(1)Evaluación de la actividad antioxidante durante el almacenamiento poscosecha del cubio (Tropaeolum tuberosum Ruíz &amp

Evaluación de la actividad antioxidante durante el almacenamiento poscosecha del cubio (Tropaeolum tuberosum Ruíz & Pavón) morfotipos morado y amarillo

empleando un modelo enzimático in vitro

SILVIA IDALID URREA REY Estudiante de Nutrición y Dietética

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar al título de:

Nutricionista Dietista

Director:

Mauricio Espinal Ruiz. Químico. MSc. PhD.

Codirectora:

Yuri Milena Castillo Quiroga. ND. MSc

Grupo de investigación:

Alimentos, Nutrición y Salud

Proyecto de investigación:

“Memoria histórica, caracterización genética y aprovechamiento alimentario de tubérculos andinos marginados en las provincias de Centro y Márquez (Boyacá)”

Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Carrera de Nutrición y Dietética

Bogotá, D.C. Junio de 2018

NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución Nº 13 del Julio de 1946.

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por qué las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

Evaluación de la actividad antioxidante durante el almacenamiento poscosecha del cubio (Tropaeolum tuberosum Ruíz & Pavón) morfotipos morado y amarillo

empleando un modelo enzimático in vitro

SILVIA IDALID URREA REY

APROBADO

__________________________________ ________________________________

Concepción Judith Puerta Bula Martha Constanza Liévano Fiesco Bacterióloga. PhD Nutricionista Dietista. MSc

Decana de Facultad de Ciencias Directora de Carrera de Nutrición y Dietética

A Dios por darme la fuerza necesaria para afrontar cada uno de los retos, por acompañarme y permitir que cumpla mis sueños.

A mi padre por su amor inigualable, por ser mi ejemplo a seguir, mi fortaleza y mi polo a tierra, gracias por creer en mí. Merecedor de todos mis triunfos.

A mi madre por su amor, apoyo, comprensión y entrega, por ser mi bendición, mi motor y llenarme de fortaleza día a día, gracias por creer en mí. Merecedora de todos mis triunfos.

A mis sobrinas, Juanita e Isabella por motivarme a ser mejor persona y por ser el regalo más inesperado y lindo que me dio la mi vida.

A todos los miembros de mi familia que siempre me llenaron de ánimo mediante palabras y sonrisas.

A mi director Mauricio Espinal y mi codirectora Yuri Castillo, quienes desde el principio confiaron en mí, creyeron en mis capacidades y me acompañaron a lo largo de este trabajo.

AGRADECIMIENTOS

 A mis papás por acompañarme en todo momento, por su compresión y por su permanente disposición, especialmente, durante estos meses.

 A mi director Mauricio Espinal por su confianza, por estar siempre dispuesto a colaborarme, guiarme y por compartir conmigo sus conocimientos.

 A mi codirectora Yuri Castillo, por creer en mí desde el inicio, por su valiosa orientación, colaboración y paciencia, además por compartir conmigo sus conocimientos.

 A mi jurado Valentina Guzmán, por sus aportes para la realización de este trabajo de grado.

 Al proyecto “Memoria histórica, caracterización genética y aprovechamiento alimentario de tubérculos andinos marginados en las provincias de Centro y Márquez (Boyacá)” por los recursos suministrados para el desarrollo y culminación de este trabajo de grado.

 A Marcos Farfán, agricultor del municipio de Ventaquemada, Boyacá, por ser uno de los guardianes de los tubérculos andinos, por su amabilidad y disposición en el momento de nuestra visita, gracias por brindarnos sus infinitos conocimientos.

 A las auxiliares del laboratorio de Bioquímica de Alimentos de la Pontificia Universidad Javeriana, Marcela Mateus, Katherine Martín y Angélica Pinzón, por la paciencia, compañía y colaboración durante mis días en el laboratorio. Sin la disposición de ustedes el trabajo experimental hubiese sido más complejo.

 A mis amigos y compañeros, en especial a Adriana, Ángela, Daniela, Yudy, David y Daniel por siempre brindarme su apoyo y llenarme de ánimo cada día.

 A grandes amigos que a pesar de la distancia me colaboraron y me daban fuerzas para continuar.

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN ... 12

2. MARCO DE REFERENCIA ... 14

2.1 Ubicación del estudio ... 14

2.2 Raíces y tubérculos andinos (RTAs) ... 14

2.3 Cubio (Tropaeolum tuberosum) ... 15

2.4 Contenido nutricional de los cubios ... 15

2.5 Antioxidantes ... 15

2.6 Actividad antioxidante ... 16

2.6.1 Actividad antioxidante exógena o no enzimática ... 16

2.6.2. Actividad antioxidante endógena o enzimática ... 16

2.7 Peroxidasa (POD) ... 16

2.8 Indicadores fisicoquímicos ... 16

3. PLANTEAMIETO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ... 17

4. OBJETIVOS ... 19

4.1 Objetivo General ... 19

4.2 Objetivos Específicos ... 19

5. HIPÓTESIS ... 19

6. MATERIALES Y MÉTODOS ... 19

6.1 Diseño de la investigación ... 19

6.2 Muestra ... 19

6.3 Variables de estudio ... 20

6.4 Métodos ... 20

6.4.1 Primera fase: Protocolo de extracción y medida de la actividad enzimática de la peroxidasa, y estandarización de la medida de los indicadores fisicoquímicos21 6.4.1.1 Muestra ... 21

6.4.1.2 Criterios de inclusión y exclusión ... 21

 Criterios de inclusión ... 21

 Criterios de exclusión ... 21

6.4.1.3 Obtención de la muestra ... 21

6.4.1.4 Protocolo de extracción de la enzima ... 21

6.4.1.5 Medida de la actividad de la peroxidasa (APOD) ... 22

6.4.1.6 Estandarización de los indicadores fisicoquímicos ... 22

6.4.1.6.1 Color instrumental ... 22

6.4.1.6.2 Dureza instrumental ... 22

6.4.1.6.3 ° Brix ... 22

6.4.1.6.4 pH ... 23

6.4.1.6.5 Acidez titulable ... 23

6.4.2 Segunda fase: Medida de la actividad antioxidante enzimática y medida de los indicadores fisicoquímicos del cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados durante 21 días poscosecha ... 23

6.4.2.1 Muestra ... 23

6.4.2.2 Criterios de inclusión y exclusión ... 23

 Criterios de inclusión ... 23

 Criterios de exclusión ... 23

6.4.2.3 Caracterización del tipo de almacenamiento poscosecha: Malla y bolsa perforada ... 23

 Malla ... 23

 Bolsa perforada ... 23

6.4.2.4. Establecimiento de las muestras de acuerdo al almacenamiento poscosecha ... 23

6.4.2.5 Almacenamiento poscosecha ... 24

6.4.2.6 Medida de la actividad antioxidante enzimática y de los indicadores fisicoquímicos del cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados en el día uno poscosecha ... 24

6.4.2.7 Medida de la actividad antioxidante enzimática y de los indicadores fisicoquímicos del cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados durante 21 días poscosecha ... 24

6.4.2.8 Análisis de datos ... 24

7. RESULTADOS ... 25

7.1 Primera fase: Protocolo de extracción y medida de la actividad antioxidante de la peroxidasa y estandarización de la medida de los indicadores fisicoquímicos ... 25

7.1.1 Estandarización de la extracción y medida de la peroxidasa ... 25

7.1.2 Medida de la actividad de la peroxidasa activa e inactiva ... 25

7.1.3 Estandarización de la medida de los indicadores fisicoquímicos ... 26

7.2 Segunda Fase: Medida de la actividad antioxidante enzimática y de los indicadores fisicoquímicos del cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados durante 21 días poscosecha ... 26

