 23.- Diagrama de Pareto estandarizada para inhibición acero galvanizado Gráfico 24.- Gráfica de interacción para inhibición acero galvanizado Gráfico 25.- Gráfica de efectos principales para inhibición acero galvanizado Gráfico 26.- Superficie de respuesta estimada Gráfico 27.- Diagrama de Pareto estandarizada para inhibición Acero 1020 Gráfico 28.- Gráfica de interacción para inhibición Acero 1020 Gráfico 29.- Gráfica de efectos principales para inhibición Acero 1020 Gráfico 30.- Superficie de respuesta estimada Gráfico 31.- Diagrama de Pareto estandarizada para acero inoxidable Gráfico 32.- Gráfica de interacción para acero inoxidable. 14.

(16) Gráfico 33.- Gráfica de efectos principales para acero inoxidable Gráfico 34.- Superficie de respuesta estimada Gráfico 35.- Diagrama de Pareto estandarizada para inhibición acero galvanizado Gráfico 36.- Gráfica de interacción para inhibición acero galvanizado Gráfico 37.- Gráfica de efectos principales para inhibición acero galvanizado Gráfico 38.- Superficie de respuesta estimada Gráfico 39.- Actividad antibacteriana en Escherichia Coli Gráfico 40.- Actividad antibacteriana en Pseudomona Aeruginosa Gráfico 41.- Actividad antibacteriana en Staphylococcus Aureus Gráfico 42.- Actividad antibacteriana en el Acero 1020 Gráfico 43.- Actividad antibacteriana en el Acero Inoxidable Gráfico 44.- Actividad antibacteriana en el Acero Galvanizado. 15.

(17) CAPÍTULO. I. INTRODUCCIÓN. 16.

(18) 1.1 INTRODUCCIÓN. Las nanopartículas tienen una o más dimensiones y tienen un tamaño de 100ƞm o menos. Entre los metales, las nanopartículas de cobre tienen bajo costo y están fácilmente disponibles. Las nanopartículas de cobre se pueden sintetizar utilizando diversos métodos de diferentes enfoques. La mayoría delos métodos utilizados para la síntesis de nanopartículas implica el uso de productos químicos tóxicos y peligrosos que crean riesgos biológicos y en algún momento estos procesos químicos no son ecológicos. Este método desarrolla el proceso amigable con el medio ambiente para la síntesis de nanopartículas de cobre. Ahora, la síntesis mediada por la planta está recibiendo mucha atención debido a su simplicidad, bajo costo y proceso rápido. Debido a la gran superficie a la relación de volumen metálico las nanopartículas tienen una notable propiedad antimicrobiana [17]. El cobre es un metal dúctil con una conductividad térmica y eléctrica muy alta. Las nanopartículas de cobre han atraído recientemente la atención especial debido a su bajo costo y propiedades ópticas, mecánicas, catalíticas, eléctricas y térmicas novedosas de la conducción, que son diferentes del de sus metales a granel [18]. Las nanopartículas de cobre son muy reactivas debido a su alta relación superficie/volumen y pueden interactuar fácilmente con otras partículas y aumentar su eficiencia antimicrobiana. La síntesis verde de Nanopartículas de cobre utilizando plantas ha recibido mucha atención debido a su bajo costo, medio ambiente, rápido, protocolo económico y ningún químico tóxico se utiliza para la síntesis de nanopartículas. Las biomoléculas presentes en los extractos vegetales son carbohidratos, flavonoides,. esteroides,. glucósidos,. saponinas,. triterpenoides,. fenoles. y. compuestos aromáticos que son responsables de la reducción y estabilización de los iones de cobre [27].. 17.

(19) 1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA. La frecuencia con la que se presentan casos de enfermedades producto de las bacterias que están presentes en estructuras metálicas en su mayoría pasamanos ya que por ser inherente a su función están en contacto con las manos de las personas las cuales en algún momento pueden entrar en contacto con vías respiratorias y digestivas o en su defecto con otros objetos u otras manos, provocando infecciones, cólicos, náuseas entre otros síntomas, lo cual es motivo de gasto para el propio individuo y como consecuencia aumento de turnos en los hospitales que podrían ser ocupados por personas que puedan presentar síntomas más serios.. 1.3 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA.. Con el fin de disminuir enfermedades provocadas por bacterias que se encuentran en estructuras metálicas de constante contacto con el ser humano, se pretende atacar a las poblaciones de estos microorganismos con una solución de nanopartículas de cobre cuya síntesis no depende de productos químicos, su costo sea bajo y su proceso sea amigable con el medio ambiente.. 1.4 OBJETIVOS. 1.4.1 OBJETIVO GENERAL. Evaluar las propiedades antibacterianas de nanopartículas de cobre sintetizadas a partir de CuSO4 y extracto de eucalipto.. 18.

(20) 1.4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS . Evaluar la actividad antimicrobiana de las nanopartículas de cobre en las. bacterias. Escherichia. Coli,. Pseudomona. Aeruginosa. y. Staphylococcus Aureus. . Analizar las variables significativas en cada tipo de bacteria para determinar la eficacia de las nanopartículas de cobre aplicadas en diferentes tipos de aceros.. .. 1.5 HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN. Con la realización de esta investigación se plantea obtener nanopartículas de cobremediante un proceso amigable con el medio ambiente, de bajo costo y proceso rápido utilizando el sulfato de cobre pentahidratado y extracto de eucalipto evitando así el uso de productos químicos y tóxicos, para posteriormente. ser. aplicadas. a. placas. metálicas. y. así. analizar. el. comportamiento de las poblaciones de echerichiacoli, pseudomona aeruginosa y estaphylococcus aureusasí como también el comportamiento de las nanopartículas enlazadas iónicamente a las placas de acero 1020, acero inoxidable y acero galvanizado que se espera generen la inhibición de estas bacterias.. 1.6 VARIABLES. 1.6.1 Variables independientes . Dilución de nanopartículas (%). . Tiempo de exposición en las bacterias (Hr). 1.6.2 Variable dependiente . Zona de inhibición (mm) 19.

(21) CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO. 20.

(22) 2.1 NANOTECNOLOGÍA 2.1.1 DEFINICIÓN El significado de “Nanotecnología” varía de campo a campo de aplicación, e incluso de país en país, y se usa, de forma muy genérica, para definir todo aquello que es muy pequeño; la nanotecnología se puede definir comúnmente como el entendimiento, control y reestructuración de los materiales en el orden de los nanómetros para crear materiales con nuevas propiedades y funciones asombrosamente novedosas. [1,2]. 2.2 NANOPARTÍCULAS 2.2.1 DEFINICIÓN Una partícula se define como un objeto pequeño que se comporta como una unidad entera en cuanto a su transporte y propiedades. Por convención, las partículas gruesas son aquellas que cubren un rango de 10.000 a 2.500 ƞm, las partículas finas son las que van de 2.500 a 100 ƞm, y las nanopartículas (NPs) (o partículas ultrafinas) son aquellas de tamaño de 1 a 100 ƞm, ya sea que estén dispersos en medios gaseosos, líquidos o sólidos. [1,3]. Figura N° 1 Tamaño de Nanoparticulas ( 0.1 y 100 ƞm). Fuente: NANOCIENCIA Y NANOTECNOLOGÍA, 2009 21.

