PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE POSTGRADO
ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE HUMANA MEDIADA POR LINFOCITOS T CONTRA ROTAVIRUS
MARTHA CECILIA MESA VILLANUEVA
TESIS
Presentada como requisito parcial Para optar al título de
DOCTOR EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Bogotá, D.C.
Enero de 2010
NOTA DE ADVERTENCIA
"La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis.
Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia"
Artículo 23 de la Resolución No.13 de julio de 1946
ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE HUMANA MEDIADA POR LINFOCITOS T CONTRA ROTAVIRUS
MARTHA CECILIA MESA VILLANUEVA
APROBADO
______________________________ ______________________________
Manuel Antonio Franco, MD, PhD Juana Angel, MD. PhD
Director Directora
_____________________________ ______________________________
Concepción Puerta Bula, Bac. PhD Beatriz Parra, Bac. PhD
Jurado Jurado
______________________________ ___ ___________________________
Carlos Alberto Parra López, MD. PhD Carlos Julio Montoya, MD. PhD
Jurado Jurado
_______________________________
Mauricio Calvo Calle, Mic. PhD Jurado
ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE HUMANA MEDIADA POR LINFOCITOS T CONTRA ROTAVIRUS
MARTHA CECILIA MESA VILLANUEVA
_____________________________ ______________________________
Ingrid Schuler, Biol. PhD Manuel Antonio Franco, MD, PhD
Decana Académica Director de Posgrado
Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias
ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE HUMANA MEDIADA POR LINFOCITOS T CONTRA ROTAVIRUS
RESUMEN
Antecedentes: Rotavirus (RV) es el principal agente etiológico de gastroenteritis (GE) severa en niños menores de 5 años en todo el mundo; sin embargo, los mecanismos de la respuesta inmune sólo se conocen parcialmente. Los trabajos previos con ensayos de citometría de flujo y ELISPOT han detectado LT circulantes CD4+ IFN-+, IL-13+ ó IL-4+ y de LT CD8+ IFN-+ específicos de RV en adultos sanos en frecuencias de 0,00-0,03; estos valores se incrementan aproximadamente 10 veces en adultos con GE-RV; pero son escasos ó inferiores al límite de detección de esas técnicas en niños con GE-RV. En el presente trabajo se estudió si esta respuesta (inferior a las frecuencias de LT específicos de otros virus reportados en la literatura) podría deberse a la secreción de citocinas diferentes, a la presencia de mecanismos reguladores y en el caso particular de los niños a linfopenia ó a la infección de las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) con RV.
Materiales y métodos: i) La producción de citocinas en LTCD4+ y CD8+ específicos de RV fue evaluada en cultivos de CMSP estimulados con RV, tinción intracelular y citometría de flujo. ii) La existencia de mecanismos reguladores se analizó en cultivos similares luego de remoción de células CD25+ ó de inhibición del TGF-. iii) Los valores relativos y absolutos de diferentes poblaciones leucocitarias se determinaron mediante analizadores electrónicos y citometría de flujo. iv) Para analizar la infección por RV de las CMSP de niños con GE-RV primero se analizó la interacción in vitro de las CMSP de adultos sanos con RV. Para esto, las CMSP se cultivaron con RV para determinar la síntesis intracelular de proteínas virales
en linfocitos, monocitos y células dendríticas (CD), el perfil de citocinas inducido por el virus y el papel de las CD en la promoción de la respuesta de IFN-+ por LT específicos de RV.
Posteriormente se evaluó si existían CMSP de niños con GE por RV infectadas por el virus.
Resultados: Se detectaron frecuencias de LTCD4+ circulantes específicos de RV secretores de IFN-/IL2 (>0,02), en aproximadamente 50% de adultos sanos, así como LTCD4+ IL-10+ e
IL-2+ (>0,02) en adultos infectados por RV durante las fases aguda y de convalescencia respectivamente. Por el contrario, en los niños con GE-RV los LTCD4+ y CD8+ circulantes específicos de RV y secretores de IFN-, IL-13, IL-2, IL-10 ó de IL-17 estuvieron por debajo del límite de detección (0,02); adicionalmente sólo se evidenció linfopenia en 5/12 niños con GE-RV. La frecuencia de LTCD4+ y LTCD8+ IFN-+ específicos de RV se incrementó en las muestras de adultos sanos luego de remoción de células CD25+, de inhibición del TGF- y en mayor grado cuando se utilizaron los dos tratamientos. El efecto regulador del TGF-
también se observó en adultos pero no en niños con GE aguda por RV, a pesar de la presencia en ellos de recuentos normales de LTreg TGF-+. En los cultivos de CMSP de adultos sanos expuestas a RV, se observó infección de los linfocitos, células NK, monocitos y CD y secreción de IFN-, pero no de IL-12. También se observó que las CDp participan en la producción de IFN- en los LTCD4+ y CD8+ específicos de RV. Por el contrario, las CMSP de niños con GE aguda por RV no mostraron evidencia ex vivo de infección por RV.
Conclusiones
Los resultados de este trabajo confirman que la frecuencia de LT circulantes Th1/Th2 específicos de RV se encuentra por debajo del límite de detección (0,02%) por tinción intracelular y citometría de flujo en niños menores de dos años y muestran que esto no se
debe a la existencia de un pool de LT secretor de IL-2, IL-10 ni IL-17, ni a la presencia de linfopenia ni a regulación por el TGF-. Adicionalmente permiten proponer que la baja respuesta T pudiera estar asociada con la antigenemia (26/32 niños con GE-RV) y la falta de activación del compartimiento sistémico en las primeras infecciones por RV. Esta suposición se basa en la ausencia de proteínas virales en las CMSP de los niños que contrasta con la infección in vitro de las CMSP de adultos y su eficiente secreción de citocinas inflamatorias e IFN- así como en su participación en la inducción de IFN- por los LT específicos de RV. Por otro lado, la detección de LT CD4+ IFN-+ e IFN-+/IL-2+ sólo en algunos adultos y su ausencia en niños sugiere que la respuesta T contra RV se construye a través de las re-infecciones con inducción de una población de LT IL-2+ que podría corresponder a un pool de memoria, probablemente protector. Aparentemente, junto con el desarrollo de los LT efectores también se inducen mecanismos reguladores mediados por células CD25+ y por el TGF-. Estos mecanismos son responsables parcialmente de las frecuencias de LT específicos de RV observadas en los adultos sanos e infectados por RV.
