Aplicaciones del procesamiento morfológico para la segmentación de imágenes en el diagnóstico computacional de la malaria

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(1)Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas Facultad de Ingeniería Eléctrica Centro de Estudios de Electrónica y Tecnologías de la Información. TRABAJO DE DIPLOMA Aplicaciones del procesamiento morfológico para la segmentación de imágenes en el diagnóstico computacional de la malaria. Autor: Patricia Rodríguez Ribalta. Tutor: Dr. Juan V. Lorenzo Ginori Cotutora: Ing. Lyanett Chinea Valdés. Santa Clara 2014 "Año 56 del Triunfo de la Revolución".

(2) Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas Facultad de Ingeniería Eléctrica Centro de Estudios de Electrónica y Tecnologías de la Información. TRABAJO DE DIPLOMA Aplicaciones del procesamiento morfológico para la segmentación de imágenes en el diagnóstico computacional de la malaria. Autor: Patricia Rodríguez Ribalta, [email protected]. Dr. Juan V. Lorenzo Ginori Profesor Titular Consultante, CEETI, [email protected]. Cotutora: Ing. Lyanett Chinea Valdés. Santa Clara 2014 "Año 56 del Triunfo de la Revolución".

(3) Hago constar que el presente trabajo de diploma fue realizado en la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas como parte de la culminación de estudios de la especialidad de Ingeniería en Automática, autorizando a que el mismo sea utilizado por la Institución, para los fines que estime conveniente, tanto de forma parcial como total y que además no podrá ser presentado en eventos, ni publicados sin autorización de la Universidad.. Firma del Autor Los abajo firmantes certificamos que el presente trabajo ha sido realizado según acuerdo de la dirección de nuestro centro y el mismo cumple con los requisitos que debe tener un trabajo de esta envergadura referido a la temática señalada.. Firma del Autor. Firma del Jefe de Departamento donde se defiende el trabajo. Firma del Responsable de Información Científico-Técnica.

(4) i. PENSAMIENTO. Todo hombre que conozco es superior a mí en algún sentido. En ese sentido, aprendo de él. Ralph Waldo Emerson.

(5) ii. DEDICATORIA. A mi mamá, la persona más maravillosa e importante en mi vida. A mi papá y a Orlaine, por todo su cariño. A mi novio y sus padres..

(6) iii. AGRADECIMIENTOS. A mis padres, por todo su cariño y apoyo incondicional a lo largo de toda mi vida. A mi novio y su familia, por compartir conmigo estos cinco años y brindarme todo su amor y comprensión. A mi familia, por su preocupación. A mi tutor Juan V. Lorenzo Ginori y mi cotutora Lyanett Chinea Valdés, por permitirme trabajar junto a ellos y brindarme toda su ayuda y confianza. A todos los profesores de la Facultad de Eléctrica y en especial a los profesores del CEETI. A mis compañeros de la carrera, con los cuales compartí momentos muy especiales. A todos los que contribuyeron a la realización de este proyecto..

(7) iv. TAREA TÉCNICA. I.. Realización de una revisión bibliográfica sobre el tema, sistematizando la información obtenida y haciendo un análisis crítico de la misma.. II.. Implementación en Matlab de algoritmos de segmentación mediante el empleo de umbrales y empleando la transformada watershed.. III.. Evaluación de la efectividad de los algoritmos programados mediante medidas de la calidad de segmentación.. IV.. Realización de un análisis estadístico de los algoritmos de segmentación propuestos.. Firma del Autor. Firma del Tutor.

(8) v. RESUMEN. La malaria es una enfermedad producida por parásitos del género Plasmodium, responsable de la muerte de millones de personas anualmente. El examen de microscopía celular es el método estándar para el diagnóstico de esta enfermedad. El mismo requiere mucho tiempo de análisis debido a la numerosa cantidad de imágenes de frotis de extendidos sanguíneos que se analizan para determinar el nivel de infestación. Varias herramientas auxiliares se han proporcionado para la realización del diagnóstico automatizado mediante el Procesamiento Digital de Imágenes y Visión Computacional. En las mismas se plantea el proceso de segmentación de imágenes como una de las tareas fundamentales a realizar. En el presente trabajo se implementan algoritmos de segmentación en escala de grises mediante el empleo de umbrales y empleando la transformada watershed. Para ello se utilizó el lenguaje de programación del software Matlab. Además se obtuvieron máscaras manuales, utilizadas como referencia, para realizar la evaluación cuantitativa de los algoritmos de segmentación propuestos a partir del cálculo de los índices de Jaccard. También se realizó un análisis estadístico para determinar si existían diferencias estadísticamente significativas entre los métodos propuestos. El estudio contribuirá con un aporte significativo en el campo de la salud, dado que es una potencial aplicación en el diagnóstico de la malaria..

(9) vi. TABLA DE CONTENIDOS. PENSAMIENTO................................................................................................................. i DEDICATORIA ................................................................................................................ ii AGRADECIMIENTOS .....................................................................................................iii TAREA TÉCNICA ........................................................................................................... iv RESUMEN ........................................................................................................................ v TABLA DE CONTENIDOS ............................................................................................. vi INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 1 Organización del informe ............................................................................................... 3 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. TÉCNICAS DE PDI Y VC................................................................................................. 4 1.1. Análisis de la malaria utilizando imágenes de microscopía celular ........................ 4. 1.2. Procesamiento automatizado de las imágenes en los estudios sobre malaria .......... 7. 1.3. Técnicas empleadas en el PDI .............................................................................. 8. 1.3.1. Procesamiento morfológico de imágenes ....................................................... 8. 1.3.2. Negativo de la imagen ................................................................................... 9. 1.3.3. Compensación de la iluminación no uniforme ............................................... 9. 1.3.4. Realce de imágenes ..................................................................................... 10. 1.3.5. Suavizado.................................................................................................... 10.

(10) vii. 1.4. Segmentación de imágenes en los estudios sobre malaria que emplean PDI/VC . 11. 1.4.1. Segmentación mediante umbralado ............................................................. 12. 1.4.2. Segmentación mediante la transformada watershed (TW) ........................... 13. 1.5. 1.4.2.1. Uso del gradiente ................................................................................. 14. 1.4.2.2. Uso de marcadores ............................................................................... 15. 1.4.2.3. La transformada watershed de área mínima .......................................... 16. Evaluación de la calidad de la segmentación ...................................................... 17. CAPÍTULO 2.. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................ 18. 2.1. Materiales utilizados .............................................................................................. 18 2.1.1. Adquisición y características de las imágenes utilizadas .............................. 18. 2.2 Descripción de los algoritmos de segmentación propuestos ..................................... 19 2.3 Pre-procesamiento de la imagen .............................................................................. 20 2.4. Doble umbral ..................................................................................................... 21. 2.4.1 Método 1A ....................................................................................................... 23 2.4.2 Método 1B ....................................................................................................... 24 2.4.3 Método 1C y Método 1D ................................................................................. 25 2.5. Otsu adaptativo .................................................................................................. 28. 2.6. Transformada watershed de área mínima (TWAM) ............................................ 28. 2.7. Post-procesamiento ............................................................................................ 29. 2.8. Validación de los algoritmos de segmentación propuestos .................................. 30. 2.8.1 Análisis estadístico........................................................................................... 30 CAPÍTULO 3. 3.1. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................... 31. Introducción ....................................................................................................... 31. 3.2 Resultados obtenidos mediante el empleo del doble umbral (Método 1) .................. 31.