(23) 2.2.2 PROPIEDADES La búsqueda constante por contar con materiales que exhiban propiedades adecuadas para ciertas aplicaciones y el desarrollo de nuevas herramientas tecnológicas han dado paso a la nanotecnología.Dentro de la nanotecnología la fabricación de nanomateriales (NPs) ha ido en aumento, así como la búsqueda de nuevas propiedades y la aplicación de las mismas en diversas áreas: industriales, biomédicas, ópticas y electrónicas. Los nanomateriales poseen al menos una de sus dimensiones en el rango de 1-100 ƞm, tienen propiedades únicas como resultado de su tamaño pequeño y poseen características estructurales y morfológicas que los hacen ideales para cierto tipo de aplicaciones. En términos generales su preparación se realiza a partir de dos esquemas, el llamado método de arriba hacia abajoen cuyo caso se parte de un material de escala mayor reduciéndolo a escala nanométrica, y del método de abajo hacia arriba en cuyo caso se parte de átomos que son ensamblados hasta obtener partículas en la escala de nanómetros con una estructura cristalina o amorfa [1,2] El origen de las propiedades que presentan las NPs se debe a los cambios en los niveles electrónicos y al incremento de los átomos de superficie respecto a los de volumen. [7,10] Figura N° 2 Algunas propiedades de las Nanopartículas.. 22.

(24) 2.2.3 CLASIFICACIÓN DE LAS NANOPARTÍCULAS La agencia del medio ambiente (EAP) ha clasificado a las nanopartículas en cuatro tipos, los cuales son: los basados en carbono, cuyas formas son: fullereno, nanotubos, grafeno; basados en metales, incluyen nanopartículas de oro, plata y óxidos metálicos; dendrímeros, con forma tridimensional de construcción. arborescente,. son. polímeros. de. tamaño. nanométrico. construidos a partir de unidades ramificadas; los nano compuestos se forman por la unión de dos o más materiales con el fin de obtener propiedades mecánicas. y de conducción ideales, que no se pueden obtener con los. materiales originales. Figura N° 3 Clasificación de las Nanopartículas.. Fuente: Elaboración Propia. 2.2.4 METODOLOGÍAS PARA LA SINTESIS DE NANOPARTÍCULAS De manera general, los métodos de preparación de NPs se clasifican como top-down (utilizan métodos físicos, procesos de molienda) y como bottom-up (métodos químicos en solución coloidal, procesos de formación de partículas a partir de una solución). Los métodos top-down más representativos son: 23.

(25) a) La evaporación térmica, que consiste en el calentamiento hasta la evaporación del material que se pretende depositar. Se lleva a cabo en una cámara de vacío en la que se condensa el vapor sobre una lámina fría requiriendo en todo momento un control preciso de las condiciones de crecimiento para no producir una modificación de la morfología de la capa depositada. b) El depósito químico en fase vapor (CVD, por sus siglas en inglés) que consiste en la descomposición de uno o varios compuestos volátiles, en el interior de una cámara de vacío (reactor), en o cerca de la superficie de un sólido para dar lugar a la formación de un material en forma de capa delgada o de nanopartículas. c) La preparación de clusters gaseosos, que utiliza un láser pulsado de alta potencia para producir vapores atómicos metálicos que son acarreados en un gas inerte y posteriormente son depositados en un óxido monocristalino u otro sustrato, bajo condiciones de ultra-alto vacío. d) La implantación de iones, que consiste en que los iones de un material pueden ser implantados en un sólido, cambiando por tanto las propiedades físicas y químicas de este último, ya que el ion implantado puede ser de un elemento distinto al que lo compone, también se pueden causar cambios estructurales en el sólido implantado, puesto que la estructura cristalina del objetivo puede ser dañada. e) La molienda de partículas de tamaño macro o micrométrico, por medio de molinos de alta eficiencia; las partículas resultantes son clasificadas por medios físicos, recuperándoselas de tamaño nanométrico. Los métodos bottom – up más representativos son: a) El método coloidal, los coloides son partículas individuales, que son más grandes que las dimensiones atómicas, pero lo suficientemente pequeño como para exhibir movimiento browniano. b) Reducción fotoquímica y radioquímica, la síntesis de nanopartículas metálicas modificando el sistema químico por medio de altas energías se 24.

(26) asocia con la generación de reductores fuertes altamente activos como electrones, radicales y especies excitadas. c) Irradiación con microondas, la técnica de irradiación con microondas produce nanopartículas con una muy baja dispersión de tamaño, aunque no siempre se logre un control preciso en la morfología, como pasa en la mayoría de las técnicas de “bottom - up”. d) Utilización de dendrímeros, la síntesis de nanopartículas también se ha llevado a cabo usando micelas, emulsiones y dendrímeros como nanorreactores que permiten la síntesis de partículas de forma y tamaño definidos. e) Síntesis solvotermal, con el nombre general de síntesis solvotermal se agrupan una serie de técnicas en las que un precursor metálico disuelto en un líquido, en un recipiente cerrado, es calentado por encima de su punto de ebullición, lo que genera una presión superior a la atmosférica (normalmente moderada). f) Método sol-gel, es un proceso químico en fase húmeda ampliamente utilizado en la ciencia de los materiales. Este método se utiliza principalmente para la fabricación de nanomateriales (normalmente un óxido metálico).. 2.2.5 CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS Para realizar la caracterización de las nanopartículas es necesario hacer uso de diferentes técnicas basadas en el conocimiento obtenido de la ciencia de los materiales. Entre las técnicas más usadas para realizar la caracterización se describen a continuación:. a) Microscopio Electrónico de Barrido (SEM). b) Microscopia Electrónica de Transmisión (MET). c) Microscopio de Fuerza Atómica. 25.

(27) d) Espectroscopia Ultravioleta y Visible (UV – Vis). e) Dispersión de Luz Dinámica (DSL). f) Espectroscopia Infrarroja (IR). g) Difracción de Rayos X (DRX). h) Análisis Termo gravimétrico (ATG). 2.2.6 APLICACIONES Las nanopartículas tienen una gran variedad de aplicaciones en múltiples campos. En la siguiente tabla podrás encontrar algunas de las aplicaciones más significativas de las nanopartículas y la naturaleza que deben tener las nanopartículas para conseguirlas.. Cuadro Nº 1 Aplicaciones de las Nanopartículas APLICACIÓN. TIPO DE NANOPARTÍCULAS. POTENCIA/ENERGÍA Células solares sensibilizadas por colorante. TiO2 es el más empleado. ZnO y Au. Almacenamiento de hidrógeno. Nanopartículas híbridas metálicas. Mejora de los materiales para ánodo y cátodo para pilas de combustible. Nanoarcillas, CNTs y NPs en CNTs. Catalizadores ambientales. TiO2, cerio. Catalizadores para automoción. NPs cerámicas óxidos metálicos (cerio, zirconio) y metales (Pt, Rh, Pd y Ru). SALUD/MEDICINA Promotores de crecimiento óseo. Hidroxiapatita (HAp) cerámica. Los protectores solares. ZnO y TiO2. Apósitos para heridas antibacterianos. Ag. Fungicidas. Nanopartículas Cu2O. Biolabeling y detección. Nanopartículas de plata y coloides de oro. Agentes de contraste de MRI. Óxidos de hierro ultrapequeños: Fe3O4 y Fe2O3. INGENIERÍA. 26.