7.2.1 Medida de la actividad antioxidante enzimática del cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados durante 21 días poscosecha ... 26

7.2.2 Medida de los indicadores fisicoquímicos del cubio morfotipos morado, amarillo y blanco con ojos morados durante 21 días poscosecha ... 27

7.2.2.1 Color instrumental ... 27

7.2.2.2 Dureza Instrumental ... 28

7.2.2.3 ° Brix ... 29

7.2.2.4 pH ... 31

7.2.2.5 Acidez Titulable ... 32

8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ... 33

8.1 Primera fase: Protocolo de extracción y medida de la actividad enzimática de la peroxidasa, y estandarización de la medida de los indicadores fisicoquímicos ... 33

8.1.1 Protocolo de extracción y medida de la actividad enzimática de la peroxidasa .... 33

8.1.2 Estandarización de la medida de los indicadores fisicoquímicos ... 34

8.2 Segunda Fase: Medida de la actividad antioxidante enzimática y medida de los indicadores fisicoquímicos del cubio morfotipos morado, amarillo y blanco con ojos morados durante 21 días poscosecha ... 34

8.2.1 Medida de la actividad antioxidante enzimática del cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados durante 21 días poscosecha ... 34

8.2.2 Medida de los indicadores fisicoquímicos del cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados durante 21 días poscosecha ... 36

9. CONCLUSIONES ... 38

10. RECOMENDACIONES ... 38

11. BIBLIOGRAFÍA ... 39

ANEXOS ... 42

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Contenido nutricional del cubio de acuerdo a Salazar 2016.……….………….15

Tabla 2. Operacionalización de las variables………..……….20

Tabla 3. Descriptores de los morfotipos de cubio empleados en el estudio de acuerdo con sus características fenotípicas y al tratamiento al que fueron sometidos………..………..21

Tabla 4. Descriptores de los morfotipos de cubio empleados en el estudio de acuerdo con sus características fenotípicas y al método de almacenamiento……….……….24

Tabla 5. Medida de los indicadores fisicoquímicos de calidad: color instrumental, dureza instrumental, pH, ° Brix y acidez titulable……….……….26

INDICE DE FIGURAS Figura 1. Oxidación de fenoles (guaiacol) hasta la quinona y reducción del H2O2 a H2O por acción de la POD………..13

Figura 2. Extracción y medida de la actividad de la peroxidasa (∆A470nm/s)………25

Figura 3. Medida de la actividad de la peroxidasa (∆A470nm/s) para cubio morfotipo blanco con ojos morados y amarillo activo e inactivo y para extracto de cubio morfotipo blanco con ojos morados y amarillo inactivo……….25

Figura 4. Medida de la actividad antioxidante enzimática de la peroxidasa durante la poscosecha en cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados almacenados en malla y en bolsa perforada………..27 Figura 5. Medida de la actividad antioxidante enzimática de la peroxidasa para los días 11 y 17 poscosecha en cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados almacenados en malla y en bolsa perforada………...27 Figura 6. Medida del color instrumental correspondiente al índice CIRG (Colour Index Red Grape) durante la poscosecha en cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados almacenados en malla y en bolsa perforada………28 Figura 7. Medida de la dureza instrumental durante la poscosecha en cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados almacenados en malla y en bolsa perforada………..29 Figura 8. Medida de la dureza instrumental para los días 11 y 17 poscosecha en cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados almacenados en malla y en bolsa perforada………...29

Figura 9. Medida de sólidos solubles durante la poscosecha en cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados almacenados en malla y en bolsa perforada………..30 Figura 10. Medida de sólidos solubles para los días 11 y 17 poscosecha en cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados almacenados en malla y en bolsa perforada………...30

Figura 11. Medida del potencial de hidrogeniones (pH) durante la poscosecha en cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados almacenados en malla y en bolsa perforada………...31 Figura 12. Medida del potencial de hidrogeniones (pH) para los días 11 y 17 poscosecha en cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados almacenados en malla y en bolsa perforada………...31 Figura 13. Medida de la acidez titulable durante la poscosecha en cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados almacenados en malla y en bolsa perforada………..32 Figura 14. Medida de la acidez titulable para los días 11 y 17 poscosecha en cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados almacenados en malla y en bolsa perforada………...33

RESUMEN

Colombia se encuentra ubicada en una zona estratégica, lo que permite la producción de diversos alimentos, muchos de ellos autóctonos de acuerdo a la zona en la que son cosechados. En la región Cundiboyacense, la cual hace parte de la cordillera de Los Andes, se siembran alimentos nativos conocidos como tubérculos andinos, dentro de los que se encuentra el cubio (Tropaeolum tuberosum). Con el tiempo y por diversas razones, el cubio ha sido denominado como un alimento marginado a pesar de su valor nutricional, en el que se resalta su elevado contenido de antioxidantes, quienes aportan beneficios para la salud por que evitan la oxidación de radicales libres. Dentro del contenido de antioxidantes, se encuentran los compuestos fenólicos que han sido altamente estudiados y son responsables de la actividad antioxidante atribuida al cubio. De manera similar, en el contenido de este tubérculo andino, también se encuentra la enzima peroxidasa (POD) quien actúa como antioxidante endógeno. Su presencia se hace más evidente durante la poscosecha, pues interviene controlando la acción del peróxido de hidrógeno, una especie reactiva de oxigeno (ROS). Justamente, en el momento en el que la peroxidasa no puede mantener el control oxidativo, el cubio entra en estado de senescencia, conllevando a un desaprovechamiento de sus beneficios nutricionales. Razón por la cual a lo largo de este trabajo de grado, se pretendió evaluar la actividad antioxidante enzimática durante la poscosecha de dos morfotipos de cubio, provenientes de Ventaquemada – Boyacá, almacenados bajo dos métodos tradicionales de almacenamiento, malla y bolsa perforada. Para esto, se realizó un protocolo de extracción y medición de la enzima POD y posteriormente se midió la actividad antioxidante enzimática y los indicadores fisicoquímicos de calidad durante tres semanas, con una frecuencia de dos medidas por semana. A partir de los resultados obtenidos, se pudo concluir que el día 11 poscosecha y el almacenamiento en malla son los ideales para que se mantengan los beneficios nutricionales del cubio, de acuerdo con la expresión de la actividad antioxidante enzimática de la peroxidasa y los indicadores de calidad fisicoquímica.

Palabras claves: Cubio (Tropaeolum tuberosum), peroxidasa, actividad antioxidante enzimática.

ABSTRACT

Colombia is strategically located, allowing the production of different kind of products and ingredients many of them and native according to the area in which they are harvested. In the Cundiboyacense region, part of the Andes Mountain, native foods known like Andean tubers are harvested, one of them is the cubio (Tropoelum tuberosum). Over the time and for many reasons the cubio has been underestimated despite of its high nutritional value, its huge content of antioxidants providing many health benefits that prevent the oxidation of free radicals. Within these, the phenolic compounds that have been highly studied and for which it is established that cubio has an antioxidant activity. In the same way, in the content of this Andean tuber is the enzyme peroxidase (POD) which acts as an endogenous antioxidant. Its presence is more evident during the post-harvest due to it acts, controlling the action of hydrogen peroxide, a reactive oxygen specie (ROS), and therefore prevents the oxidation of free radicals, this is the reason that the cubio has enzymatic antioxidant activity. When the peroxidase can’t maintain the oxidative control, the cubio pass in to a state of senescence, leading to a waste of their nutritional properties. That's why throughout this whole degree work is evaluated the enzymatic antioxidant activity during the storage post-harvest of two morphotypes of cubio from Ventaquemada – Boyacá stored in a mesh and perforated bag. For this reason, a protocol for the extraction and measurement of the POD enzyme and next the enzymatic antioxidant activity and the physicochemical indicators were measured for three weeks with a frequency of twice for week. According to the results obtained, it was possible to conclude that in the 11th day post-harvest and the storage in mesh its maintain the nutritional benefit of cubio according with the enzymatic antioxidant activity of peroxidase and the indicators of physicochemical quality.