(11) viii. 3.2.1 Método 1A ....................................................................................................... 31 3.2.2 Método 1B ....................................................................................................... 32 3.2.3 Método 1C y Método 1D ................................................................................. 33 3.3 Resultados obtenidos mediante el empleo de Otsu adaptativo (Método 2) ............... 34 3.4 Resultados obtenidos mediante el empleo de transformada watershed de área mínima (Método 3) ................................................................................................................... 35 3.5. Estadísticos descriptivos ..................................................................................... 36. 3.6. Análisis estadístico ............................................................................................. 37. 3.7. Tiempo promedio de ejecución de los algoritmos implementados ....................... 39. Tiempo promedio (s) .................................................................................................... 39 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................ 40 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 41 ANEXOS ......................................................................................................................... 45 Anexo I Anexo II. Códigos de los algoritmos programados en Matlab...................................... 45 Códigos de funciones programadas en Matlab ......................................... 49. Morph_area_granulometry ........................................................................................... 49.

(12) INTRODUCCIÓN. 1. INTRODUCCIÓN. Según las estadísticas de la Organización Mundial de Salud (OMS), en la actualidad la malaria o paludismo es uno de los mayores problemas de salud que enfrenta el planeta; con una tasa anual de morbilidad de 300 a 500 millones de personas y una cifra nada alentadora de 1.5 millones de casos en mortalidad. El 90% de las personas que mueren corresponde a niños menores de 5 años, aunque las mujeres embarazadas son también vulnerables. Las estadísticas precisas se desconocen porque muchos casos ocurren en áreas rurales, donde las personas no tienen acceso a hospitales o a recursos para garantizar cuidados de salud. Como consecuencia, la mayoría de los casos permanecen indocumentados [1]. Más de 100 países o zonas con riesgo de transmisión de malaria son visitados por más de 125 millones de viajeros internacionales cada año. Muchos de ellos contraen paludismo en los países de riesgo, notificándose, más de 10 000 enfermos al volver a casa. En América hay transmisión de paludismo en nueve países de la región que comparten la selva amazónica, y en ocho países de América Central y el Caribe. Las características de transmisión son muy variables entre regiones, incluso en un mismo país [2]. El Plasmodium falciparum transmite la especie más peligrosa de malaria con los índices más altos de complicaciones y mortalidad, productor del 80% de todas las infecciones de malaria y el 90% de las muertes por la enfermedad. Su prevalencia predomina en el África subsahariana, más que en otras áreas del mundo. Al picar a la persona, la hembra del mosquito inocula los parásitos Plasmodium en el cuerpo de esta. Estos atacan los glóbulos rojos (ver figura1) y se multiplican, iniciando el cuadro clínico en el paciente..

(13) INTRODUCCIÓN. 2. Fig.1: Glóbulo rojo infestado con Plasmodium Berghei.. Lo anteriormente expuesto condujo a la búsqueda sistemática de un tratamiento efectivo contra este parásito; sin embargo, la misma ha sido infructuosa. Uno de los inconvenientes relacionados con esta parasitosis es la resistencia desarrollada a los fármacos empleados en su tratamiento. El relativo éxito de estos compuestos se ha visto mermado por los efectos secundarios que se presentan en los pacientes infectados, especialmente los referentes a la función cardiovascular [3]. El examen de microscopía celular es actualmente el método estándar para el diagnóstico de malaria, pero el mismo requiere mucho de tiempo de análisis. Debido a la numerosa cantidad de imágenes de eritrocitos que se analizan en una aplicación dada, un proceso manual resulta ser en muchos casos: lento, tedioso y vulnerable a errores intra- e interanalistas. Los estudios en el tema proporcionaron para la realización del diagnóstico automatizado varias herramientas auxiliares mediante el Procesamiento Digital de Imágenes (PDI) y Visión por Computadora (VC); desarrollando técnicas basadas en el procesado general de la imagen y en morfología matemática. La detección del parásito es su función fundamental, así como el reconocimiento de las etapas de desarrollo de vida del mismo [4]. La segmentación es una de las tareas previas que se realiza en el PDI. En años recientes, han sido propuestas diferentes técnicas de segmentación, las que aún no son completamente capaces de detectar o impedir infra- o sobre-segmentación sobre los objetos de interés. En este trabajo se utilizarán diferentes variantes de segmentación con el objetivo de dar solución a esta problemática. El mismo formará parte de un componente de hardware que permitirá de una manera apropiada, capturar imágenes digitales de frotis sanguíneos y luego procesarlas computacionalmente para determinar el grado de infestación con malaria.

(14) INTRODUCCIÓN. 3. en animales de laboratorio. Los algoritmos de segmentación implementados serán utilizados en un proyecto de desarrollo de medicamentos antimaláricos, investigación que se lleva a cabo en el laboratorio de histopatología del Centro de Bioactivos Químicos (CBQ) de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, conjuntamente con el Centro de Estudios de Electrónica y Tecnologías de la Información (CEETI). Este contribuirá con un aporte significativo en el campo de la salud, y una potencial aplicación en múltiples enfermedades. Objetivos de la investigación Objetivo general: Implementar algoritmos de segmentación mediante el empleo de umbrales y la transformada watershed. Objetivos específicos: 1. Implementar el algoritmo de segmentación mediante el método de doble umbral. 2. Implementar el algoritmo de segmentación mediante el método de Otsu adaptativo. 3. Implementar el algoritmo de segmentación mediante la transformada watershed de área mínima. 4. Evaluar la efectividad de los algoritmos programados mediante medidas de calidad de la segmentación. 5. Comparar los resultados de los algoritmos programados a través de un análisis estadístico. Organización del informe El informe de la investigación se estructurará en introducción, capitulario, conclusiones, recomendaciones, referencias bibliográficas y anexos. En el capítulo I se realizó una revisión de las fuentes bibliográficas, a fin de fundamentar los aspectos teóricos relacionados con este trabajo. En el capítulo II se describen los materiales y métodos empleados para el desarrollo de algoritmos de segmentación de imágenes en escala de grises, mediante el PDI y VC. En el capítulo III se ilustran y discuten los resultados obtenidos con los métodos de segmentación propuestos..

(15) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 4. TÉCNICAS DE PDI Y VC. 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO TÉCNICAS DE PDI Y VC.. 1.1 Análisis de la malaria utilizando imágenes de microscopía celular La malaria se encuentra distribuida globalmente y representa un problema serio de salud humana. Diagnosticar a tiempo esta enfermedad puede ser vital para el enfermo, ya que una demora en iniciar el tratamiento puede dar lugar a la aparición de complicaciones. La misma es causada por parásitos del género Plasmodium, siendo cuatro las especies que pueden parasitar al hombre: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale y Plasmodium malariae. El descubrimiento del Plasmodium por Charles Louis, en 1880, y la demostración experimental por R. Ross y B. Grass, en 1899, de que la hembra del mosquito Anopheles pseudopunctipennis era la principal responsable de la transmisión del paludismo, condujo a la búsqueda sistemática de un tratamiento efectivo contra el parásito [3]. El ciclo biológico del Plasmodium comprende tres fases [5]: . Ciclo sexual o Esporogónico: La transmisión natural de la enfermedad se produce cuando un mosquito hembra del género Anopheles pica a un humano infestado y de esta forma adquiere los gametocitos del Plasmodium (macho y hembra), que ingresan al tubo digestivo del mosquito y tras la fecundación se reproducen en la pared de este hasta adquirir la forma infectante denominada esporozoito. Los esporozoitos recorren el cuerpo del mosquito y algunos llegan a las glándulas salivales, para ser transmitidos a otro huésped sano. En el momento de la picadura, los esporozoitos ingresan a la vía sanguínea del huésped, donde permanecen media hora antes de penetrar en las células hepáticas.. . Ciclo Exoeritrocítico: Esta fase se inicia en las células hepáticas, donde los esporozoitos se reproducen en grandes cantidades hasta asumir la forma capaz de.