(28) Herramientas de cortar trozos. ZrO2 y Al2O3, cerámicos no-óxidos (WC, TaC, TlC) y Co. sensores químicos. Diversas nanopartículas válidas, depende de la aplicación. Resistentes al desgaste / recubrimientos resistentes a la abrasión. Nanopartículas de alumina y Y-Zr2O3. Nanoarcilla polímero reforzado con composites. Organoarcillas (sepiolite, laponite ysmectite). Silicagels y POSS. Pigmentos. Pb, Zn, Mg y Ag. Otras NPs metálicas incluyendo ViO, AlO, CdO y otras. Tintas: conductores, magnéticos, etc (utilizando polvos de metal). Buenos conductores como la plata.. Mejora estructural y física de polímeros y materiales compuestos. Nanoarcillas, nanoóxidos y nanohidróxidos de metales. Montmorillonita modificada orgánicamente, TiO2, Y2O3 o SiO2.. UTENSILIOS DE CONSUMO Barrera de embalaje utilizando silicatos. Nanoarcillas, en particular bentonita y kaolinita. Vidrio autolimpiable. TiO2. MEDIO AMBIENTE Tratamientos de agua (foto-catalisis). Cerámicas óxidos metálicos, TiO2. ELECTRÓNICA Nanoescala partículas magnéticas para la alta densidad de almacenamiento de datos. Fe solo o en combinación con otros metales (o no metales), CoPt o FePt. Circuitos electrónicos. Plata, cobre y nanopartículas de Al. Ferro-líquido (utilizando materiales magnéticos). Fe (posiblemente recubiertas con una capa de carbono), Co, FeCo y Fe3O4. Optoelectrónica dispositivos tales como interruptores (por ejemplo, usando las tierras raras dopadas cerámica). Gd2O3 o Y2O3 dopados con Eu, Tb, Er, Ce. Química mecánica planarización – CMP. Alúmina, sílica y cerio. Fuente: http://carboninspired.com/blog/?p=52. 2.3 EUCALYPTUS GLOBULUS 2.3.1 GENERALIDADES El EUCALYPTUS GLOBULUS, conocido como eucalipto blanco o eucalipto común se clasifica de la siguiente manera: Reino: Plantae 27.

(29) División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Myrtales Familia: Myrtaceae Género: Eucalyptus Especie: globulus Nombre común: Eucalipto Nombre científico: Eucalyptus globulus Labill. subsp. globulus. Es natural de Australia y de Tasmania, donde se pueden encontrar más de 600 especies del género Eucalyptus. Por la rapidez de crecimiento. de. muchas especies, se puede encontrar cultivado en diversas regiones del mundo para la producción de madera, fabricación de pulpa de. papel y. obtención de aceite esencial [95]. En el Perú, el eucalipto (Eucalyptus globulus Labill) se introdujo aproximadamente en 1860. Es en este año que se hicieron los primeros esfuerzos para establecer plantaciones con criterio planificado por parte del Estado. [96]. Figura N° 4 Eucalyptus globulus: árbol, flores y frutos. Fuente: Ing. Agr. Serafina Russo; Toxicidad, efecto antialimentario Yrepelente de metabolitos secundarios…; 2013. 28.

(30) 2.3.2 CARACTERÍSTICAS Árbol perenne de la familia de las mirtáceas de 40 a 65 m de altura. Tallos erectos con corteza que se deshace de color gris azulado. Hojas adultas alternas, lanceoladas de hasta 30 cm de longitud, pecioladas, con el nervio central muy marcado, verde oscuro, brillante, de textura endurecida; hojas jóvenes, sin peciolo que abrazan el tallo, de colores verde gris y opuestos.. Flores solitarias o reunidas en umbelas de tres con numerosos estambres muy destacados y sin pétalos. Frutos en cápsula leñosa de hasta 2,5 cm de longitud, con hasta cuatro celdas que contienen un gran número de semillas. [95] Cuadro N° 2 Caracteristicas del Eucalyptus globulus. Fuente: Instituto Nacional de Tecnología Industrial (INTI). http://www.inti.gob.ar/maderaymuebles/pdf/caracterizacion_maderas/EUCALYPTUS _GLOBULUS.pdf.http://www.unalmed.edu.co/~lpforest/PDF/Eucalipto.pdf. 29.

(31) 2.3.3 PROPIEDADES Ahora bien, la utilización de la madera de eucalipto globulus no está exenta de dificultad puesto que sus propiedades físicas y mecánicas están marcadas por una fuerte anisotropía y heterogeneidad, además de la presencia de tensiones internas de crecimiento, que son especialmente grandes en árboles jóvenes que tuvieron un desarrollo muy rápido. Desde el punto de vista de la apariencia, se trata de una madera clara con color y tono parecidos a los del roble, de ahí que en el mercado internacional se la conozca también por el nombre de "Tasmanian oak" (roble de Tasmania), aunque los radios no sean visibles, ni los vasos se agrupen en anillos. [100 - 101]. Cuadro N° 3 Propiedades Físicas del eucalipto. Cuadro N° 4 Propiedades Mecánicas del eucalipto. Fuente: http://mueblesdomoticos.blogspot.pe/2014/04/el-eucaliptousoscaracteristicas-y.html 30.

(32) Esfuerzo en límite proporcional (ELP). Módulo de ruptura (MOR). Módulo de elasticidad (MOE).. 2.3.4 COMPOSICIÓN QUÍMICA El Eucalyptus globulus posee un alto contenido de lignina en su conformación, en comparación a otras latifoliadas, pero esta lignina es de fácil extracción con un bajo consumo de reactivos químicos. De todos los compuestos naturales de carbono, la celulosa parece ser el más abundante y es el principal componente de todas las maderas. Figura N° 5 Constituyentes Generales del Eucalyptus globulus. Fuente: Ana Casas García; Disolución de madera de Pinus radiata y Eucalyptus globulus en líquidosIónicos…; 2013.. La lignina, que corresponde a un polímero complejo altamente ramificado donde su función principalmente es como relleno o sustancia cementante para impartir rigidez al tejido leñoso. [98 - 99].. 31.

(33) Figura N° 6 Estructura química de la lignina. Fuente: Ana Casas García; Disolución de madera de Pinus radiata y Eucalyptus globulus en líquidos Iónicos…; 2013. Dentro de su composición química destaca su contenido en aceite esencial, terpineol, carburos terpénicos, alcoholes alifáticos, aldehídos y cetonas. Dentro de los alcoholes se encuentra la catequina, que es un antioxidante polifenólico que procede de las plantas como un metabolito secundario.. Figura N° 7 Estructura química del Epigalocatequin galato (EGCG). Fuente: “Epigallocatechin gallate". Chemicalland21.com.. 32.

(34) 2.4 BACTERIAS Las bacterias son estructuras unicelulares que por lo general son menores a los 5 µm, que se reproducen por medio de un proceso asexual denominado fisión binaria que se encuentran constituidas por un conjunto de componentes, los cuales forman el exterior y el interior de este microorganismo procariote. Presentan una envoltura que rodea exteriormente a las bacterias Gram positivas y las Gram negativas, esta estructura presenta una disposición de adentro hacia afuera comenzando con la membrana citoplasmática, pared celular y una sustancia extracelular denominada glicocálix, a su vez, el interior de la bacteria presenta el citoplasma, ribosomas y el ADN cromosómico, estructuras que son elementos permanentes e imprescindibles para la vida de la bacteria [102,103]. Figura N° 8 Tipos de Bacterias. Fuente:https://medicinaupv.files.wordpress.com/2011/04/2-3-clase-morfologc3ada-yestructura-de-laa-bacterias.pdf. 2.4.1 ESCHERICHIA COLI 2.4.1.1 CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS Según el Manual Bergey de bacteriología sistemática son bacterias Gram negativas cilíndricas con 1,1 – 1,5 μm de diámetro por 2,0 – 6,0 μm de largo que se disponen aisladas o en parejas. Conforme a la definición general de la familia Enterobacteriaceae a la que pertenecen, son bacterias quimio heterótrofas facultativas teniendo los metabolismos fermentativo y respiratorio, no forman esporas, están desprovistas de oxidasa, producen catalasa y β-galactosidasa,. 33.