Key words: Cubio (Tropaeolum tuberosum), peroxidase, enzymatic antioxidant activity.

1. INTRODUCCIÓN

El cubio es un tubérculo andino cultivado en zonas altas de la cordillera de Los Andes a una altitud entre 2400 y 4300 msnm, por lo tanto se encuentra a lo largo del territorio abarcado entre Colombia y Argentina. Es considerado como parte esencial en la identidad de los campesinos suramericanos debido a que su existencia se remonta a épocas prehispánicas, razón por la que en el caso de Colombia, su cultivo es considerado herencia de antiguos pobladores como paeces, muiscas y laches (Aguirre, Piraneque, & Pérez, 2012; Clavijo, Baron, & Combariza, 2014).

Son cuatros los departamentos en Colombia donde se reconoce su producción: Nariño, Cauca, Cundinamarca y Boyacá. La región que abarcan estos dos últimos departamentos es conocida como El Altiplano Cundiboyacense, en donde se referencia la mayor producción de cubios. Se encuentra ubicada en el centro del país e incluye los municipios de Samacá, Duitama, Combita, Umbita, Ramiriquí, Nuevo Colón, Ventaquemada, Villapinzón, Zipaquirá, Usme, Ciénaga, Toca, Turmequé y Chocontá (Clavijo et al., 2014).

A pesar que en dicha región se establece la mayor producción, esta no alcanza las 17 toneladas por hectárea. Las razones para ello se basan en que los campesinos suelen cultivar el tubérculo andino principalmente para el autoconsumo y no para la comercialización, además que para Colombia el cultivo del cubio no ha sido priorizado dentro de la cadena de producción (Cano, 2012). Sumado a lo anterior, el desconocimiento en cuanto a diversas preparaciones que pueden realizarse con este alimento junto con su sabor particular, hacen que el consumo del tubérculo sea usualmente rechazado y por ende, sea poco demandado, fomentando más su marginalización (Aguirre et al., 2012). Otro aspecto importante por mencionar, es que los métodos de almacenamiento comúnmente empleados para el cubio son la bolsa perforada y la malla, de los cuales no se tiene información certera sobre la efectividad en cuanto a conservación y posible limitación para la comercialización. Esto aún sabiendo que al ser un alimento autóctono, su producción podría ser validada como un elemento sustancial de la seguridad alimentaria, pues con su constante disponibilidad los campesinos podrían comercializarlo y de esta manera tener un permanente acceso físico y económico, lo que generaría un consumo de diversas preparaciones de alimentos que correspondan a sus costumbres alimentarias y a sus necesidades nutricionales en cuanto a cantidad, calidad e inocuidad (Clavijo et al., 2014).

De acuerdo con lo reportado por Cano (2012), tras una Feria de Agrodiversidad de Tubérculos Andinos llevada a cabo en Boyacá se lograron identificar 19 morfotipos de cubios (Cano, 2012), entre los que se encuentran variedades de acuerdo a su morfología y color variando desde una tonalidad crema hasta una tonalidad morada oscura (Chirinos et al., 2008). Dichos colores son amarillo, blanco amarillento, naranja, rojo grisáceo, morado, morado grisáceo y negro, además de encontrarse tubérculos con fondo claro y un color secundario distribuido en los ojos y bandas irregulares sobre las tuberizaciones (Clavijo et al., 2014).

Su diversidad de colores se deriva de pigmentos naturales estables, como lo son los polifenoles y carotenoides. Estos son antioxidantes que actúan contra el daño oxidativo de estructuras biológicas (Aguirre et al., 2012; Cedano, 2017; Clavijo et al., 2014) y por quienes

el cubio es denominado como un alimento con probable potencial funcional, pues es un alimento natural que dentro de su contenido nutritivo posee compuestos que desempeñan posiblemente funciones fisiológicas en el organismo humano (Luengo, 2007), tales como beneficios médicos para la prevención y tratamiento de enfermedades relacionadas con el hígado, riñón, próstata además de tener cualidades curativas en la piel (Chirinos, Rogez, Campos, Pedreschi, & Larondelle, 2007; Clavijo et al., 2014). A los polifenoles o compuestos fenólicos presentes en el cubio se les atribuye la actividad antioxidante química y a la presencia de peroxidasa (POD) se le atribuye la actividad antioxidante enzimática. Estas actividades son las encargadas de neutralizar las especies reactivas de oxigeno (ROS), que son moléculas que al aumentar y no ser controladas causan daño celular directo, pues generan radicales libres capaces de oxidar proteínas, ácidos nucleicos y lípidos además de conducir a la senescencia del tubérculo (Espinal, 2010).

La enzima POD neutraliza al peróxido de hidrógeno, una especie reactiva de oxígeno, mediante un control del estrés oxidativo, ya que cataliza la oxidación de varios fenoles donadores de electrones a quinona y reduce el peróxido de hidrógeno en agua (Figura 1), de forma que esta acción permite que las características organolépticas y beneficios nutricionales del cubio se mantengan. Sin embargo, llega un punto en que el control no puede llevarse a cabo, debido a que la acción del peróxido de hidrógeno supera el control realizado por la POD, lo cual genera colores pardos (melanoidinas), reduce las propiedades sensoriales de textura, color, sabor y por ende se disminuye la calidad nutricional del alimento (Baquero, Castro, &

Narvàez, 2005; Espinal, 2010). Entonces se establece que la POD tiene la capacidad de degradar el peróxido de hidrógeno a expensas del consumo de compuestos polifenólicos, lo que quiere decir que mediante la POD se puede determinar la cantidad de estos antioxidantes en el cubio (Baquero et al., 2005).

Este mismo control que realiza la POD en células vegetales también se da de manera muy similar en células animales, pues esta enzima cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno (H2O2) o lipoperóxido (LOOH), utilizando como agente reductor el glutatión reducido (GSH) de forma que actúa como mecanismo de defensa evitando la presencia de radicales libres. Así mismo, si la actividad de POD se ve alterada, los niveles de H2O2 y lipoperóxidos aumentan sin control, siendo fatal para la célula y por ende para el organismo, ya que esta alteración se encuentra implicada en enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares y cancerígenas además del envejecimiento (Campos et al., 2006; Cisneros, Pupo, & Cespedes, 1997;

Londoño, n.d.)

Con motivo de evaluar la actividad antioxidante enzimática durante el almacenamiento poscosecha en dos morfotipos de cubios, morado y amarillo, se pretende establecer el tipo de almacenamiento óptimo junto con el tiempo ideal en el que este tubérculo andino posee el mayor contenido de antioxidantes, traducido en mayores beneficios para la salud, sin que presente indicadores fisicoquímicos de senescencia como cambios en el color, textura, pH, Figura 1. Oxidación de fenoles (guaiacol) hasta la quinona y reducción del H2O2 a H2O por acción de la POD (Espinal, 2010).

acidez y contenido de sólidos solubles. Para ello, se estableció en un primer momento un protocolo de extracción para estandarizar la medida de la actividad antioxidante enzimática de la peroxidasa y de esta forma en un segundo momento se midió tanto de la actividad antioxidante enzimática como los indicadores fisicoquímicos de los dos morfotipos de cubios almacenados durante tres semanas bajo los dos tipos de almacenamiento más comunes bolsa perforada y en malla.