LISTA DE ABREVIATURAS
Ac Anticuerpo
Acm Anticuerpo monoclonal ADN Acido desoxiribonucleico
Ag Antígeno
ARN Acido ribonucleico
ARN cd Acido ribonucleico de cadena doble ARN cs Acido ribonucleico de cadena sencilla ARN m Acido ribonucleico mensajero
CMH Complejo Mayor de Histocompatibilidad CPA Célula presentadora de Ag
CSA Célula secretora de anticuerpos CMN Células mononucleares
CMSP Células mononucleares de sangre periférica CMV Citomegalovirus
d días
EBV Virus de Epstein-Barr GE-RV Gastroenteritis por RV
GL Ganglio
IFN- Interferón alfa IFN- Interferón gama Ig Inmunoglobulina IL-10 Interleucina 10 IL-13 Interleucina 13 IL-4 Interleucina 4
iLTreg Linfocito T regulador inducido
LB Linfocito B
LCR Líquido cefaloraquídeo LIE Linfocito intraepitelial LTm Linfocito T de memoria LTreg Linfocito T regulador m meses
min minutos
MOI Multiplicidad de infección NLM Nódulo linfoide mesentérico PP Placa de Peyer
RCP Reacción en cadena de la polimerasa RER Retículo endoplasmático Rugoso
RV Rotavirus
TGF- Factor transformante del crecimiento beta TGI Tracto gastrointestinal
TLAI Tejido linfoide asociado al intestino uff unidades formadoras de foco VHS Virus herpes simple
VI Virus de influenza
VLHT-1 Virus de la leucemia T humana tipo 1 VPH Virus del papiloma humano
VV Virus de vaccinia VZV Virus varicela-zoster
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN...1
2. OBJETIVOS...4
2.1. OBJETIVO GENERAL...4
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...4
3. JUSTIFICACIÓN ...5
4. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS...6
4.1. ROTAVIRUS ...6
4.1.1. Estructura... 6
4.1.2. Clasificación ... 7
4.1.3. Ciclo de vida ... 9
4.1.4. Crecimiento en cultivo ... 10
4.1.5. Epidemiología ... 11
4.1.6. Fisiopatología de la infección por RV en humanos... 13
4.1.7. Manifestaciones clínicas... 14
4.2. RESPUESTAINMUNECONTRARV...15
4.2.1. Inmunidad innata... 17
4.2.2. Inmunidad adaptativa... 17
4.2.2.1. Respuesta de LB ...18
4.2.2.2. Respuesta de LT...18
4.2.2.3. Vacunas para RV ...20
5. HIPÓTESIS 1: LOS LT ESPECIFICOS DE RV SECRETAN CITOCINAS DIFERENTES A IFN-, IL-13 E IL-4 ...23
5.1. IL-2 ...24
5.2. IL-10 ...25
5.3. IL-17 ...25
5.4. LT MULTIFUNCIONALES...27
6. HIPÓTESIS 2: LOS LT ESPECÍFICOS DE RV ESTÁN MODULADOS POR LT REG ...32
6.1. POBLACIONES DE LTREG...32
6.1.1. LT reg naturales... 32
6.1.2. LTr1 ...35
6.1.3. LTh3 ... 37
6.2. LA IMPORTANCIA DE TGF- EN EL CONTROL DE LA RESPUESTA INMUNE...38
6.3. MÉTODOS DE ESTUDIO DE LOS LTREG...43
7. HIPÓTESIS 3: LA BAJA FRECUENCIA DE LOS LT ESPECÍFICOS DE RV EN LOS NIÑOS SE RELACIONA CON LINFOPENIA...48
8. HIPÓTESIS 4: LA BAJA FRECUENCIA DE LOS LT ESPECÍFICOS DE RV SE RELACIONA CON INFECCIÓN DE LAS CMSP CON EL VIRUS ...49
9. ARTICULO 1: "A TGF-Β MEDIATED REGULATORY MECHANISM MODULATES THE T CELL IMMUNE RESPONSE TO ROTAVIRUS IN ADULTS BUT NOT IN CHILDREN" ....53
10. ARTICULO 2: "INTERACTION OF ROTAVIRUS WITH HUMAN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS: PLASMACYTOID DENDRITIC CELLS PLAY A ROLE IN STIMULATING MEMORY ROTAVIRUS SPECIFIC T CELLS IN VITRO". VIROLOGY, 2007. 366: 174-184...56
11. DISCUSIÓN GENERAL ...60
12. PERSPECTIVAS...72
BIBLIOGRAFÍA...73
ANEXOS I ...90
1. INTRODUCCIÓN
Desde su descubrimiento en 1973 (Bishop et al., 1973), el rotavirus (RV) ha sido identificado como el principal agente de morbilidad y mortalidad por gastroenteritis (GE) aguda en la población infantil en países desarrollados y en vía de desarrollo, respectivamente (Parashar et al., 2006). El impacto de esta infección sobre la salud pública hizo imperativo el desarrollo de métodos de prevención que condujeron a la generación de las vacunas Rotarix y Rotateq que actualmente se utilizan en varios países (Ward, McNeal, and Steele, 2008). Sin embargo, como los mecanismos de inducción y mantenimiento de la inmunidad contra RV no se conocen claramente, la investigación al respecto sigue vigente con el fin de mejorar las vacunas existentes y de definir marcadores de protección asociados con la infección natural y post-vacunación. La infección natural por RV induce una respuesta inmune no esterilizante que protege de enfermedad severa más no de reinfección, de modo que un individuo se infectará repetidamente con RV e incluso adultos al cuidado de niños con GE aguda por RV pueden presentar síntomas de enfermedad desde leves hasta moderados (Rodriguez et al., 1987). En los primeros años de vida, pocos días después de una infección natural por RV, se detectan anticuerpos (Acs) IgM, IgG e IgA específicos en suero e IgA en heces y algunos estudios muestran que la IgA es un marcador de protección de enfermedad severa; aunque, por razones desconocidas no es una respuesta permanente (Angel, Franco, and Greenberg, 2007). La presencia de estos Acs se correlaciona con proliferación de LT en algunos niños infectados y en los adultos (Offit et al., 1992; Offit et al., 1993); sin embargo, cuando se estudia el perfil de citocinas, para definir la polaridad Th1(IFN-+)/Th2(IL-13 ó IL-4) y la respuesta de LTCD8+ (IFN-+, IL-13+ ó IL-4+) circulantes específicos de RV, sólo se observan frecuencias bajas de LTCD4+IFN-+ así como de LTCD8+ IFN-+ en la mayoría de adultos
sanos e infectados pero sorprendentemente estas respuestas son aún más bajas o nulas en niños con GE aguda por RV (Jaimes et al., 2002; Rojas et al., 2003).
Hasta el momento no se conoce la razón de esta baja respuesta y en el presente trabajo se plantearon las siguientes hipótesis que podrían explicarla.
Hipótesis 1: Los LT específicos de RV secretan citocinas diferentes de IFN-, IL-13 e IL-4, tales como IL-2, IL-10 e IL-17. Esta hipótesis se sustenta en la observación de que durante la respuesta inmune la mayoría de LT no se polarizan, es decir no secretan IFN- ni IL-13/IL-4 sino IL-2 (Iezzi, Scheidegger, and Lanzavecchia, 2001); además, esta población IL-2+ es particularmente relevante porque se asocia con el pool de LT de memoria central (Harari et al., 2006; Sallusto et al., 1999; Seder, Darrah, and Roederer, 2008). La presencia de LT IL- 10+ e IL17+ se supone puesto que son poblaciones cuya generación se favorece en el Tejido Linfoide asociado al intestino (TLAI) (Ahern et al., 2008; Kamanaka et al., 2006) y de hecho, LT IL-17+ se han observado muy recientemente en respuesta a la proteína VP6 de RV en el modelo murino (Smiley et al., 2007).
Hipótesis 2: Los LT específicos de RV están bajo el control de LT reguladores (LTreg). Esta hipótesis se basa en observaciones recientes sobre la existencia de LTreg que modulan la respuesta de los LT efectores específicos de diferentes organismos infecciosos (Belkaid, 2007) y en que el sistema inmune TLAI es un compartimiento que favorece la generación de tres subpoblaciones de células reguladoras: los LTr1 (IL-10+) (Roncarolo et al., 2006), los linfocitos ayudadores tipo 3 (LTh3) (TGF-+) (Faria and Weiner, 2006) y los LTreg convertidos ó inducidos (iLTReg) Foxp3+ (TGF-+) (Curotto de Lafaille and Lafaille, 2009).
Hipótesis 3: Los LT específicos de RV no se detectan en los niños debido a linfopenia: Esta es una alteración homeostática reportada previamente en niños menores de 3 años con GE aguda por RV (Wang et al., 2007).