(16) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 5. TÉCNICAS DE PDI Y VC. invadir los glóbulos rojos. En el segundo día de esta fase, en el interior de los hepatocitos se encuentran esquizontes tisulares que aumentan de volumen y se dividen para formar millares de minúsculos merozoitos. . Ciclo Eritrocítico: Ocurre cuando los merozoitos se liberan del hígado, pasan en grandes cantidades a la sangre e invaden los glóbulos rojos en forma de trofozoitos, alimentándose de la hemoglobina y provocando su destrucción.. Fig1.1: Ciclo de vida del Plasmodium.1. 1. Imagen obtenida de [5].

(17) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 6. TÉCNICAS DE PDI Y VC. Las características morfológicas del parásito varían según el ciclo de vida de este, las cuales se describen en la tabla 1.1. Tabla 1.1: Características morfológicas de los parásitos palúdicos en extensiones sanguíneas finas (según OMS).2 P. vivax. P. ovale. P. malariae. Tamaño. Tamaño aumentado;. Glóbulo rojo. aumentado; puntos. puede ser oval con. Tamaño normal o. infestado. de Schüffner. fimbrias; puntos de. menor de lo normal.. presentes.. Schüffner presentes.. Bastante grande; uno o dos puntos. Compacto;. anillo. de cromatina;. raramente dos. (trofozoito. puede haber dos. anillos por. precoz). anillos por. eritrocito.. Compacto; raramente dos anillos por eritrocito.. eritrocito.. tardío. Pequeño; no. pigmento en forma. ameboide; pigmento. de bastones finos.. granuloso.. merozoitos. Esquizonte. grandes (12-24);. maduro. pigmento coalescente.. menudo dos puntos de cromatina; a menudo dos o más anillos por eritrocito; formas. Pequeño; compacto;. Tamaño moderado;. a menudo en forma. generalmente. de banda; pigmento. compacto; pigmento en. granuloso.. granulos.. Pequeño; merozoitos. vivax; merozoitos. grandes (6-12);. Raro en la sangre. (6-12 merozoitos);. aspecto de. periférica; merozoitos. pigmento más. “margarita”. pequeños (8-26); masa. oscuro que en P.. característico;. única de pigmento.. vivax.. pigmento granuloso. Parecidos a P. vivax. compactos; núcleo. Parecidos a P. vivax. único; pigmento. pero más pequeños.. difuso y granuloso.. hendiduras de Maurer.. Más pequeño que P.. Esféricos; Gametocitos. pueden observarse. adheridas frecuentes.. Grande; ameboide;. Grande;. Tamaño normal;. Pequeño y delicado; a. Fase de. Trofozoito. P. falciparum. pero más pequeños; menos numerosos y sin puntos de. En forma semilunar, núcleo único.. Schüffner.. Las características clínicas de la malaria dependen de la especie del parásito, la concentración de parásitos asexuales en sangre (parasitemia) y del estado inmunitario del huésped. El cuadro clínico clásico consiste en escalofrío, fiebre y sudoración. El ataque 2. Extraída de [5].

(18) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 7. TÉCNICAS DE PDI Y VC. agudo se inicia con accesos febriles precedidos por escalofrío y seguidos de intensa sudoración que se repiten cada 48 o 72 horas según la especie de Plasmodium [2]. Desde que se describiera por primera vez, el diagnóstico de esta enfermedad se ha realizado mediante la observación de las distintas formas del parásito en el examen microscópico de frotis de sangre periférica teñidas con diversos colorantes. La tinción con Giemsa es la más generalizada en esta aplicación y fue la empleada en las imágenes que se usan en este trabajo. La toma de muestras se realiza mediante la punción con una lanceta estéril, normalmente en la yema del dedo. Se recoge una gota de sangre en un portaobjetos y con otro se realiza la extensión en capa fina. Para la gota gruesa se recogen 3 o 4 gotas sobre un portaobjetos y con la esquina de otro se unen en movimientos rápidos, extendiéndose en una capa gruesa y uniforme. Hoy día esta técnica sigue siendo el método de referencia. Sin embargo, la laboriosidad que precisa el entrenamiento de un buen microscopista y la dificultad que entraña observar parasitemias bajas ha impulsado el desarrollo de técnicas de PDI y VC, para lograr el diagnóstico automatizado. 1.2 Procesamiento automatizado de las imágenes en los estudios sobre malaria Durante los últimos años, varios grupos de investigación han enfocado la atención en el desarrollo de sistemas informatizados que pueden analizar diferentes tipos de imágenes médicas y extraer información interesante para el personal médico [6], [7]. El PDI y la VC brindan herramientas que facilitan mediante métodos automatizados el diagnóstico de disímiles enfermedades. En el caso del desarrollo de medicamentos antimaláricos, es necesario analizar grandes cantidades de imágenes para determinar el grado de infestación con malaria en animales de laboratorio. El empleo del PDI y la VC contribuyen a obtener más rápidamente los resultados, haciendo el proceso más eficiente. Aunque ambos campos tienen mucho en común, el objetivo final es diferente. El PDI es el conjunto de técnicas que se aplican a las imágenes digitales con el objetivo de mejorar la calidad o facilitar la búsqueda de información. Está enfocado a lograr una mayor automatización de los procesos en una aplicación dada, para obtener resultados de forma rápida, y con mayor grado de confiabilidad. El PDI incluye cinco componentes principales [7]: Adquisición: Es el proceso a través del cual se obtiene una imagen visual..

(19) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 8. TÉCNICAS DE PDI Y VC. Pre-procesamiento: Incluye técnicas tales como la reducción de ruido y realce de detalles. Segmentación: Es el proceso mediante el cual se subdivide una imagen en sus regiones constitutivas u objetos [8]. Post-procesamiento: Puesto que las tareas de segmentación no suelen dar un resultado exacto de la delimitación de los objetos o regiones de interés, se incluyen técnicas de procesamiento morfológico para eliminar píxeles mal clasificados, bordes imprecisos de los objetos o regiones que están solapadas. Análisis de la imagen: Extraer información interesante para el profesional médico en función del diagnóstico, la terapia, control y evaluación del paciente. Un área muy ligada al PDI es la visión computacional. Su función principal es reconocer y localizar objetos en una imagen mediante el procesamiento digital de esta. Permite extraer características de una imagen y realizar su descripción e interpretación por la computadora con capacidades similares a las humanas. 1.3. Técnicas empleadas en el PDI. La segmentación en el análisis de frotis de sangre humana constituye uno de los problemas más desafiantes en el análisis automatizado de imágenes celulares. El problema implica resolver la presencia de ruido, los cambios graduales de intensidad, la similitud de intensidades entre diferentes estructuras anatómicas; así como infra- o sobre-segmentación que pueden aparecer como inconvenientes al aplicar esta técnica. El PDI incluye un conjunto de transformaciones que operan sobre la representación digital de una imagen, con el propósito de destacar algunos de los elementos que conforman la escena; de modo que se facilite su posterior análisis, bien sea por parte de un usuario (humano) o un sistema de visión artificial. En general, estas transformaciones son aplicadas cuando resulta necesario realzar o modificar una imagen para mejorar su apariencia, o cuando se requiere: medir, contrastar o clasificar algún elemento contenido en la misma. Algunas transformaciones de uso frecuente se describen a continuación. 1.3.1 Procesamiento morfológico de imágenes El procesamiento morfológico es una rama del PDI que toma su nombre a partir de la morfología matemática, para extraer y procesar componentes de la imagen que resultan.