De esta manera se pueden obtener conclusiones válidas con las que los campesinos que se dedican a la siembra de este tubérculo andino, puedan comercializarlos bajo métodos de almacenamiento correctos, de modo que su calidad nutricional se mantenga. Además, determinar la actividad antioxidante enzimática del cubio puede ser un motivo para fomentar su consumo y diversificar la dieta de la población. Finalmente, este experimento corresponde a uno de los primeros pasos para probar el posible potencial que tiene el cubio como alimento funcional, pues determinando la actividad antioxidante enzimática en un modelo in vitro se podrá iniciar con investigaciones en las que se empleen diversos modelos in vivo.

2. MARCO DE REFERENCIA

2.1 Ubicación del estudio

Ventaquemada es un municipio colombiano ubicado en la Provincia del Centro del Departamento de Boyacá, cuya altitud es de 2630 msnm otorgando un clima con temperaturas que oscilan entre los 8 hasta los 14°C, ideal para el cultivo de papa, cubios, ibias, rubas, mora, uchuva, maíz, frijol, haba, entre otros. Es por esto que su economía y desarrollo se basa en las actividades agropecuarias caracterizadas por la ocupación de mano de obra familiar (Reina, 2016), en las que la papa es considerada como su principal producto agrícola con una producción cercana a las 84000 toneladas en un terreno aproximado de 5000 ha y se ha determinado que 2800 campesinos obtienen sus ingresos de la siembra de este producto. A nivel nacional, el cultivo de papa en este municipio ocupa el segundo lugar en área de siembra y el primer lugar en generación de empleo (Clavijo & Pérez, 2014). Para Ventaquemada y Turmequé, municipio perteneciente a la Provincia del Márquez del Departamento de Boyacá, las raíces y tubérculos andinos han sido considerados como símbolo de la cultura y base de la alimentación, razón por la que en estos su producción, aunque baja, se mantiene configurando sistemas productivos de la pequeña agricultura familiar andina (Cano, 2012;

Clavijo et al., 2014).

2.2 Raíces y tubérculos andinos (RTAs)

Las raíces y tubérculos andinos son cultivos que han existido desde la época precolombina en sistemas productivos indígenas y campesinos. Incluyen la achira (Canna edulis), la ahipa (Pachyrhizus ahipa), la arracacha (Arracacia xanthorrhiza), la maca (Lepidium meyenii), el cubio o mashua (Tropaeolum tuberosum), el miso o mauca (Mirabilis expansa), la ibia u oca (Oxalis tuberosa), el ulluco, melloco o ruba (Ullucus tuberosus) y el yacón (Smallanthus sonchifolius). Alimentos considerados como especies infrautilizadas como consecuencia de la marginalización que han sufrido en especial durante el último siglo, dada por las preferencias que tienen las nuevas generaciones por la alimentación de rápida preparación y por la priorización que se le ha dado a cultivos más rentables. Esto a pesar de ser un elemento identitario para los campesinos que les proporciona sustento económico y diversificación alimentaria (Barrera, Tapia, & Monteros, 2003; Clavijo et al., 2014).

2.3 Cubio (Tropaeolum tuberosum)

El cubio (Tropaeolum tuberosum Ruiz y Pavón) también conocido como mashua en Perú y Ecuador e isaño o añu en Bolivia pertenece a la familia Tropaeolaceae y al género Tropaeolum. Este incluye alrededor de 86 especies distribuidas desde Colombia hasta Argentina a lo largo de la Cordillera de Los Andes, de las que a su vez se reconocen 2 subespecies, una cultivada y otra silvestre, T. tuberosum ssp. tuberosum y T. tuberosum ssp.

Silvestre respetivamente. Estas especies pueden adaptarse satisfactoriamente a bajas temperaturas y suelos pobres. Posee gran diversidad de morfotipos que se producen de acuerdo al color del tubérculo, la forma, características de las yemas y el color de la pulpa.

Los cubios son tubérculos ricos en contenido de proteína, carbohidratos, fibra, ácido ascórbico y calorías, además de tener propiedades antioxidantes gracias a diversos nutrientes que poseen. En países como Perú y Bolivia su cultivo abarca las más grandes áreas en comparación con los demás países, a pesar de que estas extensiones no son iguales a las destinadas para el cultivo de la papa, su producción es sumamente importante porque hace parte de la seguridad alimentaria de muchas familias campesinas de Los Andes (Morillo, Morillo, & Tovar, 2016).

2.4 Contenido nutricional de los cubios

Tabla 1. Contenido nutricional de acuerdo a Salazar, 2016

De igual forma, dentro de su contenido nutricional se encuentran componentes bioactivos como los glucosinolatos y los antioxidantes (Arias, 2011). Dentro de los antioxidantes, resaltan los compuesto fenólicos, antocianinas y carotenoides (Cedano, 2017; Reina, 2016). En la literatura se reporta que para el caso del morfotipo morado el contenido de compuestos fenólicos es mayor en comparación con el morfotipo amarillo (Chirinos et al., 2007)

2.5 Antioxidantes

Son moléculas que tienen la capacidad de retardar o inhibir la acción oxidante de los radicales libres. Estos últimos son átomos o grupos de átomos que tienen un electrón despareado o libre, lo que les otorga que sean altamente reactivos y que tiendan a captar un electrón de moléculas estables con el fin de alcanzar su estabilidad electroquímica. Tras lo cual la molécula estable que cedió su electrón se convierte a su vez en un radical libre, pues queda con un electrón despareado, iniciando más reacciones que llegan a destruir las células (Avello

& Suwalsky, 2006). Los organismos aeróbicos cuentan con sistemas de protección dados por los ya mencionados antioxidantes, los cuales tienen la capacidad de liberar electrones que

son captados por los radicales libres de manera que la protección se da mediante su propia oxidación (Avello & Suwalsky, 2006; Londoño, n.d.; Quintanar & Calderón, 2009).

2.6 Actividad antioxidante

La actividad antioxidante es la capacidad que tiene una molécula, que recibe el nombre de antioxidante, para retardar o inhibir la oxidación de otras moléculas y así no se generen radicales libres pues causan daño celular (Londoño, n.d.). Existen dos tipos de actividad antioxidante, exógena y endógena.

2.6.1 Actividad antioxidante exógena o no enzimática

Se encuentra en los alimentos que contienen antioxidantes como la vitamina E (en aceites vegetales), vitamina C (en frutas como la guayaba y naranja, verduras como tomate y espinacas), carotenoides (en frutas de color amarillo y naranja, verduras de color verde oscuro), polifenoles y minerales como el selenio y el zinc.

2.6.2. Actividad antioxidante endógena o enzimática

Se basa en enzimas como la superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y catalasa, quienes mediante un control mantienen en niveles aceptables las concentraciones de radicales libres cumpliendo la función de ser un sistema de defensa antioxidante. En especial actúan contra un grupo de radicales libres, conocidos como especies reactivas de oxigeno (ROS), que son sumamente reactivos y destructivos debido al daño celular que causan, ya que alteran el equilibrio homeostático, o sea el normal funcionamiento de los mecanismos de regulación que conservan el estado normal fisiológico de los organismos (Avello & Suwalsky, 2006; Baquero et al., 2005; Espinal, 2010; Quintanar & Calderón, 2009; Sánchez, 2013).