(35) pueden ser móviles por flagelos peritricos o inmóviles y normalmente reducen nitrato a nitrito. [105]. Figura N° 9 Bacilos de Escherichia Coli. Fuente: http://www.betelgeux.es/blog/2016/01/19/escherichia-colicaracteristicas-patogenicidad-y-prevencion-i/. 2.4.1.2 HÁBITAT E. coli es la especie predominante de la microbiota aerobia y facultativa del tracto gastro-intestinal de los animales de sangre caliente y se elimina por las heces al exterior. A pesar de ser el microorganismo facultativo predominante representa una muy pequeña proporción del contenido total de bacterias en este sitio anatómico. Se puede encontrar en el medio ambiente ya que es capaz de sobrevivir algunos días en el agua y los alimentos, de manera que su aislamiento es un indicador de contaminación fecal. [105, 106]. 2.4.1.3 PODER PATÓGENO E. coli es una especie bacteriana de considerable importancia científica, económica y médica. Están incluidas en esta especie cepas no patógenas y otras que son capaces de causar enfermedades entéricas y diversos tipos de infecciones extra intestinales en humanos y animales. La mayoría de las cepas 34.

(36) intestinales de E. coli no son patógenas y coexisten en armonía con el hospedador, algunas incluso lo benefician sintetizando cofactores y. hasta. lo. protegen. de. la. invasión. por. microorganismos. patógenos[106].No obstante, algunas cepas son patógenas y pueden producir. infecciones. entéricas. (diarrea,. disentería,. colitis. hemorrágica, síndrome urémico hemolítico) o extra intestinales (infecciones urinarias, bacteriemias o septicemias, meningitis, peritonitis, abscesos, mastitis, infecciones pulmonares y de heridas). [107].. 2.4.1.4 FACTORES DE VIRULENCIA La virulencia bacteriana en un fenómeno multifactorial. Las cepas patógenas de E. coli poseen diferentes tipos de factores de virulencia que contribuyen conjuntamente a potenciar su patogenicidad. Así, las cepas ExPEC que son caracterizadas por la diversidad de factores de virulencia que poseen, pueden causar infecciones en una diversidad de sitios extra intestinales, tales como el tracto urinario, corriente sanguínea, meninges, cavidad peritoneal y pulmones [105,110].. 2.4.1.5 SENSIBILIDAD A LOS ANTIBACTERIANOS Los. antimicrobianos. más. frecuentemente. empleados. en. el. tratamiento de las infecciones por cepas de E. coli patógenas extra intestinales son la amoxicilina, amoxicilina - ácido clavulanico, cefalosporinas, aminoglicosidos, cotrimoxazol y quinolonas. Sin embargo, la capacidad de E. coli para adquirir genes de resistencia hace impredecible su sensibilidad, por lo que esta debe determinarse siempre mediante antibiograma. Una proporción elevada (40 a 90%) de las cepas de E. coli son resistentes a la ampicilina, estreptomicina, tetraciclinas y sulfamidas. También son muchas (15 a. 35.

(37) 30%) las cepas resistentes a las cefalosporinas de 1ª generación, neomicina, kanamicina, cloranfenicol y quinolonas [105].. 2.4.2 PSEUDOMONA AERUGINOSA 2.4.2.1 CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS La Pseudomona Aeruginosa (PA) es el principal patógeno de la familia Pseudomonadaceae y se identifica por ser un bacilo gramnegativo ligeramente curvado que crece mejor en aerobiosis, es muy versátil nutritivamente y no fermenta hidratos de carbono pero produce ácido a partir de azúcares como la glucosa, fructosa y lactosa o sacarosa. La mayoría de las cepas presentan también un olor característico similar a la uva o a una fruta madura. En relación a la morfología de las colonias puede ser variada y generalmente pigmentadas, se encuentran las típicas colonias que se extienden en la placa con un brillo metálico y con un aspecto gelatinoso, viscoso. [112] Figura N° 10 Pseudomona aeruginosa. Fuente: http//www.waterrscan.co.rs/viruses-andbscteries.php?lng=sr. 36.

(38) 2.4.2.2 HÁBITAT El género Pseudomonas se localiza distribuido en todas partes, por ejemplo en agua, vegetación, suelos, objetos inanimados, gasolina, en humanos, animales, etc., [113] Las especies de Pseudomonas pueden vivir en numerosos hábitats, que van desde diversos tipos de ambientes acuáticos y terrestres, hasta tejidos diversos de animales y plantas, incluyendo frutas y verduras. [114]. 2.4.2.3 PODER PATÓGENO P. aeruginosa es el patógeno humano más importante del género Pseudomonas, tanto respecto al número, como al tipo de infecciones causadas y a la morbilidad y mortalidad asociadas. Aunque ésta especie se encuentra típicamente en suelos y aguas, es también un patógeno oportunista de plantas, y animales. Actualmente P. aeruginosa es reconocida como una fuente común en las infecciones adquiridas de la comunidad y las infecciones nosocomiales. [115]. 2.4.2.4 FACTORES DE VIRULENCIA P. aeruginosa produce una amplia variedad de factores de virulencia, por lo tanto, la patogénesis de esta bacteria puede ser descrita como multifactorial. Algunos de estos factores son el flagelo, fimbrias (pili), matriz exopolisacárida, toxinas, exoenzimas y biopelículas. [116 117].Algunos de los factores asociados a esta elevada mortalidad son neutropenia, presencia de shock séptico, terapia antibiótica inapropiada y origen de bacteriemia en el pulmón [118].. 2.4.2.5 SENSIBILIDAD A LOS ANTIBACTERIANOS P.. aeruginosa. presenta. una. resistencia. intrínseca. a. varios. antibióticos quedando de esta manera limitadas las opciones terapéuticas del tratamiento 37.

(39) Cuadro N° 5 Resistencia Natural de la P. aeruginosaa los antibióticos. Fuente: Acta Bioquím Clín Latinoam 2014; 48 (4): 465-74. 2.4.3 ESTAPHYLOCOCCUS AUREUS 2.4.3.1 CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS Staphylococcus aureus pertenece al género Staphylococcus de la familia Micrococcaceae. Las especies del género Staphylococcus son cocos Gram positivos de 0,5 a 1µm de diámetro, inmóviles, aerobios. y. anaerobios. facultativos,. no. forman. esporas. y. generalmente no están capsulados, debido a la morfología que adoptan las células de Staphylococcus en las tinciones que se realizan a partir de cultivos en medios de agar. El género Staphylococcus se compone de 35 especies y 17 subespecies, Staphylococcus aureus es la especie más patógena y virulenta para el hombre, pero también puede encontrarse colonizando la piel y las mucosas. [120 - 121]. 38.