(20) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 9. TÉCNICAS DE PDI Y VC. útiles en la representación y descripción de las formas, tales como: límites, esqueletos y cascos convexos. Esta teoría basada en el álgebra de conjuntos ofrece buenos resultados y un costo computacional mínimo convirtiéndose en una herramienta de gran ayuda en imágenes médicas [9]. En el PDI las operaciones morfológicas son de gran utilizad tanto en el pre-procesamiento como en el post-procesamiento. Las mismas, originalmente fueron concebidas para su aplicación en imágenes binarias, pero pueden ser extendidas al caso de las imágenes en escala de grises. Algunas operaciones de procesamiento morfológico en imágenes son: erosión, dilatación, apertura y cierre [10]. 1.3.2 Negativo de la imagen La idea es convertir aquellas porciones de la imagen que son claras en oscuras y las que son oscuras en claras. La complementación de la imagen, puede resultar de utilidad cuando se quiere apreciar los detalles en las porciones brillantes de una imagen, pues el ojo humano, es capaz de discernir mejor los detalles en áreas oscuras de una imagen que en las áreas más brillantes (ver figura 1.2).. Fig.1.2: a) Imagen es escala de grises e b) Imagen es escala de grises complementada.. 1.3.3 Compensación de la iluminación no uniforme El efecto de una iluminación de fondo no uniforme en las imágenes ocurre frecuentemente en aplicaciones tales como la microscopía óptica, donde el campo luminoso puede no presentar una intensidad uniforme. La transformación morfológica en escala de grises “top hat” tiene como principal objetivo estandarizar la visualización de los objetos en cada imagen [11]. Para lograr la uniformidad de iluminación del fondo de las imágenes, se utiliza un elemento estructurante lo suficientemente extenso como para que con la apertura (Ia) solamente quede presente el fondo no uniforme, que al restarse de la imagen original (I) devuelve el mapa de intensidades con una distribución adecuada (ver figura 1.3)..

(21) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 10. TÉCNICAS DE PDI Y VC. Fig.1.3: Transformación morfológica del top hat.. 1.3.4 Realce de imágenes Una de las imperfecciones más comunes de las imágenes digitales, es el pobre contraste resultante de un rango de intensidad reducido en comparación al rango disponible de niveles de gris (por ejemplo de 0 a 255 niveles). El contraste de una imagen, puede mejorarse mediante el re-escalamiento de la intensidad de cada píxel, de manera que la calidad diagnóstica final de la imagen destacada es muy superior a la imagen simple (ver figura 1.4). Para ello se emplean técnicas como ajuste de la intensidad o bien ecualizaciones o especificaciones de histograma. Muchas operaciones de realce de imágenes se hacen en la vecindad de los píxeles o regiones de interés. Esto se debe a que las regiones cercanas al píxel en cuestión pueden proporcionar información valiosa acerca de los niveles de iluminación y los detalles de la escena [12].. Fig.1.4: a) Imagen complementada en escala de grises y b) Realce de la imagen.. 1.3.5 Suavizado Se le denomina “suavizado” o filtro de ruidos, a la operación de filtrado que se usa para eliminar el ruido de una imagen y provocar el efecto con el cual la imagen aparezca algo borrosa (difuminada); por eso usualmente se le denomina suavizado. Se trata, en cuestión, de un filtro paso-bajo. Estos consisten en atenuar las componentes de la imagen con alta frecuencia espacial, dejando pasar componentes de baja frecuencia. Esto es útil en el pre-.

(22) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 11. TÉCNICAS DE PDI Y VC. procesado para eliminar pequeños detalles antes de la extracción de un objeto grande y el relleno de pequeños espacios entre líneas o curvas [13].. Fig.1.5: a) Imagen en escala de grises y b) Suavizado de la imagen. 1.4 Segmentación de imágenes en los estudios sobre malaria que emplean PDI/VC Diversos estudios describen sistemas que emplean PDI y VC para la detección y clasificación de parasitemias. Para la obtención de resultados satisfactorios en el análisis mediante PDI se necesita realizar, como una de las tareas fundamentales, un buen proceso de segmentación de las imágenes, ya que este es uno de los elementos más importantes en cualquier sistema automatizado de visión [14]. La segmentación es una etapa del procesamiento digital de imágenes que ubica y destaca algunos de los elementos de una imagen. El objetivo de esta es simplificar y/o cambiar la representación de una imagen en otra más significativa y fácil de analizar. El proceso de segmentación de una imagen presenta una gran relevancia, puesto que de la calidad del resultado de la misma depende el desempeño de la extracción de características y clasificación de los objetos presentes en la imagen [12]. En el análisis de imágenes de microscopía celular donde los eritrocitos se encuentran infestados con malaria autores como Mandal [15], Makkapati y Rao [16] utilizan algoritmos de segmentación basados en la información del color. Otros autores como Di Ruberto [18] Ross [19] y Tek [4] proponen técnicas de segmentación en escala de grises. El umbralado y la utilización de la transformada watershed son métodos clásicos que han sido utilizados por estos y otros autores. Existe una gran variedad de técnicas de propósito general para la segmentación de imágenes. Dado que no existe una solución general para el problema de la segmentación, a menudo se tienen que combinar varias técnicas para resolverlo eficazmente..

(23) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 12. TÉCNICAS DE PDI Y VC. 1.4.1 Segmentación mediante umbralado Los algoritmos de segmentación se basan generalmente en la similitud y discontinuidad de las intensidades de los píxeles. Uno de los algoritmos basados en similitud más utilizados es el umbralado a partir de los niveles de gris [8]. Este algoritmo es de simple programación y rápida ejecución. Mediante umbralado, el valor del nivel de gris de cada píxel de la imagen debe ser comparado con el umbral, para decidir si el mismo pertenece al objeto o al fondo. La imagen de salida, es una imagen binaria en la cual aquellos píxeles cuyo valor es 1, pertenecen al objeto y los píxeles cuyo valor es cero, pertenecen al fondo. La selección del valor del umbral, se realiza generalmente a partir del histograma de la imagen. Por ejemplo, en una imagen compuesta de un objeto y el mismo aparece en la escena sobre un fondo, es de esperar que su histograma sea bimodal. Si el fondo y el objeto tienen niveles de gris diferentes, en el histograma aparecerán dos picos. La selección automática del umbral, es un problema difícil, debido a que el histograma no siempre es bimodal; en cuyo caso resulta necesario combinar la información espacial presente en la imagen, con la información referente al nivel de gris. Para el caso del histograma bimodal, existen técnicas de detección automática del umbral, una de las cuales fue ideada por Otsu [19]. La misma ha sido reseñada por Haralick y Shapiro [20] y se basa en la maximización de la varianza entre clases. El procedimiento se basa en buscar un umbral global entre los picos del histograma (ver figura 1.6). En la figura 1.6, así como en las figuras 2.3, 2.6 y 2.7 se muestran la sección del histograma donde se encuentran los picos de intensidad para una mejor observación de los mismos; los valores de intensidad desde 0 hasta 0.65 son nulos. Otsu no ofrece resultados satisfactorios cuando hay cambios en la intensidad en la imagen, lo cual puede estar ocasionado por una iluminación no uniforme presente en la escena. Por ello se recurre a la utilización del método de Otsu adaptativo. El carácter adaptativo está dado en este caso por la aplicación previa de una corrección de la iluminación no uniforme presente en la imagen. Este método consiste en imponer un umbral global sobre una transformación de la intensidad de los píxeles en una imagen..

(24) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 13. TÉCNICAS DE PDI Y VC. Fig.1.6: Histograma bimodal en el que se determina el umbral global.. Otra técnica consiste en el operador de doble umbral (DU), mediante el cual se realiza el umbralado de la imagen de entrada tomando dos rangos de valores de intensidad en escala de grises, donde uno incluye al otro. El rango estrecho ( realizar la reconstrucción morfológica (. ( )). ) se utiliza como semilla para. sobre el rango amplio (. ( ). ( ). ( ). ): (1.1). El resultado es una imagen binaria más nítida que la obtenida con un único umbral (ver figura 1.7) y se mantiene estable ante ligeras modificaciones de los valores de umbrales [10].. Fig.1.7: Algoritmo para aplicar doble umbral: a) Imagen en escala de grises, b) Imagen obtenida a partir del rango estrecho, c) Imagen obtenida a partir del rango amplio y d) Imagen resultante de la reconstrucción morfológica.. 1.4.2 Segmentación mediante la transformada watershed (TW) El significado de la operación de watershed se encuentra en su notación en lengua francesa como la ligne de partage des eaux (línea de separación de aguas) [21]. Se considera una técnica de segmentación orientada a regiones, debido a que clasifica los píxeles según: su.