2.7 Peroxidasa (POD)

En el caso particular de la enzima peroxidasa del cubio, es denominada como una enzima bisustrato, ya que su actividad antioxidante es exógena, pues proviene de un alimento. Esta enzima permite determinar la cantidad de antioxidantes (compuestos polifenólicos) que hay en el cubio, por lo que tras el consumo de estos antioxidantes propios del tubérculo andino, se proporciona una defensa antioxidante en el momento en el que los sistemas antioxidantes endógenos (mediados por las enzimas catalasa, superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa) se encuentran saturados.

2.8 Indicadores fisicoquímicos

Son el conjunto de atributos físicos y químicos propios de un alimento que determinan el cumplimiento de su calidad, lo cual es fundamental en la determinación de su valor nutricional y en el control de los parámetros exigidos por los organismos de salud pública (Universidad Nacional, 2014). En el caso de las frutas y verduras, es común que se evalúen indicadores fisicoquímicos en la cosecha y en la poscosecha, que permitan identificar tanto la madurez fisiológica, es decir cuando se ha completado el desarrollo del fruto, como la madurez comercial, momento aceptado y requerido por el mercado. El color y el grado de desarrollo son los indicadores predominantes para establecer el momento de la cosecha, aunque también es común que se establezcan índices objetivos como la firmeza, sólidos solubles, aroma, pH, contenido de almidón, entre otros (FAO, 2003).

3. PLANTEAMIETO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

El cubio (Tropaeolum tuberosum) es un alimento ancestral cultivado a lo largo de las zonas altas de la cordillera de Los Andes. En Colombia, hay 4 departamentos en los que se referencia el cultivo de los mismos: Nariño, Cauca, Cundinamarca y Boyacá, siendo en estas dos últimas regiones donde existen más reportes en relación a su siembra y diversidad (Clavijo et al., 2014). Este tubérculo ha sido denominado por la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO, por sus siglas en inglés) como un alimento marginado, en razón a causas sociales (1), biológicas (2), culturales (3) y económicas (4):

1. Sociales, ya que es un alimento que a pesar de ser autóctono ha ido desapareciendo de la canasta básica familiar, pues son pocos los campesinos que lo cultivan y aquellos que lo hacen realizan la siembra en un terreno aproximado de 200 a 1000 m² limitando una baja producción. En consecuencia, se han introducido nuevos cultivos y se prefiere el consumo de otros alimentos (Aguirre et al., 2012; Clavijo et al., 2014).

2. Biológicas, por la reducción de áreas sembradas y la no conservación integral de la semilla disponible para su cultivo, conllevando a una alarmante perdida de la diversidad genética en las especies nativas tales como este tubérculo andino (FAO, 1992; Morillo et al., 2016)

3. Culturales, en razón de que su producción se dirige principalmente al autoconsumo o al intercambio por otro alimento, es decir se basa en una agricultura de subsistencia, restringiendo su consumo, además de un desconocimiento sobre usos alimentarios para desarrollar nuevos productos, así mismo por la no inclusión de este tubérculo en programas de asistencia alimentaria, ni dentro de las dietas saludables recomendadas (Morillo et al., 2016; K. Salazar, 2016)

4. Económicas, puesto que no es cultivado bajo el enfoque de agricultura tecnificada, como consecuencia de la falta de priorización en la cadena de producción (Universidad Nacional de Colombia, 2014).

La pérdida del valor de este tubérculo se remonta a la época de la conquista, pues con el arribo de los españoles, también llegaron una gran cantidad de alimentos, plantas y animales que transformaron los hábitos alimentarios de los pobladores nativos. De igual forma durante esta época se creó el estigma de que el cubio era un alimento consumido por pobres e indios, conllevando a que desde ese momento haya iniciado su estigmatización (Cano, 2012). Por razones como estas, se dejaron de lado aquellos productos que en un comienzo hacían parte de la alimentación y de la economía en la población latinoamericana (FAO, 1992), de ahí que actualmente exista una baja demanda y consecuentemente una disminución en las áreas de cultivo y producción, alterando la diversidad genética de los agroecosistemas (Clavijo et al., 2014). Esto recae en el bajo consumo, seguido del vacío existente en cuanto a la eficiencia de los métodos de conservación poscosecha usualmente empleados, malla y la bolsa perforada, los cuales son elegidos por los campesinos que producen mayor cantidad de cubio con la finalidad de comercializarlos. Mientras que aquellos campesinos que los cultivan en menor cantidad y con la finalidad principal del autoconsumo, los almacenan en sacos de polietileno, cajas de cartón, sacos de fique manteniéndolos en lugares donde no hay ventilación. Razones por las que estas prácticas aceleran el deterioro de los alimentos y como

consecuencia, deben consumirse de forma rápida, regalarse o usarse como alimento para los animales (Clavijo et al., 2014)

Junto con las razones de marginalización anteriormente mencionadas, se suma el evidente desconocimiento que existe en cuanto a algunos morfotipos que no han sido plenamente identificados, de acuerdo a las zonas donde se producen y de los que se desconocen sus características nutricionales y probable potencial funcional (Chirinos et al., 2007). A pesar de que el consumo del cubio está relacionado con beneficios para la salud, ya que en estudios previos se ha demostrado que posee prometedora actividad antioxidante (Chirinos et al., 2008).

La actividad antioxidante más estudiada en los cubios es la relacionada con sus compuestos polifenólicos, la cual ha sido evaluada solamente en morfotipos nativos de Perú mediante métodos químicos como ABTS (Azinobis 3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico), DPPH (Difenil Picril Hidrazilo), FRAP (Capacidad de Reducción de un Antioxidante Férrico), ORAC (Capacidad de Absorbancia de Radicales de Oxígeno) (Chirinos et al., 2008; Londoño, n.d.).

Dichos métodos químicos emplean radicales sintéticos que no representan el mecanismo real de actividad antioxidante a nivel biológico. A raíz de esto, se deduce que hay un vacío en la literatura frente a la utilización de métodos que midan la actividad antioxidante y que tengan una mayor validez biológica en comparación con métodos químicos usualmente empleados pues estos últimos solo denotan una aproximación de lo que ocurre en situaciones complejas dentro de un organismo (Kuskoski, Asuero, Troncoso, Mancini-Filho, & Fett, 2005).

El cubio no solo posee el ya mencionado sistema de defensa antioxidante debido a la presencia de sus compuestos polifenólicos, denominado como actividad antioxidante no enzimática o exógena ya que deriva de la dieta, sino también por enzimas antioxidantes, como la peroxidasa (POD) quien hace parte de su composición y de la cual no se han realizado estudios que permitan medir su actividad antioxidante enzimática endógena. Llevar a cabo estudios que midan esta actividad resulta de suma relevancia, pues la peroxidasa realiza un control a la producción de peróxido de hidrógeno, evitando de esta manera que las propiedades funcionales y nutricionales del alimento se perjudiquen tras la oxidación, ya que de lo contrario, conllevaría a la necrosis de los tejidos vegetales (Espinal, 2010). De igual forma esta actividad antioxidante enzimática evita la aparición de efectos no deseados en el tubérculo, como las modificaciones en color, sabor, textura y producción de olores durante el almacenamiento poscosecha. Modificaciones que se atribuyen a la senescencia, hecho que conlleva a pérdidas económicas por deterioro de los tubérculos traducido en cultivo regalado, dañado o suministrado a animales (Baquero et al., 2005; Blach, Donado, & Pinzón, 2010;

Clavijo et al., 2014; Espinal, 2010).

Como consecuencias del contexto descrito anteriormente, el interés de esta investigación es medir la actividad antioxidante enzimática del cubio, mediante métodos más representativos biológicamente que permitan dar información sobre la manera en la que debe ser conservado, para aprovechar al máximo sus propiedades nutricionales y mantener sus características organolépticas. Por tanto, a lo largo del desarrollo del trabajo se busca solucionar la siguiente pregunta de investigación: ¿Cómo se modifica la actividad antioxidante enzimática en los morfotipos de cubio morado y amarillo según el tipo de almacenamiento poscosecha?