(40) Figura N° 11 Bacilos de Staphylococcus Áureo. Fuente: https://phil.cdc.gov/details.aspx?pid=11157. 2.4.3.2 HÁBITAT Staphylococcus. aureus. es. un. microorganismo. ubicuo,. con. predilección por la piel, glándulas cutáneas y membranas mucosas de mamíferos. En el ser humano, S. aureus coloniza la piel y las mucosas de distintas localizaciones del cuerpo humano. El lugar más frecuente de colonización de S. aureus se encuentra en la parte anterior de las fosas nasales, seguidas del área perineal-ingles, de la orofaringe y de las axilas. [122]. 2.4.3.3 PODER PATÓGENO La patogenia de las infecciones por S. aureus se produce al combinarse los factores de virulencia bacteriana con una disminución de las defensas del huésped. En su acción patógena intervienen, los componentes de la pared celular y la producción de enzimas y toxinas favorecedoras de la invasión tisular, además de su capacidad para diseminarse y multiplicarse en los tejidos del huésped. Su expresión está regulada por un gen accesorio regulador de proteínas (agr) y pueden ser codificadas por el ADN cromosómico o plasmídico. [123]. 39.

(41) 2.4.3.4 FACTORES DE VIRULENCIA Las condiciones que favorecen la infección de Staphylococcus son: Factores del huésped: es más común las infecciones en niños y en pacientes. seniles,. estadios. hospitalarios,. y. enfermedades. subyacentes (diabetes mellitus tipo II, cáncer, VIH). Factores quirúrgicos:  Ventilación mecánica  Uso de accesos vasculares terapéuticos Atención clínica: uso prolongado e inadecuado de antimicrobianos y múltiples. procedimientos. invasivos.. Condiciones. higiénico. deficientes, contacto estrecho con personas infectadas, materiales contaminados y lesiones cutáneas. [123,124]. 2.4.3.5 SENSIBILIDAD A LOS ANTIBACTERIANOS S. aureus ha desarrollado resistencia a prácticamente todas las clases de antibióticos disponibles Esta resistencia abarca a los inhibidores de la pared celular como los beta-lactamicos y los glucopeptidos, etc. La penicilina y otros beta-lactamicos actúan uniéndose a un grupo de enzimas bacterianas denominadas “penicillin-binding proteins” o PBPs (proteinas de union a la penicilina) que catalizan la transpeptidacion,. la transglicosilacion. y la. carboxipeptidacion,. funciones importantes para la unión cruzada del peptidoglicano a la pared celular. Por lo tanto, las penicilinas inhiben la transpeptidación desestabilizando la pared celular, y como consecuencia se produce la muerte bacteriana. [124]. 2.5. SULFATO DE COBRE PENTAHIDRATADO El sulfato de cobre pentahidratado o sulfato cúprico pentahidratado es el producto de la reacción química entre el sulfato de cobre (II) anhidro y agua. El Sulfato de Cobre pentahidratado es, genéricamente, el compuesto químico de 40.

(42) cobre más importante a nivel industrial. Se le conoce desde épocas remotas como “vitriolo azul”. A partir de él se preparan la mayor parte de todas las demás sales de cobres usadas para fines industriales especiales: otros sulfatos, óxidos, carbonatos, cloruros y oxicloruros. [125]. Figura N° 12 Cristales de Sulfato de Cobre pentahidratado. Fuente: https://www.jonesfish.com/content/copper-sulfate-50-lbs. 2.5.1 OBTENCIÓN Las formas comerciales más importantes de sulfato de cobre son: •. Sulfato de Cobre Anhidro,. CuSO4. •. Sulfato de Cobre monohidratado,. CuSO4 * H2O. •. Sulfato de Cobre pentahidratado,. CuSO4 * 5H2O. Este último puede cristalizar con facilidad, desde soluciones acuosas formando grandes cristales azules de estructura triclínica, o bien, controlando la granulometría, como pequeños cristales celestes conocidos como sulfato “tipo nieve”. Aplicándole calor a los 110°C, pierde moléculas de agua para formar un monohidrato de color blanco verdoso y, posteriormente,. a 250°C la. correspondiente. sal anhidra, que. es. absolutamente blanca. [125,126]. 41.

(43) 2.5.2 PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS Las propiedades se describen en la siguiente tabla: Cuadro N° 6 Propiedades Físicas y Químicas del sulfato de cobre N°. Descripción. Característica. N°. Descripción. Característica. 1. Estado físico:. Sólido granular o polvo.. 15. Solubilidad (0°C):. 316 g/l. 2. Color:. azul transparente.. 16. Solubilidad (100°C):. 2033 g/l. 3. Olor:. inodoro. 17. Coef. de reparto. N/D. (logKo/w): 3. Umbral olfativo:. N/D. 18. Temperatura de. N/D. autoignición: 5. pH:. 4 (5% en solución). 19. Temperatura de. 110°C (230°F). descomposición: 6. Punto de fusión:. Descompone a 110°C (230°F). 20. Viscosidad. N/D. cinemática (cSt a 20°C): 7. Punto / intervalo. N/D. 21. de ebullición: 8. Tasa de. Constante de Henry. N/D. (20°C): N/D. 22. Log Koc:. N/D. El producto no es inflamable. 23. Límites de. N/D. evaporación: 9. Inflamabilidad:. ni combustible. 10. Punto de. N/D. inflamabilidad: 24. inflamación: 11. Densidad (20°C):. Presión de vapor. N/D. (20°C): 2,284 g/cm³. 27. Densidad de vapor. N/D. (aire=1):. Fuente: GTM, 2017. (ND: No Determinado) Reacciona violentamente con hidroxilamina, causando peligro de incendio. Reacciona con magnesio, formando gas inflamable/explosivo.. 2.5.3 APLICACIONES Sus aplicaciones se basan desde el punto de vista de uso como pesticida y no pesticida: 42.

(44) Figura N° 13 Principales Usos del Sulfato de Cobre Pentahidratado. Fuente: Francisca Ignacia Tabilo C., Memoria descriptiva, 2012.. 2.6 POLIVINILPIRROLIDONA (PVP) El polivinilpirrolidona, (PVP) es un polímero de cadena de 1- vinil-2-pirrolidona, PVP es obtenido por una síntesis de varios pasos que concluye por polimerización de vinilpirrolidona en solución acuosa en presencia de peróxido de hidrógeno. Una amplia gama de pesos moleculares, desde unos pocos miles a unos pocos millones, se pueden obtener controlando el grado de polimerización. PVP es un higroscópico polvo blanco y a diferencia de muchos polímeros sintéticos es soluble en una variedad de solventes tradicionales como agua, hidrocarburos clorados, alcoholes, amidas y aminas [127] Los polímeros de PVP están disponibles en varios grados de viscosidad, que van desde bajo a alto peso molecular. Este rango, junto con la solubilidad en sistemas de solventes acuosos y orgánicos combinados con su carácter no tóxico, le da a PVP una gran flexibilidad. Sus aplicaciones industriales incluyen, por ejemplo, adhesivos para mejorar la resistencia y la dureza; en la fabricación de papel para aumentar la resistencia y como resina de revestimiento; y en fibras sintéticas para mejorar la receptividad del tinte. También se utiliza 43.

(45) ampliamente en tintas, imágenes, litografía, detergentes y jabones, las industrias. textil,. cerámica,. eléctrica,. metalúrgica. y. como. aditivo. de. polimerización. [128]. Figura N° 14 Estructura del Polivinilpirrolidona. Fuente: Journal of Chromatographic Science, Vol. 49, July 2011. 44.

(46) CAPÍTULO III PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. 45.

(47) 3.1 PREPARACIÓN DEL EXTRACTO DE EUCALIPTO. 46.