Hipótesis 4: Los LT específicos de RV son bajos en los niños porque sus CMSP son susceptibles de infección por RV. Esta hipótesis se basa en los hallazgos recientes de antigenemia y viremia en niños infectados por RV (Blutt et al., 2003; Blutt et al., 2007), en la presencia intracelular de proteínas de RV en macrófagos, LB y células dendríticas (CD) de las placas de Peyer (PP) y el bazo de animales infectados por RV. (Ramig, 2007) y en CD derivadas de monocitos (moDC) de adultos humanos expuestas in vitro a RV (Narvaez, Angel, and Franco, 2005). Estas observaciones implican que además de la respuesta inmune localizada en la mucosa intestinal, las partículas infecciosas de RV podrían infectar las células del compartimiento sistémico modificando de alguna forma la respuesta inmune global a RV.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Determinar si la baja respuesta de LT circulantes específicos de RV observada en humanos se debe a variaciones en el perfil de citocinas secretado por los LT, a la presencia de mecanismos reguladores, a linfopenia ó a la infección de las CMSP por el virus.
2.2. Objetivos Específicos
2.2.1. Comparar la producción de IFN-, IL-13, IL-2, IL-10 e IL-17 en los LT circulantes específicos de RV en adultos sanos y en niños y adultos con GE-RV.
2.2.2. Determinar si la respuesta de LT circulantes específicos de RV en adultos sanos y en niños y adultos con GE-RV está regulada por células CD25+ y/ó por el TGF-.
2.2.3. Evaluar la presencia de linfopenia en niños con GE-RV presente ó pasada ó de diferente etiología y su relación con la respuesta de LT específica del virus.
2.2.4. Determinar si las CMSP de adultos sanos son susceptibles de infección in vitro por RV y el perfil de citocinas que secretan.
2.2.5. Evaluar in vitro el papel de las CD plasmacitoides y del IFN- en la inducción de la respuesta de LT de memoria específicos de RV en adultos sanos.
2.2.6. Determinar si las CMSP de niños con GE aguda por RV se infectan in vivo con RV y analizar la relación de esta infección con la respuesta T contra el virus.
3. JUSTIFICACIÓN
La infección por RV causa una elevada tasa de morbilidad y mortalidad en la población infantil a nivel mundial. Aunque la infección natural y las vacunas, actualmente licenciadas para uso en humanos proveen protección contra la enfermedad severa en un contacto posterior al virus, ninguna de ellas induce inmunidad esterilizante y no se conocen los mecanismos responsables. Estos podrían estar asociados con características de la respuesta inmune inducida en el ambiente tolerogénico del intestino y/ó de la respuesta a nivel sistémico que no se han evaluado hasta el momento. Con el fin de mejorar las vacunas existentes y/ó de diseñar nuevas opciones es necesario dilucidar los mecanismos responsables de la respuesta contra RV, caracterizada por la presencia de Acs IgA intestinales y séricos protectores acompañada, sin embargo, de una baja respuesta de LT.
Este conocimiento es crítico para determinar si los RV silvestres o las cepas vacunales inducen respuestas T diferentes de las convencionales Th1/Th2 o mecanismos reguladores que puedan alterar la eficacia de una respuesta inmune ó por el contrario prevenir lesiones inflamatorias en la mucosa intestinal. Además, dado que se han detectado proteínas y ARN de RV e incluso partículas virales infecciosas completas en el suero de animales y niños con GE por RV, es importante determinar si las células de sangre periférica son susceptibles de infección por RV y la forma en que este proceso puede afectar la respuesta inmune. Estas preguntas requieren obligatoriamente una solución, no sólo para reconocer efectos potenciales de la infección natural y de las vacunas en uso que son cepas vivas atenuadas, sino también para el diseño y evaluación de vacunas futuras, como se mencionó anteriormente.
4. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS
En esta parte del manuscrito se expondrán algunos conceptos fundamentales sobre el ciclo de vida y la respuesta inmune general al RV. La revisión del estado del arte se realizará teniendo como hilo conductor las hipótesis propuestas.
4.1. ROTAVIRUS 4.1.1. Estructura
Los RV son virus ARN de doble cadena (ARN cd), desnudos y de simetría icosaédrica que pertenecen a la familia Reoviridae (Estes, 2007). Su genoma está compuesto de 11 segmentos de ARN cd que codifican 6 proteínas estructurales (VP) y 6 proteínas no estructurales (NSP) (Figura 1, tabla 1).
Mediante microscopía electrónica se han caracterizado como partículas morfológicamente similares a una rueda, de 100 nm de diámetro y estructuralmente organizadas en tres capas concéntricas: interna, intermedia y externa. La capa interna está formada por las proteínas VP1, VP2, VP3 y el genoma; la intermedia por la proteína VP6 y la externa por las proteínas VP7 y VP4. Las partículas virales infecciosas completas o de tres capas (TLP/triple layer particles) cuando se tratan in vitro con quelantes de calcio liberan la capa externa de VP4 y VP7 generando partículas de doble capa (DLP/double layer particles) no infecciosas. La partícula tiene unos canales acuosos que comunican el exterior con la capa interna para conducir hacia adentro los metabolitos necesarios en la síntesis del ARN viral; y hacia afuera, el ARN viral recién sintetizado (Prasad Nature 1996). El genoma de RV es muy diverso debido a mutaciones puntuales (ocurren en una tasa de <5 x 10-5 /nucleótido /cada replicación viral), a fenómenos de reasociación y en menor grado a rearreglos genéticos específicamente del gen de la proteína VP6 (Estes, 2007).
4.1.2. Clasificación
Los RV se clasifican serológicamente en varios grupos y múltiples serotipos en cada grupo.
Existen 7 grupos de RV, A-G, de acuerdo con la presencia de epítopes antigénicos de reacción cruzada localizados en la proteína VP6. Los virus de los grupos A, B y C afectan humanos y animales; siendo el grupo A el que con mayor frecuencia causa infección en el hombre; los grupos D-G solamente se han observado en animales; esta restricción de especie es la base de la utilización de vacunas heterólogas (jennerianas) para generar inmunidad en humanos. Los virus que pertenecen a cada grupo, pero no a grupos diferentes, pueden sufrir fenómenos de reasociación. Dentro de cada grupo los RV se clasifican en serotipos de acuerdo con la reactividad de las proteínas VP4 y VP7 frente a Acs
Tabla 1. Características y funciones de las proteínas de RV (Estes, 2007; Franco MA, 2008)
Proteína Características y funciones
VP1 (Pol) Polimerasa de ARN dependiente de ARN, Unión a ARN cs
VP2 (T1) Unión no específica a ARN, necesaria para la actividad replicasa de VP1
VP3 (Cap) Guanililtransferasa, metiltransferasa, proteína básica, hace parte del complejo de transcripción del virión
VP4 (VP5-VP8)
VP5* (-COOH) VP8* (-NH2)
Trímeros de VP4 conforman las espículas de la capa exterior hemaglutinina
Se une a los receptores celulares in vivo e in vitro y media la entrada de los virus a la célula blanco
Proteína de fusión, Involucrado en virulencia Clivada por tripsina en VP5 y VP8
Su variabilidad determina los serotipos P; Genera Acs neutralizantes anti-VP4
Permeabiliza la membrana de la célula blanco y facilita la entrada del virión a la célula blanco Hemaglutinina, altamente variable (contiene los antígenos del serotipo P)
VP6 (T13)
Proteína más abundante del virión
Su variabilidad determina los Ag de grupo (A-G) y subgrupo Necesaria en la transcripción
VP7
Proteína más abundante de la capa externa con alto grado de Glicosilación Fija Ca++
Su variabilidad determina los serotipos G; Genera Acs neutralizantes anti-VP7 homo y heterotípicos
NSP1
Proteína de más alta variabilidad en los RV
¿Restricción interespecie de hospederos?