(25) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 14. TÉCNICAS DE PDI Y VC. proximidad espacial, el gradiente de sus niveles de gris, y la homogeneidad de sus texturas. Por ello, se toma como una técnica de detección de contornos y crecimiento de regiones al mismo tiempo [22]. Esta transformación consiste en simular la inundación de la imagen numérica (vista como un mapa topográfico) a partir de los mínimos regionales (ver figura 1.8). El agua es introducida desde los mínimos regionales, hasta que llega un momento, en el cual el proceso de inundación hace que las cuencas contiguas se unan. Las líneas de unión, que representan las fronteras de regiones homogéneas, son las que constituyen el esqueleto geodésico. El resultado es un conjunto de contornos que identifican las regiones de la imagen [23], [24].. Fig. 1.8: Inundación de la imagen a partir de los mínimos regionales.3. 1.4.2.1 Uso del gradiente En la práctica, el proceso de segmentación morfológica suele partir de la imagen gradiente, aplicándose a esta última la TW, pues se pretende identificar el contorno de los objetos y no su zona de influencia. Los mínimos proceden, en este caso, de la imagen gradiente. En el presente estudio se emplean los gradientes morfológicos. Estos en comparación con los gradientes lineales convencionales, son significativamente menos sensibles al ruido y permiten su aplicación a imágenes complejas, con un bajo costo computacional. Autores como Boqiang [25], González [26], Chinea [27] y Pastore [28] han obtenido resultados satisfactorios con su utilización. El gradiente morfológico o de Beucher generalizado ( 3. Imagen obtenida de [23]. ).

(26) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 15. TÉCNICAS DE PDI Y VC. es resultado de realizar la resta entre el resultado de la dilatación (. ) y de la erosión ( ). de la imagen en escala de grises, como se define en 1.2: (1.2) En comparación con los gradientes morfológicos internos y externos, el gradiente morfológico generalizado tiene la ventaja de dar como resultado contornos más anchos y siempre continuos. 1.4.2.2 Uso de marcadores El resultado de utilizar la TW en imágenes reales suele conducir al fenómeno de sobresegmentación, porque la presencia de mínimos locales en la imagen gradiente puede ser bastante alta. Para evitar este inconveniente uno de los métodos más comunes es la determinación de marcadores unívocos para cada uno de los objetos de interés. El nuevo algoritmo resultante se denomina watershed controlado por marcadores, el cual se define en la figura 1.9 [23].. Fig. 1.9: Algoritmo de watershed controlado por marcadores.. La inundación del gradiente en vez de la imagen original y la determinación de marcadores unívocos son las dos diferencias entre la TW clásica y la TW por marcadores. Estas modificaciones verdaderamente incrementan la precisión de la TW para detectar los contornos de interés. La figura 1.10 muestra la inundación de la topología de la imagen a partir de estos marcadores..

(27) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 16. TÉCNICAS DE PDI Y VC. Fig. 1.10: Algoritmo de inundación de la TW a partir de marcadores.4. Los resultados de la TW son independientes de la ubicación de los marcadores, siempre y cuando estos se coloquen en el interior del objeto y el contorno de los objetos sea significativo respecto de los gradientes internos del objeto. Se debe marcar los objetos a segmentar (marcadores internos) y el fondo (marcadores externos) para obtener los contornos buscados. La transformada de Hough ha sido ampliamente usada en la búsqueda de marcadores. Es un algoritmo empleado en reconocimiento de patrones en imágenes, que permite encontrar ciertas formas dentro de una imagen, como líneas, círculos, etc; el cual usa la información de la imagen gradiente o de los bordes. Su desventaja aparece al variar la forma y la apariencia de los objetos en la imagen. Estas variaciones causan picos que traen consigo la detección inexacta. Recientemente se ha demostrado que la transformada Radon también se puede utilizar para el propósito de encontrar marcadores y es de menor costo computacional [29], [4]. 1.4.2.3 La transformada watershed de área mínima La transformada watershed de área mínima (TWAM) es una transformación de la TW original, la cual asegura el área de “las regiones etiquetadas” por encima de un umbral dado. La misma usa varios operadores basados en la morfología matemática para ser desarrollada y es utilizada como un operador inicial de segmentación. La información del área de la célula, la cual es estimada aplicando la granulometría de área (el espectro del patrón de área), es usada como un atributo. El método es planteado para dar solución a la sobre-segmentación que se obtiene en ocasiones al aplicar la TW clásica [4]. El algoritmo 4. Imagen obtenida de [26].

(28) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO. 17. TÉCNICAS DE PDI Y VC. emplea operadores morfológicos para realizar el cierre por área en escala de grises con el objetivo de eliminar mínimos existentes en la imagen gradiente (ver figura 1.11).. Fig. 1.11: a) Imagen gradiente y b) Cierre por área de la imagen gradiente.. 1.5 Evaluación de la calidad de la segmentación Para evaluar la eficiencia de un método de segmentación se llevan a cabo experimentos de validación. Una valoración subjetiva consiste en realizar una simple inspección visual entre la imagen resultante de la segmentación realizada y una imagen segmentada de referencia o ground-truth. Esta última puede lograrse por medio de una segmentación manual realizada por un especialista o bien mediante simulaciones computacionales. Sin embargo, esto no garantiza una validación debido a la gran variabilidad inter e intra-analistas. Por esta razón, es necesario establecer alguna medida de calidad, para cuantificar la precisión y exactitud del método de segmentación [28]. El cálculo del índice de Jaccard es una herramienta ampliamente usada en diferentes aplicaciones [30], [31]. El mismo, es la proporción entre el número de píxeles en la intersección y en la unión, respectivamente, de la imagen binaria resultante(A) al ser comparada con una imagen binaria de referencia (B), donde |.| representa la cardinalidad del conjunto. El mismo se define en la expresión 1.3. |. |. |. |. (. ). (1.3). El índice de Jaccard con un valor de 1 indica una coincidencia perfecta entre A y B; un valor igual a cero sugiere ausencia total de coincidencia entre ambas imágenes. Para evaluar la calidad de los resultados de la segmentación cuantitativamente se puede utilizar también el cálculo del coeficiente Dice [32], que se define como: (. ). |. |. | | | |. (. ). (1.4).

(29) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. CAPÍTULO 2.. 18. MATERIALES Y MÉTODOS. 2.1. Materiales utilizados El algoritmo se implementó en una computadora personal con sistema operativo Windows 7 Home Premium, microprocesador Pentium(R) Dual-Core CPU E5300 @ 2.60 GHz, 2 MB de caché L2 y 2 GB de memoria RAM. Se utilizó el lenguaje de programación del software Matlab en su versión 7.10.0 (R2010a) y el Toolbox correspondiente a PDI [33]. Las principales funciones empleadas fueron: rgb2gray, adapthisteq, imadjust, imerode, imdilate, aclosegray, aopengray imreconstruct, findpeaks, im2bw, watershed, imfill, bwareaopen, imclearborder. También se utilizaron otros software disponibles en la plataforma de Windows como el Adobe Photoshop CS2 en su versión 9.0 y el IBM SPSS (Statistical Product and Service Solutions) en su versión 20. Mediante el Adobe Photoshop CS2 se obtuvieron las máscaras de referencia para realizar la evaluación cuantitativa de los algoritmos de segmentación propuestos a partir del cálculo de los índices de Jaccard. En este caso los índices de Dice no se utilizaron ya que aportaron información muy similar a los índices de Jaccard. El IBM SPSS se utilizó para realizar el análisis estadístico al aplicar pruebas de hipótesis que permitan estimar si existen diferencias estadísticamente significativas entre los algoritmos propuestos de segmentación. 2.1.1. Adquisición y características de las imágenes utilizadas. Para el desarrollo de este estudio se emplearon imágenes microscópicas de extendidos sanguíneos a partir de muestras de sangre tomadas a roedores infestados con Plasmodium Berghei. La adquisición de las imágenes se realizó mediante un microscopio en el laboratorio de histopatología del CBQ. El microscopio es marca Zuzi dotado de tres oculares, dos oculares de 10x/20mm, para visualizar las muestras a escala microscópica, y.