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General:

Evaluar la actividad antioxidante enzimática durante el almacenamiento poscosecha del cubio (Tropaeolum tuberosum Ruíz & Pavón) morfotipos morado y amarillo provenientes de Ventaquemada, Boyacá, Colombia.

4.2 Objetivos Específicos:

4.1.1 Establecer un protocolo de extracción y medida de la actividad antioxidante enzimática de la peroxidasa en el cubio (Tropaeolum tuberosum Ruíz & Pavón) morfotipos morado y amarillo.

4.1.2 Estimar la actividad antioxidante enzimática bajo dos tratamiento de almacenamiento poscosecha en el cubio (Tropaeolum tuberosum Ruíz & Pavón) morfotipos morado y amarillo.

4.1.3 Relacionar la actividad antioxidante enzimática con indicadores fisicoquímicos del cubio (Tropaeolum tuberosum Ruíz & Pavón) morfotipos morado y amarillo bajo dos tratamientos de almacenamiento poscosecha

5. HIPÓTESIS

La actividad antioxidante enzimática del cubio morfotipos morado y amarillo permite establecer el método ideal de almacenamiento y el momento en el que las propiedades antioxidantes y por ende benéficas de este tubérculo andino se encuentran en su máxima expresión sin presentar signos de senescencia.

6. MATERIALES Y MÉTODOS

Este trabajo experimental se enmarca en el proyecto de investigación: “Memoria histórica, caracterización genética y aprovechamiento alimentario de tubérculos andinos marginados en las provincias de Centro y Márquez (Boyacá)”, perteneciente a los grupos de investigación

“Institucionalidad y Desarrollo Rural” de la Facultad de Estudios Ambientales y Rurales de la Pontificia Universidad Javeriana; “Biología de Plantas y Sistemas Productivos” y “Alimentos, Nutrición y Salud” de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.

6.1 Diseño de la investigación Estudio experimental

6.2 Muestra

Cubios morfotipos morado y amarillo cosechados en el municipio de Ventaquemada, Boyacá.

Se les retiró el exceso de tierra empleando cepillos de cerdas suaves, se extendieron para que las muestras que estuviesen aun húmedas por la tierra se secaran y posteriormente se les volvió a retirar el exceso de tierra de manera tal que quedaran limpios. Fueron transportados en neveras portátiles hasta el laboratorio de Bioquímica de Alimentos (51-339) de la Pontificia Universidad Javeriana, donde fueron almacenados en malla y bolsa perforada

hasta la culminación del estudio. Al momento de realizar las medidas, se lavaron con agua y desinfectaron con 5 mL de vinagre.

6.3 Variables de estudio

Tabla 2. Operacionalización de las variables

Variable Definición de variable Unidad de

medida Tipo de variable

Morfotipo de cubio

Cubios que presentan las características morfológicas típicas de la especie, pero que se diferencian por su tonalidad, morada y amarilla, es decir sus características fenotípicas son distintas.

NO APLICA Nominal Independiente

Métodos de almacenamiento

Procedimientos que permiten mantener los alimentos seguros, pues evitan su deterioro durante periodos cortos o largos.

NO APLICA Nominal Independiente

Actividad antioxidante

enzimática

Valor medido por la actividad de la peroxidasa que permite determinar el momento óptimo en el que el cubio tiene mayor potencial nutricional.

UA/s Continua Dependiente

Parámetros fisicoquímicos

Color instrumental: Herramienta que permite medir de manera objetiva el color del cubio.

Índice CIRG Continua Dependiente

Dureza instrumental: Herramienta que permite medir la textura del cubio indicando su calidad.

Kg/cm² Continua Dependiente

pH: Concentración de hidrogeniones del cubio, indicando el grado de acidez o basicidad de las muestras.

Escala de pH

Continua Dependiente

Grados Brix: Contenido de sólidos solubles disueltos en las muestras de cubios.

°Brix Continua Dependiente

Acidez titulable: Concentración de ácidos orgánicos en las muestras de cubio, expresados como porcentaje de ácido málico libre.

Porcentaje de ácido

málico

Continua Dependiente

6.4 Métodos

Se realizó una metodología dividida en 2 fases para dar cumplimiento a los objetivos planteados.

6.4.1 Primera fase: Protocolo de extracción y medida de la actividad enzimática de la peroxidasa, y estandarización de la medida de los indicadores fisicoquímicos

6.4.1.1 Muestra

Cubios morfotipos amarillo y blanco con ojos morados para la medida de la actividad enzimática. Cubios morfotipo blanco con ojos morados para la estandarización de los indicadores fisicoquímicos.

6.4.1.2 Criterios de inclusión y exclusión

 Criterios de inclusión

Cubios frescos, pertenecientes a los morfotipos amarillo y blanco con ojos morados.

 Criterios de exclusión

Cubios senescentes, de morfotipos diferentes al amarillo y blanco con ojos morados, que se encuentren con daño físico o con patógenos asociados visiblemente.

6.4.1.3 Obtención de la muestra

Se obtuvieron cubios frescos de los morfotipos amarillo y blanco con ojos morados que fueron adquiridos en las principales plazas de mercado de Bogotá, los cuales se transportaron en neveras portátiles hasta el laboratorio de bioquímica de alimentos (51-339) de la Pontificia Universidad Javeriana.

6.4.1.4 Protocolo de extracción de la enzima

Se estableció un control de la actividad de POD mediante su inactivación de dos formas, la primera empleando cubio entero cocido (92°C, 15 min) y la segunda empleando el extracto enzimático obtenido del cubio entero crudo (92°C, 5 min).

Para cada uno de los morfotipos, se tomó una muestra de cubio entero crudo y otra de cubio entero cocido, fueron trituradas en un procesador de alimentos y en mortero hasta obtener una masa homogénea. En un tubo Falcon de 15 mL se pesó (por triplicado) 300 mg de cada uno de las muestras y se adicionaron 10 mL de solución buffer fosfato a un pH 7.0. Los tubos se agitaron en vórtex durante dos minutos y se centrifugaron durante quince minutos a 4146 x g. Posteriormente, se guardó el sobrenadante de cada una de las muestras en tubos Eppendorf en una nevera portátil a 4 °C para la posterior medida de la actividad enzimática de la POD, de acuerdo al protocolo establecido por Espinal, 2010.

A cada muestra se le asignó un descriptor con una respectiva sigla para su abreviación, de acuerdo a sus características fenotípicas y al tratamiento al que fueron sometidos, tal y como se observa en la tabla 2.

Tabla 3. Descriptores de los morfotipos de cubio empleados en el estudio de acuerdo con sus características fenotípicas y al tratamiento al que fueron sometidos.

Morfotipo Abreviación

Cubio blanco con ojos morados activo CBMA

Cubio blanco con ojos morados inactivo CBMI

Cubio amarillo liso activo CALA

Cubio amarillo liso inactivo CALI

Extracto de cubio morado alargado inactivo eCMAI

Extracto de cubio amarillo liso inactivo eCALI

6.4.1.5 Medida de la actividad de la peroxidasa (APOD)

En una celda espectrofotométrica de 1 cm de paso óptico, se mezclaron los sustratos de la enzima (125 μL de guayacol 200 mM, 125 μL de H2O2 80mM, preparados en buffer fosfato 200 mM pH 7,0) incubados a 35°C durante 5 minutos. Se les adicionó 230 μL de buffer fosfato 200 mM pH 7.0 y 20 μL del extracto enzimático obtenido de cada muestra. Se midió la absorbancia de la quinona formada a 470 nm cada diez segundos durante dos minutos.