(48) 3.2 CARACTERIZACIÓN DEL EXTRACTO DE EUCALIPTO 3.2.1 ESPECTROMETRÍA FOURIER (FTIR). INFRARROJA. CON. TRANSFORMADA. DE. Esta técnica proporciona un espectro de reflexión de las bandas de los grupos funcionales de las sustancias inorgánicas y orgánicas, por lo cual es posible realizar una identificación de los materiales.. Figura 15 FTIR – EXTRACTO DE EUCALIPTO. Fuente: Anticariogenic and phytochemical evaluation of Eucalyptus globules Labill. 47.

(49) 3.3 BIOSÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS. [ E s c r i b a u n a c i t a d e l d o c u m. 48.

(50) 3.4 CÁLCULOS 3.4.1 SULFATO DE COBRE PENTAHIDRATADO Masa atómica: 𝐶𝑢 = 63.54𝑔 𝑆 = 32.06𝑔 𝑂 = 16𝑔 𝐻 = 1𝑔 𝑪𝒖𝑺𝑶𝟒 . 𝟓𝑯𝟐 𝑶 → 𝟐𝟒𝟗. 𝟔𝒈 . 𝑪𝒖𝑺𝑶𝟒 . 𝟓𝑯𝟐 𝑶 → 𝟏𝑴 en 100ml de agua destilada (0.1Litros) 𝑛 𝑴𝒐𝒍𝒂𝒓𝒊𝒅𝒂𝒅 𝑀 = 𝑛=𝑀𝑥𝑉 𝑉 𝑛 = 1𝑥0.1 = 0.1 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝐶𝑢𝑆𝑂4. 0.1𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝐶𝑢𝑆𝑂4 𝑥. 249.6𝑔 = 𝟐𝟒. 𝟗𝟔𝒈 𝒅𝒆 𝑪𝒖𝑺𝑶𝟒 𝒆𝒏 𝟏𝟎𝟎 𝒎𝒍 𝒅𝒆 𝒂𝒈𝒖𝒂 1𝑚𝑜𝑙. 3.5 REACCIÓN PARA LA FORMACIÓN DE NANOPARTÍCULAS El epigalocatequin galato (EGCG) es un compuesto altamente soluble en agua con una fuerte polaridad y ha actuado como agente reductor y limitador. Como se muestra en la figura , EGCG sirvió como una donante estable (electrón + protón) durante las interacciones. Primero se convirtió en el ion radical “semihidro-EGCG” y luego en deshidro-EGCG mediante oxidación. Deshidro-EGCG y EGCG juntos constituyeron el sistema redox que fue suficiente para reducir Cu2+ a Cu(0). El par solitario de electrones en los grupos polares de EGCG podría haber ocupado las dos órbitas sp del ion de cobre para formar un compuesto complejo. Por lo tanto, EGCG fue tapado con los iones de cobre para sintetizar nanopartículas de Cu (0) a través de la reducción de Cu2.. 49.

(51) Figura 16. Reacción para la formación de nanopartículas de CuO J. Nanostruct Chem (2014) 50.

(52) 3.6 CARACTERIZACIÓN DE LAS NANOPARTÍCULAS DE COBRE 3.6.1 DISPERSIÓN DE LUZ DINÁMICA (DLS) Es una técnica no invasiva y bien establecida para medir el tamaño y distribución de tamaño de moléculas y partículas típicamente en la región submicrométrica inferiores a 1 nm. Las aplicaciones típicas de la dispersión de luz dinámica son la caracterización de partículas, emulsiones o moléculas que se han dispersado o disuelto en un líquido. El movimiento Browniano de las partículas o moléculas en suspensión hace que la luz láser se disperse en diferentes intensidades. Con el análisis de estas fluctuaciones en la intensidad se obtiene la velocidad del movimiento Browniano, y por lo tanto del tamaño de partícula mediante la relación de Stokes-Einstein.. Figura 17 Zetasizer – Tamaño de nanopartículas de cobre al 100%. 51.

(53) Figura 18 Zetasizer – Tamaño de nanopartículas de cobre al 10%. Cuadro 7 Diámetro de NPs al 100%. Cuadro 8 Diámetro de NPs al 10% NANOPARTÍCULAS DE Cu dilución 1:10 (10). NANOPARTÍCULAS DE Cu puro (100) DIÁMETRO (ƞm) 19.200 1.304 4159.000. DIÁMETRO (ƞm) 10.39 96.14 4167.00. % 83.8 9.2 7.0. Gráfico 1 Porcentaje de NPs según su tamaño (100%). Nanopartículas de Cu (%) 9%. % 63.5 32.4 4.1. Gráfico 2 Porcentaje de NPs según su tamaño (10%). Nanopartículas de Cu (%). 7%. 4% 19,200 84%. 1,304 4159,000. 10,39. 32% 64%. 96,14 4167,00. 52.

(54) 3.7 INCUBACIÓN DE BACTERIAS 3.7.1 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO. 53.

(55) 3.7.2 PROCESO DE INOCULACIÓN. 54.

(56) 3.8 MECANISMO ANTIBACTERIAL DEL COBRE El cobre tiene un efecto tóxico sobre las bacterias debido a la liberación de radicales de hidroperóxido, los iones de cobre potencialmente podrían sustituir iones esenciales para el metabolismo bacteriano como el hierro, interfiriendo inicialmente con la función de la membrana celular y luego a nivel del citoplasma alterando la síntesis proteica, ya sea inhibiendo la formación de proteínas o provocando la síntesis de proteínas disfuncionales, alterando la actividad de enzimas esenciales para el metabolismo bacteriano. En otras palabras, el cobre presenta capacidad de donar y aceptar electrones debido a su alto potencial de oxidación y reducción por sus propiedades electroquímicas que permite alterar las proteínas dentro de la célula microbiana impidiendo cumplir su función metabólica. La actividad inhibidora está relacionada con su concentración lo que impide la multiplicación o bien puede actuar como una sustancia bactericida. 1. El Cu inhibe o altera la síntesis de las proteínas, lo que impide el proceso metabólico (actividad bacteriostática) 2. El Cu altera la permeabilidad de la membrana celular y provoca la peroxidación, causa daño oxidativo en los lípidos que son importantes en el intercambio de moléculas del medio intracelular o extracelular y viceversa. 3. El Cu destruye o altera el ADN de las bacterias y virus provocando que los microorganismos pierdan su capacidad de multiplicarse. Una nanopartícula de cobre tiene un mejor efecto bactericida debido a que los materiales de dimensiones próximas al átomo (≤ 100 nm) manifiestan propiedades muy diferentes y de una gran potencialidad. Esto se debe al gran incremento del área de la superficie de la nanopartícula. La extraordinaria área superficial de las nanopartículas origina una redistribución de los átomos, incrementándose la fracción de átomos que se encuentran en su superficie. Los átomos situados en la superficie de las nanopartículas son inestables, tienen un mayor nivel energético. En consecuencia, tienen un mayor potencial de reacción, son muy reactivos químicamente teniendo la capacidad de unirse a otros átomos superficiales, con velocidades de reacción muy superiores y formando enlaces químicos más fuertes. 55.

(57) 3.9 DISEÑO DE LA EXPERIMENTACIÓN. El diseño experimental que se utilizó en la presente investigación es un diseño factorial N = 2k  N = 22 = 4 Pruebas a realizarse. 3.9.1 VARIABLES. 3.9.1.1. 3.9.1.2. VARIABLES INDEPENDIENTES. -. +. Z1 = X1 = Dilución de nanopartículas (%). 10. 100. Z2 = X2 = Tiempo de exposición en las bacterias (Hr). 6. 24. VARIABLES DEPENDENTES Y1 = Zona de inhibición (mm). 3.9.2 CONSTANTES. 3.9.2.1. TIPOS DE PLACAS Acero 1020 Acero Inoxidable Acero Galvanizado. 3.9.2.2. TIPOS DE BACTERIAS Escherichia coli Pseudomona aeruginosa Staphylococcus aureus. 56.