(30) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 19. un tercer ocular, al que se conecta un equipo de fotomicrografía. El objetivo utilizado en la observación de las imágenes fue el de 100x. El dispositivo de adquisición utilizado corresponde a una cámara digital del modelo UCMOS031100KPA, de la misma marca que el microscopio. Esta cámara posee un sensor CMOS, que permite obtener las imágenes de colores con una profundidad de 8 bits en cada canal de color y se conectada a una PC a través de un puerto USB [34]. En la Tabla 2.1 se muestran los datos de las imágenes que se utilizaron para el desarrollo del experimento, en las cuales se encuentran presentes eritrocitos aislados así como aglomerados. Tabla 2.1: Datos de las imágenes utilizadas.. Nombre de la. Tipo de. Tamaño en. Formato de la. Tinción. imagen. imagen. píxeles. imagen. utilizada. 29. Real. 2048x1536. TIF. Giemsa. 100x. 32. Real. 2048x1536. TIF. Giemsa. 100x. 37. Real. 2048x1536. TIF. Giemsa. 100x. 62. Real. 2048x1536. TIF. Giemsa. 100x. 63. Real. 2048x1536. TIF. Giemsa. 100x. 68. Real. 2048x1536. TIF. Giemsa. 100x. Objetivo. 2.2 Descripción de los algoritmos de segmentación propuestos La implementación de los algoritmos de segmentación propuestos siguió como patrón el diagrama de flujo que se muestra en la figura 2.1. Como primer paso se realizó una etapa de pre-procesamiento sobre la imagen adquirida. Este pre-procesamiento se aplicó indistintamente según la variante de segmentación que el mismo precedía. A continuación se mencionan las técnicas empleadas: . Corrección de la iluminación no uniforme (transformación “top hat”).. . Realce (maximización del contraste).. . Suavizado a través del filtro Erosión-Reconstrucción-Dilatación-Reconstrucción (ERDR).. Posteriormente, sobre la imagen resultante del pre-procesamiento se efectuó la binarización, implementándose los siguientes métodos para su ejecución:.

(31) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. . Doble umbral (Método 1).. . Otsu adaptativo (Método 2).. . Transformada watershed de área mínima (Método 3).. 20. Se toma el criterio de denotar cada uno de los algoritmos de segmentación propuestos como método 1, método 2 y método 3, siguiendo el orden en que serán explicados. Una vez obtenidas las máscaras de segmentación para cada uno de los métodos antes mencionados, se aplicaron técnicas de procesamiento morfológico sobre la imagen binaria a fin de eliminar píxeles mal clasificados o bordes imprecisos de los objetos en la escena. Lo anterior expuesto se corresponde con la etapa de post-procesamiento. Finalmente se obtiene la imagen segmentada.. Fig. 2.1: Diagrama de flujo de los algoritmos implementados. 2.3 Pre-procesamiento de la imagen La gran variabilidad en los parámetros de las imágenes adquiridas, como son: su tamaño, coloración, iluminación, entre otras, hace que sea necesario realizar un pre-procesamiento cuyo principal objetivo es estandarizar la visualización de los objetos en cada imagen. Para aplicar las técnicas de pre-procesamiento implementadas se realizó inicialmente la conversión a escala de grises de la imagen de entrada, la cual se encontraba en el espacio de color verdadero RGB. Inicialmente se realizaron pruebas preliminares con diferentes variantes, como tomar el plano verde en la imagen en RGB, utilizar el método decolarize [35] o el plano de intensidad en la imagen convertida a HSI usado por González & Woods [36]. Cada una de estas variantes, de forma independiente, no mantenían un.

(32) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 21. comportamiento óptimo en todos los algoritmos propuestos. Por esta razón se decidió utilizar la función rgb2gray ya que con su utilización los resultados fueron cualitativamente satisfactorios (ver figura 2.2). Su sintaxis se muestra a continuación: Igray= rgb2gray (I) donde: I: Imagen de entrada en RGB, convertida a doble precisión utilizando la función im2double. Igray: Imagen en escala de grises.. Fig.2.2: a) Imagen de entrada en RGB y b) Imagen de entrada convertida a escala de grises.. Para la corrección de la iluminación no uniforme del fondo de las imágenes, se le aplica a las mismas la transformación top hat. Para ello se utiliza la función imtophat, la cual tiene la siguiente sintaxis: Ith= imtophat (Igray, EE) donde: Igray: Imagen con iluminación no uniforme en escala de grises. EE: Elemento estructurante tipo disco con radio 100, valor que se deriva del análisis granulométrico de la imagen. El elemento estructurante se crea utilizando la función strel. Ith: Imagen con uniformidad de iluminación del fondo. La maximización del contraste de la imagen en escala de grises se realiza mediante la función adapthisteq, con la cual se ecualiza su histograma. Además se recurre a la función imadjust para re-escalar la intensidad de la imagen de manera que ocupe todo el rango dinámico. 2.4 Doble umbral Para la implementación del método de doble umbral se recurre a la utilización del histograma de la imagen sin complementar, a la cual se le realiza previamente la corrección.

(33) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 22. de la iluminación no uniforme. De esta forma, el primer lóbulo es representativo de los niveles de intensidad que poseen los objetos en el primer plano (eritrocitos) y el segundo lóbulo de los niveles de intensidad presentes en el fondo de la imagen (ver figura 2.3). A partir del mismo se determinan cuatro umbrales (u1, u2, u3, u4 si se ordenan de menor a mayor según su valor de intensidad en un rango normalizado entre 0 y 1).. Fig. 2.3: Histograma bimodal sobre el que se determina el rango amplio y el rango estrecho.. Con estos cuatro umbrales se forman dos pares. El primer par define el rango amplio, el cual está formado por u1 y u4. El segundo par define el rango estrecho y está formado por los otros dos restantes umbrales (u2 y u3). Luego la imagen de entrada es binarizada (utilizando la función im2bw) comparando su intensidad con los dos umbrales que conforman el rango amplio; y mediante intersecciones lógicas entre las imágenes binarias resultantes se obtiene la imagen máscara. De igual forma se obtiene la imagen marcadora, al binarizar en este caso, utilizando los umbrales que conforman el rango estrecho (ver figura 2.4). A partir de la imagen marcadora y la imagen máscara se realiza la reconstrucción morfológica para obtener la máscara de segmentación utilizando la función imreconstruct: Ireconst= imreconstruct (Imarker, Imask) donde: Imarker: Imagen marcadora. Imask: Imagen máscara. Ireconst: Imagen resultante de la reconstrucción morfológica (máscara de segmentación). La imagen binaria resultante mantendrá las mismas dimensiones que la imagen original..

