Tecnologías basadas en la PCR

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Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Últimas estrategias 1

Tecnologías basadas en la PCR

Últimas estrategias

(Secuenciación de ADN, EST, matrices, DArT, SNP)

Tecnologías basadas en el ADN

Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas:

Módulo de aprendizaje

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Contenido

f Secuenciación de ADN

f Marcador de secuencia expresada (EST) f Tecnología de matrices

f Tecnología de matrices de diversidad (DArT) f Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)

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f La secuenciación del ADN es la medida fundamental de la diversidad porque detecta polimorfismos dentro de los elementos básicos del ADN

f La información puede obtenerse automáticamente

Secuenciación del ADN

La secuenciación del ADN es la medida de la diversidad verdaderamente fundamental, porque todos los marcadores se derivan de polimorfismos en los elementos básicos del ADN, o sea, en la secuencia nucleotídica de un segmento específico de ADN. La tecnología de la secuenciación ha mejorado enormemente en los últimos años, y ahora los productos de la PCR (una región de ADN amplificada en cantidad suficiente) pueden provenir de cualquier posición genómica de interés y secuenciarse directamente. La recopilación de los datos puede automatizarse.

Referencias básicas

Maxam, A.M. y W. Gilbert. 1977. A new method for sequencing DNA. Proc. Natl Acad. Sci.

U.S.A. 74:560-564.

Sanger, F. 1988. Sequences, sequences and sequences. Annu. Rev. Biochem. 57:1-28.

Sanger, F., S. Nicklen y A.R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5468.

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Secuenciación del ADN: Métodos

Hay dos métodos principales:

f Maxam-Gilbert

f Sanger (secuenciación dideoxy o terminación de cadena)

Los dos métodos difieren ligeramente; el método de Sanger (descrito en la diapositiva 6) es más fácil de automatizar y, por tanto, es mucho más empleado.

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f El ADN se divide en fragmentos, que luego se sub- clonan

f Cada pedazo corto se usa como una plantilla para generar un conjunto de fragmentos que difieren entre sí, en longitud, en una sola base

f Los fragmentos se separan mediante electroforesis f Se identifica la base que queda al final de cada

fragmento. Se recrea la secuencia original de las bases (A, T, C y G) de cada pedazo corto generado en el primer paso

f Las secuencias cortas se ensamblan en una secuencia larga

Secuenciación del ADN: Procedimientos

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Un diagrama del método Sanger

Adaptado de Griffiths y col. 1996

ddATP ddTTP ddCTP ddGTP

Marcaje Polimerasa + dNTP

3’

5’

C A T A G C T G T T T C C T G T G A A A

C A T A G C T G T T T C C T G T G A A A C T T T

A G G A C A C T T T

C A C T T T G C A A A G G A C A C T T T

G T A T C G A C A A A G G A C A T T T +

+

C A T A G C T G T

T T T C C G T G A A A

Pueden usarse colorantes fluorescentes de diversos colores, lo que permite la separación de los cuatro fragmentos en un solo carril del gel y aumenta mucho la eficiencia. Los secuenciadores automáticos pueden analizar los electroferogramas resultantes y producir un cromatograma de cuatro colores en que aparecen los picos que representan cada una de las cuatro bases de ADN.

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Secuenciación del ADN: Ventajas y desventajas

f Ventajas:

• Resultados altamente reproducibles

• El contenido de información es máximo

f Desventajas:

• Costos todavía elevados

• Presenta exigencias técnicas

Los resultados son, desde luego, sumamente reproducibles e informativos. Los costos son elevados, sin embargo, y se necesita un nivel alto de pericia técnica, dos factores que alejan esta tecnología de las posibilidades de muchos investigadores. El uso de la PCR para abordar regiones específicas del ADN y la disponibilidad de máquinas de

secuenciación automatizadas han reducido las dificultades técnicas, aunque el proceso es todavía costoso, en particular en su etapa de establecimiento.

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f Estudios evolutivos

f Cálculos de la variación genética f Genómica comparativa

f Elaboración de ensayos de tipo PCR (diseño de cebadores para convertir cualquier marcador en otro marcador basado en la PCR)

Ejemplos de aplicaciones

Aunque la tecnología de los marcadores está basada, en general, en la variación de la secuencia del ADN, el investigador no necesita, por fortuna, conocer toda la secuencia del ADN para poder usar los marcadores moleculares. Desde luego, el análisis de la secuencia del ADN tiene muchas aplicaciones útiles, pero tiene un gran inconveniente, en particular para la medición de la diversidad: el hecho de que genes diferentes evolucionan en grado diferente. Por consiguiente, la extrapolación de información obtenida de genes específicos al nivel de la especie debe hacerse con cuidado (Brown, S.M. y S. Kresovich. 1996.