(58) 3.9.3 MATRIZ DE DISEÑO 3.9.3.1. PARA ESCHERICHIA COLI (A1). #. Z1. Z2. Z1 (%). Z2 (Hr.). 1 2 3 4. +1 -1 +1 -1. 1 1 -1 -1. 100 10 100 10. 24 24 6 6. Y1 (mm) =>variable de salida para: Ac. 1020, ac. Inoxidable y ac. Galvanizado. 3.9.3.2. PARA PSEUDOMONA AERUGINOSA (A2). #. Z1. Z2. Z1 (%). Z2 (Hr.). 1 2 3 4. +1 -1 +1 -1. 1 1 -1 -1. 100 10 100 10. 24 24 6 6. Y1 (mm) =>variable de salida para: Ac. 1020, ac. Inoxidable y ac. Galvanizado. 3.9.3.3. PARA STAPHYLOCOCCUS AUREUS (A3). #. Z1. Z2. Z1 (%). Z2 (Hr.). 1 2 3 4. +1 -1 +1 -1. 1 1 -1 -1. 100 10 100 10. 24 24 6 6. Y1 (mm) =>variable de salida para: Ac. 1020, ac. Inoxidable y ac. Galvanizado. 3.10 MATERIALES,HERRAMIENTAS Y EQUIPOS. 3.10.1. MATERIALES. . Eucalipto. . Agua des-ionizada. . Papel filtro 57.

(59) . Sulfato de cobre pentahidratado. . Polivinilpirrolidona. . Bacterias. . Placas de acero (3x3cm). . Agar. 3.10.2. HERRAMIENTAS. . Vaso de precipitados de 250ml. . Matraz Erlenmeyer de 250 ml. . Bagueta. . Placas de Petri. . Espátula Drigalsky. . Tubos de centrífuga de 15 ml. 3.10.3. EQUIPOS. . Balanza electrónica de precisión electrónica. . Cocina elécrica. . Centrífuga. . Horno. . Estufa. . Autoclave.. 3.11 PROCEDIMIENTO DE TRABAJO 3.11.1 APLICACIÓN DE NANOPARTÍCULAS Una vez lista la solución de nanopartículas de cobre suspendidas obtenidas por la mezcla de sulfato de cobre y extracto de eucalipto, se procede a colocar 30 ml en una placa de Petri esterilizada. Seguidamente se sumergen las placas de los diferentes tipos de acero por un periodo de 3 minutos. 58.

(60) Figura 19 Aplicación de las NPs a la placa metálica.. Y finalmente se colocan las placas metálicas en el medio de cultivo correspondiente a cada bacteria. Figura 20 Placas metálicas colocadas en el medio de cultivo. Las placas de Petri se colocaron en la estufa por 6 y 24 hrs. a una temperatura de 37°C.. 59.

(61) Figura 21 Placas de Petri en estufa. 60.

(62) CAPÍTULO IV ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS. 61.

(63) 4.1 COMPARACIÓN DEL TAMAÑO DE NANOPARTÍCULAS La síntesis de nanopartículas de cobre que utilizan plantas ha recibido mucha atención debido a su bajo costo, amigable con el medio ambiente, protocolo rápido y económico y no se usa ningún químico tóxico para la síntesis de nanopartículas. Las biomoléculas presentes en los extractos de plantas son carbohidratos, flavonoides, esteroides, glucósidos, saponinas, triterpenoides, fenoles y compuestos aromáticos que son responsables de la reducción y estabilización de los iones de cobre [55]. La siguiente tabla nos muestra el tamaño de partículas obtenidos por la síntesis de nanopartículas de cobre usando diferentes tipos de plantas. Cuadro 9 Síntesis de nanopartículas de cobre usando plantas. Fuente: “Green synthesis of copper nanoparticles using plant – a review” 2016 Como se observa en el cuadro 9 el tamaño de las nanopartículas de cobre son de 38,62 ƞm y el tamaño de las nanopartículas de cobre obtenidas en el presente trabajo varían entre 19,2 y 10,4 ƞm.. 62.

(64) 4.2 BACTERIAS APLICADAS A LAS PLACAS METÁLICAS SIN NANOPARTÍCULAS Para analizar la reacción de las bacterias ante las placas de ac. 1020, ac. inoxidable y ac. galvanizado, se realizó una incubación de las diferentes bacterias y se colocaron las placas durante un periodo de 24 hrs, con lo cual se pudo observar que ninguno de estos metales por sí solo posee actividad antibacterial.. 4.2.1 ESCHERICHIA COLI Como podemos observar en la fig. , después de 24 horas de incubación de la bacteria Escherichia Coli, en las placas de acero inoxidable y acero galvanizado las bacterias se han reproducido de manera normal incluso sobre las placas y en el caso del acero 1020 por ser un acero de oxidación rápida, las bacterias se mezclan con el óxido y por lo tanto, en los tres diferentes metales notamos que no poseen ningún tipo de actividad antibacterial, por el contrario la bacteria Escherichia Coli se coloniza sobre estos metales.. Figura 22 Placas metálicas en Escherichia Coli. 63.

(65) 4.2.2 PSEUDOMONA AERUGINOSA En la fig. , después de 24 horas de incubación de la bacteria Pseudomona Aeruginosa, las placas han sido recubiertas por completo por las colonias de esta bacteria, comprobándose así que los tres diferentes metales no poseen ningún tipo de actividad antibacterial.. Figura 23 Placas metálicas en Pseudomona Aeruginosa. 4.2.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS Al. igual. que. las. dos. bacterias. vistas. anteriormente,. la. bacteria. Staphylococcus Aureus sigue su crecimiento sobre el acero 1020, acero inoxidable y acero galvanizado, lo que nos indica que esta bacteria se reproduce sobre estos tres metales ya que estos no poseen actividad antibacterial.. 64.

(66) Figura 24 Placas metálicas en Staphylococcus Aureus. 4.3 ANALISIS DE CONTAMINACIÓN DE LAS NANOPARTÍCULAS DE COBRE Este análisis consta en colocar las nanopartículas de cobre en una placa de Petri con agar y esperar 24 horas para luego verificar si las nanopartículas estuvieran contaminadas por algún tipo de bacteria. 4.3.1 NANOPARTÍCULASDE COBRE AL 100% Se colocó aproximadamente 1 ml de la solución de nanopartículas de cobre al 100% en una placa de Petri y se llevó a la estufa por 24 horas a 37°C. Luego de este tiempo como se observa en la Fig. no se encontró rastro de ningún tipo de bacteria con lo que se puede afirmar que las nanopartículas de cobre estuvieron totalmente esterilizadas y no afectaron las pruebas con los. cultivos. de. las. tres. bacterias. estudiadas. en. este. trabajo.. 65.

(67) Figura 25 Nanopartículas de Cu al 100%. 4.3.2 NANOPARTÍCULAS DE COBRE AL 10% Al igual que la figura anterior, las nanopartículas de cobre al 10% tampoco mostraron rastros de cualquier tipo de bacteria, comprobándose así que esta solución también se encontró totalmente esterilizada.. Figura 26 Nanopartículas de Cu al 10%. 66.