Ubiquitina ligasa E3 que promueve la degradación de IRF3 e IRF7 en la célula hospedera para inhibir la producción de interferón tipo I
Unión a ARN
NSP2 (Vip)
Unión no específica a ARN cs;Unión a NSP5 y VP1 Regula la autofosforilación de NSP5
Constituyente del viroplasma
Actividad de NTPasa y helicasa; esencial en la síntesis de ARN cd Cataliza el empaquetamiento del ARN m en estructuras tipo core NSP3 Unión al ARN y regulación traduccional
NSP4
Proteína viral que se ubica en la membrana del RER para actuar como receptor de las DLP gemantes y de VP4
Modula los niveles intracelulares de Ca y la replicación del ARN Actividad de enterotoxina
NSP5
unión a NSP2 y NSP6
Kinasa autocatalítica; se une a ARN cs
Componente del viroplasma; esencial para la replicación viral
NSP6 Unión a NSP5
Componente del viroplasma
neutralizantes. Se han descrito 15 serotipos VP7 (ó G, por glicoproteína) y 18 VP4 (ó P;
por sensible a proteasa). La disponibilidad de herramientas de biología molecular ha permitido caracterizar también genotipos G y P con base en la secuencia de nucleótidos del ARN viral y existe una buena correlación entre serotipo y genotipo G, pero no para el P; por esta razón, se ha creado un sistema dual de clasificación para VP4 en el que el serotipo P es seguido del genotipo en paréntesis cuadrados. Por ejemplo, la cepa de RV de monos Rhesus, RRV, es G3P[3] y la humana, Wa, se clasifica como G1P1[8]. A nivel mundial, 5 serotipos (G1-G4 y G9) y tres P (P4, P6 y P8) son los aislados con mayor frecuencia en las infecciones humanas (Estes, 2007). Adicionalmente, también se han descrito los electroferotipos de acuerdo con los patrones de migración de los segmentos de ARN cd de los RV cuando se someten a electroforesis en gel de poliacrilamida; estos patrones son característicos de cada grupo y se utilizan en el laboratorio para verificar la pureza de las preparaciones de RV (Estes, 2007).
4.1.3. Ciclo de vida
In vivo, RV infecta preferencialmente los enterocitos maduros presentes en las puntas de las vellosidades intestinales. Para entrar a una célula, los RV se unen secuencialmente a receptores de la superficie celular con requerimientos que varían entre las diferentes cepas.
Por ejemplo, a diferencia de muchas cepas de RV animales, las cepas humanas no requieren ácido siálico en los pasos de adhesión inicial a la célula blanco, sino moléculas como los gangliósidos GM1 y GM3 y la integrina 21 que se une a VP4 (presente en VP5*
exactamente). Después, el virus se debe unir a un receptor secundario como HSC70 o mediante VP7 a las integrinas X2, 41 ó v3 antes de entrar a la célula. Estas interacciones iniciales de RV con la célula hospedera probablemente ocurren en microdominios de la membrana conocidos como rafts en los cuales ciertas combinaciones y
arreglos de proteínas y lípidos son los responsables de la susceptibilidad o no de una célula al RV. Después de su adhesión, el virus entra a la célula mediante un mecanismo no muy claro que podría ser penetración directa de la membrana plasmática ó endocitosis. En los endosomas, las bajas concentraciones de Ca++ promueven el desprendimiento de la capa externa de modo que las DLPs transcripcionalmente activas entran al citoplasma. Este proceso requiere que antes de entrar a la célula el virus sea activado con tripsina; en efecto, en presencia de la enzima el proceso ocurre en 4-5 minutos (min) y conduce a una infección productiva, pero en su ausencia requiere de 30-50 min y las partículas virales son endocitadas y transportadas a los lisosomas en una ruta que resulta en infección abortiva.
En las DLP transcripcionalmente activas se sintetizan los 11 segmentos de ARN (+) que son expulsados y que actúan como ARN mensajero (ARN m) para la síntesis de proteínas virales estructurales y no estructurales; una de éstas, NSP3, inhibe la síntesis de proteínas celulares. Por otro lado, NSP2 y NSP5 forman estructuras electrodensas llamadas viroplasmas donde ocurre el empaquetamiento del ARN viral, la replicación y el ensamblaje de las DLP y los ARN cs se convierten en ARN cd. Las proteínas virales VP4, VP7, NSP1, NSP3 y NSP4 no hacen parte del viroplasma pero se requieren en otros procesos. NSP4 se fija a la membrana del retículo endoplasmático rugoso (RER) y desde allí se une a VP6 presente en las DLPs para facilitar su gemación al espacio intraluminal del RER. Allí, las DLP se cubrirán con VP7 y VP4 para dar origen, en una secuencia de pasos aún no entendida, a las TLPs que son expulsadas del RER y luego de la célula antes o durante una lisis, aparentemente de tipo apoptótico. Aproximadamente se liberan 1x1011 partículas virales/g materia fecal muy resistentes a la degradación a temperatura ambiente, lo cual facilita la transmisión de RV entre los hospederos (Estes, 2007)
4.1.4. Crecimiento en cultivo
In vitro, los RV pueden unirse a muchos tipos de células pero sólo infectan eficientemente líneas celulares derivadas de adenocarcinoma de colon humano como Caco-2 y HT29 y de riñón de mono, MA104. En estos cultivos, el rendimiento de partículas virales se incrementa en presencia de tripsina que cliva la proteína VP4 en los fragmentos VP5' y VP8' (Estes, 2007). Generalmente en el laboratorio se utilizan sobrenadantes de células MA104 lisadas que contienen tanto TLPs como DLPs; sin embargo, para algunos experimentos se utilizan solamente TLPs purificadas que se obtienen mediante ultracentrifugación en gradientes de densidad de CsCl, porque los lisados pueden contener un exceso de proteínas virales libres y de DLPs o de otros moduladores que interfieran con los experimentos in vitro. A pesar del tratamiento con tripsina, el rendimiento de los cultivos de RV humanos es muy bajo; por eso, en el presente trabajo, la mayoría de ensayos se realizó con lisado de células MA104 infectadas con la cepa de RV de simio, RRV. En algunos experimentos seleccionados se utilizaron lisados de células MA104 infectadas con la cepa de RV humano, Wa ó TLPs purificadas de RRV o Wa; en todos los casos se confirmó la cepa de RV mediante electroferotipificación.
4.1.5. Epidemiología
Los RV son de distribución mundial e infectan a la mayoría de niños antes de los dos años de edad. La incidencia es similar en países desarrollados y en vía de desarrollo de modo que las condiciones de higiene y sanitización y el mejor cubrimiento de los servicios de salud no controlan la infección. En las zonas templadas, las infecciones se producen en los meses (m) más fríos pero en la zona ecuatorial RV tiene un patrón de presentación más bien endémico. RV es responsable del 8% de casos, 28% de consultas ambulatorias y 39% de hospitalizaciones por diarrea entre los niños menores; la diarrea que produce es más severa comparada con la causada por otros organismos, frecuentemente se asocia con
deshidratación y causa aproximadamente 1600 muertes diarias en el mundo (Parashar et al., 2006).
La incidencia de los serotipos de RV varía con la ubicación geográfica y la estación. Los más comunes son G1-G4 y G1P1A [8]; siendo esta última la cepa asociada con más de 70% de infecciones rotavirales en Norteamérica, Europa y Australia pero sólo con 30% en Latinoamérica y Asia y 23% en África. Desde 1990, el serotipo G9 se ha asociado con GE más severa en Latinoamérica y G12 con brotes en la India (Estes, 2007).