(Espinal, 2010). Los resultados se graficaron consiguiendo 6 rectas, de las cuales se obtuvo el promedio y de este la respectiva regresión lineal, para así determinar el valor correspondiente de la pendiente (m) el cual corresponde a la actividad de la enzima peroxidasa (APOD). Dicha actividad expresada en UA/s, donde UA son las unidades de absorbancia.

6.4.1.6 Estandarización de los indicadores fisicoquímicos 6.4.1.6.1 Color instrumental

Se tomó una fotografía con una cámara de 13 megapíxeles a cada muestra de cubio entero y posteriormente para establecer las coordenadas del espacio triestímulo CIE L*a*b* se empleó en un primer momento la aplicación Color Analysis (aplicación gratuita disponible en Google Play, versión 4, última actualización 2016, ofrecida por Roy Leizer) en donde se establecieron las coordenadas RGB (coordenadas basadas en la composición del color en términos de la intensidad de los colores primarios de la luz rojo, verde y azul) y en un segundo momento con la aplicación Sensor de Color Nix Pro (aplicación gratuita disponible en Google Play y App Store, versión 1.27, última actualización 2018, ofrecida por Nix Sensor Ltd) las coordenadas RGB fueron convertidas en coordenadas CIE L*a*b* y L*C*h* (luminosidad, chroma y tonalidad). Los resultados fueron expresados como el índice CIRG (Colour Index Red Grape) del sistema CIE L*a*b* (Espinal, 2010). El índice CIRG se definió como:

CIRG = ^180−ℎ∗

𝐿∗ +𝐶∗

Donde L* corresponde a la luminosidad, C* al valor chroma (saturacion) y h* al hue angle (tonalidad), que se definen así:

C* =

h* = si a* < 0  180 + arctan x

= si a* > 0  arctan x 6.4.1.6.2 Dureza instrumental

La fuerza de compresión se realizó sobre el tubérculo entero con tres medidas en la corteza en sitios al azar en un mismo cubio (replica técnica) y en tres cubios diferentes de acuerdo al morfotipo y tipo de almacenamiento (replicas analíticas) con un Penetrómetro o Medidor de dureza para Frutas de capacidad de 0,5-12kg/1-23kg modelo GY-3 cuya sonda era de 11mm.

Los resultados fueron expresados en kg/cm² 6.4.1.6.3 ° Brix

Se realizó con la parte acuosa del cubio tras su trituración, se colocaron unas gotas en el Refractómetro portátil BRIXCO 00 ~ 90% °Brix donde posteriormente se determinaron los °Brix

√(𝑎 ∗)²+ (𝑏 ∗)² 𝑏 ∗ 𝑎 ∗

360 2𝜋 𝑏 ∗

𝑎 ∗

360 2𝜋

6.4.1.6.4 pH

La medida se realizó con la parte acuosa del cubio tras la trituración mediante el pHmetro Martini Mi150 pH/Temperature Laboratory Bench Meter.

6.4.1.6.5 Acidez titulable

La medida se realizó en un beaker de 50 mL, en el que se pesó 1 g de cada muestra triturada de cubio con una balanza analítica ScienTech Serie Zeta, se añadieron 20 mL de agua destilada y 5 gotas de fenolftaleína; el vaso se colocó en la plancha de agitación Fisher con calentamiento. Se realizó una titulación potenciométrica empleando una bureta de 25 mL con NaOH 0,01N y un pHmetro Martini Mi150 pH/Temperature Laboratory Bench Meter hasta alcanzar un pH de 8.20. Posteriormente con el volumen de NaOH gastado pudo obtenerse la acidez titulable expresada como %(p/p) de ácido málico.

6.4.2 Segunda fase: Medida de la actividad antioxidante enzimática y medida de los indicadores fisicoquímicos del cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados durante 21 días poscosecha

6.4.2.1 Muestra

Cubios de los morfotipos morado y amarillo cosechados en el municipio de Ventaquemada, Boyacá. Cubios morfotipo blanco con ojos morados obtenidos en una plaza de mercado de Cota, Cundinamarca.

6.4.2.2 Criterios de inclusión y exclusión

 Criterios de inclusión

Cubios frescos pertenecientes a los morfotipos morado, amarillo y blanco con ojos morados.

Los morfotipos morado y amarillo que hayan sido cosechados en el municipio de Ventaquemada, Boyacá, y el morfotipo blanco con ojos morado que haya sido adquirido en una plaza de mercado de Cota, Cundinamarca.

 Criterios de exclusión

Cubios senescentes, de morfotipos diferentes al morado, amarillo y blanco con ojos morados, con daño físico o con patógenos asociados visiblemente, que no provengan del municipio de Ventaquemada, Boyacá, que no hayan sido adquiridos en una plaza de mercado Cota Cundinamarca.

6.4.2.3 Caracterización del tipo de almacenamiento poscosecha: Malla y bolsa perforada

 Malla

Para el almacenamiento de cada muestra (3 cubios por morfotipo) se empleó una malla con dimensiones iguales a 23.5 cm X 15.0 cm y una superficie de exposición del 98.04%.

 Bolsa perforada

Para el almacenamiento de cada muestra (3 cubios por morfotipo) se empleó una bolsa de plástico de polietileno de baja densidad, con dimensiones iguales a 27.5 cm X 15.5 cm y una superficie de exposición del 0.40%.

6.4.2.4. Establecimiento de las muestras de acuerdo al almacenamiento poscosecha En el momento de la cosecha de los cubios morfotipos morado y amarillo en Ventaquemada, Boyacá, Colombia se tomaron de cada morfotipo 42 cubios en total. Se establecieron 14 grupos por morfotipo (cada uno contaba con 3 cubios), 7 grupos se almacenarían en malla y los 7 restantes en bolsa perforada. Tras la cosecha de estos dos morfotipos de cubio, se

procedió a adquirir en una plaza de mercado de Cota, Cundinamarca cubios del morfotipo blanco con ojos morados, para poder comparar los resultados contra un morfotipo comercial.

Fueron 42 cubios de este morfotipo, los cuales fueron separados de igual forma en 14 grupos (cada uno de 3 cubios), 7 almacenados en malla y 7 en bolsa perforada. De manera que se obtuvieron 42 muestras en total.

A cada muestra se le asignó un descriptor con una respectiva sigla para su abreviación, de acuerdo a características fenotípicas y al método de almacenamiento, tal y como se observa en la tabla 3.

Tabla 4. Descriptores de los morfotipos de cubio empleados en el estudio de acuerdo con sus características fenotípicas y al método de almacenamiento.

Morfotipo Abreviación

Cubio morado alargado almacenado en malla CMAm

Cubio morado alargado almacenado en bolsa perforada CMAb

Cubio amarillo liso almacenado en malla CALm

Cubio amarillo liso almacenado en bolsa perforada CALb

Cubio blanco con ojos morados en malla CBMm

Cubio blanco con ojos morados en bolsa perforada CBMb

6.4.2.5 Almacenamiento poscosecha

Las muestras de los cubios se transportaron y se llevaron al laboratorio de Bioquímica de Alimentos (51-339) de la Pontificia Universidad Javeriana en neveras portátiles, donde se almacenaron de manera que la luz directa no los alcanzaba.