(34) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 23. Fig.2.4: a) Imagen marcadora y b) Imagen máscara.. De la implementación del método de doble umbral (Método 1) se deriva: Método 1A, Método 1B, Método 1C y Método 1D. Los dos primeros (Método 1A y Método 1B) son aplicados cuando inicialmente el histograma de la imagen en cuestión es bimodal y difieren en dependencia del criterio que se sigue al determinar los umbrales en el histograma. El Método 1C y Método 1D son propuestos para el caso en que el histograma de la imagen no tiene un comportamiento bimodal inicialmente. En este caso se le realiza un tratamiento a la imagen para obtener una representación del histograma del primer plano y el fondo de la imagen independientemente, a partir de los que de determinan los umbrales según las dos variantes implementadas (ver figura 2.5).. Fig.2.5: Diagrama en bloques de los métodos que se derivan al aplicar doble umbral.. 2.4.1 Método 1A En este método se sigue el razonamiento expuesto por Tek [4] para determinar los umbrales a partir del histograma de la imagen. Los dos primeros umbrales se tomarían como cero (u1 y u2); mientras que los valores del tercer y cuarto umbral (u3 y u4) se determinan a partir de los valores de los picos máximos representados en el histograma. Estos picos se corresponden con el primer plano (pfg) y el fondo (pbg)..

(35) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 24. Para obtener el valor de estos se obtiene el histograma de la imagen en cuestión utilizando la función imhist, la que devuelve dos variables: "counts" y "x". En "counts" se evalúa la proporción asociada a la intensidad de los píxeles para los diferentes niveles de grises presentes en la imagen. Estos niveles de grises se almacenan en el vector "x". Luego se utiliza la función findpeaks, la cual recorre el vector "counts" y almacena descendentemente en la variable "locs" las posiciones del vector "x" que se corresponden con los picos representativos en el histograma. La media entre ellos se denota como la variable m. De esta forma el valor del tercero y del cuarto umbral se calcularía a través de las expresiones 2.1 y 2.2 respectivamente: m= (pfg+pbg)/2. (2.1). u3= (pfg+m)/2. (2.2). u4= (pbg+m)/2. (2.3). Siguiendo este criterio los umbrales quedarían impuestos sobre el histograma como se muestra en la figura 2.6.. Fig.2.6: Imposición de umbrales sobre el histograma de la imagen según la variante 1.. 2.4.2 Método 1B En este método se propone una alternativa para determinar los umbrales de forma diferente a la propuesta en el método anterior. En este caso solo el primer umbral se hace igual a 0. Las expresiones para determinar los restantes umbrales se definen a continuación: u2=2pfg-(pfg+m)/2. (2.4). u3= (pfg+m)/2. (2.5). u4=m. (2.6).

(36) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 25. El algoritmo para determinar el nivel de intensidad de los picos que se corresponden con el primer plano (pfg) y el fondo (pbg) se hace de forma análoga a la empleada en la variante 1. De esta forma la imagen marcador quedará determinada a partir de un rango más estrecho, en comparación con el método 1A, el cual queda enmarcado alrededor del pico representativo correspondiente al primer plano. Siguiendo este criterio los umbrales quedarían impuestos sobre el histograma como se muestra en la figura 2.7. Fig.2.7: Imposición de umbrales sobre el histograma de la imagen según la variante 2.. 2.4.3 Método 1C y Método 1D El método 1C y el método 1D se implementaron para el caso en que el histograma de la imagen no presentara un comportamiento bimodal, criterio que deben cumplir los métodos de umbralado para que se obtengan resultados satisfactorios. En la bibliografía consultada [37], se plantea un algoritmo mediante operadores de morfología matemática que permite determinar una imagen representativa del primer plano y una imagen representativa del fondo independientemente. De esta forma se precisan los picos máximos fácilmente sin afectar la correcta determinación de los umbrales para la implementación del método de doble umbral. Para la obtención de las imágenes representativas del fondo y el primer plano se realiza inicialmente sobre la imagen en escala de grises aperturas sucesivas con un elemento estructurante adaptativo de tamaño creciente, tomando como atributo el área de los eritrocitos. A partir del espectro patrón de área (ver figura 2.8) se estima el seudo-radio (r) de los eritrocitos que no forman parte de aglomerados y su área (A_moda) a través de la expresión 2.7: (2.7).

(37) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 26. Para obtener el espectro patrón se implementó una función acumulativa nombrada morph_area_granulometry (ver su programación en Anexo 2).. Fig.2.8: Espectro patrón de la granulometría de área.. Luego se realizan dos aperturas sucesivas sobre la imagen inicial en escala de grises utilizando la función aopengray, cuya programación es descrita en el Anexo 2. Su sintaxis es la siguiente: Aopen=aopengray (Ithn, inca) Ithn: Imagen en escala de grises, con corrección de la iluminación y complementada. inca: Incremento, cuya magnitud se realiza a partir del valor de área estimado a través del espectro patrón. Aopen: Imagen resultante de la apertura por área. Con una apertura inicial es posible eliminar aquellos objetos de la imagen que no son de interés para el analista (ruido, artefactos) y luego se eliminan todos los eritrocitos sin incluir los aglomerados. Seguidamente se restan las imágenes resultantes de las anteriores aperturas y utilizando un operador de comparación se obtiene una representación de una máscara binaria del fondo (B), cuya expresión se define a continuación: (. (. )(. ). (. )(. )). El algoritmo anteriormente descrito se muestra en la figura 2.9.. (2.8).

(38) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 27. Fig.2.9: a) Apertura en la que se eliminan los elementos de menor área, b) Apertura en la que se eliminan todos los eritrocitos independientes presentes en la imagen, c) Resta de las aperturas sucesivas y d) Máscara previa para obtener la representación del primer plano/fondo.. Las imágenes representativas del primer plano (Ifg) y el fondo (Ibg) (ver figura 2.10) se obtienen a partir de las siguientes expresiones: (2.9) (2.10). Fig. 2.10: a) Imagen representativa del primer plano, b) Imagen representativa del fondo, c) Histograma representativo del primer plano y d) Histograma representativo del fondo.. Al obtener los histogramas representativos del primer plano y el fondo independientemente, se extraen los picos máximos (pfg y pbg).A continuación se prosigue con la binarización de.

(39) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 28. la imagen utilizando indistintamente las variantes expuestas en el epígrafe 2.4.1 y 2.4.2 para la determinación de los umbrales. 2.5 Otsu adaptativo El método de Otsu adaptativo binariza la imagen, utilizando la función im2bw, con la siguiente sintaxis: BW= im2bw (Ith, umbral_global) donde: Ith: Imagen con uniformidad de iluminación del fondo. umbral_global: Umbral global que devuelve la función graythresh, pasándole como argumento Ith, para separar en clases los valores de intensidad de la imagen a partir de su histograma. BW: Imagen binaria resultante (máscara de segmentación). La imagen binaria resultante tendrá valor 0 en los píxeles donde Ith sea menor que el umbral global y 1 en el resto. Además, mantendrá las mismas dimensiones que la imagen original. 2.6 Transformada watershed de área mínima (TWAM) En la implementación de la transformada de watershed de área mínima se recurre a la utilización de la imagen gradiente. Esta se obtiene a partir de la utilización del gradiente morfológico generalizado (explicado en el subepígrafe 1.4.2.1 del capítulo anterior). Luego se maximiza el contraste de la imagen gradiente. A la imagen gradiente resultante del procedimiento anterior, se le realiza el cierre por área a través de la función aclosegray, cuya programación se describe en el Anexo 2. A la misma se le pasa como argumento la mitad del área perteneciente a un eritrocito. Aclose=aclosegray (Ith_n, A_min) donde: Ith_n: Imagen en escala de grises, con corrección de la iluminación y complementada. A_min: Área mínima, que se determina a partir de la mitad del valor de área estimado en el espectro patrón. Aclose: Imagen resultante del cierre por área. Finalmente se aplica la transformada watershed a través de la siguiente sintaxis:.