La infección por RV se transmite por via fecal-oral y respiratoria; RV se aísla de agua tratada y no tratada pero la transmisión por el agua es baja por la inestabilidad del virus en humedad relativamente alta (Estes, 2007). La transmisión a partir de alimentos es rara pero las ostras y mejillones pueden estar fuertemente contaminados. Debido a que RV se excreta en altas concentraciones en las heces y retiene su infectividad por muchos meses a temperatura ambiente, las superficies como teléfonos, fuentes de agua y mesas son sitios comunes de contaminación en los centros asistenciales; las infecciones por RV son frecuentes en guarderías y servicios pediátricos de los hospitales (Estes, 2007). Como no existen reservorios animales debido a la restricción de especie, es probable que una fuente de infección sean los adultos sanos que excretan RV en las heces. En neonatos la infección por RV es frecuentemente asintomática probablemente por la presencia de IgG materna adquirida transplacentariamente. El pico de incidencia de infección por RV en niños está entre 6-11 m de edad en países en vía de desarrollo y en el segundo año de vida en países desarrollados. Las reinfecciones son muy comunes; los niños se reinfectan 1, 2, 3, 4 y 5 veces en un 96, 69, 42, 22 y 13% respectivamente, aunque la severidad de la enfermedad disminuye después de la primera infección, presumiblemente debido al desarrollo de
inmunidad homo y heterotípica (Velazquez et al., 1996). En niños infectados la excreción del virus determinada por ELISA y PCR se presenta hasta 10, 20 y 25-57 días (d) post-diarrea en 43%, 70% y 30% de los casos respectivamente. Las infecciones también pueden ocurrir en adultos y son frecuentes en adultos mayores; un 50% de adultos que cuidan niños con diarrea por RV se infectan y 50% de ellos presentan síntomas leves (Rodriguez et al., 1987).
En un estudio realizado en Colombia en los años 2003-2004 en Bogotá, Barranquilla y Cali se detectó RV como causa de diarrea en el 50% de los casos siendo motivo de 16 hospitalizaciones/1000 y 1 muerte/2000 niños. En 199 casos positivos por ELISA, se encontraron los genotipos G3P8, G2P4, G1P8 y mixtos con frecuencias de 32,7; 21,1; 19,1 y 8,5%, respectivamente. En Bogotá el genotipo más frecuente fue G1P8 (36,9%) seguido por G3P8 (29,2%) y G2P4 (16,9%) (Caceres et al., 2006). El CDC estima que la infección por RV ocasiona 1318 muertes cada año en Colombia (http://www.cd.cgov/ncidod/EID/vol9no5/02-0562).
4.1.6. Fisiopatología de la infección por RV en humanos
Convencionalmente se considera que RV se replica exclusivamente en los enterocitos maduros de las puntas de las vellosidades del intestino delgado (Estes, 2007); sin embargo, la mayoría de infecciones en animales y niños menores se asocian con presencia de Ag (Blutt et al., 2003), ARN (Ray et al., 2006) e incluso de virus infecciosos en sangre (Blutt et al., 2007); además, la replicación viral extraintestinal también ha sido evidenciada en el modelo murino (Fenaux et al., 2006).
La infección por RV causa cambios histológicos y fisiológicos en la mucosa del intestino delgado que van desde mayores en niños a escasos ó ausentes en adultos. El epitelio
cambia de columnar a cuboide lo que resulta en acortamiento y atrofia; las células en las puntas vellosas se desprenden y en la lamina propia aumenta el número de células reticulares y la infiltración por células mononucleares (CMN); sin embargo, los síntomas no se correlacionan con el daño histológico (Ramig, 2004; Ramig, 2007). La patogénesis de la infección del tracto gastrointestinal (TGI) por RV no es clara y se atribuye a diferentes causas: malabsorción, secreción, aumento de la permeabilidad y estímulo del sistema nervioso entérico. La malabsorción, secundaria a la destrucción de los enterocitos, produce un aumento del bolo alimenticio no digerido hacia el colon que ocasiona diarrea osmótica.
Los otros tres factores parecen estar relacionados con la proteína viral NSP4. Esta proteína se comporta como una enterotoxina y eleva la concentración intracelular de calcio, lo cual produce ruptura de las "tight junctions" permitiendo el escape de líquido y en las células de la cripta, un incremento en la secreción de Cl- y de agua. Además, NSP4 produce activación del sistema nervioso entérico aumentando la secreción de fluido intestinal y de electrolitos (Ramig, 2004; Ramig, 2007).
4.1.7. Manifestaciones clínicas
Después de ingestión de RV sigue un periodo de incubación de 2-4 d antes de la aparición de GE aguda. El cuadro clínico se caracteriza por vómito repentino de 1-2 d de duración, seguido de diarrea acuosa por 5 d aproximadamente acompañada de fiebre, deshidratación, anorexia, náusea, cólico y malestar que pueden ser leves y de corta duración o tan severos como para producir deshidratación. La enfermedad es más grave en niños de 6-24 m de edad y generalmente es autolimitada con una duración de 4-8 d ó de hasta 2-14 d cuando requiere hospitalización. El diagnóstico preciso se realiza mediante detección de Ag ó ARN viral en las heces, aunque no se requiere con fines terapéuticos (Rodriguez et al., 1977).
Un aspecto importante de la infección por RV es su diseminación extraintestinal y la asociación con manifestaciones sistémicas tales como compromiso hepático (hepatitis transitoria), respiratorio (tos, faringitis, otitis media, neumonía), de piel (exantema) y neurológico (encefalitis, meningitis, convulsiones); incluso, en muchos estudios se han detectado proteínas y/ó ARN viral en secreciones respiratorias y LCR de los niños afectados (Ushijima et al., 1994). También se han reportado casos aislados de GE por RV asociados con complicaciones y muerte y presencia de proteínas y/ó ARN viral en bazo, corazón, pulmón, riñón, testículos, vejiga, glándulas adrenales y páncreas (Lynch et al., 2003); sin embargo, hacen falta estudios experimentales en animales y de vigilancia epidemiológica en humanos que permitan establecer si la presencia de RV durante el curso de manifestaciones sistémicas es sólo aleatoria ó si RV es su agente causal (Ramig, 2007).
4.2. RESPUESTA INMUNE CONTRA RV
Por su replicación en el intestino, se ha asumido tradicionalmente que los mecanismos inductores y efectores de la respuesta inmune contra RV se generan y actúan en la mucosa intestinal; sin embargo, la presencia de antigenemia (Blutt et al., 2003) y viremia (Blutt et al., 2007), descritas recientemente en modelos animales y en niños con GE aguda por RV, sugieren la participación de una respuesta inmune sistémica que hasta el momento no se conoce. Se considera que la PP es el principal sitio de inducción de la respuesta inmune en el intestino. Los RV se unen a las células M y a través de ellas, los Ags virales son transportados a las CPA de la PP y del nódulo linfoide mesentérico (NLM). Estas células presentan los Ags para activación de los LTh seguido de expansión de LT y LB. Desde los NLM los linfocitos efectores salen por los linfáticos eferentes para llegar al conducto torácico y desembocar en la circulación sanguínea para migrar luego de regreso a la lamina propia y las PP a través de las vénulas post-capilares. Esta migración al intestino está mediada por la
integrina 47 y el CCR9 en la membrana de los linfocitos, que interactúan respectivamente con MAdCAM1 y TECK del endotelio de las vénulas postcapilares del intestino (Butcher et al., 1999; Kunkel et al., 2000; Rott et al., 1997). Se presume que los Ags virales en el compartimiento sistémico estimulan adicionalmente la formación de linfocitos efectores y células secretoras de Acs (CSA) que se establecen en MO y de linfocitos memoria que se ubican en el bazo (Malik, 2008).