6.4.2.6 Medida de la actividad antioxidante enzimática y de los indicadores fisicoquímicos del cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados en el día uno poscosecha

El día posterior a la cosecha (día 1) de los cubios morfotipo morado y amarillo se midió la actividad antioxidante enzimática de la peroxidasa y los indicadores fisicoquímicos color instrumental, dureza instrumental, °Brix, pH, y acidez titulable, como medidas de control de calidad, en 6 muestras (morfotipos morado, amarillo y blanco con ojos morados almacenados en bolsa perforada y malla), de acuerdo a los protocolos establecidos en la primera fase.

6.4.2.7 Medida de la actividad antioxidante enzimática y de los indicadores fisicoquímicos del cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados durante 21 días poscosecha

Se midió la actividad antioxidante enzimática de la peroxidasa y los indicadores fisicoquímicos color instrumental, dureza instrumental, pH, °Brix y acidez titulable, como medidas de control de calidad en 6 muestras por día (morfotipos morado, amarillo y blanco con ojos morados almacenados en bolsa perforada y malla) durante tres semanas, con una frecuencia de dos veces por semana.

6.4.2.8 Análisis de datos

Se empleó el promedio como medida de centralización y la desviación estándar como medida de dispersión. Todas las medidas se realizaron como mínimo por triplicado (n=3). Para evaluar la relación entre el tiempo poscosecha y el tipo de almacenamiento se empleó un análisis de varianza (ANOVA) multifactorial y para comparar el día 11 y el día 17 de los morfotipos de acuerdo al tipo de almacenamiento se empleó una prueba t student (p<0.05).

7. RESULTADOS

7.1 Primera fase: Protocolo de extracción y medida de la actividad antioxidante de la peroxidasa y estandarización de la medida de los indicadores fisicoquímicos

7.1.1 Estandarización de la extracción y medida de la peroxidasa

Para la obtención del extracto enzimático se empleó 300mg de muestra junto con 10 mL de buffer fosfato 200mM pH 7.0. Para la medida de la actividad de la POD se mezclaron 125 μL de guayacol 200mM, 125 μL de H2O2 80mM y 230 μL Buffer fosfato 200mM pH 7.0 incubados a 35°C durante 5 min y se adicionaron 20 μL de extracto enzimático. De forma que se logró medir la absorbancia de la quinona formada a 470 nm durante 2 minutos sin superar un valor emitido por el espectrofotómetro de 1.200 UA (unidades de absorbancia). (Figura 2)

7.1.2 Medida de la actividad de la peroxidasa activa e inactiva

Se encontró que los morfotipos blanco con ojos morados y amarillo activos expresaron una mayor actividad antioxidante enzimática, en comparación con los morfotipos y los extractos inactivados (92°C, 15 min y 92°C 5 min, respectivamente), lo cuales no expresaron actividad antioxidante enzimática. (Figura 3)

y = 0,0091x + 0,1076 R² = 0,9956

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

0 20 40 60 80 100 120 140

Absorbancia 470nm

Tiempo (s)

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

-20 0 20 40 60 80 100 120 140

Absorbancia 470nm

Tiempo (s)

CMBi CALa CALi eCBM eCAL CBMa

Figura 3. Medida de la actividad de la peroxidasa (∆A470nm/s) para cubio morfotipo blanco con ojos morados activo e inactivo (CMBa y CMBi), para cubio morfotipo amarillo activo e inactivo (CALa y CALi) y para extracto de cubio morfotipo blanco con ojos morados y amarillo inactivo (eCBM y eCAL). La regresión

Figura 2. Extracción y medida de la actividad de la peroxidasa (∆A470nm/s). La regresión lineal, determina la pendiente con un valor igual a 0,0091 UA/s, el cual corresponde a APOD. UA corresponde a unidades de absorbancia

7.1.3 Estandarización de la medida de los indicadores fisicoquímicos

Tabla 5. Medida de los indicadores fisicoquímicos de calidad: color instrumental, dureza instrumental, pH, ° Brix y acidez titulable, para cubio morfotipo blanco con ojos morados

7.2 Segunda Fase: Medida de la actividad antioxidante enzimática y de los indicadores fisicoquímicos del cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados durante 21 días poscosecha

7.2.1 Medida de la actividad antioxidante enzimática del cubio morfotipo morado, amarillo y blanco con ojos morados durante 21 días poscosecha

Se encontró que para el día 11 y el día 17 hay mayor actividad antioxidante enzimática, evidenciado en mayor proporción en el almacenamiento en malla para el morfotipo morado.

(Figura 4 y Figura 5).

-0,005 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

APOD (UA/s)

Día

CMAm CMAb

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

APOD (UA/s)

Día

CALm CALb

Color instrumental Dureza

Instrumental pH °Brix

Acidez titulable

%p/p¹

( ± DS) ( ± DS) ( ± DS) ( ± DS) ( ± DS)

Coordenadas RGB

R (Rojo) :228 ± 0,00

6,50 ± 0,20 6,48 ± 0,02 4,50 ± 0,58 0,83 ± 0,15 G (Verde) : 227± 0,00

B (Azul) : 179 ± 0,00

Coordenadas a* b*

a* (Verde/rojo): -5,3 ± 0,00

b* (Azul/amarillo): 23,7 ± 0,00

Coordenadas LCH

L (Luminosidad) : 89.4 ± 0,00

C (Chroma): 24,3 ± 0,00 H (Tonalidad):102,7 ±

0,00 Índice CIRG 0,68 ± 0,00

A B

DS = Desviación Estándar

1= Acidez titulable expresada como porcentaje peso a peso de ácido málico

7.2.2 Medida de los indicadores fisicoquímicos del cubio morfotipos morado, amarillo y blanco con ojos morados durante 21 días poscosecha

7.2.2.1 Color instrumental

Se encontraron valores variables para el color y más elevados en el morfotipo morado debido a su coloración más oscura. (Figura 6)

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

APOD (UA/s)

Días

CBMm CBMb

0,0000 0,0050 0,0100 0,0150 0,0200 0,0250 0,0300

CMA CAL CMA CAL

Día 11 Día 17

APOD (UA/s)

Malla Bolsa

C

Figura 4. Medida de la actividad antioxidante enzimática de la peroxidasa durante la poscosecha de (A) cubio morfotipo morado alargado almacenado en malla (CMAm) y en bolsa perforada (CMAb), (B) cubio morfotipo amarillo alargado almacenado en malla (CALm) y en bolsa perforada (CALb), (C) cubio morfotipo blanco con ojos morados almacenado en malla (CBMm) y en bolsa perforada (CBMb).

Para el morfotipo morado el anova multifactorial (α=0,05) muestra diferencias estadísticamente significativas entre el tiempo de poscosecha (p=0,0029) y el tipo de almacenamiento (p=0,0000).

Para el morfotipo amarillo el anova multifactorial (α=0,05) no muestra diferencias estadísticamente significativas entre el tiempo de poscosecha (p=0,7136) y el tipo de almacenamiento (p=0,0000).

Para el morfotipo blanco con ojos morados el anova multifactorial (α=0,05) no muestra diferencias estadísticamente significativas entre el tiempo de poscosecha (p=0,1732) y el tipo de almacenamiento (p=0,0000).

Figura 5. Medida de la actividad antioxidante enzimática de la peroxidasa para los días 11 y 17 poscosecha de (A) cubio morfotipo morado alargado (CMA) almacenado en malla y en bolsa perforada, (B) cubio morfotipo amarillo alargado (CAL) almacenado en malla y en bolsa perforada.

Para el almacenamiento en malla la prueba de t student no muestra diferencia estadísticamente significativa para los días 11 (p=0,3814) y 17 (p=0,0956).

Para el almacenamiento en bolsa perforada la prueba de t student no muestra diferencia estadísticamente significativa para los días 11 (p=0,0038) y 17 (p=0,4967).