Molecular characterization for plant genetic resources conservation. p. 85-93, en: Genome mapping in plants (H. Paterson, ed.). R.G. Landes Company, Georgetown, TX, E.U.)

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f Las etiquetas de secuencia expresada son pedazos pequeños de secuencia del ADN que tienen, generalmente, de 200 a 500 nucleótidos de largo

f Se generan al secuenciar bien sea uno o ambos extremos de un gen expresado proveniente de una genoteca de ADNc

f Esta estrategia es una forma sumamente eficaz de encontrar genes nuevos

Marcador de secuencia expresada (EST)

El número de secuencias de EST de plantas disponibles para el público ha aumentado extraordinariamente en los últimos años llegando a más de 1,000,000 en el momento de escribir este documento (Informe de Progreso de la Iniciativa Nacional del Genoma Vegetal, diciembre 2001). Una lista de bases de datos de los EST de muchas plantas se puede encontrar en la dirección electrónica http:/www.ostp.gov/NSTC/html/mpgi2001/building.htm Referencia básica

National Center for Biotechnology Information (NCBI). 2001. ESTs: gene discovery made easier. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/est.html

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Diseño de cebadores de EST

http:/www.ostp.gov/NSTC/html/mpgi2001/building.htm

ARNm

ARN Transcriptasa inversa

Degradación del ARN por ribonucleasas Síntesis de la segunda cadena del ADN

ADNc

ADN de doble cadena

Cebador Cebador

3’ EST 5’ EST

A C U G

T G A C

A C T G

T G A C

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Los EST: Ventajas y desventajas

f Ventajas:

• Muy buenos como marcadores genéticos

• Codominantes

• Las secuencias se pueden generar rápidamente

• Fuente eficiente de secuencias para obtener cebadores para SSR

f Desventajas:

• El aislamiento del ARNm puede ser complicado

• Los intrones, que pueden contener información importante, no son parte del ADNc

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Los EST: Ejemplos de aplicaciones

Las aplicaciones de los EST se basan en el hecho de que se originan a partir de segmentos de

secuencias génicas:

f Comparación de la diversidad génica en diferentes organismos

f Estudios de evolución génica

f Búsqueda de supuestos ortólogos en bases de datos

f Sondas para estudios de expresión génica f Detección de SNP*

* Ver la sección que empieza en la diapositiva 25.

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f Las matrices son ordenamientos de pequeños fragmentos de ADN fijados a portaobjetos de vidrio o membranas de nylon

f Esta tecnología permite hacer el seguimiento simultáneo del genoma entero

f El principio fundamental de las matrices es el apareamiento de las bases ⎯o la

hibridación⎯ de sondas cortas con secuencias complementarias de ADN

f Las matrices se construyen con ADNc (matrices de ADNc), con secuencias genómicas o con

oligonucleótidos sintetizados in silico (“arreglos de ADN”)

Tecnología de matrices o “arreglos”

Mediante la tecnología de matrices (también llamada 'tecnología de chip'), los genomas pueden analizarse a escala del genoma entero. Esta tecnología se basa en la hibridación entre sondas cortas de oligonucleótidos y secuencias complementarias de ADN. Decenas de miles de muestras se pueden inmovilizar en una lámina pequeña de vidrio (que es lo más corriente) o en una membrana de nylon donde pueden hibridarse con diferentes sondas o trozos de ADN de interés (la terminología es equívoca y permite que al ADN inmovilizado en el “arreglo” se le llame también sonda o ADN de interés). Se puede hibridar más de una sonda a la vez, por ejemplo, para comparar diferencias en la expresión,

marcando las sondas con tintes fluorescentes de diverso color.

Hay programas informáticos especiales que captan datos automáticamente. Las matrices pueden aplicarse al diagnóstico, al estudio de la expresión de genes y al desarrollo o análisis de mapas genéticos, entre otros objetivos. Sin embargo, la tecnología es todavía relativamente costosa, en particular en su etapa inicial, y la cantidad de datos generados puede ser imponente.