Como en humanos es difícil estudiar la respuesta inmune directamente en la mucosa intestinal, la mayoría de observaciones derivan de modelos animales y de algunos estudios en adultos y niños en los que se caracterizan los linfocitos circulantes específicos de RV, a modo de una ventana que permite detectar los linfocitos generados en el TLAI cuando van de regreso al intestino (Kantele et al., 1999). Los modelos animales más utilizados son el murino, tanto en ratones lactantes como adultos; el porcino y el de los primates no humanos conocidos como monos Rhesus. Sin embargo, ninguno de ellos reproduce la enfermedad ni la respuesta inmune de modo similar al humano; por ejemplo, los ratones lactantes desarrollan GE pero a diferencia de los niños, adquieren inmunidad protectora después de una infección primaria por RV (Franco, 1999) aunque sus respuestas de Acs y de LT a los RV homólogos son bajas y curiosamente son mayores frente a RV heterólogos, tal vez porque estos tienen una mayor tasa de replicación extra-intestinal. En los ratones adultos, la infección por un RV homólogo desencadena una respuesta de LB y LT en la que los LTCD8+ participan en la resolución oportuna de la infección primaria y los LTCD4+ tienen un papel importante pero no esencial en la generación de la IgA específica intestinal, la cual es el principal marcador de protección a largo plazo contra la infección por RV (Franco, Angel, and Greenberg, 2006). En humanos la importancia de los LB y LT se hace obvia al considerar
los pacientes con inmunodeficiencia severa combinada, en los cuales RV ocasiona infección crónica, síntomas prolongados e infección extraintestinal (Gilger et al., 1992).
4.2.1. Inmunidad innata
La replicación de RV en el intestino es clave en la inducción de la respuesta inmune debido a mediadores solubles, secretados por los enterocitos y otras células, que modulan la respuesta adaptativa en una forma que no se conoce claramente. Las citocinas IL-8, IL-1, IFN- e IFN- se observan en el intestino de ratones infectados por RV (Rollo et al., 2005;
Rollo et al., 1999; Sheth et al., 1996) e in vitro, pueden inducir una resistencia dependiente de la dosis a la infección por RV (Bass, 1997). Sin embargo, nuestro grupo mostró recientemente que las células Caco-2 infectadas con RV producen IL-8, PGE2, bajas concentraciones de TGF- y nulas de las citocinas pro-inflamatorias IL-1, IL-6, IL-12p70 y TNF-, un ambiente claramente anti-inflamatorio (Rodriguez et al., 2009). Este ambiente podría ser inducido en parte por el mismo virus; de hecho, RV tiene varios mecanismos para regular negativamente la síntesis de citocinas de la respuesta innata temprana. Entre estos mecanismos se encuentran la degradación en el proteasoma de los factores de transcripción IRF3, IRF5 e IRF7, involucrados en la síntesis de IFN- (Barro and Patton, 2005; Barro and Patton, 2007), la inhibición de la señalización de IFN-I e IFN-II en las células blanco mediante bloqueo de la traslocación de STAT1 y STAT2 al núcleo (Holloway, Truong, and Coulson, 2009) y la inhibición de la síntesis de IFN- mediante retención de NFB en el citoplasma bien sea por secuestro en los viroplasmas o por bloqueo de la degradación de I- (Graff, Ettayebi, and Hardy, 2009). Es probable que estos eventos estén asociados con la inflamación leve de la mucosa intestinal característica de la infección por RV (Ramig, 2004).
4.2.2. Inmunidad adaptativa
4.2.2.1. Respuesta de LB
En humanos, la infección aguda por RV induce la producción de Acs IgM séricos que son reemplazados por IgG e IgA; también se observa IgM intestinal seguida de IgA y muy bajos niveles de IgG (Uhnoo et al., 1988). Los títulos de IgG e IgA séricas y de IgA fecal se correlacionan con protección luego de infección natural, aunque esta observación no es consistente y la respuesta de IgA es de corta duración, tal vez porque no se generan LB de memoria de larga vida (Angel, Franco, and Greenberg, 2007). Los Acs anti-RV están dirigidos contra diferentes proteínas virales. Los Acs anti-VP4 y anti-VP7, por su efecto neutralizante, se consideran protectores; sin embargo, los títulos de Acs homo y heterotípicos no siempre se correlacionan con protección, lo cual sugiere que mecanismos adicionales están involucrados. Por ejemplo, en el modelo murino se han identificado Acs IgA anti-VP6 protectores (Burns et al., 1996) y un estudio in vitro sugiere que en su transcitosis hacia el lumen intestinal la IgA anti-VP6 puede inhibir la replicación de RV en el interior de las células epiteliales (Corthesy et al., 2006). En humanos, los Acs anti-VP6 así como anti-NSP4 están siendo estudiados para establecer su utilidad como marcadores de protección de la infección y/ó de la enfermedad (Angel, Franco, and Greenberg, 2007; Malik, 2008).
4.2.2.2. Respuesta de LT
En humanos, la respuesta inmune T contra RV se estudia in vitro mediante cultivos de CMSP totales ó de subpoblaciones aisladas que se estimulan con RV ó sus proteínas para evaluar la proliferación y/ó la síntesis de citocinas. En los ensayos de linfoproliferación se han observado respuestas de magnitud variable en adultos sanos pero ninguna en células de sangre de cordón estimuladas con partículas virales completas de RV de las cepas Wa, SA11 y NCDV (Makela et al., 2004; Totterdell et al., 1988; Yasukawa, Nakagomi, and
Kobayashi, 1990). En niños sanos menores de 6 m, el porcentaje de respuestas proliferativas a RV es bajo y se incrementa con la edad de modo que hacia los 5 años, el 80% es positivo (Offit et al., 1992). En algunos niños con GE-RV se observan respuestas proliferativas bajas que decaen rápidamente para ser casi indetectables al cabo de 12 m post-infección (Makela et al., 2004; Offit et al., 1993). También se ha observado proliferación en 50% de adultos sanos en respuesta a NSP4 (Johansen et al., 1999). En general, la linfoproliferación frente a RV es fuerte y consistente en adultos pero declina rápidamente en niños con infección confirmada por RV.
En contraste, en estudios del grupo diseñados para determinar la polarización Th1 (IFN-+) / Th2 (IL-13 ó IL-4) en la respuesta inmune contra RV mediante citometría de flujo se ha observado que la frecuencia de LTCD4+ IFN-+ (Th1) específicos del virus es aproximadamente de 0,03% en adultos sanos, que se incrementa hasta unas 10 veces durante la fase aguda de una GE-RV; y que no hay LTCD4+ IL-13+ (Th2); adicionalmente se evidencian porcentajes similares para LTCD8+ IFN-+. Por el contrario, la frecuencia de LTh1 (IFN-+), LTh2 (IL-13+) y CD8+ IFN-+ específicos de RV en niños con GE-RV de 4-24 m es muy baja o inferior al límite de detección de la citometría de flujo (Jaimes et al., 2002).