(68) 4.4 ZONA DE INHIBICIÓN DE POBLACIONES BACTERIANAS 4.4.1 ESCHERICHIA COLI (A1). Cuadro 10 Zona de inhibición en Escherichia Coli X1 N° 1 2 3 4. Dilución (%) 10 (-1) 10 (-1) 100 (+1) 100 (+1). X2 tiempo 6 24 6 24. Y1 = Zona de Inhibición (mm) (seg) (-1) (+1) (-1) (+1). 3.30 3.00 3.40 3.30. Acero 1020 3.00 3.00 3.50 3.20. 3.28 3.00 3.52 3.26. Acero Inoxidable 3.10 3.20 3.16 3.00 3.00 3.00 4.10 4.30 4.35 3.40 3.60 3.55. Acero Galvanizado 3.60 4.30 4.35 4.10 3.50 3.80 4.80 5.40 5.38 5.40 5.20 5.00. Cuadro 11 Efectos estimados para inhibición acero 1020 (mm) Escherichia Coli Efecto Estimado Error Estd. V.I.F. Promedio 3.23 0.0269258 A:Dilución 0.266667 0.0538516 1.0 B:tiempo -0.206667 0.0538516 1.0 AB -0.0133333 0.0538516 1.0 Errores estándar basados en el error total con 8 g.l.. Cuadro 12 Análisis de varianza para inhibición acero 1020 Escherichia Coli Fuente A:Dilución B:tiempo AB Error total Total (corr.). Suma de Cuadrados 0.213333 0.128133 0.000533333 0.0696 0.4116. Gl 1 1 1 8 11. Cuadrado Medio 0.213333 0.128133 0.000533333 0.0087. Razón-F 24.52 14.73 0.06. Valor-P 0.0011 0.0050 0.8107. 67.

(69) Gráfico 3. Gráfico 4. Gráfica 5. 68.

(70) Gráfico 6. MODELO MATEMÁTICO 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 − 𝐴𝑐𝑒𝑟𝑜 1020 = 3.23926 + 0.00296296 ∗ 𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 − 0.0114815 ∗ 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜. Cuadro 13 Análisis de residuos Acero 1020 Escherichia Coli Fuente A:Dilución B:Tiempo Falta de ajuste Error puro Total (corr.). Suma de Cuadrados 0.213333 0.128133 0.000533333 0.0696 0.4116. Gl 1 1 1 8 11. Cuadrado Medio 0.213333 0.128133 0.000533333 0.0087. Razón-F 24.52 14.73 0.06. Valor-P 0.0011 0.0050 0.8107. 69.

(71) Cuadro 14 Efectos estimados para inhibición acero inoxidable (mm) Escherichia Coli Efecto Estimado Error Estd. V.I.F. promedio 3.48 0.0253585 A:Dilución 0.806667 0.0507171 1.0 B:tiempo -0.443333 0.0507171 1.0 AB -0.29 0.0507171 1.0 Errores estándar basados en el error total con 8 g.l.. Cuadro 15 Análisis de varianza para inhibición-acero inoxidable Escherichia Coli Fuente A:Dilución B:tiempo AB Error total Total (corr.). Suma de Cuadrados 1.95213 0.589633 0.2523 0.0617333 2.8558. Gl 1 1 1 8 11. Cuadrado Medio 1.95213 0.589633 0.2523 0.00771667. Razón-F 252.98 76.41 32.70. Valor-P 0.0000 0.0000 0.0004. Gráfico 7. 70.

(72) Gráfico 8. Gráfico 9. 71.

(73) Gráfico 10. MODELO MATEMÁTICO 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 − 𝐼𝑁𝑂𝑋 = 3.06111 + 0.0143333 ∗ Dilución − 0.00493827 ∗ tiempo − 0.000358025 ∗ Dilución ∗ tiempo. Cuadro 16 Análisis de residuos Acero Inoxidable Escherichia Coli Fuente A:Dilución B:Tiempo AB Error puro Total (corr.). Suma de Cuadrados 1.95213 0.589633 0.2523 0.0617333 2.8558. Gl 1 1 1 8 11. Cuadrado Medio 1.95213 0.589633 0.2523 0.00771667. Razón-F 252.98 76.41 32.70. Valor-P 0.0000 0.0000 0.0004. 72.

(74) Cuadro 17 Efectos estimados para inhibición acero galvanizado (mm) Escherichia Coli Efecto Estimado Error Estd. V.I.F. promedio 4.56917 0.0937602 A:Dilución 1.255 0.18752 1.0 B:tiempo -0.138333 0.18752 1.0 AB 0.145 0.18752 1.0 Errores estándar basados en el error total con 8 g.l.. Cuadro 18 Análisis de varianza para inhibición acero galvanizado Escherichia Coli Fuente A:Dilución B:tiempo AB Error total Total (corr.). Suma de Cuadrados 4.72508 0.0574083 0.063075 0.843933 5.68949. Gl 1 1 1 8 11. Cuadrado Medio 4.72508 0.0574083 0.063075 0.105492. Razón-F 44.79 0.54 0.60. Valor-P 0.0002 0.4818 0.4616. Gráfico 11. 73.

(75) Gráfico 12. Gráfico 13. 74.

(76) Gráfico 14. MODELO MATEMÁTICO 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 − 𝐴𝑐𝑒𝑟𝑜 𝐺𝑎𝑙𝑣𝑎𝑛𝑖𝑧𝑎𝑑𝑜 = 3.80222 + 0.0139444 ∗ Dilución. Cuadro 19 Análisis de residuos Acero Galvanizado Escherichia Coli Fuente A:Dilución Error puro Total (corr.). Suma de Cuadrados 4.72508 0.964417 5.68949. Gl Cuadrado Medio 1 4.72508 10 0.0964417 11. Razón-F Valor-P 48.99 0.0000. 75.

(77) Figura 27 Zona de inhibición E. Coli – 6 y 24 Hrs.. Figura 28 Zona de inhibición E.Coli – 24Hrs.. 76.

(78) 4.4.2 PSEUDOMONA AERUGINOSA (A2). Cuadro 20 Zona de inhibición en Pseudomona Aeruginosa X1 N° 1 2 3 4. X2. Dilución (%) 10 (-1) 10 (-1) 100 (+1) 100 (+1). tiempo 6 24 6 24. Y1 = Zona de Inhibición (mm) (seg) (-1) (+1) (-1) (+1). 3.00 3.00 3.00 3.40. Acero 1020 3.00 3.00 3.40 4.45. 3.00 3.00 3.42 3.80. Acero Inoxidable 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 4.00 3.98 3.35 3.25 3.20. Acero Galvanizado 3.00 3.00 3.00 4.20 4.10 4.05 3.00 3.00 3.00 3.85 3.80 4.10. Cuadro 21 Efectos estimados para acero 1020 (mm) Pseudomona Aeruginosa Efecto Estimado Error Estd. V.I.F. promedio 3.28917 0.0837863 A:Dilución 0.578333 0.167573 1.0 B:Tiempo 0.305 0.167573 1.0 AB 0.305 0.167573 1.0 Errores estándar basados en el error total con 8 g.l.. Cuadro 22 Análisis de Varianza para Acero 1020 Pseudomona Aeruginosa Fuente A:Dilución B:Tiempo AB Error total Total (corr.). Suma de Cuadrados 1.00341 0.279075 0.279075 0.673933 2.23549. Gl 1 1 1 8 11. Cuadrado Medio 1.00341 0.279075 0.279075 0.0842417. Razón-F 11.91 3.31 3.31. Valor-P 0.0087 0.1062 0.1062. 77.