Alscher, R. 2001. Grid it: resources for microarray research.

http://www.bsi.vt.edu/ralscher/gridit/

Brown, V.O. y D. Botstein. 1999. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genet. 21(supp): 33-37.

Richmond, T. y S. Somerville. 2000. Chasing the dream: plant EST microarrays. Current Opinion Plant Biol. 3(2):108-116.

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Una matriz hibridada

http://bti.cornell.edu/CGEP/CGEP.html

La imagen es cortesía de Mark D’Ascenzo, Boyce Thompson Institute for Plant Research, Center for Gene Expression Profiling, Cornell University.

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Matrices: Ventajas y desventajas

f Ventajas:

• Tecnología de alto rendimiento

• Exploración del genoma entero

• Permite el descubrimiento de la relación genotipo- fenotipo

f Desventajas:

• Debe estar disponible la información sobre la secuencia de los genes

• Costosa

• Tiene requisitos técnicos considerables

• La cantidad y el tipo de los datos producidos

requiere de un alto nivel de pericia en computación y de un equipo avanzado

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Matrices: Ejemplos de aplicaciones

f Identificación de secuencias (génicas o de mutación génica)

f Determinación del nivel de expresión de los genes

• Ensayo de la abundancia de secuencias específicas en el ADN genómico

• Análisis de la expresión de gran número de genes (matrices de ADNc)

• Identificación de gran número de marcadores específicos de ADN (por ejemplo, polimorfismo de un solo nucleótido o SNP) mediante hibridación molecular (matrices de oligonucleótidos sintéticos)

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Tecnología de matrices de diversidad (DArT)

Comprende dos pasos:

f Generación de la matriz

f Genotipificación de la muestra

Las matrices de diversidad, también llamadas DArT, fueron concebidas por CAMBIA (ver Glosario). Esta tecnología implica un nuevo uso de las matrices que no requiere un conocimiento previo de las secuencias; por tanto, puede convertirse en una herramienta muy útil para los investigadores.

Las siguientes diapositivas de DArT se han tomado, con autorización previa de CAMBIA, del sitio web de dicho Centro: http://www.cambia.org.au/

CAMBIA. 2000. Enabling innovation. http://www.cambia.org/

Jaccoud, D., K. Peng, D. Feinstein y A. Kilian. 2001. Diversity arrays: a solid-state technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Research 29 (4):E25.

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f Se clonan los fragmentos generados por

restricción, que representan la diversidad de un acervo genético. Al resultado se le llama una 'representación' (de 0.1% a 10% del genoma, comúnmente)

f Se identifican los clones polimórficos de la genoteca obteniendo primero la matriz de

fragmentos tomados de un conjunto aleatorio de clones e hibridando luego la matriz con

diferentes muestras

f Los fragmentos de los clones polimórficos se inmovilizan en una matriz

DArT: Preparación de la matriz (1)

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DArT: Preparación de la matriz (2)

Gx Gy Gn ADN de interés

Mezcla de genomas

Clonar fragmentos

de la representación Genoteca

Seleccionar clones individuales y amplificar por PCR

Productos de la PCR purificados y ordenados

Utilizar método de reducción de complejidad, por ejemplo, digestión con enzimas de restricción, ligamiento de adaptadores, amplificación por PCR

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f Marcar la representación (ADN) de la muestra con fluorescencia e hibridarla con la matriz

f Examinar la matriz y medir, para cada fragmento de la matriz, la cantidad de señal de hibridación f Empleando marcas múltiples, contrastar la

representación de una muestra con la representación obtenida de otra o con una sonda testigo

DArT: Obtención del genotipo de una

muestra (1)

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DArT: Obtención del genotipo de una muestra (2)

Cortar, ligar adaptadores y amplificar vía PCR

Gx Gy

Seleccionar 2 genomas para el análisis

Utilizar el mismo método de reducción de la complejidad que usó para hacer el panel de diversidad

Marcar cada subgrupo genómico: color rojo…

Marcar cada subgrupo genómico: color verde…

Hibridar con la matriz

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Una matriz DArT hibridada

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DArT: Ventajas y desventajas

f Ventajas:

• No requiere información sobre las secuencias

• Alto rendimiento

• Adquisición rápida de datos y análisis rápido

• Detecta cambios de una sola base así como inserciones o deleciones

• Detecta diferencias en la metilación del ADN, según el enzima usado para generar los fragmentos