Resultados similares para LTh1 (IFN-+) y Th2 (IL-4+) se han observado en adultos sanos y niños con GE-RV mediante ELISPOT así como valores similares de CD8+ IFN-+ en adultos sanos (Kaufhold et al., 2005; Rojas et al., 2003). En algunos niños con GE-RV se detectan LT CD8+ IFN-+ (Rojas et al., 2003) y CD4+ IFN-+ específicos de RV (Malik et al., 2008) por ELISPOT. En conjunto estos resultados muestran que la respuesta de LT específicos de RV secretores de las clásicas citocinas Th1/Th2 es baja en niños y que por el contrario la respuesta de LTCD4+ y CD8+ secretores de IFN-+ es detectable en adultos. Es probable que esta menor respuesta a RV en periferia se deba a la acumulación preferencial de LT de
memoria (LTm) en intestino u otros órganos (Masopust et al., 2001) ó a la polarización hacia un fenotipo secretor de citocinas diferentes, siendo interesante la existencia de LTh17 en respuesta a la proteína VP6 acoplada a la proteína adyuvante LT de E.coli en ratones (Smiley et al., 2007). Otras alternativas posibles se relacionan con procesos ineficientes de activación y polarización que generarían LT anérgicos (Faria and Weiner, 2005), o no polarizados (no secretores de citocinas) (Sad and Mosmann, 1994) que mantienen la capacidad de proliferar. Estas situaciones son factibles en el TLAI debido a la presencia de CDs secretoras de moléculas que favorecen la inducción de respuestas tolerogénicas a Ags de alimentos y bacterias comensales. Las CD de las PP murinas, por ejemplo, secretan mayores cantidades de TGF- e IL-10 que las de bazo (Sato and Iwasaki, 2005), y además, producen ácido retinoico, metabolito necesario para la generación de LTreg TGF-+ (Manicassamy and Pulendran, 2009). Finalmente como en niños con GE-RV se ha reportado linfopenia (Wang, 2007) y antigenemia/viremia (Blutt et al., 2003; Blutt et al., 2007), es probable que la baja respuesta T detectada in vitro pudiera estar asociada con la interacción de las CMSP con Ags o partículas virales completas de RV.
4.2.2.3. Vacunas para RV
Como la infección natural por RV protege de enfermedad severa, las vacunas se han diseñado con virus vivos atenuados. Los primeros ensayos se hicieron con RV de animales (procedimiento jenneriano) basado en dos premisas, primera que los virus heterólogos son naturalmente atenuados para el hombre y segunda, que el reconocimiento heterotípico protege. La primera vacuna que se utilizó fue la RIT4237 G6P [1] bovina que resultó efectiva en Finlandia con una protección mayor de 80% para un virus heterotípico humano pero que no fue eficaz en países en vía de desarrollo. En 1998 se introdujo en Estados Unidos de Norteamérica, Rotashield, conformada por la cepa RRV de monos Rhesus, G3P3, que
comparte G3 con las cepas de RV humanas y que además contenía virus reasociados para los genes de VP7 de las cepas humanas G1, G2, y G4; sin embargo, se retiró un año más tarde por una asociación baja pero significativa con intususcepción (Murphy et al., 2003).
Actualmente se utilizan dos vacunas en humanos, Rotateq y Rotarix. Rotateq (Merck) es una vacuna reassortant bovina-humana pentavalente; está basada en la cepa bovina WC3 G6P[5] y contiene reassortants para los genes de RV humano G1, G2, G3, G4 ó P1A[8]
(procedimiento jenneriano modificado). Esta vacuna reduce los casos de GE por RV G1-G4 en un 75%, la GE severa en un 98% y las hospitalizaciones y emergencias en un 95%
(Vesikari et al., 2006). Rotarix (GlaxoSmithKline) es una vacuna basada en la cepa humana de RV 89-12 que pertenece al tipo más común en el mundo, G1P1A[8] que fue aislada de un niño con GE por RV y atenuada mediante múltiples pases en cultivo. La eficacia fue mayor de 86% contra diarrea severa causada no solo por G1P[8] sino también contra las relacionadas en VP4, G3P[8], G4P[8] y G9P[8]; y, solo del 41% contra la cepa G2P[4]
(Ward, McNeal, and Steele, 2008). Dos dosis dan 89% de protección contra cualquier enfermedad por RV y 100% de protección contra infección severa (Bernstein 1999).
Actualmente se aplica en más de 100 países del mundo incluido Colombia (Ruiz-Palacios 2006; Vesikari 2006). Curiosamente y similar a Rotateq, Rotarix protege en un 59% de hospitalizaciones por GE de cualquier origen. Los estudios de seguridad pre-licenciatura y post-licenciatura de las vacunas han demostrado que no aumentan significativamente el riesgo de intususcepción (Angel, Franco, and Greenberg, 2007). Desafortunadamente, el costo de producción de estas vacunas es muy elevado, su eficacia ha sido menor en países en vía de desarrollo (Patel et al., 2009) y se desconoce su papel profiláctico contra serotipos emergentes como G12. Adicionalmente, aunque los niveles de IgA anti-RV post- inmunización se asocian con protección contra la infección, los resultados de diferentes trabajos son variables. Estas observaciones hacen imperativa la necesidad de un mejor
conocimiento de la respuesta inmune a RV, tanto para el mejoramiento y/ó diseño de nuevas vacunas, así como para la determinación de mejores marcadores de protección. Como se mencionó anteriormente, algunas hipótesis que explicarían la baja respuesta inmune de LT a RV se analizaron en el presente estudio y su relevancia se presenta a continuación.
5. HIPÓTESIS 1: LOS LT ESPECIFICOS DE RV SECRETAN CITOCINAS DIFERENTES A IFN-, IL-13 e IL-4
La población de LT que responde ante un antígeno es heterogénea en fenotipo y función. El entendimiento actual sobre esta heterogeneidad se basa en dos paradigmas: El paradigma de la polarización Th1/Th2 (Mosmann et al., 1986) y el paradigma de la existencia de LT de memoria central (LTCM) y de memoria efectora (LTEM) (Sallusto, Geginat, and Lanzavecchia, 2004). Sin embargo, en los últimos años se ha observado que existen poblaciones de LT distintos a Th1(IFN-+) / Th2 (IL-4+, IL-5+, IL13+) (Sallusto and Lanzavecchia, 2009) y que las funciones de los LTCM y los LTEM se sobrelapan en algunas infecciones (Seder, Darrah, and Roederer, 2008).
En el caso de la polarización Th1/Th2, se ha observado que dependiendo del Ag, la fuerza de la señal vía TCR, las moléculas coestimuladoras, las citocinas y el entorno tisular, se generan a veces LTh17 (IL-17+, IL-22+), LTreg inducidos (iLTreg) (TGF-+), LTreg tipo 1 (LTR1) (IL-10+), LT ayudadores de los LB en el folículo linfoide (LTFH) (IL-21+), LTh0 (IFN-+/IL- 13+) y LT no polarizados (IL-2+) (Sallusto and Lanzavecchia, 2009; Seder, Darrah, and Roederer, 2008). Por esta razón cuando en el estudio de la respuesta inmune contra un organismo infeccioso sólo se analizan unas pocas citocinas como IFN- e IL-13 se incurre en el error de ignorar la posible existencia de otras poblaciones celulares. Adicionalmente, la citometría multiparamétrica ha permitido detectar poblaciones de LT multifuncionales, que secretan 2 o más citocinas ó moléculas efectoras; como LT IFN-+/IL-2+, LT IFN-+/TNF-+, LT IFN-+/IL-10+, LT IFN+/TNF-+ /IL-2+, LT IFN+/IL-17+, etc.