(40) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 29. IWAM=watershed (Aclose) donde: IWAM: Imagen resultante de aplicar la transformada watershed de área mínima. Para obtener la máscara de segmentación al aplicar la WAM se aplican una secuencia de pasos sobre IWAM, la cual representa una imagen etiquetada. Primero se localiza la etiqueta que se corresponde con el fondo y se igualan a cero los píxeles que la componen. Seguidamente los píxeles pertenecientes a las restantes etiquetas son puestos en uno, representando los objetos de interés. La imagen binaria resultante mantendrá las mismas dimensiones que la imagen original. 2.7 Post-procesamiento A las máscaras de segmentación obtenidas para cada uno de los algoritmos de segmentación propuestos se le realizaron algunos pasos adicionales. Estos incluyen, la eliminación de elementos que no forman parte de la estructura celular dado que no son de interés para el analista; este es el caso de los artefactos producidos por el ruido presente en el fondo de la imagen. Esto se realiza mediante la función bwareopen: Mask_res= bwareopen (BW, Amin) BW: Máscara resultante de la binarización. Amin: Valor que se estima a partir del análisis granulométrico de la imagen. Mask_res: Máscara de segmentación final. Posteriormente se rellenan los centros de los eritrocitos. Además se eliminan los eritrocitos cercanos a los bordes pues estos no son de información útil al analista ya que en su mayoría aparecen recortados. Para ello se emplean las funciones imfill e imclearborder respectivamente. De esta forma se obtiene la máscara de segmentación final (ver figura 2.11).. Fig.2.11: a) Máscara resultante de la binarización y b) Máscara resultante del post-procesamiento..

(41) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 30. 2.8 Validación de los algoritmos de segmentación propuestos Para la validación de los algoritmos de segmentación propuestos se calculó el coeficiente de Jaccard para 180 eritrocitos presentes en las imágenes utilizadas en el experimento, de los cuales 68 eran eritrocitos infestados. Estos eritrocitos se escogieron indistintamente en cada una de las imágenes, tomando no solo los que se encontraban aislados, sino aquellos que formaban parte de aglomerados. Previamente no se contaban con máscaras de segmentación de referencia que se tomarían como ground-truth para el cálculo de los coeficientes de Jaccard; por lo que la obtención de estas máscaras para el caso de las imágenes utilizadas en el experimento se realizó de forma manual (ver figura 2.12). Para ello utilizó el software Adobe Photoshop CS2, el cual a través de herramientas de selección semiautomáticas, permitió de forma interactiva delinear el contorno de los eritrocitos de seleccionados, a partir del criterio expuesto por expertos del CBQ. La selección semiautomática realizada se consultó con los expertos para su validación.. Fig. 2.12: Máscara de segmentación manual.. 2.8.1 Análisis estadístico Para el análisis e interpretación de los coeficientes de Jaccard calculados se realizó un análisis estadístico aplicando pruebas de hipótesis, para comprobar si existían diferencias estadísticamente significativas entre los métodos de segmentación propuestos aplicando el test de Friedman. Posteriormente se aplicaron pruebas post hoc, para determinar entre que métodos de segmentación existían diferencias significativas, siendo en este caso el test de Wilcoxon el utilizado..

(42) CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. CAPÍTULO 3.. 31. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 3.1 Introducción En el presente capítulo se realiza un análisis de los resultados al aplicar los algoritmos de segmentación propuestos: doble umbral (el cual incluye cuatro métodos), Otsu adaptativo y transformada de watershed de área mínima. Cada uno de los métodos de segmentación será comparado con los restantes, utilizando una imagen ilustrativa. Luego, mediante los índices de Jaccard calculados, se evalúan los métodos de segmentación cuantitativamente a través de estadígrafos descriptivos y se determina si existen estadísticamente diferencias entre ellos. Para realizar una valoración cualitativa de los métodos (de forma ilustrativa) se utilizó una de las imágenes con las trabajó en la investigación. La misma se muestra segmentada, con los bordes resaltados en verde, para cada uno de los métodos propuestos. En ella aparecen destacadas, con líneas discontinuas y colores diferentes, cuatro regiones de interés sobre las cuales se realizaron apreciaciones convenientes. El tamaño de estas regiones se encuentra ampliado a la derecha de la imagen segmentada con bordes resaltados, en correspondencia con el color de la región señalada con líneas discontinuas, para facilitar la visualización de las mismas. 3.2 Resultados obtenidos mediante el empleo del doble umbral (Método 1) A continuación se exponen los resultados obtenidos para cada uno de los métodos que incluye el operador de doble umbral. 3.2.1 Método 1A En la figura 3.1 se muestra la imagen segmentada, con los bordes resaltados, utilizando el método 1A..

(43) CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 32. Fig. 3.1: Imagen segmentada con bordes resaltados por el método 1A.. En la región señalada en rojo se muestra uno de los artefactos presentes en el fondo de la imagen, el cual no se segmentó. Esto se debe a que en la etapa de post-procesamiento, se aplican métodos morfológicos, donde se eliminan los objetos que no son de interés para el analista. La mayoría de los eritrocitos que estaban aislados (región señalada en azul) fueron segmentados correctamente. Los resultados fueron satisfactorios en la detección de bordes, observándose algunos casos de eritrocitos aglomerados que no pudieron ser separados, sobre los cuales se pueden aplicar posteriormente algoritmos para su separación [14]. En la región señalada en negro se muestra un aglomerado compuesto por dos eritrocitos, el cual es tomado por el método erróneamente, ya que una inspección visual muestra que se encuentran separados en la imagen. Esto se debe, a que los umbrales que conforman el rango estrecho en el histograma, el cual se determina para obtener la imagen marcador, incluye niveles de intensidad que se corresponden con el fondo de la imagen. El eritrocito que aparece enmarcado en la región señalada en amarillo no fue segmentado por el método, mientras que los eritrocitos que se encuentran a su alrededor sí son segmentados correctamente. 3.2.2 Método 1B En la figura 3.2 se muestra la imagen segmentada, con los bordes resaltados, utilizando el método 1B..

(44) CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 33. Fig. 3.2: Imagen segmentada con bordes resaltados para el método 1B.. La región señalada en rojo muestra dos eritrocitos que fueron segmentados correctamente de forma independiente, no siendo así en el método anterior, el cual los toma aglomerados. Esto se debe, a que en este caso los umbrales que conforman el rango estrecho, con el cual se obtiene la imagen marcador, queda enmarcado alrededor del pico representativo del primer plano, en el que se incluyen los niveles de intensidad de los objetos que son de interés segmentar. Por lo que el algoritmo es menos sensible a extraer tras la binarización ruido presente en el fondo de la imagen. En la región señalada en azul se destaca como el método detecta correctamente los bordes de los aglomerados presentes en la imagen. En la región señalada en negro el eritrocito que se presenta es segmentado como un objeto independiente y no formando parte de un aglomerado como en el método anterior. Sin embargo, este método falla en la detección correcta del contorno del mismo. Además, en la región señalada en amarillo, aparece segmentado correctamente el eritrocito que no había sido segmentado en la variante anterior. 3.2.3 Método 1C y Método 1D En las figuras 3.3 y 3.4 se muestran la imagen segmentada, con los bordes resaltados, al aplicar el método 1C y el método 1D respectivamente..

(45) CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 34. Fig. 3.3: Imagen segmentada con bordes resaltados para el método 1C.. Fig. 3.4: Imagen segmentada con bordes resaltados para el método 1D.. Al igual que en los métodos anteriores, en las imágenes no aparecen segmentados los artefactos presentes en el fondo de las mismas y los eritrocitos aislados, en su mayoría, fueron segmentados correctamente. Se definen bien el contorno de los aglomerados, aunque los métodos fallan en algunas ocasiones ya que algunos eritrocitos no son segmentados completamente o toman parte del fondo. Se observa además al inspeccionar estas figuras resultados similares entre el método 1A y 1C y los métodos 1B y 1D. Esto se debe a que ambos métodos mantienen una correspondencia en el algoritmo implementado para la determinación de los umbrales. 3.3 Resultados obtenidos mediante el empleo de Otsu adaptativo (Método 2) En la figura 3.5 se muestra la imagen segmentada, con los bordes resaltados, utilizando el método de Otsu adaptativo..