• Genera clones listos para secuenciar

• Requiere muestras pequeñas de ADN

• Buena transferencia de marcadores entre poblaciones de mejoramiento

• Puede automatizarse totalmente

f Desventajas:

• Los marcadores son dominantes

• Tiene requisitos técnicos considerables

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f Caracterización rápida del germoplasma f Construcción de mapas genéticos

f Mejoramiento asistido por marcadores

DArT: Ejemplos de aplicaciones

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f Sustituciones de una sola base entre secuencias homólogas

f Los SNP se dan con mayor frecuencia que cualquier otro tipo de polimorfismo

f Pueden identificarse mediante matrices y el equipo DHPLC

Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)

Un tipo muy reciente de marcador, que está disponible gracias a las nuevas tecnologías de secuenciación, son los polimorfismos de un solo nucleótido (los SNP). Estos polimorfismos son sustituciones de una sola base entre secuencias. Los SNP ocurren con mayor

frecuencia que cualquier otro tipo de marcador y están o muy cerca del gen que interesa o incluso dentro de él.

Los SNP pueden ser identificados o empleando una matriz o con una máquina de DHPLC.

Referencia

Patil, N., A.J. Berno, D.A. Hinds, W.A. Barret, J.M. Doshi, C.R. Hacker, y otros. 2001.

Blocks of limited haplotype diversity revealed by high-resolution scanning of human chromosome 21. Science 294:1719-1723.

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Equipo DHPLC

DHPLC se refiere a la cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento, y se usa para visualizar los SNP.

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Interpretación de los SNP (1)

http://bldg6.arsusda.gov/pberkum/Public/sarl/cregan/snps.htm

Este dibujo esquemático del polimorfismo de un solo nucleótido muestra dos fragmentos de ADN (uno en la parte superior y otro en la inferior) que comparten la misma secuencia en 30 pares de bases y difieren sólo en un par: la posición 28 de los fragmentos. En esa posición, un A-T (parte superior) ha cambiado a un C-G (parte inferior).

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Interpretación de los SNP (2)

De: Patil y col., 2001. Science 294:1719-1723

SNP #1 SNP #2

La altura del bloque representa un tramo de ADN en un cromosoma. Cada columna de cuadritos representa la misma sección de ADN en un individuo diferente por genotipo.

Cada hilera de cuadritos amarillos o azules representa un solo SNP. Los cuadritos azules de cada hilera representan el alelo principal de ese SNP, y los cuadritos amarillos

representan el alelo secundario. La ausencia de un cuadrito en cualquier posición de una hilera indica que faltan datos.

En este bloque, se pueden identificar 26 SNP comunes. Pueden organizarse en siete patrones diferentes de haplotipos (número de genotipos: 5, 4, 4, 3, 2, 1 y 1). Entre los cuatro patrones más comunes están 16 de los 20 cromosomas muestreados. Los círculos azules y amarillos indican los patrones alélicos de dos SNP (encerrados por líneas rectas), que distinguen sin ambigüedad los cuatro haplotipos comunes del bloque.

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f Continuamente se desarrollan estrategias para mejorar la detección de polimorfismos

f La obtención de secuencias de ADN permite detectar la variación incluso a nivel de los nucleótidos

f Los EST son herramientas poderosas para detectar la diversidad dentro de regiones codificantes

f Las matrices y las DArT hacen posible el análisis simultáneo de muchos loci

f Los SNP son sustituciones de una sola base entre secuencias, y representan la variante más frecuente del ADN

En resumen

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f Los diferentes tipos de variación del ADN que pueden detectarse por secuenciación, los EST y los SNP

f El principio fundamental de las matrices y de las DArT

f Las ventajas y las desventajas de las más modernas tecnologías con que se analiza la diversidad genética

Hasta el momento usted debería saber

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Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M.

Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6^aedn.). W.H.

Freeman y Co., NY.

Hajeer, A., J. Worthington y S. John (eds.). 2000. SNP and microsatellite genotyping: markers for genetic analysis.

Biotechniques: Molecular Laboratory Methods Series. Eaton Publishing, Manchester, U.K.

USDA-ARS. 1999. The Cregan lab.

http://bldg6.arsusda.gov/pberkum/Public/sarl/cregan/snps.htm Wang, D.G., J.B. Fan, C.J. Siao, A. Berno, P. Young, R. Sapolsky,

y otros. 1998. Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome. Science 280(5366):1077-1082.

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A continuación

f Consideraciones finales f Glosario

Tecnologías basadas en la PCR