En cuanto al paradigma LTCM (CCR7+/CD62L+/CD45RO+/CD127+ ó CD27+/CD28+, secretores de IL-2+ y rápidamente proliferantes, presentes en órganos linfoides secundarios) / LTEM
(CCR7-/CD62L-/CD45RO+/CD127-/+ ó CD27+/CD28-, no proliferantes, secretores rápidos de IFN-+ ó IL-13+) (Harari et al., 2006), varios estudios han mostrado que en la respuesta al virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV) y virus de vaccinia (VV) en humanos, existen poblaciones de LTEM como fuente principal de IL-2, de modo que la denominación LTCM / LTEM basada en los parámetros descritos anteriormente puede ser inadecuada, al menos en algunas infecciones y se estudia actualmente la relación de los linfocitos multifuncionales con el fenotipo LTCM / LTEM así como con el de LT efectores y LT efectores terminalmente diferenciados (Harari et al., 2006; Seder, Darrah, and Roederer, 2008).
En la respuesta inmune a RV, el estudio de linfocitos T secretores de IFN-, IL-13 e IL-4 ha permitido establecer que existe una respuesta de memoria Th1 y de LTCD8+ IFN-+ específicos de RV en sangre periférica de adultos sanos y con GE-RV pero no en niños con GE-RV (Jaimes et al., 2002; Rojas et al., 2003). Debido a la posibilidad de producción de otras citocinas, en el presente estudio se analizó la presencia de LTCD4+ y LTCD8+ secretores de IL-2, IL-10 e IL-17, adicionalmente a la de IFN-+ e IL-13+, así como también la presencia de poblaciones multifuncionales.
5.1. IL-2
Es una citocina con poca función efectora, pero siempre se ha considerado que es necesaria en la expansión y desarrollo de la función de los LT efectores y de las células NK in vitro. Sin embargo, estudios recientes sugieren que in vivo la IL-2 es dispensable en los procesos de
sin genes de IL-2, CD25 (IL-2R) ó CD122 (IL-2R) generan respuestas linfoproliferativas T4 y T8 cuando se estimulan con superantígenos, virus de vaccinia, LCMV y VHS y además son linfocitos susceptibles de apoptosis inducida por activación. Sin embargo, IL-2 si parece ser indispensable en la generación de las respuestas de memoria de LT CD4 y CD8. Los LTCD4+ de ratones sin gen de IL-2 responden adecuadamente in vivo al estímulo con CD pulsadas con péptidos, pero sobreviven poco y generan un número muy bajo de células de memoria; tal vez por un defecto en la expresión del receptor de IL-7. Por otro lado, IL-2 no es necesaria para la generación de los LTCD8+ de memoria pero si para la respuesta de estos ante un estímulo secundario; curiosamente IL-2 no es necesaria en el momento de la respuesta secundaria sino durante la programación de los LTCD8+ en las fases iniciales de la respuesta primaria (Schluns and Lefrancois, 2003).
5.2. IL-10
IL-10 es una citocina reguladora producida por células de la inmunidad innata como CD y macrófagos y por células de la inmunidad adaptativa como LTh2, LTreg naturales (LTreg), LTr1 y LTh3. Adicionalmente, IL-10 también puede ser producida por LTh1 secretores de IFN-. La IL-10 suprime la proliferación y la secreción de citocinas por los LTh murinos mediante la inhibición de la capacidad presentadora de las CPA; sin embargo también incrementa la proliferación y la actividad citotóxica de los LTCD8+, inhibe la apoptosis de los LB y favorece el switch de clase hacia IgA (Roncarolo et al., 2006). Algunos conceptos básicos de la biología de los LT IFN-+/IL-10+ y de los LTreg y LTr1 se resumen más adelante.
5.3. IL-17
IL-17 es una citocina secretada por un linaje de LTCD4+ diferente de Th1 y Th2 conocido como LTh17 (Rouvier et al., 1993). Estos LTh17 se generan a partir de LT humanos estimulados en presencia de IL-6, IL-1 y bajas dosis de TGF- (Acosta-Rodriguez et al., 2007; Manel, Unutmaz, and Littman, 2008) y se mantienen y expanden en presencia de IL-23 derivada de CD en un ambiente que es particularmente favorable en el intestino delgado (Aggarwal et al., 2003; Ahern et al., 2008). IL17 es una citocina proinflamatoria que promueve la expresión de otras citocinas proinflamatorias y hematopoyéticas (Fossiez et al., 1996). Aunque se ha determinado que los LTh17 son claves en la respuesta contra organismos extracelulares que causan infección aguda como Candida (Milner et al., 2008), algunos estudios muestran que también se generan LTh17 en la fase crónica de infección por HCV (Rowan et al., 2008), en las fases tempranas de infección por HIV (Yue et al., 2008) en el compartimiento sistémico y en el TLAI post-terapia HAART, asociándose con recuperación de la polifuncionalidad y protección (Macal et al., 2008). Por otro lado, LTCD8+ secretores de IL-17 (LTc17) se han aislado de pulmones de ratones infectados con virus de influenza (VI) en los cuales tienen un efecto protector al comienzo de la infección, mediado por reclutamiento de neutrófilos, CD y LTm (Hamada et al., 2009).
En el modelo murino de infección por RV existen antecedentes que sugieren la participación de IL-17; en los ratones adultos inmunizados con la proteína VP6 de RV y la proteína LT de Escherichia coli como adyuvante se detecta transcripción del ARN m de IFN- y de IL17 en los linfocitos intestinales (intraepiteliales/LIE y de la lamina propia) y de las PP en las primeras 24 h post-dosis de refuerzo; y además, un segundo pico a los 6-8 d en los linfocitos intestinales. La principal fuente de IL-17 son los LIE y la de IFN- los LT de la lamina propia (Smiley et al., 2007). Aunque no se observó un efecto directo de IL-17 en la protección contra la infección por RV, su papel podría ser el de potenciar el efecto pro-inflamatorio del
IFN- (McNeal et al., 2007), el de promover la síntesis de péptidos antimicrobianos ó el de mantener la función de barrera del epitelio intestinal (Aujla, Dubin, and Kolls, 2007).
Adicionalmente, los LTh17 podrían mediar algún mecanismo de protección dependiente de las otras citocinas que secretan tales como IL-17F, IL-6, IL-21, IL-22 y TNF- (Dong, 2008).
5.4. LT multifuncionales
Los LT multifuncionales son linfocitos que producen simultáneamente más de una citocina ó molécula efectora como perforina o granzima. Su detección en los últimos años ha sido posible mediante la citometría de flujo multiparamétrica y ha permitido una caracterización más fina de la respuesta inmune mediada por LTCD4+ y LTCD8+ contra diferentes organismos infecciosos, siendo evidente que algunos perfiles se asocian con la respuesta inmune de memoria y/ó el control de la enfermedad. Las tablas 2 y 3 resumen los hallazgos de poblaciones multifuncionales en la respuesta a virus causantes de infecciones agudas y crónicas en humanos. De estos estudios se derivan algunas conclusiones generales:
i) Los LT multifuncionales se asocian con mejor control de la carga viral; por ejemplo, los LTCD4+ IFN-+/IL-2+ constituyen la respuesta preponderante luego de infecciones virales que se resuelven tales como VI ó por virus que persisten en bajos niveles como EBV, virus de la varicela-zoster (VZV), CMV y en pacientes HIV+ no progresores o en tratamiento. Por el contrario, en individuos HIV+ progresores, con alta carga viral, la población mayoritaria es de LTCD4+ que producen IFN- exclusivamente. En el caso de los LTCD8+ específicos de HIV, se observa una mayor frecuencia de células con mayor capacidad de proliferación, función citolítica y múltiples citocinas (TNF-/IFN-/IL-2) en los no progresores tanto en sangre como en la mucosa rectal (Seder, Darrah, and Roederer, 2008).
ii) Los LT multifuncionales tienen mayor capacidad efectora; esto se debe no sólo a su mayor espectro de funciones sino también a que la producción de IFN- e IL-2 es mayor en cada
